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¿Qué significan estos nuevos sitios de empalme?

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Estoy seguro de que la respuesta es obvia para algunos de ustedes, pero acabo de terminar mi pasantía donde encontramos uniones de empalme novedosas (junctionseq; datos de RNAseq) (consulte el archivo adjunto) y tengo algunas dificultades con las uniones de empalme. Entiendo que las lecturas pueden mapear en la unión de 2 exones (que pueden estar vinculados a la evaluación de la calidad) y que comparando 2 condiciones, podemos encontrar grupos de exones más "asociados" pero no entiendo:

  • Cómo se puede descubrir una unión nueva en una unión anterior (sub1), o detrás del último exón de un gen (sub2) y, por lo tanto, cuáles pueden ser las consecuencias

Una unión de empalme se forma a partir de un pre-ARNm (o transcripción primaria) siempre que se elimina o empalma un intrón. Dos segmentos de ARN que solían estar separados en el pre-ARNm ahora están ligados entre sí, formando una unión de dos exones.

Las lecturas de RNA-Seq que abarcan dicho sitio de unión de empalme no se alinearían muy bien con la secuencia genómica; sin embargo, si crea un archivo de todas las posibles uniones de empalme simuladas, puede haber algunas lecturas de RNA-Seq que ahora se alinean perfectamente.

La distinción entre lo que constituye un intrón y lo que constituye un exón es puramente empírica. Si bien es cierto que el complejo espliceosomal reconoce y se une preferentemente a sitios donantes de empalme y aceptores de empalme yuxtapuestos adecuadamente, una variedad de transcripciones maduras procesadas diferentes pueden resultar de una sola transcripción primaria. Este análisis sintáctico diferencial de las secuencias que actúan en cis en los límites de los intrones y exones potenciales se denomina corte y empalme alternativo.


Empalme de genes

una de las unidades biológicas de la herencia, que se auto-reproduce y se encuentra en una posición definida (locus) en un cromosoma particular. Los genes forman segmentos de la molécula compleja de ácido desoxirribonucleico (ADN) que controla la reproducción y función celular. Hay miles de genes en los cromosomas de cada núcleo celular que juegan un papel importante en la herencia porque controlan los rasgos físicos, bioquímicos y fisiológicos individuales heredados por la descendencia de sus padres. A través del código genético del ADN, también controlan las funciones diarias y la reproducción de todas las células del cuerpo. Por ejemplo, los genes controlan la síntesis de proteínas estructurales y también las enzimas que regulan diversas reacciones químicas que tienen lugar en una célula.

El gen es capaz de replicarse. Cuando una célula se multiplica por mitosis, cada célula hija porta un conjunto de genes que es una réplica exacta del de la célula madre. Esta característica de la replicación explica cómo los genes pueden transmitir rasgos hereditarios a través de generaciones sucesivas sin cambios.


Introducción

El empalme es un proceso biológico fundamental en el que los intrones se cortan de los ARN precursores y los exones se unen. El empalme alternativo se refiere al uso alternativo de exones. Se estima que aproximadamente el 95% de los genes de múltiples exones humanos se someten a un empalme alternativo [1]. La omisión de exones (de los denominados exones de casete) es el patrón de corte y empalme alternativo más común [2]. El nivel de omisión de un exón se cuantifica comúnmente con el porcentaje de empalme (PSI o Ψ) [3]. El porcentaje de empalme se puede estimar a partir de los datos de secuenciación de ARN (RNA-Seq) como el número de lecturas de RNA-Seq divididas que respaldan la inclusión del exón dividido por el número total de lecturas divididas que respaldan la omisión o la inclusión del exón. El empalme es un proceso complejo que implica la regulación por elementos de secuencia en los exones y los intrones flanqueantes [4, 5]. Además, el empalme alternativo suele ser específico de tejido [2, 3, 6, 7]. Esto significa que ciertas isoformas de empalme solo están presentes en ciertos tejidos o que la abundancia relativa de isoformas de empalme difiere entre los tejidos. El empalme alternativo juega un papel importante en el desarrollo del tejido y en la configuración de la identidad del tejido [8, 9]. El análisis de las funciones de codificación de proteínas de los exones específicos de tejido reveló su papel fundamental en el recableado de redes de interacción de proteínas en diferentes tejidos [10]. Los patrones de empalme específicos de tejido se asocian con motivos de ARN cortos [2, 11-14]. Estos motivos cortos de ARN codifican elementos reguladores de corte y empalme específicos de tejido, típicamente sitios de unión intrónicos o exónicos para factores de corte y empalme con una actividad específica de tejido. Los factores de empalme específicos de tejido de mamíferos incluyen Nova1, Nova2, PTB / nPTB y RBFOX1 para tejidos nerviosos y MBNL1 para músculos, entre otros. Para una revisión, consulte Chen y Manley [15].

Los defectos de empalme representan una fracción importante de la base genética de las enfermedades humanas [16-18]. Algunos de estos defectos de empalme son específicos de tejidos relevantes para la enfermedad. Por ejemplo, los individuos afectados por el trastorno del espectro autista (TEA) presentan con frecuencia un empalme incorrecto de exones específicos del cerebro [19-21], así como un enriquecimiento de mutaciones de novo en exones específicos del cerebro [22]. Por lo tanto, las herramientas computacionales que pueden predecir los efectos específicos de los tejidos de las variantes genéticas en el empalme serían relevantes para comprender la base genética de las enfermedades específicas de los tejidos, como el TEA.

Se han desarrollado muchas herramientas computacionales para predecir los sitios de empalme o la fuerza del empalme a partir de la secuencia [23-33]. Sin embargo, faltan herramientas para predecir los efectos específicos de tejido de las variantes genéticas humanas en el empalme. Barash y col. desarrolló el primer modelo basado en secuencias que predice el empalme específico de tejido en células de ratón [34]. El modelo integra elementos de secuencia reguladora para predecir cualitativamente si la inclusión de un exón de casete aumenta, disminuye o permanece en un nivel similar de un tejido a otro tejido. Este modelo se mejoró aún más para predecir cambios direccionales entre tejidos junto con Ψ categorías (baja, media y alta) dentro de un tejido mediante el uso de una red neuronal bayesiana con variables ocultas [35]. En un estudio posterior, se entrenó una red neuronal bayesiana similar (SPANR) con datos humanos [29]. Sin embargo, SPANR se evaluó solo para predecir el efecto más grande en todos los tejidos investigados. Por lo tanto, el rendimiento de SPANR en cualquier tejido no está claro. Además, el SPANR disponible públicamente no permite realizar predicciones específicas de tejido.

Anteriormente desarrollamos MMSplice, una red neuronal con un diseño modular que predice el efecto de las variantes en el empalme [30, 31]. A diferencia de SPANR, que ha sido entrenado en la secuencia genómica endógena natural, MMSplice aprovecha los datos de perturbación de un ensayo informador masivamente paralelo publicado recientemente [28]. MMSplice superó a SPANR y a muchos otros predictores de empalme en la predicción Ψ variaciones asociadas con variantes genéticas de origen natural, así como efectos de variantes sobre el porcentaje de empalme medido en ensayos de reportero [30, 36]. MMSplice modela la razón de posibilidades de un exón de casete a empalmar cuando se compara una secuencia alternativa con una secuencia de referencia. Las razones de probabilidades previstas son las mismas para todos los tejidos porque MMSplice se ha entrenado de forma independiente del tejido y, por lo tanto, no captura los efectos de las variantes que afectan a los elementos reguladores específicos del tejido.

Se han desarrollado modelos de aprendizaje profundo de elementos reguladores específicos de tejido para otros procesos biológicos. Estos modelos incluyen DeepSEA para los perfiles de cromatina [37], Basset para la hipersensibilidad a la DNasa I [38], ExPecto para la expresión génica específica de tejido [39], FactorNet para la unión del factor de transcripción [40] y ChromDragoNN para la accesibilidad a la cromatina [41]. Un denominador común de estos modelos es que se entrenan mediante el aprendizaje de múltiples tareas, es decir, los modelos hacen predicciones conjuntas para todos los tejidos o tipos de células utilizando un conjunto común de características predictivas subyacentes. Esta estrategia permite que los modelos agrupen de manera eficiente la información sobre los elementos reguladores que se comparten entre los tipos de células o tejidos.

Aquí, desarrollamos MTSplice (empalme de múltiples tejidos), un modelo que predice efectos de empalme específicos de tejido de variantes genéticas humanas. MTSplice ajusta las predicciones de MMSplice con las predicciones de TSplice (empalme específico de tejido), una nueva red neuronal profunda que predice variaciones específicas de tejido de Ψ de la secuencia que entrenamos en 56 tejidos humanos utilizando el aprendizaje multitarea. El rendimiento de MTSplice se demuestra mediante la predicción de variaciones específicas de tejido de Ψ asociado con variantes genéticas de origen natural del conjunto de datos GTEx, así como la investigación de predicciones del efecto de empalme específico del cerebro para variantes asociadas al autismo. MTSplice es de código abierto y está disponible gratuitamente en el repositorio de modelos Kipoi [42].


Materiales y métodos

Muestras de plasma humano

Los perfiles de proteínas plasmáticas fueron recogidos por el Hoosier Oncology Group (HOG) (Indianápolis, IN, EE. UU.). Cada muestra se analizó en un solo lote mediante espectrometría de masas. En el estudio, se recolectaron 80 muestras de plasma (40 muestras recolectadas de mujeres con cáncer de mama y 40 de mujeres voluntarias sanas que sirvieron como controles). Un conjunto de datos de validación independiente de 80 muestras que contiene 40 muestras recolectadas de mujeres diagnosticadas con cáncer de mama y 40 de mujeres voluntarias sanas que sirvieron como controles también fueron recolectadas por el Hoosier Oncology Group (HOG) (Indianápolis, IN, EE. UU.) Y es comparable a el estudio de la demografía y distribución clínica de los estadios / subtipos del cáncer de mama. Por ejemplo, a la mayoría de los pacientes que participaron en los dos estudios se les diagnosticó un cáncer de mama en estadio temprano (estadio I o II), pertenecían al grupo de edad entre 40 y 65 años y tenían un tamaño tumoral medio de 2,2.

Identificación y cuantificación de proteínas

Para la identificación de proteínas, los péptidos trípticos se analizaron utilizando un espectrómetro de masas con trampa de iones lineal Thermo-Fisher Scientific (LTQ) acoplado con un sistema de HPLC Surveyor. Los péptidos se eluyeron con un gradiente del 5 al 45% de acetonitrilo desarrollado durante 120 minutos y los datos se recopilaron en el juego triple modo (escaneo MS, escaneo con zoom y escaneo MS / MS). Los datos de la lista de picos sin procesar adquiridos fueron generados por XCalibur (versión 2.0) usando parámetros predeterminados y analizados adicionalmente por la identificación sin etiqueta y el algoritmo cuantitativo usando parámetros predeterminados descritos por Higgs. et al [33]. Las búsquedas en la base de datos de MS se realizaron contra el conjunto de datos de proteínas combinado del International Protein Index y la base de datos de proteínas humanas NCBI-nr no redundante, que totalizó 22.180 registros de proteínas. Se aplicaron cuidadosos filtros de procesamiento de datos para la identificación de proteínas para mantener solo los péptidos con la puntuación XCorr por encima de 1,5 para los péptidos con carga simple, 2,5 para los péptidos con carga doble y 3,5 para los péptidos con carga triple. Estas puntuaciones de XCorr se establecieron de acuerdo con un análisis discriminante lineal similar al descrito en DTASelect (versión 2.0) para controlar la tasa de falsos positivos a niveles inferiores al 5%.

Para la cuantificación de proteínas, en primer lugar, todos los cromatogramas de iones extraídos (XIC) se alinearon por tiempo de retención. Cada pico alineado se emparejó por ion precursor, estado de carga, iones de fragmento de datos de MS / MS y tiempo de retención dentro de una ventana de un minuto. Luego, después de la alineación, se midió el área bajo la curva (AUC) para cada pico alineado individualmente de cada muestra, se normalizó y se comparó la abundancia relativa, todo como se describe en [33]. Aquí, se utilizó un modelo lineal mixto generalizado a partir de ANOVA (análisis de varianza) individual para cuantificar las intensidades de las proteínas. En principio, el modelo lineal mixto considera tres tipos de efectos al derivar las intensidades de las proteínas en función del promedio ponderado de las intensidades de péptidos normalizados por cuantiles: 1) efecto de grupo, que se refiere a los efectos fijos no aleatorios provocados por las condiciones experimentales o tratamientos que se están comparando 2) efecto de muestra, que se refiere a los efectos aleatorios (incluidos los que surgen de las preparaciones de muestras) de muestras biológicas individuales dentro de un grupo 3) efecto replicado, que se refiere a los efectos aleatorios de las inyecciones repetidas de la misma preparación de muestra.

Enfoque de la peptidómica para buscar una nueva isoforma de empalme alternativa en los datos de proteómica

Nuestro enfoque de peptidómica para identificar una nueva isoforma de empalme alternativa en los datos de proteómica incluye tres pasos (Figura & # x200B (Figura 1): 1): 1) construir una base de datos sintética de isoformas de empalme alternativas para experimentos de proteómica 2) identificación, caracterización de la isoforma de empalme alternativa usando proteómica y 3) validación de la isoforma de empalme alternativa.


Discusión

En este estudio, examinamos las estructuras de transcripción de longitud completa de isoformas de empalme aberrantes mediante el uso de datos de secuenciación de lectura larga. Construimos un catálogo de tales isoformas para los NSCLC. Para abordar la secuenciación inexacta de MinION, utilizamos datos de secuenciación de lectura corta para identificar las uniones de empalme exactas. Este enfoque reveló un número sustancial de nuevas transcripciones aberrantes y algunas de estas isoformas se detectaron como péptidos mediante el análisis del proteoma. Además, un ensayo ELISpot demostró que al menos algunas de estas isoformas, que tienen una fuerte antigenicidad, tenían el potencial de convertirse en neoantígenos. Estos resultados muestran claramente la capacidad de la secuenciación de lectura larga para buscar nuevas isoformas y neoantígenos que pueden ser pasados ​​por alto por los enfoques actuales de secuenciación de lectura corta.

En el ámbito clínico, la TMB, que está determinada por el número total de mutaciones no sinónimas, se considera un predictor de la eficacia de la inmunoterapia para el cáncer. Sin embargo, la precisión de la predicción no es suficiente para muchos tipos de cáncer. El estudio actual muestra que la isoforma de empalme aberrante y las mutaciones de desplazamiento de marco tienen un potencial significativo para producir un mayor número de neoantígenos. Múltiples informes previos sugieren que este potencial puede tener una influencia en la configuración del panorama inmunológico tumoral de los pacientes, además de la TMB genómica [28, 29, 30]. Cuando los transcriptomas no se pueden examinar directamente en un entorno clínico determinado, el estado de NMD y otros factores de empalme pueden proporcionar información importante. De hecho, informes anteriores han indicado que el número de mutaciones de desplazamiento de marco que se predice que no desencadenarán la ENM es mayor en los que responden a la inmunoterapia y que el factor combinado con la TMB mejora la precisión de la predicción para los que responden a la inmunoterapia [61].

En este estudio, nos centramos principalmente en el NSCLC. Sin embargo, pudimos identificar posibles isoformas aberrantes para otros tipos de cáncer al considerar nuestro catálogo completo. Obviamente, cuando se agreguen más tipos de cáncer al catálogo, la sensibilidad y selectividad de la detección aumentarán aún más. También tenga en cuenta que, dado que GTEx se basa en conjuntos de datos de secuenciación de ARN de lectura corta, la representación de las uniones en GTEx no necesariamente indica la existencia de la isoforma en sus formas de longitud completa en tejidos normales. Para calcular y extraer patrones de isoformas verdaderamente específicos del cáncer, deberíamos generar un conjunto de datos más grande de isoformas de lectura larga para tejidos normales en un estudio futuro. Más análisis en profundidad aclararían la posibilidad de que estas características transcriptómicas proporcionen un indicador complementario para predecir la eficacia de la inmunoterapia, además de las características genómicas.


Discusión

El empalme alternativo del ARN del receptor 5-HT1A humano altera su estabilidad

A pesar de su papel fundamental en la neurotransmisión serotoninérgica y los trastornos del estado de ánimo, la secuencia completa del ARNm de 5-HT1A no se caracterizó por completo. Aunque durante mucho tiempo se consideró un gen "sin intrones" (Fargin et al., 1988 Charest et al., 1993), mostramos que el 5-HT1A 3′-UTR humano se empalma alternativamente en tres isoformas de ARNm que difieren mucho en su estabilidad y traducción. producción. Corroborando nuestros resultados, la variante LS se identificó en las bases de datos RNAseq (lanzamiento 108 de la anotación del Centro Nacional de Información Biotecnológica Homo Sapiens), pero nunca se caracterizó realmente. En roedor HTR1A genes, los sitios aceptores / donantes de empalme están mal conservados y no se detectó empalme (Fig.1D). Por el contrario, la comparación de secuencias del macaco rhesus y las 5-HT1A 3′-UTR humanas muestra una fuerte homología (93% de identidad) y conservación de los sitios de empalme (Fig.1mi), lo que sugiere que el empalme de 5-HT1A puede ocurrir en otros primates. Esto es consistente con la evidencia de todo el genoma de que la incidencia de empalme aumenta con la evolución (Barbosa-Morais et al., 2012 Gueroussov et al., 2015), y la presencia de intrones en el ARNm de 5-HT1A 3′-UTR confiere un Potente mecanismo para la sintonización dependiente del empalme de la expresión del receptor 5-HT1A en primates. La elucidación de los mecanismos específicos de primates o humanos [por ejemplo, mecanismos dependientes de miARN (Lopez et al., 2014)] implicados en la depresión puede proporcionar nuevos objetivos y conocimientos que no se pueden extraer de modelos de roedores.

La presencia de intrones 3'-UTR ocurre en solo el 6% de los genes (Bicknell et al., 2012) y típicamente produce ARNm altamente inestables degradados por NMD. Sin embargo, este no es el caso de las variantes de ARNm de 5-HT1A empalmadas, que son extremadamente estables en comparación con la forma sin empalmar. Por lo tanto, abordamos el papel de miR135 en el empalme inducido HTR1A estabilización, ya que miR135 actúa en un sitio altamente conservado dentro del HTR1A intrón para regular negativamente los niveles de ARN del receptor 5-HT1A (Issler et al., 2014). En las neuronas 5-HT murinas, miR135 es rápidamente inducido por los antidepresivos imipramina y fluoxetina, y la sobreexpresión de miR135 en las neuronas 5-HT regula negativamente el ARN del receptor 5-HT1A y reduce la ansiedad y la depresión en el modelo de derrota social crónica (Issler et al. , 2014). Por el contrario, la eliminación de miR135 en el rafe aumentó la ansiedad y reveló un comportamiento similar a la depresión inducido por el inhibidor selectivo de la recaptación de serotonina (ISRS), al tiempo que previene las acciones ansiolíticas inducidas por los ISRS. Estos hallazgos son consistentes con un papel clave de miR135 en la supresión de la expresión del autorreceptor 5-HT1A y sus consecuencias conductuales. Nuestros datos muestran que HTR1A El empalme evita la desestabilización mediada por miR135 al eliminar el sitio de unión del miRNA. Este hallazgo en el HTR1A 3′-UTR proporciona más evidencia de este nuevo mecanismo para la estabilización del ARN (Mohr y Mott, 2015).

NSR100 y PTBP1 como determinantes del empalme de ARNm de 5-HT1A

Las proteínas de unión de ARN específicas de tejido que promueven o bloquean la inclusión de exones alternativos en las transcripciones de ARN son reguladores importantes del corte y empalme alternativo (Lee y Rio, 2015). Al manipular varios reguladores de empalme enriquecidos en el cerebro y examinar los cambios en el empalme de ARNm de 5-HT1A, encontramos que el empalme de ARN de 5-HT1A es reprimido por PTBP1, pero mejorado por nSR100. Sin embargo, no podemos descartar la posibilidad de que otro factor de empalme aguas abajo de PTBP1 o nSR100 pueda mediar o contribuir a la regulación del empalme del ARNm de 5-HT1A. PTBP1, un represor ubicuo del empalme, está regulado negativamente por miR124 durante la diferenciación neuronal, lo que permite la expresión de PTBP2 y la activación de un programa de empalme neuronal específico (Makeyev et al., 2007). Los bajos niveles basales de empalme de ARNm de 5-HT1A en líneas celulares parecen estar impulsados ​​principalmente por una alta expresión de PTBP1, ya que la eliminación de PTBP1 aumentó HTR1A empalme a pesar de un aumento en PTBP2, un represor más débil del empalme (Markovtsov et al., 2000). Por el contrario, nSR100 promueve la inclusión de una serie de exones neuronales específicos (Raj et al., 2014), y su sobreexpresión en células SKN-SH aumentó los niveles de la variante SS, que no detectamos en el tejido cerebral. Esto sugiere que pueden ser necesarios reguladores de empalme adicionales que no están presentes en las células SKN-SH para un empalme adecuado de 5-HT1A en vivo. Se ha informado de la regulación opuesta del empalme por PTBP1 y nSR100 para otros genes neuronales, incluidos PTBP2 (Calarco et al., 2009 Raj et al., 2014). Nuestros datos sugieren que en las células neuronales, los niveles más bajos de PTBP1 combinados con la presencia de nSR100 promueven la síntesis de la isoforma del ARN 5-HT1A empalmado estable para mejorar los niveles del receptor (Fig.5H), mientras que en las células no neuronales, PTBP1 inhibe fuertemente el corte y empalme y la expresión del receptor. Es importante destacar que las diferencias regionales en los niveles de nSR100 y PTBP1 también parecen afectar el empalme de 5-HT1A en vivo.

Regulación del empalme de ARNm de 5-HT1A en el cerebro humano

De acuerdo con la prevalencia del empalme alternativo en el cerebro humano (Kang et al., 2011), encontramos que HTR1A el empalme en el cerebro humano post mortem fue mayor que en las líneas celulares y fue específico de la región. Específico de la región HTR1A El empalme pareció estar impulsado principalmente por la expresión de nSR100: fue más bajo en el mesencéfalo / hipocampo, donde una baja nSR100 y una alta expresión de PTBP1 se asociaron con un aumento de HTR1A ARN, mientras que los niveles más altos de nSR100 en el PFC se asociaron con un ARNm sin empalmar reducido y proporciones más altas de empalme / sin empalmar (Fig.5H). Si bien nSR100 ha estado fuertemente implicado en el empalme del desarrollo cerebral (Calarco et al., 2009 Irimia et al., 2014 Raj et al., 2014), nuestros resultados sugieren que puede ser importante en la regulación dinámica de la expresión de ARN específica de una región. Además, la reducción del empalme para aumentar la regulación a la baja del ARN 5-HT1A inducida por miR135 (Issler et al., 2014) también podría contribuir a la reducción preferencial en los receptores 5-HT1A observada en el mesencéfalo y el hipocampo después del tratamiento crónico con ISRS en la depresión humana (Gray et al., 2013) y ansiedad, respectivamente (Spindelegger et al., 2009). La especificidad regional de HTR1A El empalme establece un mecanismo novedoso para la regulación diferencial de los receptores 5-HT1A postsinápticos y presinápticos, complementario a los mecanismos transcripcionales (Czesak et al., 2006, 2012).

En la PFC de los individuos deprimidos, hubo una reducción significativa en la relación de corte y empalme, consistente con una reducción en nSR100, aunque la reducción en PTBP1 puede contrarrestar parcialmente el efecto de niveles reducidos de nSR100. Tanto los estudios de imágenes como los post mortem han informado reducciones en los receptores corticales 5-HT1A en la depresión (López-Figueroa et al., 2004 Savitz et al., 2009 Szewczyk et al., 2009), un fenotipo que redujo el empalme de 5-HT1A podría contribuir a . En contraste, los autorreceptores presinápticos 5-HT1A parecen estar regulados positivamente en la depresión (Stockmeier et al., 1998 Boldrini et al., 2008 Hesselgrave y Parsey, 2013), lo que es consistente con su papel en la inhibición de la actividad neuronal 5-HT. Si bien no observamos una reducción significativa en el ARN total de 5-HT1A en el PFC, la mayoría de los estudios muestran cambios muy localizados en los receptores 5-HT1A de la corteza frontal que pueden haberse pasado por alto en el tejido que estudiamos.

Varios humanos HTR1A Los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) están asociados con la depresión (Kishi et al., 2013), incluido el promotor funcional SNP rs6295 C (-1019) G (Lemonde et al., 2003), que se ha asociado con una mayor expresión de 5 Autorreceptores -HT1A (Hesselgrave y Parsey, 2013) y una reducción de los receptores PFC 5-HT1A (Kautzky et al., 2017). Hay varios SNP ubicados proximales a la región empalmada, dos de los cuales están en fuerte desequilibrio de ligamiento con rs6295-C / G: rs6449693 T / C y rs878567 C / T (Donaldson et al., 2016). HTR1A El ARN con el alelo rs878567-C es el alelo expresado con más fuerza en un PFC normal, pero se reduce en un PFC deprimido (Donaldson et al., 2016). Esto sugiere un efecto estabilizador de rs878567-C, quizás aumentando el empalme HTR1A ARN. Sin embargo, HTR1A Los niveles de ARN también están influenciados por la transcripción específica de alelos del promotor SNP rs6295-C (Lemonde et al., 2003). Curiosamente, el rs749099 A / G SNP se encuentra a unos pocos nucleótidos del sitio aceptor de empalme y podría afectar el empalme. Se necesitarán más estudios para abordar el vínculo entre el promotor y los SNP 3'-UTR y su impacto en el empalme de 5-HT1A, los niveles de receptor y la depresión mayor.

En resumen, nuestros datos proporcionan la primera evidencia de alteración HTR1A empalme en la depresión. Otros dos genes serotoninérgicos están regulados por empalme alternativo (HTR2C y TPH2), y el deterioro en sus patrones de empalme se correlaciona con trastornos psiquiátricos (Grohmann et al., 2010 Zhang et al., 2011 Martin et al., 2013). Sin embargo, se desconocen los factores de empalme implicados. Proponemos que los cambios relacionados con la depresión en la expresión o actividad del factor de empalme podrían afectar potencialmente a muchos genes neuronales sujetos a regulación por empalme (Calarco et al., 2009 Raj et al., 2014). Se necesitan más estudios como este para dilucidar los mecanismos que regulan el empalme específico de la región del cerebro y su impacto en la función y la enfermedad del cerebro.


Métodos

Síntesis de resveralogues novedosos

Resveratrol (Sigma Aldrich, Reino Unido 1) se utilizó para sintetizar dihidroresveratrol 2 como se informó anteriormente [47]. (mi) -N- (4- (3,5-dimetoxiestiril) fenil) metanosulfonamida 3 fue sintetizado a partir del análogo nitro-sustituido previamente reportado 7 a través de un Fe / NH4Reducción de Cl para dar amina 8 [26], seguido de sulfonilación con cloruro de metanosulfonilo (Fig. 1b). La amida correspondiente 9 también fue preparado a partir de 8, por acilación con cloruro de acetilo. El producto 9 fue sometido a desmetilación (BBr3, CH2Cl2) para dar el compuesto objetivo (mi) -N- (4- (3,5-dihidroxiestiril) fenil) acetamida 4. (mi) -5- (4- (3,5-dimetoxiestiril) fenil) -1H–Tetrazol 5 y el isomérico 2-1H-análogo de tetrazol 6 se prepararon directamente mediante cicloadición catalizada por ácido con iones azida de los 4 y 2-cianoestilbenos [26] (10 y 11 respectivamente). (Fig.1b) Los detalles de la síntesis, purificación y caracterización de los resveralogues se dan en el archivo adicional 8.

Determinación de la activación de la enzima SIRT1

La actividad de la enzima SIRT1 se midió utilizando el kit de descubrimiento de fármacos fluorométrico SIRT1 (Cayman Chemicals, Michigan, EE. UU.) De acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este ensayo es un ensayo de cribado fluorescente directo estándar para SIRT1 ex vivo y es esencialmente una variante del conocido sistema "fluor de lys". Para determinar la capacidad relativa de cada resveralogue para activar la enzima, solución de 25 μM de cada compuesto (norte = 3) se preincubó con la enzima y los cofactores antes de medir la actividad. La cuantificación se logró midiendo la salida en λex = 360 nm y λem = 460 nm. Cada placa incluía mediciones de fondo y controles de enzima solamente. Los datos se presentan como cambio de veces (media ± de) en la actividad normalizada a solo enzima y resveratrol 1, de modo que 0 no representa activación y 1,0 indica activación equivalente a la observada con resveratrol 1.

Determinación de la citotoxicidad de la biblioteca resveralogue

Se utilizó un ensayo comercial de liberación de LDH (kit de ensayo de citotoxicidad de LDH Pierce) para determinar la muerte celular. Brevemente, las células MRC5 (con duplicación de población (PD) = 45) se sembraron en placas de 24 pocillos a 1,3 × 10 5 células / cm 2 y se dejaron recuperar de la tripsinización durante 24 h y luego se expusieron a cada uno de los resveralogues (3 réplicas biológicas × 3 concentraciones 10, 50 y 100 μM) durante 24 h más. Luego se mezclaron 50 µl de medio de cada pocillo con un volumen igual de mezcla de reacción de ensayo de LDH y se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 min. Se añadieron 50 µl de solución de parada de ensayo de LDH a cada pocillo y se midió la absorbancia de la solución mediante espectrofotometría a 490 nm. La lisis completa y el vehículo solo se incluyeron los controles positivos y negativos. Los datos se presentan como media (+/− desviación estándar)% del control de lisis total.

Cultivo de fibroblastos primarios humanos (NHDF, MRC-5 y HF043)

En este estudio se utilizaron cepas de células de fibroblastos de tres orígenes genéticos y dos linajes: fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF Heidelburg, Alemania), fibroblastos pulmonares fetales diploides humanos (MRC-5 Coriell Institute for Medical Research) y fibroblastos de prepucio neonatal (HF043 Dundee Cell Productos, Reino Unido). Las condiciones de cultivo estándar fueron una densidad de siembra de 6 x 104 células / cm 2 en medio (C-23020, Promocell, Heidelburg, Alemania) que contenía penicilina y estreptomicina al 1%, y una mezcla de suplemento específico para fibroblastos que consistía en suero de ternero fetal (3 % v/ v), factor de crecimiento de fibroblastos recombinante (1 ng / ml) e insulina humana recombinante (5 μg / ml) (Promocell, Heidelburg, Alemania). Para los ensayos que requieren cultivos senescentes, se contaron las células y se sembraron cantidades iguales de células en cada pase hasta que el crecimiento del cultivo se redujo a menos de 0,5 PD / semana como se describió anteriormente [2] (esto ocurrió en PD = 64 (NHDF), 65 (MRC-5) y 64 (HF043). El número de células viables se determinó en cada pase mediante tinción con azul tripán. Para cultivos desarrollados en condiciones de privación de suero, las células se mantuvieron en DMEM (Sigma Aldrich, Dorset, Reino Unido) suplementado con 0,1% de suero y penicilina y estreptomicina al 1% en ausencia de suplemento específico de fibroblastos, durante 24 h antes del tratamiento.

Cuantificación de la secreción de citocinas clave

Se sembraron células NHDF de un cultivo senescente a 6 x 104 células / cm 2 en una placa de 6 pocillos en medio sin suero, y después de 10 días se trataron con 5 μM de cada uno de 1–6 durante 24 h. A continuación, se recogieron los sobrenadantes celulares y se almacenaron a -80 ° C. Los niveles de 9 citocinas (GMCSF, IFNγ, IL1β, IL2, IL6, IL8, IL10, IL-12p70 y TNFα) en sobrenadantes celulares de células de control tratadas y solo con vehículo se determinaron mediante el inmunoensayo ELISA multiplex K15007B MesoScale Discovery (MSD, Rockville, EE. UU.) En 11 réplicas. Las proteínas se cuantificaron en relación con una curva estándar utilizando un Sector Imager SI-6000 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos se presentan como media (+/− SEM).

Perfil de expresión de la expresión del factor de empalme en cultivos de células senescentes

Las células NHDF se sembraron a 6 x 104 células / cm 2 en placas de 6 pocillos, se dejaron crecer durante 10 días y luego se trataron con 5 μM de cada compuesto durante 24 h en 3 réplicas biológicas, con controles de solo vehículo (DMSO). Resveratrol 1 el tratamiento agudo fue a una dosis inicial de 5 µM, seguido de cultivo sin tratamiento adicional durante 4 semanas. Para los regímenes de tratamiento crónico, se añadió resveratrol (o vehículo DMSO) una vez cada 48 h durante 4 semanas. 20 transcripciones de factor de empalme que se asociaron con la edad y la senescencia replicativa en nuestro trabajo anterior [1, 2] fueron seleccionadas a priori para su evaluación aquí. (Los identificadores de ensayo están disponibles a pedido). El ARN se extrajo usando 1 ml de reactivo TRI® (Life Technologies, Foster City USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN total (100 ng) se transcribió de forma inversa en reacciones de 20 μl utilizando el kit Superscript III VILO (Life Technologies, Foster City, EE. UU.). A continuación, la expresión de la transcripción se cuantificó por triplicado para cada réplica biológica utilizando TaqMan Low Density Array (TLDA) en la plataforma ABI-Prism 7900HT. Las condiciones de los ciclos fueron 1 ciclo cada uno de 50 ° C durante 2 min, 94,5 ° C durante 10 min y luego 40 ciclos de 97 ° C durante 30 sy 57,9 ° C durante 1 min. Las mezclas de reacción incluían 50 μl de TaqMan Fast Universal PCR Mastermix (Life Technologies, Foster City, EE. UU.), 30 μl de dH2O y 20 μl de plantilla de ADNc. Se dispensaron 100 µl de mezcla de reacción en la cámara de tarjetas TLDA y se centrifugaron dos veces durante 1 min a 1000 rpm para asegurar la distribución correcta de la solución en cada pocillo. La expresión de la transcripción se evaluó mediante el enfoque comparativo Ct, en relación con el IDH3B, GUSB y PPIA genes de control endógenos, seleccionados sobre la base de evidencia empírica de estabilidad con la edad en nuestros primeros datos de microarrays [1] y con senescencia celular en nuestro trabajo anterior [2]. La expresión de la transcripción se expresó en relación con el nivel de expresión del factor de corte y empalme en las células de control tratadas con vehículo.

Assessment of total gene expression and alternative splicing for senescence-related genes

To assess gene expression and splicing, NHDF cells were seeded at 6 × 10 4 cells/cm 2 in 6 well plates and after 10 days were treated with 5 μM of each compound for 24 h in 3 biological replicates. Target transcripts included the known age-related genes CDKN2A, CDKN1A, TP53, MTOR, CHK1 y CHK2. Probes specific to particular isoforms or groups of isoforms were designed to unique regions of the transcripts in question. Assays were validated by standard curve analysis of 7 serial 1:2 dilutions of pooled cDNA and proved robust and sensitive with an average efficiency of −3.4 and an average r 2 for reproducibility between replicates of 0.87. PCR reactions contained 2.5 μl TaqMan Universal Mastermix (no AMPerase) (Applied Biosystems, Foster City, USA), 0.9 μM each primer, 0.25 μM probe and 0.5 μl cDNA reverse transcribed as above in a total volume of 5 μl in a 384 well plate. PCR conditions were a single cycle of 95 °C for 10 min followed by 40 cycles of 95 °C for 15 s and 60 °C for 1 min. We also measured the total expression of the ATR, ATM. RB1, SIRT1 y SIRT2 genes. Probe and primer details are available on request. Each biological replicate was tested in triplicate. Isoform-specific and total expression changes were examined for statistical significance by two way ANOVA analysis using SPSS v.22 (IBM, USA).

Catalytic histochemical determination of SA β-gal positive fraction

Senescence marker SA β-Gal was assayed in triplicate using a commercial kit (Sigma Aldrich, UK) according to manufacturer’s instructions, with a minimum of 400 cells assessed per replicate.

QRTPCR measurement of transcripts of senescence associated genes

Molecular markers of senescence (CDKN2A y CD248 transcript levels) were measured by qRTPCR relative to the GUSB y PPIA endogenous control genes, on the ABI Prism 7900HT platform. PCR conditions and analysis were as previously described [2].

Live cell capture microscopy

For live capture microscopy, cells were seeded at a density of 5 × 10 4 cells per 35 mm glass bottomed dish (World Precision Instruments, USA) in 2 ml of media. They were then imaged on a Leica Axiovert inverted environmental microscope with heated chamber (37 °C) and CO2 capacidades. An image was taken every 10 min over the course of 92 h. A 20× objective was used with a 30 mS shutter speed and 10% light intensity from a widefield white light source for each image giving optimal contrast and minimal light exposure. Images were analysed using Leica LAS X software.

Determination of cell proliferation

Senescent cultures of each strain were seeded at 6 × 10 4 cells/cm 2 into 6-well plates and cultured for 10 days then treated with 5 μM of each compound for 24 h. Cell counts in three replicates of treated and vehicle-only cultures were carried out manually following trypsinisation and suspension of cells and are presented as mean (+/−SEM).

Immunocytochemical determination of Ki67 positive fraction

Proliferation index was assessed by using Ki67 staining on NHDF cells. Cells were seeded at 1 × 10 4 cells/coverslip and after 10 days were treated with 5 μM of each compound for 24 h in 3 biological replicates. Cells were fixed for 10 min with 4% PFA and permeabilized with 0.025% Triton and 10% serum in PBS for 1 h. Cells were then incubated with a rabbit monoclonal anti-Ki67 antibody (ab16667, Abcam, UK) at 1:200 overnight at 4 °C followed by FITC-conjugated secondary goat anti-rabbit (1:400) for 1 h, and nuclei were counterstained with DAPI. Coverslips were mounted on slides in DAKO fluorescence mounting medium (S3023 Dako). The proliferation index was determined by counting the percentage of Ki67 positive cells from at least 400 nuclei from each biological replicate at 400× magnification under a Leica D4000 fluorescence microscope.

Assessment of apoptosis using TUNEL assay

Terminal DNA breakpoints in situ 3 - hydroxy end labeling (TUNEL) was to quantify levels of apoptosis in NHDF cells. Cells were seeded at 1 × 10 4 cells/cm 2 in 6 well plates and after 10 days were treated with 5 μM of each compound for 24 h in 3 biological replicates. The TUNEL assay was performed with Click-iT® TUNEL Alexa Fluor® 488 Imaging Assay kit (Thermofisher, UK) following the manufacturer’s instructions. Negative and positive (DNase1) controls were also performed. The apoptotic index was determined by counting the percentage of positive cells from at least 400 nuclei from each biological replicate at 400× magnification.

Assessment of apoptosis by assessment of Caspase 3 and 7 activity

Caspase-3 and-7 activities were assessed as secondary measures of apoptosis. Cells were seeded (1000 cells per well) in a white-walled 96-well plate and then treated with 5 μM of each compound for 24 h in 11 biological replicates alongside vehicle-only controls. Caspase-3 and -7 activities in the supernatants were then measured by Caspase-Glo 3/7 assay (Promega, Madison, WI, USA) following the manufacturer’s instructions. Luminescence was measured by using a BMG Pherastar FSX.

Moderation of ERK signalling pathway with inhibitors and agonists

The role of ERK signalling in reversal of senescence was investigated using agonists (ceramide) and inhibitors (trametinib) of the ERK pathway. Cells from a senescent culture were seeded at 6 × 10 4 cells/cm 2 in a 6 well plate in serum free media, and after 10 days were treated with 1-20 μM of the ERK inhibitor trametinib (LC laboratories, Woburn, USA for 24 h hours, or with the ERK agonist N-Acetyl-D-sphingosine (C2-ceramide Sigma Aldrich, UK) at 20 μM for 24 or 120 h. To examine the role of ERK signalling in resveralogue-induced rescue of senescence, HNDF cells were treated with 20 μM of the ERK agonist C2-ceramide as above, but with the addition of 5 μM resveralogue for 24 h.

Assessment of telomere length in resveratrol treated cells

DNA was extracted from 2 × 10 5 NHDF cells treated with 5 μM resveralogue for 24 h, using the PureLink® Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen™/Thermo Fisher, MA, USA) according to the manufacturer’s instructions. DNA quality and concentration was checked by Nanodrop spectrophotometry (NanoDrop/Thermo Fisher, MA, USA). Relative telomere length was assessed by a modified qPCR protocol [48]. PCR reactions contained 1 μl EvaGreen (Solis Biodyne, Tartu, Estonia), 2 μM each primer and 25 ng DNA in a total volume of 5 μl in a 384 well plate. PCR conditions were a single cycle of 95 °C for 15 min followed by 45 cycles of 95 °C for 10 s, 60 °C for 30 s and 72 °C for 1 min. Telomere length was calculated using the comparative Ct approach relative to the 36B4 housekeeping gene and normalised to the quantification from untreated cells. Three biological replicates were tested and each was assessed in triplicate.

Análisis estadístico

Unless otherwise indicated, differences between treated and vehicle-only control cultures were assessed for statistical significance by two way ANOVA analysis using SPSS v.22 (IBM, USA).


Discusión

Global splicing changes in cancer have been studied using microarray or RNA-seq techniques in the past [14,15,16]. Compared to microarray (eg. Affymatrix Exon Array), RNA-seq can more precisely measure the splicing changes because the reads covering the exon-exon junction directly represent the splicing choice. Usually, a PSI value can be calculated based on the read counts of the upstream junction, downstream junction and the junction skipping the exon (eg. Fig. 1a). In this study, we used two additional approaches (PSI_junc5’ and PSI_junc3’) to calculate the PSI values (Fig. 2a-b). The two approaches have the advantage to deal with more complex splicing events like in CD44, nine consecutive alternative exons can be partially included, or all excluded. Using regular PSI exon method, only exon v10 was found to be significantly included in CRC. However, combining with the two additional PSI analysis, we concluded that the isoform CD44v8–10 is upregulated in CRC. The PSI_junc5’ and PSI_junc3’ approaches can also be used to study alternative last exons and alternative first exons, respectively. In this study, we identified 5 alternative first exon events in CRC or metastasis tissues. Except for HNF4A, none of the other four events was reported previously. The results indicated that the new approaches could identify novel splicing events. Interestingly, using the same approach, we did not identify any significant alternative last exon events. This may indicate that the transcription-coupled alternative first exon choices play a more important role in CRC compared to alternative polyadenylation-coupled last exon choices.

The exon4-skipping isoform of CLK1, predominantly expressed in NC samples, matches the isoform 3 transcript from Refseq annotation. Interestingly, isoform 3 is annotated as a non-coding transcript because skipping the 91 nt exon 4 is predicted to cause out-of-frame translation and the nonsense mediated decay (NMD) of the transcript (Fig. 1c). The increase of exon4-inclusion isoform (isoform 1) at the expense of isoform 3 in CRC and MC may thus increase the productive transcript level of CLK1 and potentially produce more proteins. CLK1 encodes a member of the CDC2-like family of protein kinases (CLKs). In the cell nucleus, CLKs phosphorylate serine/arginine-rich proteins, release them into the nucleoplasm and then regulate AS of genes. Small molecule inhibitors against these CLKs were developed and exhibited growth suppression, apoptosis induction and anti-tumor effect [40, 41]. Here, we found that CLK1 itself can be alternatively spliced. CRC cells may increase the CLK1 expression by regulating the inclusion of exon 4. Other CLKs (CLK2, CLK3 and CLK4) are also expressed in CRC and normal tissues from the RNA-seq data we analyzed. It’s unclear whether the CLK1 splicing change in CRC have a major functional impact of CLKs or not. If the function of this splicing event can be validated by further evidences, exon 4 skipping could be a new target for cancer therapy.

The splicing change of the exon 6 of COL6A3 has been reported previously in colon, bladder, prostate and pancreatic cancers tissues compared to normal tissues [14, 42], indicating that the splicing change may play a role in multiple cancer types. High expression of COL6A3 in stroma were associated with poor prognosis in CRC [43]. The percent of stromal cells does not correlate with the junction usage of COL6A3 (Supplementary Table 2, 8), excluding the possibility that the splicing events is caused by the variability of stroma content in tumor tissues. COL6A3 was also found to be a key hub gene in the cell migration/extracellular matrix module that was associated with poor prognosis in CRC [44]. COL6A3 knockout decreases cell proliferation and invasion, increases cell apoptosis in cancer cell lines [44]. Taken together, the relevance and importance of COL6A3 to CRC tumorigenesis were highlighted. Our finding of exon 6 splicing change added more complexity of the role of COL6A3 in CRC and this may serve as an additional biomarker in the diagnosis of CRC.

The expression of alternatively spliced CD44 adhesion molecules has been implicated in the pathogenesis and metastasis of colorectal cancer. mRNA expression, different splice isoform expression or protein isoform expression have been used in different studies. However, the results are usually conflicting. Either positive correlation [27, 45,46,47,48] or no correlation [49] to CRC or metastasis has been reported. Our study suggests that isoform CD44v8–10 is upregulated in CRC and liver metastasis tissue with relative downregulation of CD44s. However, metastasis did not show further increase of CD44v8–10 compared to CRC. Therefore, CD44v8–10 or maybe the ratio of CD44v8–10/CD44s could be used as a CRC biomarker.

We identified four genes (ARHGEF9, CHEK1, HKDC1 and HNF4A) with alternative first exon regulation in CRC. Although some studies indicated that many of these genes are linked to tumorigenesis or metastasis, the detailed functions of these splicing events in CRC have not been reported. ARHGEF9 has been shown to play a role in tumor cell migration, invasion and metastasis by linking oncogene CHD1L and Cdc42 pathway in hepatocellular carcinoma (HCC) [50]. HKDC1 encodes the hexokinase domain containing 1, which catalyzes the phosphorylation of glucose. Its high expression in hepatocarcinoma (HCC) is related to poor overall survival (OS) [51]. And it is also predicted to be a novel therapeutic target in lung cancer [52]. CHEK1 contributes to CDC25C-mediated Docetaxel resistance and can also be a therapeutic target in prostate cancer [53]. In HNF4A gene, the promoter P1 driven isoforms (expressing exon 1A) were decreased in CRCs and MCs compared to the promoter P2-driven isoforms (expressing exon 1D) (Fig. 3d, supplementary Figure 7). It was reported that P1-HNF4a is expressed primarily in the differentiated compartment of the mouse colonic crypt and P2-HNF4a in the proliferative compartment. The mice that could only produce P2-HNF4a experienced more colitis and developed more tumors than normal mice [54]. Taken together, the splicing changes of these genes identified in this study may contribute to tumorigenesis and can be better biomarkers than gene expression in CRC.

In this study, AS of two genes (SERPINA1 and CALD1) were found to be associated with metastasis. For SERPINA1, although the two splice isoforms have the same start codon in exon 4, their different 5’UTR sequences may contribute to different RNA decay or protein translation of the gene. Elevated expression of SERPINA1 has been associated with the advanced stage, lymph node metastasis, poor prognosis and shorter overall survival in CRC [55] and gastric cancer [56]. For CALD1 exon 6 skipping, the same splicing event was reported to be present in colon, bladder and prostate tumors compared to normal tissues [14]. The isoform expressed in metastatic CRC samples matches the low-molecular-weight isoforms (L-CAD), specifically encoded by WI-38 L-CAD II (transcript variant 2). The same isoform was significantly associated with poorer prognosis in urothelial bladder carcinoma (BC) [57]. L-CaD was also linked to lymph node metastasis and poorer prognosis in oral cavity squamous cell carcinoma (OSCC) [58].

The logistic regression analysis generated 17 models using 2 or 3 junctions as predictors with an average AUC above 0.99. This indicated that the splicing events identified here can be used as potential diagnosis biomarkers in CRC. It remains unclear whether the splicing events can be detected in circulating tumor cells. Although doing RNA-seq using patient samples is not feasible in the clinical setting, easier experimental approaches, such as RT-qPCR, NanoString, or AmpliSeq can be designed using as few as two or three genes of the 8 genes identified in this study.

We have identified two genes (COL6A3 and HKDC1) with AS associated with overall survival. The high gene expression of COL6A3 in stroma has been linked to poor overall survival in CRC [43], while high expression of gene HKDC1 is related to poor overall survival in hepatocarcinoma [51]. However, it’s still unclear whether the splicing isoforms of these two genes have the same functions. It might suggest that the splice isoforms have variable functions in different cancer types. More data is required to illustrate the functional link between the isoforms and patient survival.

Zong et al. have developed a prognostic predictors model using AS pattern of 13 genes identified from TCGA data [59]. However, normal tissue controls had not been used in that study. It’s not clear whether those splicing events are different in normal tissues.


Discusión

The first evidence of the in vivo importance of FN was demonstrated by R. Hynes's group who showed that FN-null mice die during embryonic development (George et al., 1993). The early embryo lethality makes it difficult to study the biological functions of FN in the in vivo models. Therefore, one of the best methodologies to study the function of FN is by selective modification of the gene. Along with this line, Sakai et al. (2001) described a mouse model lacking pFN which showed increased neuronal apoptosis and larger infarction areas after transient focal cerebral ischemia. In an attempt to elucidate the role of the EDB exon, mice lacking this exon were also produced, but showed no obvious abnormalities in vivo (Fukuda et al., 2002).

We have investigated the in vivo role of the EDA exon by constructing mouse strains unable to carry out EDA exon alternative splicing. The EDA +/+ strain showing constitutive expression of the EDA exon in all tissues was obtained without any modification of the coding sequences and gene structure. This novel approach avoided the difficulties found in a previous attempt to produce animals devoid of alternative splicing of the EDB exon in the FN gene where the modification of the gene structure through the introduction of a selection cassette within the introns produced an FN-null allele (Georges-Labouesse et al., 1996). A similar phenomenon has recently been observed in other genes (Lewandoski, 2001). None of these negative effects was observed in our mutant mice, indicating that the insertion of loxP sites within the flanking introns did not modify the normal pre-mRNA transcription and processing.

Moreover, we observed no obvious embryonic mortality nor malformation in any of the homozygous mutant mice analyzed (EDA +/+ and EDA −/− animals), suggesting that the alternative splicing regulation of the EDA exon is not essential for the developmental processes or that it could be compensated by other gene products. The absence of any obvious developmental abnormality in EDA +/+ and EDA −/− mice suggests that the information and postulated roles for the EDA exon obtained by using recombinant FN fragments (Introduction) cannot be extended automatically to the in vivo functions where more complex mechanisms are acting.

EDA +/+ mice have decreased levels of FN in all tissues

The observation of decreased levels of FN in adult EDA +/+ mice, but not in embryos and very young mice (<1 mo old) suggests that different control mechanisms of FN levels are acting before and after puberty. This decrease could be due to one of the following explanations or a combination of them: (1) a decrease in FN mRNA levels (2) a decrease in the secretion rate of FN or (3) an increase in extracellular degradation of FN.

A series of experiments have been performed to test which of these mechanisms, if any, was acting in the EDA +/+ mice. Northern blot experiments showed that the mRNA levels were not directly related to FN protein levels (Figs. 3 and 4 and Fig. S3). Protease levels were similar to those of EDA wt/wt , no additional FN degradation products were seen in EDA +/+ tissue extracts, and we were unable to see a decrease of FN levels in in vitro cultured cells derived from adult organs of EDA +/+ mice. The failure to identify the precise cause of the low FN-EDA + levels suggests that an atypical mechanism might be acting. One possibility is that a specific intracellular trafficking mechanism is able to modulate the levels of EDA + FN forms in adult animals. This mechanism was suggested for polarized secretion of FN forms in airway epithelial cells (Wang et al., 1991). It is interesting to note that Schwarzbauer et al (1989) have shown that the IIICS-0/IIICS-0 dimers were not secreted. It is possible that a similar control in the secretion mechanism could also be present for the EDA + subunits.

However, none of these effects was obvious in cultured fibroblasts from embryos and adult animals, and in the early stages of development of mice. In fact, the decrease in the amount of FN was evident only after 2–3 mo of age, which is after sexual development. Alternatively, a down-regulation of specific tissue inhibitors of MMPs in adult animals would have as its consequence an increase in activity of specific MMPs, a subtle change that direct gelatin zymography analysis will not detect.

Cutaneous wound healing is abnormal in EDA −/− mice

Initially, up to 3 d after wounding, there were no differences in the healing process between the three genotypes (EDA wt/wt , EDA −/− , and EDA +/+ ). This seems to be consistent with the fact that in the first days after wounding, deposited FN is mainly derived from plasma (Clark et al., 1983 ffrench-Constant et al., 1989). It was shown that normal wound healing could be helped by the presence of cFN (ffrench-Constant et al., 1989 Sakai et al., 2001). In fact, in mice devoid of pFN, normal wound healing was reported (Sakai et al., 2001). cFN is produced in situ 3 d after wounding (Clark et al., 1983 ffrench-Constant et al., 1989 Sakai et al., 2001) and a thin layer of cFN deposited on the surface of the wound immediately after injury in pFN-null mice (Sakai et al., 2001). Expression of cFN by the cells found at the base and edges of the wound just beneath the epidermis was observed, and the presence of cFN preceded the migration of epithelial cells that eventually covered the wound (ffrench-Constant et al., 1989). Previous studies have also shown that FN appears in the provisional matrix beneath the migrating epidermis coordinating with the FN-receptor expression on migrating epidermal cells (Clark et al., 1982, 1983 Grinnell, 1984). These data correlate perfectly with our results showing that after that period, despite the formation of granulation tissue and neovascularization, we observed abnormal reepithelization in EDA −/− mice. The granulation tissue of the EDA −/− wounds displayed edematous regions that occur before the ulcerative process. The subsequent epidermal ulceration was accompanied by a proliferative stimulus with the influx of polymorphonuclear leukocytes and macrophages, and a delay in the healing of the wounds. Possible reasons for these phenomena could be related to defects in the basal lamina, a change in integrin receptor levels, and/or a defect in the skin keratinocytes, fibroblasts, or immune system. The basal lamina looked similar in EDA −/− mice compared with EDA wt/wt mice by both Azan-Mallory coloration and the specific immunostaining of laminin. However, we cannot rule out minor differences in one of the other specific proteins that are present in the basal lamina. Moreover, similar levels of α9β1 integrin, one of the EDA receptors (Liao et al., 2002), were observed in skin of the three genotypes. Preliminary attempts to define differences between the EDA wt/wt and EDA −/− genotypes in immune system cells (T/B lymphocytes ratio and delayed hypersensitivity) and in the characteristics of fibroblasts (in vitro cell migration, cell adhesion, and duplication time) failed to show significant differences. However, it remains to be seen if the localization pattern of the integrin receptors or their signaling have been affected in the mutant mice.

The increase in ulceration in the EDA −/− wounds could be the result of a higher rate of cell death in the skin of the mice during wound closure. This does not seem to be the case as the number of positive cells between the EDA wt/wt , EDA −/− , and EDA +/+ wounds in the granulation tissue were similar in the area devoid of ulceration by both TUNEL and caspase-3 assay.

On the basis of these considerations and the data described in Results, we conclude that FN containing the EDA segment plays an essential role in the organization of the granulation tissue and probably in epidermal cell migration, either directly or by interaction with other ECM components.

EDA +/+ and EDA −/− mouse strains have a shorter lifespan

It has been shown that deficiency of SH2-containing inositol-5-phosphatase, lysosomal acid lipase, and DNA topoisomerase IIIβ had no consequences in embryonic development, but shortens the lifespan of the animals (Helgason et al., 1998 Du et al., 2001 Kwan and Wang, 2001). The shortened lifespan could be due to the changes in biological processes, which require the presence of the investigated protein during aging.

In the case of the FN mice, we showed that the absence of regulation of the EDA exon affects the lifespan of mutant animals. In normal animals, a dramatic change in the EDA + /EDA ratio is observed after birth and a gradual decrease of EDA inclusion is observed in the tissues that increases with the age of the animal (Magnuson et al., 1991 Pagani et al., 1991). Alternative splicing of FN is regulated at both the extracellular (ffrench-Constant, 1995 Kornblihtt et al., 1996 Boyle et al., 2000) and the molecular levels (Mardon et al., 1987 Lavigueur et al., 1993 Caputi et al., 1994 Muro et al., 1999). The mutant EDA +/+ and EDA −/− mice have no regulation of splicing of the EDA exon. It was possible that some biological processes that required specific EDA + /EDA − ratios of FN were altered because of the absence of regulation of EDA splicing. In fact, this was shown in this paper for the specific case of cutaneous wound healing in the EDA −/− mice. Furthermore, the low healing efficiency was exacerbated in older mice. In a similar fashion, other maintenance and tissue repair mechanisms could be affected, and the cumulative lower efficiency may result in a decrease in the lifespan of mutant animals. In the specific case of the EDA +/+ mice, due to the dramatic reduction in FN levels in most organs, it remains unclear whether the shortened lifespan seen in EDA +/+ mice was due to a change in FN quantity and/or quality. Although no significant differences have been reported on the lifespan of c129 and C57BL/6 (Smith et al., 1973 Goodrick, 1975 Kunstyr and Leuenberger, 1975), we cannot formally rule out that the differences in chromosome background at the FN EDA locus (C57BL/6 for the EDA wt/wt and c129 with one or two loxP sites for EDA −/− and EDA +/+ , respectively) could be responsible for the observed differences in lifespan.

In summary, we generated mice devoid of regulated splicing at the EDA exon of the FN gene. Surprisingly, both mouse strains showed that the alternative splicing at the EDA exon was dispensable during embryonic development, but it was necessary for a normal lifespan. Moreover, mice unable to incorporate the EDA exon in the FN protein displayed abnormal skin wound healing. On the other hand, mice having constitutive inclusion of the EDA exon showed an important decrease in the FN levels in all tissues.

The results presented here are important for three reasons: first, we presented a novel method to study the function of protein isoforms second, we added valuable information regarding the function of the FN isoforms and third, we showed that changes in the regulation of splicing are responsible for subtle changes in the phenotype that may be present, but undetected, in human pathologies.


Nonsynonymous Mutations

Nonsynonymous mutations have a much greater effect on an individual than a synonymous mutation. In a nonsynonymous mutation, there is usually an insertion or deletion of a single nucleotide in the sequence during transcription when the messenger RNA is copying the DNA. This single missing or added nucleotide causes a frameshift mutation which throws off the entire reading frame of the amino acid sequence and mixes up the codons. This usually does affect the amino acids that are coded for and change the resulting protein that is expressed. The severity of this kind of mutation depends on how early in the amino acid sequence it happens. If it happens near the beginning and the entire protein is changed, this could become a lethal mutation.

Another way a nonsynonymous mutation can occur is if the point mutation changes the single nucleotide into a codon that does not translate into the same amino acid. A lot of times, the single amino acid change does not affect the protein very much and is still viable. If it happens early in the sequence and the codon is changed to translate into a stop signal, then the protein will not be made and it could cause serious consequences.

Sometimes nonsynonymous mutations are actually positive changes. Natural selection may favor this new expression of the gene and the individual may have developed a favorable adaptation from the mutation. If that mutation occurs in the gametes, this adaptation will be passed down to the next generation of offspring. Nonsynonymous mutations increase the diversity in the gene pool for natural selection to work on and drive evolution on a microevolutionary level.


Ver el vídeo: The different types of mutations. Biomolecules. MCAT. Khan Academy (Junio 2022).