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¿Cuál es la razón detrás de la elección del gen reportero cuando se experimenta con el gen de interés?

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Noté en experimentos de ejemplo en clase que se eligen diferentes genes informadores para insertarlos cerca del gen de interés para probar si el gen se expresa o no. Por ejemplo, puede insertar el gen de fluorescencia junto al gen de interés para saber si se transcribe o no según si las células del organismo son fluorescentes y en qué grado lo hacen.

He notado en algunos experimentos que tienen múltiples versiones que en un caso usan el gen fluorescente y en el siguiente un gen diferente (por ejemplo, lactosa). Ambas partes del experimento usan casi exactamente los mismos pasos, entonces, ¿por qué no elegirían el mismo gen informador?


Los diferentes genes servirán para diferentes propósitos. Por ejemplo, si desea realizar estudios de colocalización, entonces los genes fluorescentes como eGFP y DS-Red (o cualquier variación de ellos, es decir, Emerald, mCherry, etc.) serán bastante útiles, ya que puede usar diferentes filtros en su microscopio para el varios fluoróforos. Para las evaluaciones morfológicas, quizás un gen LacZ o una fosfatasa alcalina puedan ser más adecuados, ya que la detección de estas enzimas es compatible con las técnicas histológicas estándar y normalmente se obtiene un contraste mucho mejor que con la fluorescencia. Para propósitos de cuantificación, probablemente usaría luciferasa de luciérnaga o CAT, ya que existen muy buenos ensayos cuantitativos para estas enzimas.

La decisión también dependerá del grado de experiencia del laboratorio con cada técnica de detección e incluso de la disponibilidad de los constructos. Si el laboratorio de al lado ya ha creado un reportero y se ajusta a sus necesidades, simplemente lo usará, en lugar de crear el suyo propio, incluso si el gen reportero no hubiera sido su primera opción.


Los genes informadores también se utilizan cuando el experimento intenta distinguir el efecto de ese gen que introduce el científico (exógeno) y el mismo gen que ya tiene la célula (endógeno). Idealmente, a uno le gustaría elegir un sistema celular que no contenga genes endógenos de interés debido a este efecto de confusión, pero no siempre es factible.

Los genes informadores también se utilizan principalmente cuando es imposible o muy difícil medir directamente un gen de interés, especialmente si el gen es relativamente oscuro en la literatura científica. Por ejemplo, las células que no expresan un gen de timidina quinasa son imposibles de visualizar mediante tomografía por emisión de positrones. No es porque haya algo malo con el gen de interés, solo que las células necesitan una forma de retener un agente radiactivo que pueda ser detectado por la máquina PET. Del mismo modo, los genes fluorescentes se utilizan con mucha frecuencia porque a menudo es necesario ver dónde se encuentra el producto génico dentro de la célula, y la única forma de hacerlo es combinarlo con algo visible al microscopio que le permita ver la fluorescencia y la célula. estructuras. Por último, un gen indicador se utiliza a menudo cuando el gen de interés es difícil de detectar debido a las limitaciones de los anticuerpos comerciales o los kits de detección, y el indicador, que se usa con mucha frecuencia, es fácil de detectar con productos y anticuerpos comerciales.


Los genes informadores se han convertido en una herramienta invaluable en los estudios de expresión génica. Un gen consta de dos partes funcionales: una es una secuencia de ADN que proporciona la información sobre la proteína que se produce (región codificante). La otra parte es una secuencia de ADN específica ligada a la región codificante; regula la transcripción del gen (promotor). El promotor activa o suprime la expresión del gen. El propósito del ensayo del gen informador es medir el potencial regulador de una secuencia de ADN desconocida, por lo que es muy útil, es una especie de ingeniería inversa de la función y luego permite saber qué hace exactamente.


Mancha del norte

Con la transferencia Northern es posible observar el control celular sobre la estructura y la función determinando las tasas de expresión génica particulares durante la diferenciación y morfogénesis, así como en condiciones anormales o enfermas. [4] La transferencia Northern implica el uso de electroforesis para separar las muestras de ARN por tamaño y la detección con una sonda de hibridación complementaria a parte de la secuencia objetivo o a la totalidad de la misma. El término "transferencia Northern" en realidad se refiere específicamente a la transferencia capilar de ARN desde el gel de electroforesis a la membrana de transferencia. Sin embargo, el proceso completo se denomina comúnmente transferencia Northern. [5] La técnica de Northern blot fue desarrollada en 1977 por James Alwine, David Kemp y George Stark en la Universidad de Stanford, [6]. La transferencia Northern toma su nombre de su similitud con la primera técnica de transferencia, la transferencia Southern, llamada así por el biólogo Edwin Southern. [2] La principal diferencia es que el ARN, en lugar del ADN, se analiza en la transferencia Northern. [7]


Contenido

Iniciada por Stanley Fields y Ok-Kyu Song en 1989, la técnica fue diseñada originalmente para detectar interacciones proteína-proteína utilizando el activador transcripcional Gal4 de la levadura. Saccharomyces cerevisiae. La proteína Gal4 activó la transcripción de un gen involucrado en la utilización de galactosa, que formó la base de la selección. [4] Desde entonces, el mismo principio se ha adaptado para describir muchos métodos alternativos, incluidos algunos que detectan interacciones proteína-ADN o interacciones ADN-ADN, así como métodos que utilizan diferentes organismos hospedadores como Escherichia coli o células de mamífero en lugar de levadura. [3] [5]

La clave para la selección de dos híbridos es que en la mayoría de los factores de transcripción eucariotas, los dominios de activación y unión son modulares y pueden funcionar en proximidad entre sí sin unión directa. [6] Esto significa que aunque el factor de transcripción se divide en dos fragmentos, aún puede activar la transcripción cuando los dos fragmentos están conectados indirectamente.

El enfoque de cribado más común es el ensayo de dos híbridos de levadura. En este enfoque, el investigador sabe dónde se encuentra cada presa en el medio utilizado (placas de agar). En la última década se han examinado millones de interacciones potenciales en varios organismos utilizando sistemas de detección de alto rendimiento (a menudo con robots) y se han detectado y categorizado en bases de datos como BioGRID más de miles de interacciones. [7] [8] Este sistema a menudo utiliza una cepa de levadura modificada genéticamente en la que falta la biosíntesis de ciertos nutrientes (generalmente aminoácidos o ácidos nucleicos). Cuando se cultiva en un medio que carece de estos nutrientes, la levadura no sobrevive. Se puede hacer que esta cepa de levadura mutante incorpore ADN extraño en forma de plásmidos. En el cribado de dos híbridos de levadura, se introducen simultáneamente plásmidos de cebo y presa separados en la cepa de levadura mutante o se utiliza una estrategia de apareamiento para obtener ambos plásmidos en una célula huésped. [9]

El segundo enfoque de alto rendimiento es el enfoque de selección de bibliotecas. En esta configuración, las células que albergan el cebo y la presa se aparean en un orden aleatorio. Después de aparearse y seleccionar las células supervivientes en un medio selectivo, el científico secuenciará los plásmidos aislados para ver qué presa (secuencia de ADN) está interactuando con el cebo utilizado. Este enfoque tiene una menor tasa de reproducibilidad y tiende a producir cantidades más altas de falsos positivos en comparación con el enfoque matricial. [9]

Los plásmidos están diseñados para producir un producto proteico en el que el fragmento del dominio de unión al ADN (BD) se fusiona con una proteína mientras que otro plásmido se modifica para producir un producto proteico en el que el fragmento del dominio de activación (AD) se fusiona con otra proteína. La proteína fusionada con el BD puede denominarse proteína cebo y, por lo general, es una proteína conocida que el investigador utiliza para identificar nuevos socios de unión. La proteína fusionada con la AD puede denominarse proteína de presa y puede ser una sola proteína conocida o una biblioteca de proteínas conocidas o desconocidas. En este contexto, una biblioteca puede consistir en una colección de secuencias que codifican proteínas que representan todas las proteínas expresadas en un organismo o tejido particular, o puede generarse sintetizando secuencias de ADN aleatorias. [3] Independientemente de la fuente, se incorporan posteriormente en la secuencia que codifica la proteína de un plásmido, que luego se transfecta en las células elegidas para el método de selección. [3] Esta técnica, cuando se usa una biblioteca, asume que cada célula se transfecta con un solo plásmido y que, por lo tanto, cada célula finalmente expresa no más de un miembro de la biblioteca de proteínas.

Si las proteínas de cebo y presa interactúan (es decir, se unen), entonces la AD y la BD del factor de transcripción están conectadas indirectamente, lo que lleva a la AD a la proximidad del sitio de inicio de la transcripción y puede ocurrir la transcripción de los genes informadores. Si las dos proteínas no interactúan, no hay transcripción del gen reportero. De esta manera, una interacción exitosa entre la proteína fusionada está vinculada a un cambio en el fenotipo celular. [1]

El desafío de separar las células que expresan proteínas que interactúan con sus proteínas de fusión homólogas de aquellas que no lo hacen, se aborda en la siguiente sección.

En cualquier estudio, algunos de los dominios de proteínas, los que se están investigando, se variarán de acuerdo con los objetivos del estudio, mientras que otros dominios, los que no se están investigando, se mantendrán constantes. Por ejemplo, en un estudio de dos híbridos para seleccionar dominios de unión al ADN, se variará el dominio de unión al ADN, BD, mientras que las dos proteínas que interactúan, el cebo y la presa, deben mantenerse constantes para mantener una unión fuerte entre los BD y AD. Hay una serie de dominios entre los que elegir el BD, el cebo y la presa y el AD, si se desea que se mantengan constantes. En las investigaciones de interacción proteína-proteína, el BD puede elegirse de cualquiera de los muchos dominios fuertes de unión al ADN, como Zif268. [2] Una elección frecuente de dominios de cebo y presa son los residuos 263-352 de la levadura Gal11P con una mutación N342V [2] y los residuos 58-97 de la levadura Gal4, [2] respectivamente. Estos dominios se pueden usar en técnicas de selección basadas tanto en levaduras como en bacterias y se sabe que se unen fuertemente. [1] [2]

La EA elegida debe poder activar la transcripción del gen informador, utilizando la propia maquinaria de transcripción de la célula. Por tanto, la variedad de AD disponibles para su uso en técnicas basadas en levaduras puede no ser adecuada para su uso en sus análogos basados ​​en bacterias. La AD, VP16 y la levadura Gal4 AD derivada del virus del herpes simple se han utilizado con éxito en la levadura [1], mientras que una parte de la subunidad α de E. coli La ARN polimerasa se ha utilizado en E. coli-Métodos basados ​​en. [2] [3]

Mientras que los dominios de activación poderosa pueden permitir una mayor sensibilidad hacia interacciones más débiles, a la inversa, una AD más débil puede proporcionar una mayor rigurosidad.

Se deben incorporar varias secuencias genéticas diseñadas en la célula huésped para realizar análisis de dos híbridos o una de sus técnicas derivadas. Las consideraciones y métodos usados ​​en la construcción y entrega de estas secuencias difieren según las necesidades del ensayo y el organismo elegido como base experimental.

Hay dos amplias categorías de bibliotecas híbridas: bibliotecas aleatorias y bibliotecas basadas en cDNA. Una biblioteca de ADNc está constituida por el ADNc producido a través de la transcripción inversa del ARNm recogido de células específicas de tipos de células. Esta biblioteca se puede ligar en una construcción de modo que se adhiera al BD o AD que se usa en el ensayo. [1] Una biblioteca aleatoria utiliza longitudes de ADN de secuencia aleatoria en lugar de estas secciones de ADNc. Existen varios métodos para la producción de estas secuencias aleatorias, incluida la mutagénesis en casete. [2] Independientemente de la fuente de la biblioteca de ADN, se liga en el lugar apropiado en el plásmido / fagémido relevante usando las endonucleasas de restricción apropiadas. [2]

E. coli-Consideraciones específicas Editar

Al colocar las proteínas híbridas bajo el control de IPTG inducible laca promotores, se expresan solo en medios complementados con IPTG. Además, al incluir diferentes genes de resistencia a antibióticos en cada construcción genética, el crecimiento de células no transformadas se evita fácilmente mediante cultivo en medios que contienen los antibióticos correspondientes. Esto es particularmente importante para los métodos de selección de contador en los que un ausencia de interacción es necesaria para la supervivencia celular. [2]

El gen informador puede insertarse en el E. coli genoma insertándolo primero en un episoma, un tipo de plásmido con la capacidad de incorporarse al genoma de la célula bacteriana [2] con un número de copias de aproximadamente una por célula. [10]

Los fagémidos de expresión híbridos se pueden electroporar en E. coli Células XL-1 Blue que, después de la amplificación e infección con el fago auxiliar VCS-M13, producirán una reserva del fago de la biblioteca. Cada uno de estos fagos contendrá un miembro monocatenario de la biblioteca de fagémidos. [2]

Una vez realizada la selección, se debe determinar la estructura primaria de las proteínas que presentan las características adecuadas. Esto se logra mediante la recuperación de las secuencias que codifican proteínas (como se insertaron originalmente) de las células que muestran el fenotipo apropiado.

E. coli Editar

El fagémido utilizado para transformar E. coli las células se pueden "rescatar" de las células seleccionadas infectándolas con el fago auxiliar VCS-M13. Las partículas de fago resultantes que se producen contienen los fagémidos monocatenarios y se utilizan para infectar células XL-1 Blue. [2] Los fagémidos bicatenarios se recolectan posteriormente de estas células XL-1 Blue, esencialmente invirtiendo el proceso utilizado para producir el fago de la biblioteca original. Finalmente, las secuencias de ADN se determinan mediante secuenciación didesoxi. [2]

los Escherichia coliEl represor de Tet-R derivado puede usarse en línea con un gen indicador convencional y puede ser controlado por tetraciclina o doxiciclina (inhibidores de Tet-R). Por lo tanto, la expresión de Tet-R está controlada por el sistema estándar de dos híbridos, pero el Tet-R a su vez controla (reprime) la expresión de un reportero mencionado anteriormente, como HIS3, a través de su promotor Tet-R. A continuación, se pueden utilizar tetraciclina o sus derivados para regular la sensibilidad de un sistema que utiliza Tet-R. [1]

La sensibilidad también puede controlarse variando la dependencia de las células de sus genes indicadores. Por ejemplo, esto puede verse afectado por la alteración de la concentración de histidina en el medio de crecimiento para his3-dependientes y alterando la concentración de estreptomicina para aadA células dependientes. [2] [3] La dependencia del gen de selección también puede controlarse aplicando un inhibidor del gen de selección a una concentración adecuada. El 3-amino-1,2,4-triazol (3-AT), por ejemplo, es un inhibidor competitivo de la HIS3-producto genético y puede utilizarse para valorar el nivel mínimo de HIS3 expresión requerida para el crecimiento en medios deficientes en histidina. [2]

La sensibilidad también se puede modular variando el número de secuencias operadoras en el ADN informador.

Una tercera proteína que no es de fusión puede coexpresarse con dos proteínas de fusión. Dependiendo de la investigación, la tercera proteína puede modificar una de las proteínas de fusión o mediar o interferir con su interacción. [1]

La coexpresión de la tercera proteína puede ser necesaria para la modificación o activación de una o ambas proteínas de fusión. Por ejemplo, S. cerevisiae no posee tirosina quinasa endógena. Si una investigación involucra una proteína que requiere fosforilación de tirosina, la quinasa debe suministrarse en forma de gen de tirosina quinasa. [1]

La proteína de no fusión puede mediar en la interacción uniendo ambas proteínas de fusión simultáneamente, como en el caso de la dimerización del receptor dependiente de ligando. [1]

Para una proteína con un compañero que interactúa, su homología funcional con otras proteínas puede evaluarse suministrando la tercera proteína en forma de no fusión, que luego puede o no competir con la proteína de fusión por su compañero de unión. La unión entre la tercera proteína y la otra proteína de fusión interrumpirá la formación del complejo de activación de la expresión del informador y reducirá así la expresión del informador, lo que conducirá al cambio distintivo en el fenotipo. [1]

Una limitación de las pantallas clásicas de dos híbridos de levadura es que se limitan a proteínas solubles. Por tanto, es imposible utilizarlos para estudiar las interacciones proteína-proteína entre proteínas de membrana integrales insolubles. El sistema de ubiquitina dividida proporciona un método para superar esta limitación. [11] En el sistema de ubiquitina dividida, dos proteínas de membrana integrales que se estudiarán se fusionan con dos restos de ubiquitina diferentes: un resto de ubiquitina C-terminal ("Cub", residuos 35-76) y un resto de ubiquitina N-terminal (" Nub ", residuos 1-34). Estas proteínas fusionadas se denominan cebo y presa, respectivamente. Además de fusionarse con una proteína de membrana integral, el resto Cub también se fusiona con un factor de transcripción (TF) que puede escindirse mediante proteasas específicas de ubiquitina. Tras la interacción cebo-presa, Nub y Cub-mitades se ensamblan, reconstituyendo la ubiquitina dividida. La molécula de ubiquitina dividida reconstituida es reconocida por proteasas específicas de ubiquitina, que escinden el factor de transcripción, lo que le permite inducir la transcripción de genes indicadores. [12]

Zolghadr y colaboradores presentaron un sistema fluorescente de dos híbridos que utiliza dos proteínas híbridas que se fusionan con diferentes proteínas fluorescentes, así como con LacI, el represor lac. La estructura de las proteínas de fusión se ve así: FP2-LacI-cebo y FP1-presa donde las proteínas de cebo y presa interactúan y traen las proteínas fluorescentes (FP1 = GFP, FP2 = mCherry) en estrecha proximidad en el sitio de unión del LacI proteína en el genoma de la célula huésped. [13] El sistema también se puede utilizar para detectar inhibidores de interacciones proteína-proteína. [14]

Mientras que el sistema Y2H original usaba un factor de transcripción reconstituido, otros sistemas crean actividades enzimáticas para detectar IBP. Por ejemplo, el sensor de sustrato de quinasa ("KISS"), es un enfoque de dos híbridos de mamíferos que se ha diseñado para mapear los PPI intracelulares. Aquí, una proteína de cebo se fusiona con una porción de TYK2 que contiene quinasa y una presa se acopla a un fragmento de receptor de citocina gp130. Cuando el cebo y la presa interactúan, TYK2 fosforila los sitios de acoplamiento de STAT3 en la quimera de la presa, lo que finalmente conduce a la activación de un gen indicador. [15]

Un híbrido Editar

La variación de un híbrido de esta técnica está diseñada para investigar las interacciones proteína-ADN y utiliza una única proteína de fusión en la que la EA está vinculada directamente al dominio de unión. Sin embargo, el dominio de unión en este caso no es necesariamente de secuencia fija como en el análisis proteína-proteína de dos híbridos, sino que puede estar constituido por una biblioteca. Esta biblioteca se puede seleccionar frente a la secuencia diana deseada, que se inserta en la región promotora de la construcción del gen indicador.En un sistema de selección positiva, se selecciona así un dominio de unión que se une con éxito al UAS y permite la transcripción. [1]

Tenga en cuenta que la selección de dominios de unión al ADN no se realiza necesariamente usando un sistema de un híbrido, pero también se puede realizar usando un sistema de dos híbridos en el que se varía el dominio de unión y las proteínas de cebo y presa se mantienen constantes. [2] [3]

Tres híbridos Editar

Las interacciones ARN-proteína se han investigado mediante una variación de tres híbridos de la técnica de dos híbridos. En este caso, una molécula de ARN híbrida sirve para unir los dos dominios de fusión de proteínas, que no están destinados a interactuar entre sí, sino a la molécula de ARN intermediaria (a través de sus dominios de unión al ARN). [1] Las técnicas que involucran proteínas que no son de fusión y que realizan una función similar, como se describe en la sección anterior sobre "proteínas que no son de fusión", también pueden denominarse métodos de tres híbridos.

Uno-dos-híbrido Editar

El uso simultáneo de los métodos de uno y dos híbridos (es decir, interacción simultánea proteína-proteína y proteína-ADN) se conoce como un enfoque de uno-dos híbridos y se espera que aumente la rigurosidad del cribado. [1]

Aunque teóricamente, cualquier célula viva podría usarse como base para un análisis de dos híbridos, existen consideraciones prácticas que dictan cuál se elige. La línea celular elegida debe ser relativamente barata y fácil de cultivar y suficientemente robusta para resistir la aplicación de los métodos de investigación y reactivos. [1] Esto último es especialmente importante para realizar estudios de alto rendimiento. Por eso la levadura S. cerevisiae ha sido el principal organismo huésped para estudios de dos híbridos. Sin embargo, no siempre es el sistema ideal para estudiar proteínas que interactúan de otros organismos. [16] Las células de levadura a menudo no tienen las mismas modificaciones postraduccionales, tienen un uso de codón diferente o carecen de ciertas proteínas que son importantes para la expresión correcta de las proteínas. Para hacer frente a estos problemas, se han desarrollado varios sistemas novedosos de dos híbridos. Dependiendo del sistema utilizado, se utilizan placas de agar o medio de crecimiento específico para hacer crecer las células y permitir la selección para la interacción. El método utilizado más común es el de placas de agar, en el que las células se cultivan en placas en un medio selectivo para ver si tiene lugar la interacción. Las células que no tienen proteínas de interacción no deberían sobrevivir en este medio selectivo. [7] [17]

S. cerevisiae (levadura) Editar

La levadura S. cerevisiae fue el organismo modelo utilizado durante el inicio de la técnica de dos híbridos. Se conoce comúnmente como el sistema Y2H. Tiene varias características que lo convierten en un organismo robusto para albergar la interacción, incluida la capacidad de formar estructuras de proteínas terciarias, pH interno neutro, capacidad mejorada para formar enlaces disulfuro y glutatión en estado reducido, entre otros factores tampón citosólicos, para mantener un ambiente interno hospitalario. medio ambiente. [1] El modelo de levadura puede manipularse mediante técnicas no moleculares y se conoce la secuencia completa del genoma. [1] Los sistemas de levadura son tolerantes a diversas condiciones de cultivo y productos químicos agresivos que no podrían aplicarse a cultivos de tejidos de mamíferos. [1]

Se han creado varias cepas de levadura específicamente para las pantallas Y2H, p. Ej. Y187 [18] y AH109, ​​[19] ambos producidos por Clontech. También se han utilizado las cepas de levadura R2HMet y BK100. [20]

Candida albicans Editar

C. albicans es una levadura con una característica particular: traduce el codón CUG en serina en lugar de leucina. Debido a este uso diferente de codones, es difícil usar el sistema modelo S. cerevisiae como Y2H para comprobar las interacciones proteína-proteína utilizando C. albicans genes. Para proporcionar un entorno más nativo un C. albicans Se desarrolló un sistema de dos híbridos (C2H). Con este sistema, las interacciones proteína-proteína se pueden estudiar en C. albicans sí mismo. [21] [22] Una adición reciente fue la creación de un sistema de alto rendimiento. [23] [24] [25]

E. coli Editar

Los dos métodos híbridos bacterianos (B2H o BTH) generalmente se llevan a cabo en E. coli y tienen algunas ventajas sobre los sistemas basados ​​en levadura. Por ejemplo, la mayor eficiencia de transformación y la tasa de crecimiento más rápida E. coli al uso de bibliotecas más grandes (más de 10 8). [2] La ausencia de requisitos para que se incluya una señal de localización nuclear en la secuencia de proteínas y la capacidad de estudiar proteínas que serían tóxicas para la levadura también pueden ser factores importantes a considerar al elegir un organismo de base experimental. [2]

La actividad de metilación de ciertos E. coli Las proteínas de ADN metiltransferasa pueden interferir con algunas selecciones de proteínas de unión al ADN. Si esto se anticipa, el uso de un E. coli La cepa que es defectuosa para una metiltransferasa particular puede ser una solución obvia. [2] El B2H puede no ser ideal cuando se estudian interacciones proteína-proteína eucariotas (por ejemplo, proteínas humanas) ya que las proteínas pueden no plegarse como en las células eucariotas o pueden carecer de otro procesamiento.

Células de mamíferos Editar

En los últimos años, se ha diseñado un sistema de dos híbridos de mamíferos (M2H) para estudiar las interacciones proteína-proteína de mamíferos en un entorno celular que imita de cerca el entorno de proteínas nativas. [26] En este sistema se utilizan células de mamífero transfectadas transitoriamente para encontrar interacciones proteína-proteína. [27] [28] El uso de una línea celular de mamíferos para estudiar las interacciones proteína-proteína de los mamíferos ofrece la ventaja de trabajar en un contexto más nativo. [5] Las modificaciones postraduccionales, fosforilación, acilación y glicosilación son similares. La localización intracelular de las proteínas también es más correcta en comparación con el uso de un sistema de dos híbridos de levadura. [29] [30] También es posible con el sistema de dos híbridos de mamíferos estudiar las entradas de señal. [31] Otra gran ventaja es que los resultados se pueden obtener dentro de las 48 horas posteriores a la transfección. [5]

Arabidopsis thaliana Editar

En 2005 se desarrolló un sistema de dos híbridos en plantas. Usando protoplastos de A. thaliana Las interacciones proteína-proteína se pueden estudiar en plantas. De esta manera, las interacciones se pueden estudiar en su contexto nativo. En este sistema, GAL4 AD y BD están bajo el control del fuerte promotor 35S. La interacción se mide utilizando un reportero GUS. Para permitir un cribado de alto rendimiento, los vectores se hicieron compatibles con la pasarela. El sistema se conoce como sistema de protoplastos dos híbridos (P2H). [32]

Aplysia californica Editar

La liebre de mar Una californica es un organismo modelo en neurobiología para estudiar, entre otros, los mecanismos moleculares de la memoria a largo plazo. Para estudiar las interacciones, importantes en neurología, en un entorno más nativo se ha desarrollado un sistema de dos híbridos en Una californica neuronas. En este sistema se utilizan GAL4 AD y BD. [33] [34]

Bombyx mori Editar

Se desarrolló un sistema de insectos dos híbridos (I2H) en una línea celular de gusano de seda de la larva u oruga de la polilla de la seda domesticada, Bombyx mori (Células BmN4). Este sistema utiliza GAL4 BD y el dominio de activación del ratón NF-κB P65. Ambos están bajo el control del promotor OpIE2. [35]

Determinación de secuencias cruciales para la interacción Editar

Al cambiar los aminoácidos específicos mediante la mutación de los pares de bases de ADN correspondientes en los plásmidos usados, se puede determinar la importancia de esos residuos de aminoácidos para mantener la interacción. [1]

Después de utilizar el método basado en células bacterianas para seleccionar proteínas de unión al ADN, es necesario comprobar la especificidad de estos dominios, ya que existe un límite en la medida en que el genoma de la célula bacteriana puede actuar como sumidero de dominios con afinidad por otros. secuencias (o de hecho, una afinidad general por el ADN). [2]

Descubrimiento de drogas y venenos Editar

Las interacciones de señalización proteína-proteína plantean dianas terapéuticas adecuadas debido a su especificidad y omnipresencia. El enfoque de descubrimiento aleatorio de fármacos utiliza bancos de compuestos que comprenden estructuras químicas aleatorias y requiere un método de alto rendimiento para probar estas estructuras en su objetivo previsto. [1] [17]

La célula elegida para la investigación puede diseñarse específicamente para reflejar el aspecto molecular que el investigador pretende estudiar y luego usarse para identificar nuevos agentes terapéuticos o anti-plagas para humanos o animales. [1] [17]

Determinación de la función proteica Editar

Mediante la determinación de los socios de interacción de proteínas desconocidas, se pueden inferir las posibles funciones de estas nuevas proteínas. [1] Esto se puede hacer usando una sola proteína conocida contra una biblioteca de proteínas desconocidas o, a la inversa, seleccionando de una biblioteca de proteínas conocidas usando una sola proteína de función desconocida. [1]

Selección de proteína de dedo de zinc Editar

Para seleccionar proteínas con dedos de zinc (ZFP) para la ingeniería de proteínas, se han utilizado con éxito métodos adaptados de la técnica de detección de dos híbridos. [2] [3] Una ZFP es en sí misma una proteína de unión al ADN que se utiliza en la construcción de dominios de unión al ADN personalizados que se unen a una secuencia de ADN deseada. [36]

Mediante el uso de un gen de selección con la secuencia diana deseada incluida en el UAS, y aleatorizando las secuencias de aminoácidos relevantes para producir una biblioteca ZFP, se pueden seleccionar células que albergan una interacción ADN-ZFP con las características requeridas. Cada ZFP normalmente reconoce solo 3-4 pares de bases, por lo que para evitar el reconocimiento de sitios fuera del UAS, el ZFP aleatorizado se diseña en un "andamio" que consta de otras dos ZFP de secuencia constante. Por tanto, el UAS está diseñado para incluir la secuencia objetivo del andamio constante además de la secuencia para la que se selecciona una ZFP. [2] [3]

También pueden investigarse varios otros dominios de unión al ADN utilizando este sistema. [2]

  • Las pantallas de dos híbridos son de baja tecnología y se pueden realizar en cualquier laboratorio sin equipos sofisticados.
  • Las pantallas de dos híbridos pueden proporcionar una primera pista importante para la identificación de los socios de interacción.
  • El ensayo es escalable, lo que permite detectar interacciones entre muchas proteínas. Además, se puede automatizar y, mediante el uso de robots, muchas proteínas se pueden cribar frente a miles de proteínas potencialmente interactuantes en un tiempo relativamente corto. Se utilizan dos tipos de pantallas grandes: el enfoque de biblioteca y el enfoque matricial.
  • Los datos de dos híbridos de levadura pueden ser de calidad similar a los datos generados por el enfoque alternativo de purificación por coafinidad seguida de espectrometría de masas (AP / MS). [37] [9]
  • La principal crítica aplicada a la selección de levaduras de dos híbridos de interacciones proteína-proteína es la posibilidad de un alto número de identificaciones falsas positivas (y falsas negativas). Se desconoce la tasa exacta de resultados falsos positivos, pero las estimaciones anteriores llegaban al 70%. Esto también explica, en parte, el solapamiento muy pequeño que a menudo se encuentra en los resultados cuando se usa un cribado de dos híbridos (de alto rendimiento), especialmente cuando se usan diferentes sistemas experimentales. [9] [28]

El motivo de esta alta tasa de error radica en las características de la pantalla:

  • Ciertas variantes de ensayo sobreexpresan las proteínas de fusión que pueden causar concentraciones de proteínas no naturales que conducen a positivos inespecíficos (falsos).
  • Las proteínas híbridas son proteínas de fusión, es decir, las partes fusionadas pueden inhibir ciertas interacciones, especialmente si tiene lugar una interacción en el extremo N de una proteína de prueba (donde normalmente se une el dominio de activación o de unión al ADN).
  • Es posible que no se produzca una interacción en la levadura, el organismo huésped típico del Y2H. Por ejemplo, si se prueba una proteína bacteriana en levadura, es posible que le falte una chaperona para el plegado adecuado que solo está presente en su huésped bacteriano. Además, una proteína de mamífero a veces no se modifica correctamente en la levadura (por ejemplo, falta la fosforilación), lo que también puede conducir a resultados falsos.
  • El Y2H tiene lugar en el núcleo. Si las proteínas de prueba no están localizadas en el núcleo (porque tienen otras señales de localización), se puede encontrar que dos proteínas que interactúan no interactúan.
  • Algunas proteínas pueden interactuar específicamente cuando se coexpresan en la levadura, aunque en realidad nunca están presentes en la misma célula al mismo tiempo. Sin embargo, en la mayoría de los casos no se puede descartar que dichas proteínas se expresen efectivamente en determinadas células o en determinadas circunstancias.

Cada uno de estos puntos por sí solo puede dar lugar a resultados falsos. Debido a los efectos combinados de todas las fuentes de error, la levadura de dos híbridos debe interpretarse con precaución. La probabilidad de generar falsos positivos significa que todas las interacciones deben confirmarse mediante un ensayo de alta confianza, por ejemplo, la coinmunoprecipitación de las proteínas endógenas, lo que es difícil para los datos de interacción proteína-proteína a gran escala. Alternativamente, los datos de Y2H se pueden verificar utilizando múltiples variantes de Y2H [38] o técnicas bioinformáticas. La última prueba si las proteínas que interactúan se expresan al mismo tiempo, comparten algunas características comunes (como anotaciones de ontología genética o ciertas topologías de red), tienen interacciones homólogas en otras especies. [39]


Los plásmidos son moléculas de ADN autorreplicantes extracromosómicas

Los plásmidos son moléculas circulares de ADN bicatenario (dsDNA) que están separadas del ADN cromosómico de una célula. Estos ADN extracromosómicos, que se encuentran naturalmente en bacterias, levaduras y algunas células eucariotas superiores, existen en una relación parasitaria o simbiótica con su célula huésped. Los plásmidos varían en tamaño desde unos pocos miles de pares de bases hasta más de 100 kilobases (kb). Al igual que el ADN cromosómico de la célula huésped, el ADN plasmídico se duplica antes de cada división celular. Durante la división celular, al menos una copia del ADN plasmídico se segrega a cada célula hija, asegurando la propagación continua del plásmido a través de generaciones sucesivas de la célula huésped.

Muchos plásmidos de origen natural contienen genes que proporcionan algún beneficio a la célula huésped, cumpliendo con la parte del plásmido de la relación simbiótica. Por ejemplo, algunos plásmidos bacterianos codifican enzimas que inactivan antibióticos. Dichos plásmidos resistentes a fármacos se han convertido en un problema importante en el tratamiento de varios patógenos bacterianos comunes. A medida que se generalizó el uso de antibióticos, evolucionaron plásmidos que contenían varios genes de resistencia a los medicamentos, lo que hizo que sus células huésped fueran resistentes a una variedad de antibióticos diferentes simultáneamente. Muchos de estos plásmidos también contienen & # x0201ctransfer genes & # x0201d que codifican proteínas que pueden formar un tubo macromolecular, o pilus, a través del cual se puede transferir una copia del plásmido a otras células huésped de la misma especie bacteriana o relacionada. Tal transferencia puede resultar en la rápida propagación de plásmidos resistentes a los medicamentos, expandiendo el número de bacterias resistentes a los antibióticos en un entorno como un hospital. Hacer frente a la propagación de plásmidos resistentes a los medicamentos es un desafío importante para la medicina moderna.


Las pantallas genéticas identifican mutantes deficientes en procesos celulares

Una vez que se ha producido una colección de mutantes en un organismo modelo, como levaduras o moscas, generalmente se deben examinar miles de individuos para encontrar el fenotipo alterado de interés. Esta búsqueda se denomina cribado genético. Debido a que la obtención de una mutación en un gen de interés depende de la probabilidad de que el gen sea inactivado o mutado durante la mutagénesis aleatoria, cuanto más grande sea el genoma, menos probable es que se mute cualquier gen en particular. Por lo tanto, cuanto más complejo es el organismo, más mutantes deben examinarse para evitar la pérdida de genes. El fenotipo que se analiza puede ser simple o complejo. Los fenotipos simples son los más fáciles de detectar: ​​una deficiencia metabólica, por ejemplo, en la que un organismo ya no puede crecer en ausencia de un aminoácido o nutriente en particular.

Los fenotipos que son más complejos, por ejemplo, las mutaciones que causan defectos en el aprendizaje o la memoria, pueden requerir pantallas más elaboradas (figura 8-56). Pero incluso las pantallas genéticas que se utilizan para diseccionar sistemas fisiológicos complejos deben tener un diseño lo más simple posible y, si es posible, deben permitir el examen de un gran número de mutantes simultáneamente. Como ejemplo, se diseñó una pantalla particularmente elegante para buscar genes involucrados en el procesamiento visual del pez cebra. La base de esta pantalla, que monitorea la respuesta de los peces al movimiento, es un cambio de comportamiento. Los peces de tipo salvaje tienden a nadar en la dirección de un movimiento percibido, mientras que los mutantes con defectos en sus sistemas visuales nadan en direcciones aleatorias, un comportamiento que se detecta fácilmente. Un mutante descubierto en esta pantalla se llama lakritz, que carece del 80% de las células ganglionares de la retina que ayudan a transmitir las señales visuales del ojo al cerebro. Como la organización celular de la retina del pez cebra refleja la de todos los vertebrados, el estudio de tales mutantes también debería proporcionar información sobre el procesamiento visual en humanos.

Figura 8-56

Las pantallas pueden detectar mutaciones que afectan el comportamiento de un animal. (A) Tipo salvaje C. elegans participar en la alimentación social. Los gusanos nadan hasta que se encuentran con sus vecinos y comienzan a alimentarse. (B) Los animales mutantes se alimentan solos. (Cortesía de Cornelia (más.)

Debido a que los defectos en los genes que se requieren para los procesos celulares fundamentales (por ejemplo, la síntesis y el procesamiento de ARN o el control del ciclo celular) son generalmente letales, las funciones de estos genes a menudo se estudian en mutantes sensibles a la temperatura. En estos mutantes, el producto proteico del gen mutante funciona normalmente a una temperatura media, pero puede inactivarse mediante un pequeño aumento o disminución de la temperatura. Por lo tanto, la anomalía se puede activar y desactivar experimentalmente simplemente cambiando la temperatura. Sin embargo, una célula que contiene una mutación sensible a la temperatura en un gen esencial para la supervivencia a una temperatura no permisiva puede crecer a la temperatura normal o permisiva (figura 8-57). El gen sensible a la temperatura en tal mutante generalmente contiene una mutación puntual que causa un cambio sutil en su producto proteico.

Figura 8-57

Detección de mutantes de levadura o bacterias sensibles a la temperatura. Las células mutagenizadas se cultivan en placa a la temperatura permisiva. Las colonias resultantes se transfieren a dos placas de Petri idénticas mediante la reproducción en placa de una de estas placas se incuban a (más.)

Se aislaron muchos mutantes sensibles a la temperatura en los genes que codifican las proteínas bacterianas necesarias para la replicación del ADN mediante el cribado de poblaciones de bacterias tratadas con mutágenos en busca de células que dejen de producir ADN cuando se calientan de 30 ° C a 42 ° C. Estos mutantes se usaron más tarde para identificar y caracterizar las proteínas de replicación del ADN correspondientes (discutidas en el Capítulo 5). Los mutantes sensibles a la temperatura también llevaron a la identificación de muchas proteínas involucradas en la regulación del ciclo celular y en el movimiento de proteínas a través de la vía secretora en la levadura (ver Panel 13-1). Los enfoques de cribado relacionados han demostrado la función de las enzimas implicadas en las principales vías metabólicas de las bacterias y las levaduras (discutidas en el Capítulo 2), así como el descubrimiento de muchos de los productos génicos responsables del desarrollo ordenado de las bacterias. Drosophila embrión (discutido en el Capítulo 21).


La similitud de secuencia puede proporcionar pistas sobre la función de las proteínas

Gracias a la proliferación de secuencias de proteínas y ácidos nucleicos que están catalogadas en bases de datos del genoma, la función de un gen & # x02014 y su proteína codificada & # x02014 puede predecirse a menudo simplemente comparando su secuencia con la de genes previamente caracterizados. Debido a que la secuencia de aminoácidos determina la estructura de la proteína y la estructura dicta la función bioquímica, las proteínas que comparten una secuencia de aminoácidos similar generalmente realizan funciones bioquímicas similares, incluso cuando se encuentran en organismos relacionados lejanamente. Por lo tanto, en la actualidad, la determinación de lo que hace una proteína recién descubierta generalmente comienza con una búsqueda de proteínas previamente identificadas que son similares en sus secuencias de aminoácidos.

La búsqueda de genes o proteínas homólogos en una colección de secuencias conocidas se realiza típicamente en la World-Wide Web, y simplemente implica seleccionar una base de datos e ingresar la secuencia deseada. Un programa de alineación de secuencias, los más populares son BLAST y FASTA, escanea la base de datos en busca de secuencias similares deslizando la secuencia enviada a lo largo de las secuencias archivadas hasta que un grupo de residuos cae en alineación total o parcial (Figura 8-47). Los resultados de incluso una búsqueda compleja, que se puede realizar en una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos, se devuelven en cuestión de minutos. Estas comparaciones pueden usarse para predecir las funciones de proteínas individuales, familias de proteínas o incluso el complemento proteico completo de un organismo recién secuenciado.

Figura 8-47

Resultados de una búsqueda BLAST. Se pueden buscar en las bases de datos de secuencias para encontrar secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos similares. Aquí una búsqueda de proteínas similares a la proteína reguladora del ciclo celular humano cdc2 (Consulta) localiza maíz cdc2 (Tema), que es 68% idéntico (más.)

Sin embargo, al final, las predicciones que surgen del análisis de secuencias a menudo son solo una herramienta para dirigir más investigaciones experimentales.


Activación o represión de genes objetivo mediante CRISPR

CRISPR es una herramienta notablemente flexible para la manipulación del genoma, ya que las enzimas Cas se unen al ADN diana independientemente de su capacidad para escindir el ADN diana. Específicamente, los dominios de nucleasa RuvC y HNH pueden volverse inactivos por mutaciones puntuales (D10A y H840A en SpCas9), lo que da como resultado una molécula Cas9 (dCas9) muerta por nucleasa que no puede escindir el ADN diana. La molécula dCas9 conserva la capacidad de unirse al ADN diana en función de la secuencia de orientación del ARNg.

Los primeros experimentos demostraron que dirigir dCas9 a los sitios de inicio de la transcripción era suficiente para reprimir la transcripción bloqueando el inicio. dCas9 también se puede fusionar con represores o activadores transcripcionales, y dirigir estas proteínas de fusión dCas9 a la región promotora da como resultado una fuerte represión transcripcional (interferencia CRISPR, o CRISPRi) o activación (CRISPRa) de genes diana aguas abajo. Los activadores y represores más simples basados ​​en dCas9 consisten en dCas9 fusionado directamente a un solo activador transcripcional (por ejemplo, VP64) o represor (por ejemplo, KRAB, ver panel A A la derecha).

Además, se han desarrollado estrategias de activación más elaboradas para una activación más potente de genes diana en células de mamíferos. Estos incluyen: coexpresión de dCas9 etiquetado con epítopo y proteínas efectoras activador de anticuerpo (p. Ej., Sistema SunTag, panel B) dCas9 fusionado a varios dominios de activación diferentes en serie (por ejemplo, dCas9-VPR, panel C) o coexpresión de dCas9-VP64 con un ARNg de andamio modificado y activadores auxiliares de unión de ARN adicionales (por ejemplo, activadores SAM, panel D). Es importante destacar que, a diferencia de las modificaciones del genoma inducidas por la nickasa Cas9 o Cas9, la activación o represión génica mediada por dCas9 es reversible, ya que no modifica permanentemente el ADN genómico. dCas9 también se ha utilizado para pantallas de todo el genoma para activar o reprimir la expresión génica en ratones y células humanas.

En el ámbito bacteriano, la activación de la expresión génica es más difícil debido a la ausencia de activadores genéticos efectivos cuando se fusionan con dominios de unión de ADN molecular como dCas9. Recientemente, se han desarrollado activadores sintéticos del gen CRISPR-Cas para bacterias mediante el uso de un ARN andamio que contiene el ARNg y una horquilla de ARN para reclutar proteínas de activación.

CRISPRi también se ha adaptado para diversas especies de bacterias utilizando un sistema modular llamado Mobile-CRISPRi. En este sistema, CRISPRi se introduce en las bacterias mediante conjugación y se integra de forma estable en el cromosoma.


Genes reporteros bioluminiscentes

¿Por qué elegir luminiscencia sobre fluorescencia?

Los fotones se producen principalmente a través de la quimioluminiscencia y la fluorescencia como consecuencia de las transiciones de energía de los orbitales moleculares en estado excitado a los orbitales de menor energía. Sin embargo, los orbitales en estado excitado se crean de manera diferente. En la quimioluminiscencia, los estados excitados son el producto de reacciones químicas exotérmicas, mientras que en la fluorescencia los estados excitados se crean por absorción de luz.

Esta diferencia en la creación del estado excitado afecta en gran medida el carácter del ensayo. Por ejemplo, los ensayos basados ​​en fluorescencia tienden a ser mucho más brillantes porque se puede usar luz de alta intensidad para generar el estado excitado. En los ensayos quimioluminiscentes, las reacciones químicas suelen producir tasas más bajas de emisión de fotones. El mayor brillo de la fluorescencia parece correlacionarse con una mejor sensibilidad del ensayo, pero normalmente este no es el caso. La sensibilidad del ensayo se determina mediante un análisis estadístico de la señal relativa al fondo, donde la señal relativa consiste en una medición de la muestra menos la medición del fondo. Los ensayos fluorescentes tienden a tener antecedentes mucho más altos, lo que conduce a señales relativas más bajas.

El fondo más alto en los ensayos fluorescentes se debe principalmente a que los fluorómetros no pueden discriminar perfectamente entre la entrada muy alta de fotones en la muestra y la emisión mucho más pequeña de fotones de los fluoróforos analíticos. Esta discriminación se logra en gran medida mediante filtración óptica y los fotones emitidos tienen longitudes de onda más largas que los fotones de excitación y, además, por la geometría porque los fotones emitidos normalmente viajan por un camino diferente al de los fotones de excitación. Sin embargo, los filtros ópticos no son perfectos en su capacidad para diferenciar entre longitudes de onda y los fotones pueden cambiar de dirección a través de la dispersión. La quimioluminiscencia tiene la ventaja de que, dado que no se requieren fotones para crear los estados excitados, no constituyen un fondo inherente cuando se mide la salida de fotones de una muestra. El bajo fondo resultante permite una medición precisa de cambios muy pequeños en la luz.

Obtenga más información sobre la ventaja de la bioluminiscencia en este artículo.

Genes reporteros bioluminiscentes disponibles

La bioluminiscencia es un fenómeno natural en el que los organismos vivos crean su propia luz. La base de la bioluminiscencia es la interacción de la enzima luciferasa con un sustrato luminógeno (por ejemplo, luciferina) para producir luz (Figura 1). Las luciferasas que se utilizan más ampliamente son las luciferasas de escarabajo (incluida la luciferasa de luciérnaga), Renilla luciferasa y una luciferasa de camarón de aguas profundas modificada (luciferasa NanoLuc®). Los genes de luciferasa se han clonado a partir de bacterias, escarabajos (p. Ej., Luciérnagas), Renilla, camarones de aguas profundasOplophorus), Aequorea, Vargula y Gonyaulax (un dinoflagelado). De estos, solo las luciferasas de bacterias, escarabajos, camarones de aguas profundas y Renilla han encontrado un uso generalizado como genes indicadores para evaluar la expresión transcripcional. Aquí describimos genes informadores de luciferasa de uso común.

Figura 1. Diagrama de luciérnaga, Renilla y reacciones químicas de NanoLuc & reg luciferasa con sus respectivos sustratos (luciferina de escarabajo, coelenterazina y furimazina) para producir luz.

Luciérnaga luciferasa

La luciferasa de luciérnaga es, con mucho, el reportero bioluminiscente más utilizado. Esta enzima monomérica de 61 kDa fue clonada de la luciérnaga norteamericana (Photinus pyralis) y cataliza una reacción de dos pasos en la que la oxidación de D-luciferina produce luz verde a amarilla, típicamente 550–570 nm en el espectro de luz (Figura 1). El primer paso de reacción es la activación de luciferina con ATP para dar un adenilato de luciferilo y pirofosfato. En el segundo paso, el luciferil-adenilato reacciona con el oxígeno molecular para producir oxiluciferina en un estado excitado electrónicamente y CO2. La oxiluciferina en estado excitado luego regresa al estado fundamental con la liberación de luz. Cuando se mezcla con sustratos químicos, la luciferasa de luciérnaga produce un estallido inicial de luz que decae durante unos 15 segundos hasta un nivel bajo de luminiscencia sostenida.

Para estabilizar la luminiscencia y hacer que el ensayo sea más conveniente para el uso de laboratorio de rutina, se incorpora coenzima A (CoA) para producir una intensidad de luminiscencia máxima que decae lentamente durante varios minutos. Un ensayo optimizado que contiene coenzima A genera una luminiscencia relativamente estable en menos de 0,3 segundos, con linealidad en un rango de concentraciones de enzima de 100 millones de veces y lo suficientemente sensible como para cuantificar menos de 10 a 20 moles de enzima.

La popularidad de la luciferasa de luciérnaga nativa como informador genético se debe a la sensibilidad y conveniencia del ensayo enzimático y al estrecho acoplamiento de la síntesis de proteínas con la actividad enzimática. La luciferasa de luciérnaga, que está codificada por el gen luc, es un monómero que no requiere modificaciones postraduccionales y se convierte en una enzima madura directamente tras la traducción de su ARNm. La actividad catalítica está disponible inmediatamente después de la liberación del ribosoma. Además, la luciferasa de luciérnaga tiene una vida media relativamente corta en las células en comparación con otros indicadores de uso común.

NanoLuc® Luciferasa

La luciferasa NanoLuc® es una pequeña enzima monomérica (19,1 kDa, 171 aminoácidos) basada en la luciferasa del camarón de aguas profundas Oplophorus gracilirostris (Sala et al. 2012). Esta enzima diseñada utiliza un sustrato novedoso, furimazina, para producir luminiscencia de luz azul de tipo resplandor de alta intensidad (λmax = 465nM) en una reacción independiente de ATP (Figura 1). La semivida de la señal es & gt2 horas, y la luminiscencia es aproximadamente 100 veces más brillante que la de la luciérnaga o Renilla luciferasa (Figura 2). Vea por qué el brillo de NanoLuc® Luciferase es importante en esta charla de tiza:

En células de mamíferos, NanoLuc & reg luciferasa no muestra evidencia de modificaciones postraduccionales, enlaces disulfuro o partición subcelular. La enzima es activa en un amplio rango de pH (pH 6 & ndash8), exhibe una alta estabilidad física y retiene la actividad a temperaturas de hasta 55 & degC o en medio de cultivo durante & gt15 horas a 37 & degC.

A diferencia de otras formas de luciferasa, la luciferasa NanoLuc & reg es ideal para aplicaciones de genes informadores estándar (líticos) y basados ​​en secreciones (no líticos). El pequeño tamaño del gen (513 pb) y la proteína codificada es ideal para aplicaciones de virus informadores y fusiones de proteínas. Además, los sustratos de células vivas se pueden utilizar para aplicaciones de imágenes.

Además, la secuencia de luciferasa NanoLuc & reg se puede fusionar con otro gen para crear una proteína de fusión. Estas fusiones se pueden expresar en células para su uso en muchas aplicaciones, incluso como donante bioluminiscente en transferencia de energía por resonancia bioluminiscente (BRET).

Figura 2. Una comparación de la sensibilidad de NanoLuc & reg, firefly y Renilla ensayos de luciferasa. La luminiscencia se midió a partir de concentraciones variables de luciferasas purificadas después de mezclar la enzima informadora con su reactivo de detección respectivo. NanoLuc & reg luciferase fue aproximadamente 100 veces más brillante que la luciérnaga o Renilla luciferasas a concentraciones equivalentes. La luminiscencia se midió utilizando el ensayo de luciferasa Nano-Glo & reg para luciferasa NanoLuc & reg, el sistema de ensayo de luciferasa ONE-Glo & trade para luciferasa de luciérnaga y Renilla-Sistema de ensayo de luciferasa Glo & trade para Renilla luciferasa.

Renilla Luciferasa

Renilla la luciferasa es una enzima monomérica de 36 kDa que cataliza la oxidación de coelenterazina para producir coelenteramida y luz azul de 480 nm (Figura 1). El organismo huésped, Renilla reniformis (pensamiento de mar), es un celentéreo que crea destellos de color verde brillante tras la estimulación táctil, aparentemente para protegerse de posibles depredadores. La luz verde se crea mediante la asociación de la luciferasa con una proteína verde fluorescente y representa un ejemplo natural de BRET.

Como molécula reportera, Renilla luciferasa, que está codificada por la Rluc gen, proporciona muchos de los mismos beneficios que la luciferasa de luciérnaga. Históricamente, la presencia de luminiscencia no enzimática, denominada autoluminiscencia, dio como resultado un fondo alto y una sensibilidad reducida del ensayo; sin embargo, las mejoras en la química del ensayo casi han eliminado este problema. Además, la sencillez del Renilla La química de la luciferasa y, más recientemente, las mejoras en el sustrato de la luciferasa han significado Renilla la luciferasa se puede cuantificar en células vivas in situ o in vivo.


CH450 y CH451: bioquímica: definición de la vida a nivel molecular

Ácido desoxirribonucleico genómico es el ADN cromosómico, en contraste con el ADN extracromosómico, como el que se encuentra en las mitocondrias de los mamíferos o las estructuras plasmídicas en las bacterias (Figura 5.1). Los plásmidos se discutirán con más detalle en la sección 5.3 durante la discusión de la clonación y expresión de genes. Luego también se abrevia como ADNg. La mayoría de los organismos tienen el mismo ADN genómico en todas las células, sin embargo, solo ciertos genes están activos en cada célula para permitir la función celular y la diferenciación dentro del cuerpo.

El genoma de un organismo (codificado por el ADN genómico) es la información (biológica) de la herencia que se transmite de una generación de organismo a la siguiente. Ese genoma se transcribe para producir varios ARN, que son necesarios para la función del organismo. El ARNm precursor (pre-ARNm) es transcrito por la ARN polimerasa II en el núcleo. El pre-ARNm se procesa luego empalmando para eliminar los intrones, dejando los exones en el ARN mensajero maduro (ARNm). El procesamiento adicional incluye la adición de una tapa 5 & # 8242 y una cola de poli (A) al pre-mRNA. El ARNm maduro puede transportarse luego al citosol y ser traducido por el ribosoma en una proteína. Otros tipos de ARN incluyen ARN ribosómico (ARNr) y ARN de transferencia (ARNt). Estos tipos son transcritos por la ARN polimerasa II y la ARN polimerasa III, respectivamente, y son esenciales para la síntesis de proteínas. Sin embargo, el ARNr 5s es el único ARNr que es transcrito por la ARN polimerasa III.

En genética, ADN complementario (ADNc) es ADN sintetizado a partir de una plantilla de ARN monocatenario (p. ej., ARN mensajero (ARNm) o microARN) en una reacción catalizada por la enzima transcriptasa inversa (Figura 5.1). La transcriptasa inversa es una enzima que se encuentra en retrovirus como el VIH que tienen el ARN como material genético central. Al entrar en la célula huésped, el ARN se transcribe de forma inversa para producir una copia del ADNc que luego puede integrarse en el ADN genómico del huésped. En biotecnología, la transcriptasa inversa se usa a menudo para crear ADNc a partir del ARNm expresado en células o tejidos específicos. De esta manera, los genes eucariotas pueden clonarse sin ningún intrón alojado en la estructura. Esto es especialmente útil si el objetivo es expresar la proteína en un huésped procariota (bacteriano). Recuerde que el ADN bacteriano no alberga ninguna secuencia de intrones dentro de su ADN cromosómico. Por lo tanto, si está utilizando un sistema procariótico para expresar proteínas eucarióticas, debe utilizar ADNc, ya que el sistema procariótico no podrá eliminar las secuencias de intrones después de la transcripción génica.

El término ADNc también se utiliza, normalmente en un contexto bioinformático, para hacer referencia a una secuencia de transcripción de ARNm, expresada como bases de ADN (GCAT) en lugar de bases de ARN (GCAU).

Figura 5.1. ADN genómico (ADNg) frente a ADN complementario (ADNc). El diagrama de la izquierda muestra el procesamiento del ADN genómico dentro de una célula para producir una proteína (Panel azul superior muestra los elementos estructurales comunes a los genes eucariotas. El proceso de transcripción de genes produce una molécula de ARN mensajero (ARNm) que debe modificarse postraduccionalmente, panel gris, para eliminar las secuencias de intrones no codificantes y agregar las secciones 5 & # 8242-CAP y Poly-A-Tail. El ARNm maduro se transporta desde el núcleo hasta el citoplasma, donde el ribosoma lo traduce a la secuencia de la proteína. panel rojo.) El diagrama de la derecha muestra que el aislamiento de ARNm de una célula puede usarse para sintetizar ADNc usando la enzima transcriptasa inversa. El ADNc resultante solo contiene elementos del ARNm maduro, incluidos los exones y la cola poli-A.

Técnicas de aislamiento de ADN

Aislamiento de ADN es un proceso de purificación de ADN a partir de una muestra mediante una combinación de métodos físicos y químicos. El primer aislamiento de ADN fue realizado en 1869 por Friedrich Miescher. Actualmente es un procedimiento de rutina en biología molecular o análisis forenses. Para el método químico, se utilizan muchos kits diferentes para la extracción, y seleccionar el correcto ahorrará tiempo en la optimización del kit y los procedimientos de extracción. Se considera que la detección de sensibilidad por PCR muestra la variación entre los kits comerciales.

Hay tres técnicas estándar de purificación de ADN que se describen a continuación:

  • Es necesario recolectar las células que se van a estudiar.
  • Romper las membranas celulares para exponer el ADN junto con el citoplasma interno (lisis celular).
    • Los lípidos de la membrana celular y el núcleo se descomponen con detergentes y tensioactivos.
    • Romper proteínas agregando una proteasa (opcional).
    • Romper el ARN agregando una ARNasa (opcional).
    1. Precipitación de etanolgeneralmente con etanol helado o isopropanol. Dado que el ADN es insoluble en estos alcoholes, se agregará, dando una bolita tras la centrifugación. La precipitación del ADN se mejora aumentando la fuerza iónica, generalmente agregando acetato de sodio.
    2. Extracción de fenol-cloroformo en el que el fenol desnaturaliza las proteínas de la muestra. Después de la centrifugación de la muestra, las proteínas desnaturalizadas permanecen en la fase orgánica mientras que la fase acuosa que contiene ácido nucleico se mezcla con el cloroformo que elimina los residuos de fenol de la solución.
    3. Purificación de minicolumnas que se basa en el hecho de que los ácidos nucleicos pueden unirse (adsorción) a la fase sólida (sílice u otra) dependiendo del pH y la concentración de sal del tampón (Figura 5.2).

    Las proteínas celulares e histonas unidas al ADN pueden eliminarse añadiendo una proteasa o habiendo precipitado las proteínas con acetato de sodio o amonio, o extrayéndolas con una mezcla de fenol-cloroformo antes de la precipitación del ADN.

    Después del aislamiento, el ADN se disuelve en un tampón ligeramente alcalino, normalmente en un tampón Tris-EDTA o en agua ultrapura. Las modificaciones realizadas a estas técnicas estándar a menudo se realizan si el tejido que se usa es difícil de descomponer, si persisten contaminantes en la solución de lisis que inhiben reacciones posteriores o si la muestra es extremadamente mínima, como suele ser el caso en las investigaciones forenses. Además, se adaptarán diferentes kits comerciales para el aislamiento de ADN genómico más grande o ADN plásmido más pequeño.

    Figura 5.2 Columna de centrifugación de sílice utilizada para la purificación de ADN. La purificación de ácidos nucleicos basada en columna de centrifugación es un método de extracción en fase sólida para purificar rápidamente los ácidos nucleicos.Este método se basa en el hecho de que el ácido nucleico se unirá a la fase sólida de la sílice en determinadas condiciones y luego se liberará cuando se alteren esas condiciones. Para la unión, se agrega una solución tampón al lisado de ADN junto con etanol o isopropanol. Esto forma la solución vinculante. La solución de unión se transfiere a una columna de centrifugación y la columna se coloca en una centrífuga. La centrífuga fuerza la solución de unión a través de una membrana de gel de sílice que se encuentra dentro de la columna de centrifugado. Si el pH y la concentración de sal de la solución de unión son óptimos, el ácido nucleico se unirá a la membrana de gel de sílice a medida que la solución la atraviese. Para lavar los componentes celulares no específicos de la columna, se elimina el flujo continuo y se agrega un tampón de lavado a la columna. La columna se vuelve a poner en una centrífuga, lo que obliga al tampón de lavado a través de la membrana. Esto elimina las impurezas restantes de la membrana, dejando solo el ácido nucleico unido al gel de sílice. Para eluir, se elimina el tampón de lavado y se añade a la columna un tampón de elución con bajo contenido de sal (o simplemente agua). La columna se vuelve a colocar en una centrífuga, lo que obliga al tampón de elución a través de la membrana. El tampón de elución desplaza el ácido nucleico de la columna permitiendo que se recoja en el flujo. A diferencia del ARN que se degrada muy rápidamente, el ADN es bastante estable y puede almacenarse durante largos períodos de tiempo a -20 o C.

    Técnicas de secuenciación de ADN

    secuencia ADN es el proceso de determinar la secuencia de ácido nucleico, el orden de los nucleótidos en el ADN. Incluye cualquier método o tecnología que se utilice para determinar el orden de las cuatro bases: adenina, guanina, citosina y timina. El advenimiento de los métodos rápidos de secuenciación del ADN ha acelerado enormemente la investigación y el descubrimiento biológicos y médicos.

    El conocimiento de las secuencias de ADN se ha vuelto indispensable para la investigación biológica básica y en numerosos campos aplicados como el diagnóstico médico, la biotecnología, la biología forense, la virología y la sistemática biológica. La comparación de secuencias de ADN sanas y mutadas puede diagnosticar diferentes enfermedades, incluidos varios cánceres, caracterizar el repertorio de anticuerpos y puede usarse para guiar el tratamiento del paciente. Tener una forma rápida de secuenciar el ADN permite administrar una atención médica más rápida e individualizada, y para identificar y catalogar más organismos.

    La rápida velocidad de secuenciación lograda con la tecnología moderna de secuenciación de ADN ha sido fundamental en la secuenciación de secuencias completas de ADN, o genomas, de numerosos tipos y especies de vida, incluido el genoma humano y otras secuencias completas de ADN de muchos animales, plantas y microbios. especies.

    Las primeras secuencias de ADN fueron obtenidas a principios de la década de 1970 por investigadores académicos utilizando laboriosos métodos basados ​​en cromatografía bidimensional. Tras el desarrollo de métodos de secuenciación basados ​​en fluorescencia con un secuenciador de ADN, la secuenciación de ADN se ha vuelto más fácil y mucho más rápida.

    La estructura canónica del ADN tiene cuatro bases: timina (T), adenina (A), citosina (C) y guanina (G). La secuenciación del ADN es la determinación del orden físico de estas bases en una molécula de ADN. Sin embargo, las bases de ADN a menudo se modifican mediante procesos epigenéticos para controlar la expresión génica. Por tanto, muchas otras bases modificadas que pueden estar presentes en una molécula de ADN además de las cuatro bases estándar. Por ejemplo, en algunos virus (específicamente, bacteriófagos), la citosina puede ser reemplazada por hidroximetil- o hidroximetilglucosa citosina. En el ADN eucariota, se pueden encontrar bases variantes con grupos metilo o fosfosulfato (Figura 5.3). Dependiendo de la técnica de secuenciación, una modificación particular, por ejemplo, la 5mC (5-metilcitosina) común en humanos, puede detectarse o no.

    Figura 5.3 Modificaciones del ADN con funciones reguladoras epigenéticas y sus interdependencias. La citosina (C) se metila a 5-metilcitosina (5mC) mediante ADN metiltransferasas (DNMT) y luego se oxida adicionalmente a 5hmC, 5fC y 5caC mediante Tet dioxigenasas. El 5-hidroxiuracilo (5hmU) se produce por oxidación de timina (T) catalizada por Tet. N6-metiladenina (6mA) probablemente es catalizada por ADN N6 adenina metiltransferasas (DAMT-1 en C. elegans), aunque queda por caracterizar la actividad bioquímica de estas enzimas. Se ha demostrado que las enzimas ALKB similares a Tet NMAD (N6-metil adenina desmetilasa 1) y DMAD (ADN 6mA desmetilasa) están involucradas en la desmetilación de 6 mA en C. elegans y en Drosophila, respectivamente, posiblemente mediante el uso de un mecanismo de dioxigenasa conservada.

    Métodos tempranos de secuenciación de ADN

    El primer método para determinar las secuencias de ADN involucró una estrategia de extensión de cebadores específica de la ubicación establecida por Ray Wu en la Universidad de Cornell en 1970. Para secuenciar los extremos cohesivos se utilizaron la catálisis de la ADN polimerasa y el marcaje de nucleótidos específicos, que figuran de manera prominente en los esquemas de secuenciación actuales. del ADN del fago lambda. Entre 1970 y 1973, Wu, R Padmanabhan y sus colegas demostraron que este método se puede emplear para determinar cualquier secuencia de ADN utilizando cebadores sintéticos específicos de la ubicación. Frederick Sanger adoptó luego esta estrategia de extensión de cebadores para desarrollar métodos de secuenciación de ADN más rápidos en el Centro MRC, Cambridge, Reino Unido, y publicó un método para la secuenciación de ADN con inhibidores de terminación de cadena # 8221 en 1977. Walter Gilbert y Allan Maxam en Harvard también desarrolló métodos de secuenciación, incluido uno para & # 8220Secuenciación del ADN por degradación química & # 8221. En 1973, Gilbert y Maxam informaron la secuencia de 24 pares de bases utilizando un método conocido como análisis de puntos errantes. Los avances en la secuenciación se vieron favorecidos por el desarrollo simultáneo de tecnología de ADN recombinante, que permitió aislar muestras de ADN de fuentes distintas de los virus.

    Secuenciación de Maxam-Gilbert requiere el marcaje radiactivo en un extremo 5 & # 8242 del ADN y la purificación del fragmento de ADN que se va a secuenciar. El tratamiento químico genera entonces roturas en una pequeña proporción de una o dos de las cuatro bases de nucleótidos en cada una de las cuatro reacciones (G, A + G, C, C + T). La concentración de los químicos modificadores se controla para introducir en promedio una modificación por molécula de ADN. Por tanto, se genera una serie de fragmentos marcados, desde el extremo marcado radiactivamente hasta el primer sitio & # 8220cut & # 8221 en cada molécula. Los fragmentos de las cuatro reacciones se someten a electroforesis uno al lado del otro en geles de acrilamida desnaturalizantes para la separación por tamaños. Para visualizar los fragmentos, el gel se expone a una película de rayos X para autorradiografía, produciendo una serie de bandas oscuras, cada una correspondiente a un fragmento de ADN radiomarcado, a partir del cual se puede inferir la secuencia.

    Los aspectos técnicos de la secuenciación de Maxam-Gilbert hicieron que perdiera el favor una vez que el método de secuenciación de Sanger se había establecido bien, como se describe a continuación.

    Método de secuenciación de Sanger

    El método de terminación de cadena desarrollado por Frederick Sanger y sus colaboradores en 1977 pronto se convirtió en el método de elección, debido a su relativa facilidad y confiabilidad. Cuando se inventó, el método de terminación de cadena utilizaba menos productos químicos tóxicos y menores cantidades de radiactividad que el método Maxam-Gilbert. Debido a su facilidad comparativa, el método Sanger pronto se automatizó y fue el método utilizado en la primera generación de secuenciadores de ADN.

    El método clásico de terminación de cadena requiere una plantilla de ADN monocatenario, un cebador de ADN, una ADN polimerasa, trifosfatos de desoxinucleótido normales (dNTP) y trifosfatos de di-desoxinucleótido modificados (ddNTP), el último de los cuales termina la elongación de la cadena de ADN. Estos nucleótidos de terminación de cadena carecen de un grupo 3 & # 8242-OH necesario para la formación de un enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos, lo que hace que la ADN polimerasa cese la extensión del ADN cuando se incorpora un ddNTP modificado. Los ddNTP se pueden marcar de forma radiactiva o fluorescente para su detección en máquinas de secuenciación automatizadas.

    La muestra de ADN se divide en cuatro reacciones de secuenciación separadas, que contienen los cuatro desoxinucleótidos estándar (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) y la ADN polimerasa. A cada reacción se le agrega solo uno de los cuatro didesoxinucleótidos (ddATP, ddGTP, ddCTP o ddTTP), mientras que los otros nucleótidos agregados son los ordinarios (Figura 5.4).

    Figura 5.4. DdNTP fluorescentes para secuenciación de Sanger. Los didesoxinucleótidos se utilizan para la secuenciación ya que no pueden extenderse más una vez que se incorporan al ADN nacente.

    La concentración de didesoxinucleótido debe ser aproximadamente 100 veces menor que la del desoxinucleótido correspondiente (por ejemplo, ddTTP 0,005 mM: dTTP 0,5 mM) para permitir que se produzcan suficientes fragmentos mientras se sigue transcribiendo la secuencia completa. En total, se necesitan cuatro reacciones separadas en este proceso para probar los cuatro ddNTP (Figura 5.5).

    Figura 5.5. El método de Sanger (terminación de cadena) para la secuenciación del ADN. (1) Se hibrida un cebador con una secuencia, (2) Se agregan reactivos al cebador y al molde, que incluyen: ADN polimerasa, dNTP y una pequeña cantidad de los cuatro didesoxinucleótidos (ddNTP) marcados con fluoróforos. Durante el alargamiento del cebador, la inserción aleatoria de un ddNTP en lugar de un dNTP termina la síntesis de la cadena porque la ADN polimerasa no puede reaccionar con el hidroxilo faltante. Esto produce todas las longitudes posibles de cadenas. (3) Los productos se separan en un gel capilar de un solo carril, donde las bandas resultantes son leídas por un sistema de imágenes. (4) Esto produce varios cientos de miles de nucleótidos al día, datos que requieren almacenamiento y análisis computacional posterior.

    Después de rondas de extensión del ADN molde del cebador unido, los fragmentos de ADN resultantes se desnaturalizan por calor y se separan por tamaño usando electroforesis en gel. Esta técnica se realizó con frecuencia usando un gel de poliacrilamida-urea desnaturalizante con cada una de las cuatro reacciones desarrolladas en uno de los cuatro carriles individuales (carriles A, T, G, C). Las bandas de ADN se pueden visualizar mediante autorradiografía o luz ultravioleta y la secuencia de ADN se puede leer directamente en la película de rayos X o en la imagen del gel (Figura 5.6).

    Figura 5.6. Gel secuenciador tradicional de Sanger. Secuencia visualizada por autorradiografía. Cada carril contiene una única reacción que tiene los cuatro nucleótidos regulares y una pequeña cantidad de uno de los didesoxinucleótidos (ddNTP). Con el tiempo, los ddNTP se incorporarán en cada posición que contenga ese nucleótido específico. El gel se puede leer de abajo hacia arriba, ya que los fragmentos más pequeños (aquellos fragmentos terminados más cerca del cebador en el extremo 5 & # 8242) correrán la distancia más lejana en el gel. La secuencia de este fragmento es:

    La automatización del método de secuenciación de Sanger fue posible cuando se realizó el cambio de nucleótidos marcados radiactivamente a nucleótidos marcados con fluorescencia. Dentro de los secuenciadores automáticos, la electroforesis capilar en gel se realiza en lugar de separar las muestras usando electroforesis en gel. La salida de la electroforesis capilar son cromatogramas de trazas de picos fluorescentes (Figura 5.7). Los instrumentos de secuenciación de ADN automatizados (secuenciadores de ADN) pueden secuenciar hasta 384 muestras de ADN en un solo lote. Las ejecuciones por lotes pueden realizarse hasta 24 veces al día, lo que mejora en gran medida la velocidad con la que las muestras pueden secuenciarse y analizarse. Los desafíos comunes de la secuenciación de ADN con el método Sanger incluyen la mala calidad en las primeras 15-40 bases de la secuencia debido a la unión del cebador y el deterioro de la calidad de las trazas de secuenciación después de 400-500 bases.

    Figura 5.7 Comparación lado a lado de electroforesis en gel y electroforesis capilar. Diagrama de la mano izquierda muestra el autorradiograma tradicional de muestras de secuenciación de Sanger. los Diagrama de la mano derecha muestra las mismas reacciones usando ddNTP marcados con fluorescencia separados por electroforesis capilar. La salida del cromatograma se muestra en el extremo derecho.

    La secuenciación de Sanger es el método que prevaleció desde la década de 1980 hasta

    2005. Durante ese período, se lograron grandes avances en la técnica, como el marcaje fluorescente, la electroforesis capilar y la automatización general. Estos desarrollos permitieron una secuenciación mucho más eficiente, lo que condujo a menores costos. El método Sanger, en forma de producción en masa, es la tecnología que produjo el primer genoma humano en 2001, marcando el comienzo de la era de la genómica.

    Secuenciación Sanger de microfluidos

    La secuenciación microfluídica de Sanger es una aplicación de laboratorio en un chip para la secuenciación de ADN, en la que los pasos de secuenciación de Sanger (ciclos térmicos, purificación de muestras y electroforesis capilar) se integran en un chip a escala de oblea utilizando volúmenes de muestra a escala de nanolitros (Figura 5.8). Esta tecnología genera lecturas de secuencia largas y precisas, al tiempo que elimina muchas de las deficiencias significativas del método Sanger convencional (por ejemplo, alto consumo de reactivos costosos, dependencia de equipos costosos, manipulaciones intensivas en personal, etc.) al integrar y automatizar los pasos de secuenciación de Sanger. .

    Figura 5.8 Tecnologías Lab-On-A-Chip. Ejemplo de un laboratorio de microfluidos en un dispositivo de chip colocado sobre un plato de poliestireno. Las agujas de acero inoxidable insertadas en el dispositivo sirven como puntos de acceso para los fluidos en pequeños canales dentro del dispositivo, que son aproximadamente del tamaño de un cabello humano.

    Secuenciación de próxima generación

    La secuenciación de próxima generación (NGS), también conocida como secuenciación de alto rendimiento, es el término general que se utiliza para describir varias tecnologías de secuenciación modernas diferentes. Estas tecnologías permiten la secuenciación de ADN y ARN de forma mucho más rápida y económica que la secuenciación de Sanger utilizada anteriormente y, como tal, revolucionaron el estudio de la genómica y la biología molecular. Dichas tecnologías incluyen:

    Secuenciación de Illumina & # 8211 En NGS, una gran cantidad de lecturas cortas se secuencian de un solo golpe utilizando la tecnología lab-on-a-chip descrita anteriormente. Para hacer esto, la muestra de entrada debe dividirse en secciones cortas. En la secuenciación de Illumina, se utilizan lecturas de 100-150 pb. Los fragmentos algo más largos se ligan a adaptadores genéricos y se recocen en un portaobjetos utilizando los adaptadores. Se lleva a cabo una PCR para amplificar cada lectura, creando un punto con muchas copias de la misma lectura. Luego se separan en ADN monocatenario para secuenciar (Figura 5.9).

    Figura 5.9 Procedimiento para la secuenciación de Illumina. (A) El portaobjetos con fragmentos de ADN amplificados por PCR se inunda con nucleótidos y ADN polimerasa. Estos nucleótidos están marcados con fluorescencia y cada color corresponde a una base específica. Las reacciones también tienen un terminador presente, de modo que solo se agrega una base a la vez. (B) Se toma una imagen de la diapositiva. En cada lugar de reacción, habrá una señal fluorescente que indica que se ha agregado una base específica. (C) Los datos se registran y la diapositiva se prepara para el siguiente ciclo. En preparación, se eliminan los terminadores, lo que permitirá agregar la siguiente base, y la señal fluorescente se escinde, evitando que la señal fluorescente contamine la siguiente imagen. El proceso se repite, agregando un nucleótido a la vez (G, A, T o C) y obteniendo imágenes en el medio. Todas las lecturas de la secuencia tendrán la misma longitud ya que se agregan bases individuales en cada ciclo.

    Roche 454-Secuenciaciónes similar al proceso de Illumina pero puede secuenciar lecturas mucho más largas. Al igual que Illumina, lo hace secuenciando varias lecturas a la vez mediante la lectura de señales ópticas a medida que se agregan las bases.

    Como en Illumina, el ADN o ARN se fragmenta en lecturas más cortas, en este caso hasta 1 kb (1000 pb). Los adaptadores genéricos se agregan a los extremos y estos se recocen en perlas, un fragmento de ADN por perla. A continuación, los fragmentos se amplifican mediante PCR utilizando cebadores específicos del adaptador. Luego, cada cuenta se coloca en un solo pozo de un portaobjetos. Por lo tanto, cada pocillo contendrá una sola perla, cubierta con muchas copias de PCR de una sola secuencia. Los pocillos también contienen ADN polimerasa y tampones de secuenciación (Figura 5.10).

    5.10 Procedimiento para la secuenciación de Roche 454. (A) Una vez que el producto de PCR se adhiere a la perla, el portaobjetos se inunda con una de las cuatro especies de NTP. Cuando este nucleótido es el siguiente en la secuencia, se agrega a la secuencia leída. Si esa base única se repite, se agregarán más. Entonces, si inundamos con bases de guanina, y el siguiente en la secuencia es G, se agregará un G, sin embargo, si la siguiente parte de la secuencia es GGGG, se agregarán cuatro Gs. (B) La adición de cada nucleótido libera una señal luminosa. Estas ubicaciones de señales se detectan y utilizan para determinar a qué perlas se añaden los nucleótidos. (C) La mezcla de NTP se elimina por lavado. Ahora se agrega la siguiente mezcla de NTP y se repite el proceso, pasando por los cuatro NTP. Todas las lecturas de secuencia de la secuenciación 454 tendrán diferentes longitudes, porque se agregarán diferentes números de bases con cada ciclo.

    Nuevas tecnologías como la Tecnología Ion Torrenty el Sistema MinION detectar datos de secuencia utilizando señales eléctricas en un chip semiconductor, en lugar de leer ópticamente nucleótidos marcados con colorante. Esto es posible porque la adición de un dNTP al polímero de ADN provoca la liberación de un ion H + (Figura 5.11). Como en otros tipos de NGS, el ADN o ARN de entrada está fragmentado, esta vez

    200 pb. Se agregan adaptadores y se coloca una molécula en una perla. Las moléculas se amplifican en la perla mediante PCR en emulsión. Cada cuenta se coloca en un solo pozo de un portaobjetos.

    Figura 5.11 Tecnología de secuenciación Ion Torrent. (A) Similar a la secuenciación 454, el portaobjetos se inunda con una única especie de dNTP, junto con tampones y polimerasa. El pH se controla en cada uno de los pocillos después de la adición del dNTP específico. El pH disminuirá cuando el dNTP se incorpore al polímero provocando la liberación de un protón (H +). Los cambios en el pH nos permiten determinar si esa base y cuántas de ella se agregaron a la secuencia leída. (B) Los dNTP se eliminan por lavado y el proceso se repite ciclando a través de las diferentes especies de dNTP. (C) El cambio de pH, si lo hay, se usa para determinar cuántas bases (si alguna) se agregaron con cada ciclo.

    Estas tecnologías de iones que no requieren detección óptica han permitido la producción de pequeños dispositivos portátiles de secuenciación de ADN que se pueden conectar a la unidad USB de una computadora portátil y utilizar en el campo en condiciones de recolección en tiempo real (Figura 5.12).

    Figura 5.12 El dispositivo de secuenciación portátil en tiempo real MinION. El MinION puede producir hasta 30 Gb de datos de secuencia de ADN por muestra

    Las cuatro ventajas principales de NGS sobre la secuenciación clásica de Sanger son:

    Tamaño de la muestra

    NGS es significativamente más barata, más rápida, necesita mucho menos ADN y es más precisa y confiable que la secuenciación de Sanger. Miremos esto más de cerca. Para la secuenciación de Sanger, se necesita una gran cantidad de ADN molde para cada lectura. Se necesitan varias hebras de ADN molde para cada base que se secuencia (es decir, para una secuencia de 100 pb, necesita muchos cientos de copias, para una secuencia de 1000 pb necesita muchos miles de copias), ya que una hebra que termina en cada base es necesario para construir una secuencia completa. En NGS, se puede obtener una secuencia de una sola hebra. En ambos tipos de secuenciación, se toman múltiples copias escalonadas para la construcción de contig y validación de secuencia.

    NGS es más rápido que la secuenciación de Sanger de dos formas. En primer lugar, la reacción química puede combinarse con la detección de señales en algunas versiones de NGS, mientras que en la secuenciación de Sanger estos son dos procesos separados.En segundo lugar, y de manera más significativa, solo una lectura (máximo

    1 kb) se pueden tomar a la vez en la secuenciación de Sanger, mientras que NGS es enormemente paralelo, lo que permite leer 300 Gb de ADN en una sola ejecución en un solo chip.

    La reducción de tiempo, mano de obra y reactivos en NGS significa que los costos son mucho más bajos. La primera secuencia del genoma humano costó en la región de $ 2.7 mil millones en 2003. Usando métodos modernos de secuenciación de Sanger, con la ayuda de datos de la secuencia conocida, un genoma humano completo todavía costaba $ 300,000 en 2006. Secuenciar un genoma humano con NGS hoy cuesta aproximadamente $ 1,000.

    Las repeticiones son intrínsecas a NGS, ya que cada lectura se amplifica antes de la secuenciación y debido a que se basa en muchas lecturas cortas superpuestas, por lo que cada sección de ADN o ARN se secuencia varias veces. Además, debido a que es mucho más rápido y económico, es posible hacer más repeticiones que con la secuenciación de Sanger. Más repeticiones significa una mayor cobertura, lo que conduce a una secuencia más precisa y confiable, incluso si las lecturas individuales son menos precisas para NGS.

    La secuenciación de Sanger se puede utilizar para obtener lecturas de secuencia mucho más largas. Sin embargo, la naturaleza paralela de NGS significa que se pueden construir lecturas más largas a partir de muchas lecturas cortas contiguas.

    Técnicas de síntesis de ADN

    Síntesis de ADN es la creación natural o artificial de moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN). El término síntesis de ADN puede referirse a Replicación de ADN (que se tratará con más detalle en el Capítulo XX), reacción en cadena de la polimerasa (PCR)o síntesis de genes (creando físicamente secuencias de genes artificiales).

    Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

    La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se refiere a una técnica ampliamente empleada en las ciencias básicas y biomédicas. La PCR es una técnica de laboratorio utilizada para amplificar segmentos específicos de ADN para una amplia gama de aplicaciones clínicas y / o de laboratorio. Sobre la base del trabajo de la exitosa amplificación del ADN de Panet y Khorana in vitro, Kary Mullis y sus colaboradores desarrollaron la PCR a principios de la década de 1980, después de haber obtenido un premio Nobel solo una década después. Al permitir una amplificación de más de mil millones de veces de regiones objetivo específicas, se ha convertido en un instrumento en muchas aplicaciones, incluida la clonación de genes, el diagnóstico de enfermedades infecciosas y la detección de anomalías genéticas deletéreas en bebés prenatales.

    Fundamentos

    Los componentes principales de la PCR son una plantilla, cebadores, bases de nucleótidos libres y la enzima ADN polimerasa. los Plantilla de ADNcontiene la región específica que desea amplificar, como el ADN extraído de un mechón de cabello, por ejemplo. Imprimaciones, u oligonucleótidos, son hebras cortas de ADN monocatenario complementarias al extremo 3 & # 8242 de cada región diana. Se requieren tanto un cebador directo como uno inverso, uno para cada hebra complementaria de ADN. ADN polimerasa es la enzima que realiza la replicación del ADN. Los análogos termoestables de la ADN polimerasa I, como la polimerasa Taq, que se encontró originalmente en una bacteria que crece en aguas termales, es una elección común debido a su resistencia a los ciclos de calentamiento y enfriamiento necesarios para la PCR.

    La PCR aprovecha el apareamiento de bases complementarias, la naturaleza bicatenaria y la temperatura de fusión de las moléculas de ADN. Este proceso implica un ciclo a través de 3 rondas secuenciales de reacciones dependientes de la temperatura: fusión del ADN (desnaturalización), hibridación y replicación del ADN impulsada por enzimas (elongación). Desnaturalizacióncomienza calentando la reacción a aproximadamente 95 ° C, rompiendo los enlaces de hidrógeno que mantienen unidas las dos hebras de ADN molde. A continuación, la reacción se reduce a alrededor de 50 a 65 o C, dependiendo de las variables fisicoquímicas de los cebadores, lo que permite recocidode pares de bases complementarios. Los cebadores, que se añaden a la solución en exceso, se unen al comienzo del extremo 3 & # 8242 de cada hebra molde y previenen la re-hibridación de la hebra molde consigo misma. Por último, la replicación del ADN impulsada por enzimas, o alargamiento, comienza ajustando la temperatura de reacción a la cantidad que optimiza la actividad de la ADN polimerasa, que es de alrededor de 75 a 80 o C.En este punto, la ADN polimerasa, que necesita ADN de doble hebra para comenzar la replicación, sintetiza una nueva hebra de ADN mediante ensamblar nucleótidos libres en solución en la dirección 3 & # 8242 a 5 & # 8242 para producir 2 conjuntos completos de hebras complementarias. El ADN recién sintetizado ahora es idéntico a la hebra molde y se usará como tal en los ciclos de PCR progresiva (Video 5.1).

    Video 5.1: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). (1) Pasos del proceso de PCR tradicional. (2) Detección de fluoróforos no específicos en qPCR, y (3) Detección de sonda de hibridación específica en qPCR.

    Dado que las cadenas de ADN sintetizadas previamente sirven como plantillas, la amplificación de ADN mediante PCR aumenta a una tasa exponencial, donde las copias de ADN se duplican al final de cada paso de replicación. La replicación exponencial del ADN diana eventualmente se estabiliza alrededor de 30 a 40 ciclos principalmente debido a la limitación del reactivo, pero también puede deberse a inhibidores de la reacción de la polimerasa que se encuentran en la muestra, autoanillado del producto acumulado y acumulación de moléculas de pirofosfato.

    En su advenimiento, la tecnología de PCR se limitó al análisis cualitativo o semicuantitativo debido a limitaciones en la capacidad de cuantificar ácidos nucleicos. En ese momento, para verificar si el gen diana se amplificó con éxito, el producto de ADN se separó por tamaño mediante electroforesis en gel de agarosa. El bromuro de etidio, una molécula que emite fluorescencia cuando se une a dsDNA, podría dar una estimación aproximada de la cantidad de ADN comparando aproximadamente el brillo de las bandas separadas, pero no era lo suficientemente sensible para un análisis cuantitativo riguroso.

    Las mejoras en el desarrollo y la instrumentación de fluoróforos llevaron a termocicladores que ya no requerían la medición de solo el ADN del producto final. Este proceso, conocido como PCR en tiempo real,o PCR cuantitativa (qPCR), ha permitido la detección de dsDNA durante la amplificación. Los termocicladores qPCR están equipados con la capacidad de excitar fluoróforos en longitudes de onda específicas, detectar su emisión con un fotodetector y registrar los valores. La colección sensible de valores numéricos durante la amplificación ha mejorado considerablemente el poder analítico cuantitativo.

    Hay dos tipos principales de fluoróforos utilizados en qPCR: los que se unen específicamente a una secuencia diana determinada y los que no. La sensibilidad de los fluoróforos ha sido un aspecto importante del desarrollo de qPCR. Uno de los marcadores no específicos más efectivos y ampliamente utilizados, SYBR Green, después de unirse al surco menor del dsDNA, exhibe un aumento de 1000 veces en la fluorescencia en comparación con estar libre en solución (Video 5.1). Sin embargo, si se desea incluso más especificidad, se puede añadir un oligonucleótido específico de secuencia, o sonda de hibridación, que se une al gen diana en algún punto delante del cebador (después del extremo 3 & # 8242). Estas sondas de hibridación contienen una molécula informadora en el extremo 5 & # 8242 y una molécula extintora en el extremo 3 & # 8242. La molécula inhibidora inhibe eficazmente al informador de la fluorescencia mientras la sonda está intacta. Sin embargo, al entrar en contacto con la ADN polimerasa I, la sonda de hibridación se escinde, lo que permite la fluorescencia del tinte (Video 5.1).

    PCR de transcripción inversa

    Desde su advenimiento, la tecnología de PCR se ha expandido creativamente y PCR de transcripción inversa (RT-PCR) es uno de los avances más importantes. La PCR en tiempo real se confunde con frecuencia con la PCR de transcripción inversa, pero son técnicas independientes. En la RT-PCR, el ADN amplificado se deriva del ARNm mediante el uso de enzimas de transcriptasa inversa, para producir una copia de ADNc del gen. Usando secuencias de cebadores para genes de interés, se pueden usar métodos de PCR tradicionales con el ADNc para estudiar la expresión de genes de manera cualitativa. Actualmente, la PCR de transcripción inversa se usa comúnmente con la PCR en tiempo real, lo que permite medir cuantitativamente el cambio relativo en la expresión génica en diferentes muestras.

    Cuestiones de interés

    Una desventaja de la tecnología de PCR es que es extremadamente sensible. Las trazas de contaminación de ARN o ADN en la muestra pueden producir resultados extremadamente engañosos. Otra desventaja es que los cebadores diseñados para PCR requieren datos de secuencia y, por lo tanto, solo se pueden usar para identificar la presencia o ausencia de un patógeno o gen conocido. Otra limitación es que a veces los cebadores utilizados para la PCR pueden aparearse de forma no específica con secuencias que son similares, pero no idénticas, al gen diana.

    Otro problema potencial del uso de PCR es la posibilidad de formación de dímeros de cebadores (PD). La PD es un subproducto potencial y consiste en moléculas de cebadores que se han hibridado entre sí debido a las cadenas de bases complementarias en los cebadores. La ADN polimerasa amplifica la PD, lo que conduce a la competencia por reactivos de PCR que podrían usarse para amplificar las secuencias diana.

    Significación clínica

    La amplificación por PCR es una herramienta indispensable con diversas aplicaciones dentro de la medicina. A menudo, se usa para probar la presencia de alelos específicos, como en el caso de los padres potenciales que examinan la presencia de portadores genéticos, pero también se puede usar para diagnosticar la presencia de una enfermedad directamente y para detectar mutaciones en el embrión en desarrollo. Por ejemplo, la primera vez que se utilizó la PCR de esta forma fue para el diagnóstico de anemia de células falciformes mediante la detección de una única mutación genética.

    Además, la PCR ha revolucionado enormemente el potencial de diagnóstico de las enfermedades infecciosas, ya que se puede utilizar para determinar rápidamente la identidad de los microbios que tradicionalmente no se podían cultivar o que requerían semanas para crecer. Los patógenos que se detectan habitualmente mediante PCR incluyen Mycobacterium tuberculosis, virus de inmunodeficiencia humana, virus del herpes simple, sífilis e innumerables otros patógenos. Además, la qPCR no solo se utiliza para probar la presencia cualitativa de microbios, sino también para cuantificar las cargas bacterianas, fúngicas y virales.

    La sensibilidad de las herramientas de diagnóstico para mutaciones de oncogenes y genes de supresión de tumores se ha mejorado al menos 10.000 veces gracias a la PCR, lo que permite un diagnóstico más temprano de cánceres como la leucemia. La PCR también ha permitido terapias más matizadas e individualizadas para pacientes con cáncer. Además, la PCR se puede utilizar para la tipificación de tejidos que es vital para la implantación de órganos e incluso se ha propuesto como un reemplazo de las pruebas basadas en anticuerpos para el tipo de sangre. La PCR también tiene aplicaciones clínicas en el campo de las pruebas prenatales para diversas enfermedades genéticas y / o patologías clínicas. Las muestras se obtienen mediante amniocentesis o muestreo de vellosidades coriónicas.

    En la medicina forense, los fragmentos cortos de ADN repetido altamente polimórfico, las repeticiones cortas en tándem acuñadas (STR), se amplifican y se utilizan para comparar variaciones específicas dentro de los genes para diferenciar a los individuos. [9] Los cebadores específicos para los loci de estos STR se utilizan y amplifican mediante PCR. Varios loci contienen STR en el genoma humano, y el poder estadístico de esta técnica se mejora al verificar múltiples sitios.

    Síntesis de genes

    Síntesis de genes artificiales, a veces conocido como Impresión de ADN es un método de biología sintética que se utiliza para crear genes artificiales en el laboratorio. Basado en la síntesis de ADN en fase sólida, se diferencia de la clonación molecular y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en que no tiene que comenzar con secuencias de ADN preexistentes. Por lo tanto, es posible hacer una molécula de ADN de doble hebra completamente sintética sin límites aparentes ni en la secuencia ni en el tamaño de nucleótidos.

    El método se ha utilizado para generar cromosomas funcionales bacterianos o de levadura que contienen aproximadamente un millón de pares de bases. La creación de nuevos pares de nucleobase además de los dos pares de bases en la naturaleza podría expandir enormemente el código genético.

    La síntesis del primer gen completo, un ARNt de levadura, fue demostrada por Har Gobind Khorana y colaboradores en 1972. La síntesis de los primeros genes codificadores de péptidos y proteínas se realizó en los laboratorios de Herbert Boyer y Alexander Markham, respectivamente.

    Los servicios comerciales de síntesis de genes ya están disponibles. Los enfoques se basan en la mayoría de los casos en una combinación de técnicas de química orgánica y biología molecular y pueden sintetizarse genes completos & # 8220 de novo & # 8221, sin la necesidad de una plantilla de ADN. La síntesis de genes es una herramienta importante en muchos campos de la tecnología del ADN recombinante, incluida la expresión de genes heterólogos, el desarrollo de vacunas, la terapia génica y la ingeniería molecular. La síntesis de secuencias de ácido nucleico puede ser más económica que los procedimientos clásicos de clonación y mutagénesis. También es una herramienta de ingeniería poderosa y flexible para crear y diseñar nuevas secuencias de ADN y funciones de proteínas.

    Optimización de genes

    Si bien la capacidad de producir tramos de ADN cada vez más largos de manera eficiente y a precios más bajos es un motor tecnológico de este campo, cada vez se presta más atención a mejorar el diseño de genes para fines específicos. Al principio de la era de la secuenciación del genoma, la síntesis de genes se utilizó como una fuente (cara) de ADNc que se predijo mediante información de ADNc genómico o parcial, pero que era difícil de clonar. A medida que se dispone de fuentes de ADNc clonado de secuencia verificada de mayor calidad, esta práctica se ha vuelto menos urgente.

    Producir grandes cantidades de proteína a partir de secuencias de genes (o al menos las regiones codificantes de proteínas de los genes, el marco de lectura abierto) que se encuentra en la naturaleza a veces puede resultar difícil y es un problema de suficiente impacto para que se hayan dedicado conferencias científicas al tema. Muchas de las proteínas más interesantes buscadas por los biólogos moleculares normalmente están reguladas para expresarse en cantidades muy bajas en células de tipo salvaje. El rediseño de estos genes ofrece un medio para mejorar la expresión génica en muchos casos. Es posible reescribir el marco de lectura abierto debido a la degeneración del código genético. Por tanto, es posible cambiar hasta aproximadamente un tercio de los nucleótidos en un marco de lectura abierto y seguir produciendo la misma proteína. El número disponible de diseños alternativos posibles para una proteína dada es astronómico. Para una secuencia de proteína típica de 300 aminoácidos, hay más de 10 150 combinaciones de codones que codificarán una proteína idéntica. La optimización de codones, o la sustitución de codones poco utilizados por codones más comunes, a veces tiene efectos dramáticos. También se pueden incluir optimizaciones adicionales, como la eliminación de estructuras secundarias de ARN. Al menos en el caso de E. coli, la expresión de proteínas se maximiza utilizando predominantemente codones correspondientes al ARNt que retienen la carga de aminoácidos durante la inanición. Los programas de computadora escritos para realizar estas y otras optimizaciones simultáneas se utilizan para manejar la enorme complejidad de la tarea. Un gen bien optimizado puede mejorar la expresión de proteínas de 2 a 10 veces y, en algunos casos, se han informado mejoras de más de 100 veces. Debido a la gran cantidad de cambios de nucleótidos realizados en la secuencia de ADN original, la única forma práctica de crear los genes de nuevo diseño es mediante la síntesis de genes.

    Síntesis de oligonucleótidos

    Los oligonucleótidos se sintetizan químicamente utilizando componentes básicos llamados fosforamiditas de nucleósidos. Estos pueden ser nucleósidos normales o modificados que tienen grupos protectores para evitar que sus aminas, grupos hidroxilo y grupos fosfato interactúen incorrectamente. Se añade una fosforamidita a la vez, se desprotege el grupo hidroxilo 5 & # 8242 y se añade una nueva base y así sucesivamente. La cadena crece en la dirección 3 & # 8242 a 5 & # 8242, que es hacia atrás en relación con la biosíntesis de ADN. en vivo. Al final, se eliminan todos los grupos protectores.

    Figura 5.13 Ciclo de síntesis de oligodesoxinucleótidos de fosforamidita de cuatro pasos. El método de la fosforamidita, iniciado por Marvin Caruthers a principios de la década de 1980 y mejorado por la aplicación de la tecnología de fase sólida y la automatización, está ahora firmemente establecido como el método de elección. La síntesis de oligonucleótidos de fosforamidita avanza en la dirección 3 a 5 (opuesta a la dirección 5 a 3 de la biosíntesis del ADN en la replicación del ADN). Se agrega un nucleótido por ciclo de síntesis. El ciclo de síntesis de ADN de fosforamidita consta de una serie de pasos que se describen en la figura

    Sin embargo, al tratarse de un proceso químico, se producen varias interacciones incorrectas que dan lugar a algunos productos defectuosos. Cuanto más larga sea la secuencia de oligonucleótidos que se está sintetizando, más defectos habrá, por lo que este proceso solo es práctico para producir secuencias cortas de nucleótidos. El límite práctico actual es de aproximadamente 200 pb (pares de bases) para un oligonucleótido con calidad suficiente para usarse directamente para una aplicación biológica. Se puede utilizar HPLC para aislar productos con la secuencia adecuada. Mientras tanto, se puede sintetizar una gran cantidad de oligos en paralelo en chips genéticos. Para un rendimiento óptimo en los procedimientos posteriores de síntesis de genes, deben prepararse individualmente y en escalas mayores.

    Síntesis de ADN y biología sintética.

    La significativa caída en el costo de la síntesis de genes en los últimos años debido a la creciente competencia de las empresas que brindan este servicio ha llevado a la capacidad de producir plásmidos bacterianos completos que nunca han existido en la naturaleza. El campo de la biología sintética utiliza la tecnología para producir circuitos biológicos sintéticos, que son tramos de ADN manipulados para cambiar la expresión génica dentro de las células y hacer que la célula produzca un producto deseado.

    La capacidad de producir ADN sintéticamente permitirá el desarrollo de productos medioambientales, médicos y comercialmente relevantes. Por ejemplo, en 2015, Novartis, en colaboración con Synthetic Genomics Vaccines inc. y la Autoridad de Desarrollo e Investigación Biomédica Avanzada de EE. UU., anunciaron que habían creado efectivamente una vacuna contra la influenza de ADN sintético. Las nuevas vacunas de ADN sintético prometen ofrecer una alternativa a las actuales vacunas convencionales producidas en huevos que pueden verse afectadas por una baja eficacia.

    Las vacunas de ADN pueden evitar muchos problemas asociados con la producción de vacunas a base de huevo al generar proteínas virales dentro de las células huésped. Para crear una vacuna de ADN, se clona un gen que codifica un antígeno en un plásmido de expresión no replicativo, que se administra al huésped mediante las rutas de vacunación tradicionales. Las células hospedadoras que captan el plásmido expresan el antígeno de la vacuna que puede presentarse a las células inmunitarias a través de las vías del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). La activación de las células T auxiliares CD4 + después de la presentación del MHC de clase II de la proteína de la vacuna de ADN secretada es fundamental para la producción de anticuerpos específicos de antígeno (Figura 5.14).

    Figura 5.14 Creación de una vacuna de ADN. Un gen antigénico se sintetiza y se clona en un vector plasmídico. (Los pasos relacionados con el proceso de clonación se describen con más detalle en la sección 5.3). La vacuna de ADN se entrega al huésped, donde se expresará para producir y presentar antígeno al sistema inmunológico del huésped.

    Después de dos décadas de investigación, la tecnología de las vacunas de ADN está ganando madurez; actualmente, varias vacunas de ADN veterinarias están autorizadas para el virus del Nilo Occidental y el melanoma y, significativamente, la primera vacuna comercial de ADN contra el H5N1 en pollos ha sido aprobada condicionalmente recientemente por el USDA.Además, los grandes ensayos con animales en curso de vacunas de ADN contra otras enfermedades como el VIH, la hepatitis y el virus del Zika ofrecen información valiosa que se puede aplicar al diseño de vacunas de ADN contra la influenza. Han surgido enfoques prometedores a partir de numerosos estudios que evalúan diferentes formulaciones de vacunas de ADN y sistemas de administración, pero aún no ha surgido una estrategia que genere protección contra la influenza de manera consistente en modelos animales grandes. La entrega exitosa de plásmidos y el uso de adyuvantes apropiados siguen siendo desafíos clave que deben abordarse antes de que las vacunas de ADN contra la influenza sean efectivas para uso humano.

    5.2 Bioinformática

    Se ha observado una revolución sin precedentes en la ciencia con los avances tecnológicos recientes, que han proporcionado una gran cantidad de datos "ómicos". La creciente generación y disponibilidad de esta información disponible en bases de datos públicas fue, y sigue siendo, un desafío para los profesionales de diferentes áreas. Sin embargo, ¿cuál es el desafío? En biología, el principal desafío es dar sentido a la enorme cantidad de datos y secuencias estructurales que se han generado en múltiples niveles de sistemas biológicos. Aún así, en bioinformática, es necesario el desarrollo de herramientas (estadísticas y computacionales) capaces de ayudar a comprender los mecanismos subyacentes a las cuestiones biológicas del estudio. Además, si consideramos la complejidad de la ciencia, esta es una visión muy reduccionista. La era de una “nueva biología” surge acompañada por el nacimiento / desarrollo de otras ciencias, como la bioinformática y la biología computacional, que tienen una interfaz integrada de biología molecular. Aunque se consideró recientemente, la bioinformática y la genómica han evolucionado de manera interdependiente y han promovido un impacto histórico en el conocimiento disponible.

    La bioinformática, una ciencia híbrida que vincula datos biológicos con técnicas de almacenamiento, distribución y análisis de información para respaldar múltiples áreas de investigación científica, incluida la biomedicina. Se trata principalmente de biología y genética molecular, informática, matemáticas y estadística. Los problemas biológicos a gran escala y con uso intensivo de datos se abordan desde un punto de vista computacional. La bioinformática se alimenta de experimentos de generación de datos de alto rendimiento, que incluyen determinaciones de secuencias genómicas y mediciones de patrones de expresión génica. Los proyectos de bases de datos seleccionan y anotan los datos y luego los distribuyen a través de la World Wide Web. La extracción de estos datos conduce a descubrimientos científicos y a la identificación de nuevas aplicaciones clínicas.

    Una solución bioinformática generalmente implica los siguientes pasos:

    • Recopilar estadísticas de datos biológicos
    • Construye un modelo computacional
    • Resolver un problema de modelado computacional
    • Probar y evaluar un algoritmo computacional

    También aborda los siguientes aspectos:

    • Tipos de información biológica y bases de datos
    • Análisis de secuencia y modelado molecular
    • Análisis genómico
    • Biologia de sistemas

    En el campo de la medicina en particular, se han descubierto varias aplicaciones importantes para la bioinformática. Por ejemplo, se utiliza para identificar correlaciones entre secuencias de genes y enfermedades, para predecir estructuras de proteínas a partir de secuencias de aminoácidos, para ayudar en el diseño de nuevos fármacos y para adaptar tratamientos a pacientes individuales en función de sus secuencias de ADN (farmacogenómica). En bioinformática, ahora podemos realizar análisis globales de todos los datos disponibles con el objetivo de descubrir principios comunes que se aplican en muchos sistemas y resaltar características novedosas.

    Algunas aplicaciones de la bioinformática en biotecnología se detallan a continuación:

    Genómica

    Para gestionar una cantidad cada vez mayor de información genómica, se requieren herramientas bioinformáticas para mantener y analizar las secuencias de ADN de diferentes organismos. Determinación de homología de secuencia, búsqueda de genes, identificación de región codificante, análisis estructural y funcional de secuencias genómicas, etc., todo esto es posible mediante el uso de diferentes herramientas bioinformáticas y paquetes de software.

    A continuación se muestra una lista de algunas herramientas bioinformáticas utilizadas en genómica (Tabla 5.1).

    Tabla 5.1 Herramientas / bases de datos bioinformáticas utilizadas en genómica

    Herramientas de bioinformática Objetivo
    Carrie Base de datos de redes reguladoras transcripcionales
    CisML Herramienta de detección de motivos
    ICSF Identificación de características estructurales conservadas en sitios de unión de TF
    zarigüeya Herramienta para la búsqueda de motivos
    Promotor Herramienta de extracción de promotores de organismos eucariotas
    REPFIND Determinar repeticiones agrupadas en fragmentos de ADN
    Cluster ‐ Buster Herramienta para predecir grupos de motivos en secuencias de ADN
    Cister Encuentra regiones reguladoras en fragmentos de ADN.
    Trébol Encuentra motivos sobrerrepresentados en secuencias de ADN
    GLAM Herramienta para predecir motivos funcionales
    MotifViz Identificación de motivos sobrerrepresentados
    NECorr Herramienta para analizar datos de expresión génica
    VAGABUNDO Predice motivos sobrerrepresentados en fragmentos de ADN
    SeqVISTA Herramienta de visor de secuencias
    DNADynamo Herramienta para encontrar factores de transcripción con sitios de unión sobrerrepresentados en las regiones aguas arriba de genes humanos coexpresados

    Genómica comparada

    La bioinformática juega un papel importante en la genómica comparada al determinar la relación genómica estructural y funcional entre diferentes especies biológicas.

    A continuación se muestra una lista de algunas herramientas bioinformáticas utilizadas en genómica comparada (Tabla 5.2).

    Tabla 5.2 Herramientas de bioinformática / bases de datos utilizadas en genómica comparativa

    Herramientas de bioinformática Objetivo
    EXPLOSIÓN Herramienta de alineación de secuencias de ADN o proteínas
    HMMER Herramienta de búsqueda de secuencias de proteínas homólogas
    Clúster Omega Herramienta de alineaciones de secuencia múltiple
    Sequerome Herramienta de creación de perfiles de secuencia
    ProtParam Predice las propiedades físico-químicas de las proteínas.
    novoSNP Predice la mutación de un solo punto en las secuencias de ADN
    Buscador de ORF Encontrar un marco de lectura abierto en genes putativos
    Huella virtual Análisis de todo el genoma procariota
    WebGeSTer Predice los sitios de terminación de genes durante la transcripción
    Genscan Encuentra sitios de exón-intrón en secuencias de ADN
    Herramientas de Softberry Herramienta de anotación de genomas junto con la predicción de estructura y función de moléculas biológicas
    MEGA Estudiar la relación evolutiva
    MOLPHY Herramienta de análisis filogenético basada en máxima verosimilitud
    PHYLIP Herramienta para estudios filogenéticos
    JStree Herramienta para ver y editar árboles filogenéticos
    Jalview Es una herramienta de edición de alineación.
    El banco de datos de ADN de Japón Recursos para secuencias de nucleótidos
    Rfam La base de datos contiene una colección de familias de ARN
    Uniprot Base de datos de secuencias de proteínas
    Banco de datos de proteínas La base de datos proporciona datos sobre estructuras de ácidos nucleicos, proteínas, etc.
    PROT SUIZA Base de datos que contiene las secuencias de proteínas anotadas manualmente
    InterPro Proporcionar información sobre familias de proteínas, sus dominios conservados y sitios activos.
    Base de datos de identificaciones proteómicas Contiene datos sobre la caracterización funcional y la modificación posterior a la traducción de proteínas y péptidos.
    Ensembl Base de datos que contiene genomas anotados de eucariotas, incluidos humanos, ratones y otros vertebrados
    Medherb Base de datos de hierbas medicinales

    Proteómica:

    Las técnicas avanzadas de base molecular llevaron a la acumulación de enormes datos proteómicos de patrones de actividad de proteínas, interacciones, perfiles, composición, información estructural, análisis de imágenes, huellas dactilares de masas de péptidos, huellas dactilares de fragmentación de péptidos, etc. Estos enormes datos podrían gestionarse utilizando diferentes herramientas de bioinformática .

    A continuación se muestra una lista de algunas herramientas bioinformáticas utilizadas en proteómica (Tabla 5.3).

    Tabla 5.3 Herramientas / Bases de datos de bioinformática utilizadas en proteómica.

    Herramientas de bioinformática Objetivo
    K2 / RÁPIDO Herramienta de alineación de la estructura de proteínas
    SMM Herramienta para determinar la unión de péptidos al complejo principal de histocompatibilidad
    ZDOCK Herramienta de acoplamiento proteína-proteína
    Benchmark de acoplamiento Herramienta para evaluar el rendimiento de los algoritmos de acoplamiento
    Servidor ZDOCK Un servidor automatizado para ejecutar ZDOCK
    MELANIE Análisis proteómico para analizar imágenes 2D-Gel

    Descubrimiento de medicamento

    La bioinformática clínica es un nuevo campo emergente de la bioinformática que emplea diversas herramientas bioinformáticas, como el diseño de fármacos asistido por computadora para diseñar fármacos novedosos, vacunas, modelado de fármacos de ADN y en silico pruebas de drogas para producir medicamentos nuevos y eficaces en un período de tiempo más corto con menores riesgos.

    Investigación y análisis del cáncer

    Las herramientas bioinformáticas como NCI, NCIP (parte de NCI) y CBIIT han jugado un papel importante en genómica, proteómica, imagenología y metabolómica para incrementar nuestro conocimiento de las bases moleculares del cáncer.

    Estudios filogenéticos

    Utilizando numerosas herramientas bioinformáticas, el análisis filogenético de los datos moleculares se puede lograr fácilmente en un corto período de tiempo mediante la construcción de árboles filogenéticos para estudiar su relación evolutiva basada en la alineación de secuencias.

    Ciencia forense

    Varias bases de datos constan de perfiles de ADN de delincuentes conocidos. Los avances en la tecnología de microarrays, las redes bayesianas y los algoritmos de programación proporcionan un método eficaz de organización e interpretación de la evidencia.

    Biodefensa

    Aunque la bioinformática tiene un impacto limitado en la ciencia forense, ya que se necesitan algoritmos y aplicaciones computacionales más avanzados para que las bases de datos establecidas puedan exhibir interoperabilidad entre sí.

    Nutrigenómica

    Los avances en la genómica estructural / funcional y las tecnologías moleculares, como la secuenciación del genoma y los microarrays de ADN, generan un conocimiento valioso que explica la nutrición en relación con la genética de un individuo que influye directamente en su metabolismo. Debido a la afluencia de herramientas bioinformáticas, la investigación relacionada con la nutrición ha aumentado enormemente.

    La expresion genica

    La regulación de la expresión génica es el núcleo de la genómica funcional que permite a los investigadores aplicar datos genómicos a tecnologías moleculares que pueden cuantificar la cantidad de genes que transcriben activamente en cualquier célula en cualquier momento (por ejemplo, matrices de expresión génica).

    A continuación se muestra una lista de algunas herramientas bioinformáticas utilizadas en el estudio de expresión génica. Tabla 5.4.

    Tabla 5.4 Herramientas / bases de datos bioinformáticas utilizadas en la expresión genética

    Herramientas de bioinformática Objetivo
    GeneChords Herramienta de recuperación de genes conservados
    Bioconductor Proporciona herramientas para el análisis de datos genómicos de alto rendimiento.
    GXD Base de datos de expresión génica para el ratón de laboratorio
    Buscador de repeticiones invertidas Encuentra repeticiones invertidas en el ADN genómico
    BU ORCHID La base de datos almacena datos de escisión de radicales hidroxilo de secuencias de ADN
    ODB Predice agrupaciones de genes funcionales
    Soporte de pliegue de ARN Predice la estructura del ARN basándose en mutaciones en los alelos
    CellNetVis Herramienta de visualización de redes y complejos biológicos
    Buscador de repetición en tándem Encuentra repeticiones en tándem en el ADN genómico
    VisANT Herramientas para visualizar y analizar muchas interacciones biológicas.
    PROMOCIÓN Identificación de los sitios de unión del factor de transcripción.
    ConTra V.3 Detección del sitio de unión del factor de transcripción

    Mesa remezclada de Kahn, N.T. (2018)

    Calidad de la comida

    Las nuevas mejoras en los algoritmos informáticos y las bases de datos de simulación estructural disponibles de estructuras reconocidas han llevado el modelado molecular a la química alimentaria convencional. Estas simulaciones permitirán mejorar la calidad de los alimentos mediante el desarrollo de nuevos aditivos alimentarios al comprender las bases de la tenacidad, el antagonismo y la complementación del sabor.

    Predicción de la estructura y función de las proteínas

    La predicción de la topología de proteínas ahora es mucho más fácil gracias a la bioinformática que ayuda en la predicción de la estructura 3D de una proteína para obtener una idea de su función también.

    A continuación se muestra una lista de algunas herramientas bioinformáticas utilizadas en la estructura de proteínas y la predicción de funciones. Tabla 5.

    Tabla 5.5 Herramientas / bases de datos bioinformáticas utilizadas en la predicción de la estructura y función de las proteínas

    Herramientas de bioinformática Objetivo
    CATH Herramienta para la organización categorizada de proteínas
    Phyre2 Herramienta para la predicción de la estructura de proteínas
    HMMSTR Para la predicción de correlaciones secuencia-estructura en proteínas.
    MODELADOR Predice la estructura 3D de la proteína
    JPRED / APSSP2 Predice estructuras secundarias de proteínas.
    RaptorX Predice la estructura de las proteínas
    CUARC Predice la estructura de las proteínas

    Mesa remezclada de Kahn, N.T. (2018)

    Medicina personalizada

    Los médicos podrán analizar el perfil genético de un paciente y prescribir la mejor terapia farmacológica y la mejor dosis disponibles desde el principio mediante el empleo de una herramienta bioinformática.

    Aplicaciones del genoma microbiano

    Los microbios se han estudiado a un nivel muy básico con la ayuda de herramientas bioinformáticas necesarias para analizar su conjunto único de genes que les permite sobrevivir en condiciones desfavorables.

    5.3 Clonación y expresión recombinante

    Para lograr las aplicaciones descritas anteriormente, los bioquímicos deben poder extraer, manipular y analizar ácidos nucleicos. Para comprender las técnicas básicas que se utilizan para trabajar con ácidos nucleicos, recuerde que los ácidos nucleicos son macromoléculas compuestas por nucleótidos (un azúcar, un fosfato y una base nitrogenada). Los grupos fosfato de estas moléculas tienen cada uno una carga neta negativa. Un conjunto completo de moléculas de ADN en el núcleo de organismos eucariotas se llama genoma. El ADN tiene dos hebras complementarias unidas por enlaces de hidrógeno entre las bases emparejadas.

    A diferencia del ADN de las células eucariotas, las moléculas de ARN abandonan el núcleo. El ARN mensajero (ARNm) se analiza con mayor frecuencia porque representa los genes que codifican proteínas que se expresan en la célula.

    Las técnicas de aislamiento de ADN se han descrito en la sección 5.1 y son el primer paso utilizado para estudiar o manipular ácidos nucleicos. El ARN también se puede extraer y estudiar para comprender los patrones de expresión génica en las células. El ARN es naturalmente muy inestable porque las enzimas que descomponen el ARN están comúnmente presentes en la naturaleza. Algunos incluso son secretados por nuestra propia piel y son muy difíciles de inactivar. Durante la extracción de ARN, se utilizan inhibidores de ARNasa y el tratamiento especial de la cristalería para reducir el riesgo de destruir la muestra durante el aislamiento.

    Electroforesis en gel

    Debido a que los ácidos nucleicos son iones cargados negativamente a pH neutro o alcalino en un ambiente acuoso, pueden ser movidos por un campo eléctrico. La electroforesis en gel es una técnica que se utiliza para separar moléculas cargadas en función del tamaño y la carga. Los ácidos nucleicos se pueden separar como cromosomas completos o como fragmentos. Los ácidos nucleicos se cargan en una ranura en un extremo de una matriz de gel, se aplica una corriente eléctrica y las moléculas cargadas negativamente se empujan hacia el extremo opuesto del gel (el extremo con el electrodo positivo). Las moléculas más pequeñas se mueven a través de los poros del gel más rápido que las moléculas más grandes. Esta diferencia en la velocidad de migración separa los fragmentos en función del tamaño. Los ácidos nucleicos en una matriz de gel son invisibles hasta que se tiñen con un compuesto que les permite ser vistos, como un tinte. Los distintos fragmentos de ácidos nucleicos aparecen como bandas a distancias específicas desde la parte superior del gel (el extremo del electrodo negativo) que se basan en su tamaño (Figura 5.15). Una mezcla de muchos fragmentos de diferentes tamaños aparece como un frotis largo, mientras que el ADN genómico sin cortar suele ser demasiado grande para pasar a través del gel y forma una única banda grande en la parte superior del gel.

    Figura 5.15 Electroforesis en gel de ADN. Se muestran fragmentos de ADN de seis muestras procesadas en un gel, teñidas con un tinte fluorescente y vistas bajo luz ultravioleta. (crédito: modificación del trabajo de James Jacob, Tompkins Cortland Community College)

    Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

    Los detalles de la PCR se analizan en la sección 5.1. Esta técnica se utiliza en la clonación de ADN para aumentar rápidamente el número de copias de regiones específicas de ADN.

    Clonación

    En general, la clonación significa la creación de una réplica perfecta. Por lo general, la palabra se usa para describir la creación de una copia genéticamente idéntica. En biología, la recreación de un organismo completo se conoce como "clonación reproductiva". Mucho antes de que se hicieran intentos de clonar un organismo completo, los investigadores aprendieron a copiar tramos cortos de ADN, un proceso que se conoce como clonación molecular.

    La clonación molecular permite la creación de múltiples copias de genes, expresión de genes y estudio de genes específicos. Para introducir el fragmento de ADN en una célula bacteriana en una forma que se copiará o expresará, primero se inserta el fragmento en un vector de clonación.

    A vector de clonación es un pequeño fragmento de ADN que se puede mantener de forma estable en un organismo y en el que se puede insertar un fragmento de ADN extraño con fines de clonación. El vector de clonación puede ser ADN tomado de un virus, la célula de un organismo superior o puede ser el plásmido de una bacteria. Por lo tanto, el vector contiene características que permiten la inserción o eliminación conveniente de un fragmento de ADN hacia o desde el vector, por ejemplo, tratando el vector y el ADN extraño con una enzima de restricción que corta el ADN. Los fragmentos de ADN así generados contienen extremos romos o salientes conocidos como extremos pegajosos, y el ADN del vector y el ADN extraño con extremos compatibles se pueden unir mediante ligación molecular. Una vez que se ha clonado un fragmento de ADN en un vector de clonación, puede subclonarse adicionalmente en otro vector diseñado para un uso más específico.

    Hay muchos tipos de vectores de clonación, pero los más utilizados son los plásmidos modificados genéticamente. La clonación generalmente se realiza primero usando Escherichia coliy vectores de clonación en E. coli incluyen plásmidos, bacteriófagos (como el fago λ), cósmidos y cromosomas artificiales bacterianos (BAC). Sin embargo, parte del ADN no se puede mantener de forma estable en E. coli, por ejemplo, fragmentos de ADN muy grandes. Para estos estudios, se pueden utilizar otros organismos como la levadura. Los vectores de clonación en levadura incluyen cromosomas artificiales de levadura (YAC).

    Figura 5.16 Ejemplo de un vector de clonación común.

    Todos los vectores de clonación comúnmente usados ​​en biología molecular tienen características clave necesarias para su función, como un sitio de clonación adecuado con enzimas de restricción y un marcador seleccionable. Otros pueden tener características adicionales específicas para su uso. Por razones de facilidad y conveniencia, la clonación se realiza a menudo utilizando E. coli. Así, los vectores de clonación utilizados suelen tener elementos necesarios para su propagación y mantenimiento en E. coli, como un funcional origen de replicación (ori). El origen de replicación de ColE1 se encuentra en muchos plásmidos. Algunos vectores también incluyen elementos que les permiten mantenerse en otro organismo además de E. coli, y estos vectores se llaman vectores de lanzadera.

    Sitio de clonación

    Todos los vectores de clonación tienen características que permiten insertar o eliminar convenientemente un gen en el vector. Esto puede ser un sitio de clonación múltiple (MCS) o polienlazador, que contiene muchos sitios de restricción únicos. Los sitios de restricción en el MCS primero se escinden mediante enzimas de restricción, luego un gen diana amplificado por PCR también digerido con las mismas enzimas se liga en los vectores usando ADN ligasa. La secuencia de ADN diana se puede insertar en el vector en una dirección específica si así se desea. Los sitios de restricción pueden usarse adicionalmente para subclonar en otro vector si es necesario.

    Otros vectores de clonación pueden usar topoisomerasa en lugar de ligasa y la clonación puede realizarse más rápidamente sin la necesidad de una digestión por restricción del vector o inserto.En este método de clonación TOPO, un vector linealizado se activa uniendo la topoisomerasa I a sus extremos, y este vector & # 8220TOPO activado & # 8221 puede aceptar un producto de PCR ligando ambos extremos 5 & # 8242 del producto de PCR, liberando la topoisomerasa y formando un vector circular en el proceso. Otro método de clonación sin el uso de digestión de ADN y ligasa es mediante recombinación de ADN, por ejemplo, como se usa en el sistema de clonación Gateway. El gen, una vez clonado en el vector de clonación (denominado clon de entrada en este método), puede introducirse convenientemente en una variedad de vectores de expresión mediante recombinación.

    Enzimas de restricción

    Enzimas de restricción (también llamadas endonucleasas de restricción) reconocen secuencias de ADN específicas y las cortan de una manera predecible; son producidas naturalmente por bacterias como mecanismo de defensa contra ADN extraño.

    Como su nombre lo indica, las endonucleasas de restricción (o enzimas de restricción) son "restringido”En su capacidad para cortar o digerir el ADN. La restricción que es útil para los bioquímicos suele ser una palíndromo Secuencia de ADN. Las secuencias palindrómicas son la misma secuencia hacia adelante y hacia atrás. Algunos ejemplos de palíndromos: COCHE DE CARRERAS, CIVIC, UN HOMBRE A PLAN A CANAL PANAMÁ. Con respecto al ADN, hay 2 hebras que corren antiparalelas entre sí. Por lo tanto, el complemento inverso de una hebra es idéntica a la otra.

    Al igual que con la palabra palíndromo, esto significa que la secuencia palindrómica del ADN se lee igual hacia adelante y hacia atrás. En la mayoría de los casos, la secuencia se lee igual hacia adelante en una hebra y hacia atrás en la hebra complementaria. Los RE a menudo cortan el ADN en un patrón escalonado. Cuando se hace un corte escalonado en una secuencia, los voladizos son complementarios (Figura 5.17).

    Figura 5.17 Secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción. En este (a) sitio de reconocimiento de la enzima de restricción de seis nucleótidos, observe que la secuencia de seis nucleótidos se lee igual en la dirección 5 ′ a 3 ′ en una hebra que en la dirección 5 ′ a 3 ′ en la hebra complementaria. Esto se conoce como palíndromo. (b) La enzima de restricción rompe las hebras de ADN y (c) el corte en el ADN da como resultado "extremos pegajosos". Otro trozo de ADN cortado en cada extremo por la misma enzima de restricción podría adherirse a estos extremos pegajosos e insertarse en el espacio formado por este corte.

    Los biólogos moleculares también tienden a usar estas tijeras moleculares especiales que reconocen palíndromos de 6 u 8. Al usar cortadores de 6 u 8 cortadores, las secuencias ocurren a lo largo de grandes tramos rara vez, pero con la frecuencia suficiente para ser de utilidad.

    EcoRI genera puntas pegajosas de cohesión SmaI genera extremos romos

    Figura 5.18 Enzimas de restricción. Las enzimas de restricción reconocen secuencias palindrómicas en el ADN e hidrolizan los enlaces fosfodiéster covalentes del ADN para dejar extremos “pegajosos / cohesivos” o extremos “romos”. Esta distinción en el corte es importante porque una EcoRI El extremo adhesivo se puede usar para unir un trozo de ADN cortado con la misma enzima para pegarlos o ligarlos nuevamente. Mientras que las endonucleasas cortan el ADN, ligasas únalas de nuevo. ADN digerido con EcoRI se puede ligar de nuevo junto con otro trozo de ADN digerido con EcoRI, pero no a una pieza digerida con SmaI. Otro cortador contundente es EcoRV con una secuencia de reconocimiento de GAT | ATC.

    Marcador seleccionable

    El vector lleva un marcador seleccionable para permitir la selección de células transformadas positivamente. La resistencia a los antibióticos se usa a menudo como marcador, un ejemplo es el gen de la betalactamasa, que confiere resistencia al grupo de la penicilina de los antibióticos betalactámicos como la ampicilina. Algunos vectores contienen dos marcadores seleccionables, por ejemplo, el plásmido pACYC177 tiene genes de resistencia tanto a ampicilina como a kanamicina. Los vectores lanzadera que están diseñados para mantenerse en dos organismos diferentes también pueden requerir dos marcadores seleccionables, aunque algunos marcadores seleccionables como la resistencia a zeocina e higromicina B son efectivos en diferentes tipos de células. También se pueden usar marcadores de selección auxotróficos que permiten que un organismo auxotrófico crezca en un medio de crecimiento mínimo. LEU2 y URA3 que se utilizan con sus correspondientes cepas auxotróficas de levadura.

    Otro tipo de marcador seleccionable permite la selección positiva de plásmido con gen clonado. Esto puede implicar el uso de un gen letal para las células huésped, como barnasa, Ccda y las toxinas parD / parE. Por lo general, esto funciona interrumpiendo o eliminando el gen letal durante el proceso de clonación, y los clones fallidos donde el gen letal aún permanece intacto matarían las células huésped, por lo tanto, solo se seleccionan los clones exitosos.

    Genes reporteros

    Los genes indicadores se utilizan en algunos vectores de clonación para facilitar el cribado de clones exitosos mediante el uso de características de estos genes que permiten identificar fácilmente el clon exitoso. Tales características presentes en los vectores de clonación pueden ser la lacZfragmento α para la complementación α en la selección azul-blanca, y / o gen marcador o genes indicadores en el marco y flanqueando el MCS para facilitar la producción de proteínas de fusión. Ejemplos de socios de fusión que pueden usarse para la detección son la proteína verde fluorescente (GFP) y la luciferasa.

    Figura 5.19 Genes reporteros. En este diagrama, la proteína de fluorescencia verde se utiliza como gen indicador para estudiar secuencias reguladoras aguas arriba.

    Elementos de expresión

    Si se desea la expresión del gen diana, entonces un vector de clonación también debe contener elementos adecuados para la expresión del gen diana clonado, incluido un promotor y un sitio de unión ribosómico (RBS). El ADN diana puede insertarse en un sitio que está bajo el control de un promotor particular necesario para la expresión del gen diana en el hospedador elegido. Cuando el promotor está presente, la expresión del gen se controla de manera estricta e inducible, de modo que las proteínas solo se producen cuando se requieren. Algunos promotores de uso común son el T7 y laca promotores. La presencia de un promotor es necesaria cuando se utilizan técnicas de cribado como la selección azul-blanca.

    A veces se utilizan vectores de clonación sin promotor y RBS para la secuencia de ADN clonado, por ejemplo, cuando se clonan genes cuyos productos son tóxicos para E. coli células. El promotor y el RBS para la secuencia de ADN clonado también son innecesarios cuando se hace por primera vez una biblioteca genómica o de ADNc de clones, ya que los genes clonados normalmente se subclonan en un vector de expresión más apropiado si se requiere su expresión.

    Tipos de vectores de clonación

    Hay una gran cantidad de vectores de clonación disponibles y la elección del vector correcto puede depender de varios factores, como el tamaño del inserto, el número de copias y el método de clonación. Es posible que los insertos de ADN grandes no se mantengan de forma estable en un vector de clonación general, especialmente para aquellos con un número alto de copias, por lo que la clonación de fragmentos grandes puede requerir un vector de clonación más especializado.

    Los plásmidos replican de forma autónoma ADN extracromosómico circular. Son los vectores de clonación estándar y los más utilizados. La mayoría de los plásmidos generales pueden usarse para clonar insertos de ADN de hasta 15 kb de tamaño. Muchos plásmidos tienen un alto número de copias, por ejemplo, pUC19 que tiene un número de copias de 500-700 copias por célula, y un alto número de copias es útil ya que produce un mayor rendimiento de plásmido recombinante para la manipulación posterior. Sin embargo, los plásmidos de bajo número de copias se pueden usar preferiblemente en determinadas circunstancias, por ejemplo, cuando la proteína del gen clonado es tóxica para las células.

    Bacteriófago

    Los bacteriófagos más comúnmente utilizados para la clonación son el fago lambda (λ) y el fago M13. Existe un límite superior en la cantidad de ADN que se puede empaquetar en un fago (un máximo de 53 kb). El genoma medio del fago lambda es de aproximadamente 48,5 kb (Figura 5.20). Por lo tanto, para permitir la inserción de ADN extraño en el ADN de fagos, es posible que los vectores de clonación de fagos necesiten eliminar algunos de sus genes no esenciales para dejar espacio para el ADN extraño.

    También existe un límite de tamaño más bajo para el ADN que puede empaquetarse en un fago, y el ADN del vector que es demasiado pequeño no puede empaquetarse adecuadamente en el fago. Esta propiedad puede usarse para la selección & # 8211 el vector sin inserto puede ser demasiado pequeño, por lo tanto, solo los vectores con inserto pueden seleccionarse para propagación.

    Figura 5.20 Fago Lambda. (A) Representación esquemática del genoma circular del fago lambda (B) Diagrama de la partícula infecciosa del fago Lambda y (C) Micrografía electrónica del bacteriófago relacionado, vibriophage VvAWI. La barra denota 50 nm de longitud.

    Los cósmidos son plásmidos que incorporan un segmento de ADN del bacteriófago λ que tiene los sitios terminales cohesivos (porque) que contiene elementos necesarios para empaquetar el ADN en partículas λ. Normalmente se utiliza para clonar grandes fragmentos de ADN entre 28 y 45 Kb.

    Cromosoma artificial bacteriano

    Se puede clonar un tamaño de inserto de hasta 350 kb en un cromosoma artificial bacteriano (BAC). Los BAC se mantienen en E. coli con un número de copias de solo 1 por celda. Los BAC se han utilizado a menudo para secuenciar el genoma de organismos en proyectos de genoma, incluido el Proyecto del Genoma Humano. Una pequeña parte del ADN del organismo se amplifica como un inserto en BAC y luego se secuencia. Finalmente, las partes secuenciadas se reorganizan en silico, resultando en la secuencia genómica del organismo. Los BAC se han reemplazado en gran medida en esta capacidad con métodos de secuenciación más rápidos y menos laboriosos, como la secuenciación de escopeta del genoma completo y ahora, más recientemente, la secuenciación de próxima generación.

    Cromosoma artificial de levadura

    Los cromosomas artificiales de levadura se utilizan como vectores para clonar fragmentos de ADN de más de 1 mega base (1 Mb = 1000 kb = 1.000.000 de bases) de tamaño. Son útiles en la clonación de fragmentos de ADN más grandes, según se requiera en el mapeo de genomas, como en el proyecto del genoma humano. Contiene una secuencia telomérica, una secuencia de replicación autónoma (características necesarias para replicar cromosomas lineales en células de levadura). Estos vectores también contienen sitios de restricción adecuados para clonar ADN extraño, así como genes que se utilizarán como marcadores seleccionables.

    Cromosoma artificial humano

    Los cromosomas artificiales humanos pueden ser potencialmente útiles como vectores de transferencia de genes para la entrega de genes en células humanas y una herramienta para estudios de expresión y determinación de la función cromosómica humana. Puede transportar fragmentos de ADN muy grandes (no existe un límite superior de tamaño para fines prácticos), por lo tanto, no tiene el problema de la capacidad de clonación limitada de otros vectores, y también evita una posible mutagénesis insercional causada por la integración en los cromosomas del huésped por virus. vector.

    También se han manipulado vectores virales animales y vegetales que infectan células vegetales y animales para introducir genes extraños en células vegetales y animales. La capacidad natural de los virus para adsorberse en las células, introducir su ADN y replicarse los ha convertido en vehículos ideales para transferir ADN extraño a células eucariotas en cultivo. Se usó un vector basado en el virus Simian 40 (SV40) en el primer experimento de clonación que involucraba células de mamífero. Se han utilizado varios vectores basados ​​en otro tipo de virus como los adenovirus y el virus del papiloma para clonar genes en mamíferos. En la actualidad, los vectores retrovirales son populares para clonar genes en células de mamíferos. En el caso de la transformación de plantas, se han utilizado virus que incluyen el virus del mosaico de la coliflor, el virus del mosaico del tabaco y los virus Géminis con un éxito limitado.

    Resumen de la clonación de ADN

    La figura 5.21 proporciona un resumen de los métodos básicos de clonación más utilizados en los laboratorios de bioquímica. El ADN extraño se aísla o amplifica mediante PCR para obtener suficiente material para el procedimiento de clonación. El ADN se purifica y se corta con enzimas de restricción y luego se mezcla con un vector que se ha cortado con las mismas enzimas de restricción. El ADN se puede volver a coser con ADN ligasa. Luego, el ADN puede transformarse en un sistema huésped, a menudo bacterias, para hacer crecer grandes cantidades del plásmido que contiene el ADN clonado.

    El patrón de fragmentos de restricción y la secuenciación de ADN se pueden usar para validar el material clonado.

    Figura 5.21 Diagrama que muestra los pasos principales de la clonación.

    Para ver un tutorial en video sobre la clonación de ADN, visite: HHMI & # 8211 BioInteractive

    Los plásmidos con ADN extraño insertado en ellos se denominan moléculas de ADN recombinante porque contienen nuevas combinaciones de material genético. Las proteínas que se producen a partir de moléculas de ADN recombinante se denominan proteínas recombinantes. No todos los plásmidos recombinantes son capaces de expresar genes. Los plásmidos también pueden diseñarse para expresar proteínas solo cuando son estimulados por ciertos factores ambientales, de modo que los científicos puedan controlar la expresión de las proteínas recombinantes.

    La clonación reproductiva

    La clonación reproductiva es un método utilizado para hacer un clon o un copia idéntica de un organismo multicelular completo. La mayoría de los organismos multicelulares se reproducen por vía sexual, lo que implica la contribución de ADN de dos individuos (padres), lo que hace imposible generar una copia idéntica o un clon de cualquiera de los padres. Los recientes avances en biotecnología han hecho posible la clonación reproductiva de mamíferos en el laboratorio.

    La reproducción sexual natural implica la unión, durante la fertilización, de un espermatozoide y un óvulo. Cada uno de estos gametos es haploide lo que significa que contienen un conjunto de cromosomas en sus núcleos. La celda resultante, o cigoto, es entonces diploide y contiene dos juegos de cromosomas. Esta célula se divide mitóticamente para producir un organismo multicelular. Sin embargo, la unión de dos células no puede producir un cigoto viable; hay componentes en el citoplasma del óvulo que son esenciales para el desarrollo temprano del embrión durante sus primeras divisiones celulares. Sin estas disposiciones, no habría desarrollo posterior. Por lo tanto, para producir un nuevo individuo, se requieren tanto un complemento genético diploide como un citoplasma de huevo. El método para producir un individuo clonado artificialmente es tomar el óvulo de un individuo y eliminar el núcleo haploide. Luego, se coloca en el óvulo un núcleo diploide de una célula corporal de un segundo individuo, el donante. Luego, se estimula al huevo para que se divida para que prosiga el desarrollo. Esto suena simple, pero de hecho se necesitan muchos intentos antes de que cada uno de los pasos se complete con éxito.

    El primer animal agrícola clonado fue Dolly, una oveja que nació en 1996. La tasa de éxito de la clonación reproductiva en ese momento era muy baja. Dolly vivió seis años y murió de un tumor de pulmón (Figura 5.22). Se especuló que debido a que el ADN celular que dio origen a Dolly provenía de un individuo mayor, la edad del ADN pudo haber afectado su esperanza de vida. Desde Dolly, se han clonado con éxito varias especies de animales (como caballos, toros y cabras).

    Ha habido intentos de producir embriones humanos clonados como fuentes de células madre embrionarias. En el procedimiento, el ADN de un ser humano adulto se introduce en un óvulo humano, que luego se estimula para que se divida. La tecnología es similar a la tecnología que se utilizó para producir Dolly, pero el embrión nunca se implanta en una madre sustituta. Las células producidas se denominan células madre embrionarias porque tienen la capacidad de convertirse en muchos tipos diferentes de células, como células musculares o nerviosas. Las células madre podrían usarse para investigar y, en última instancia, proporcionar aplicaciones terapéuticas, como reemplazar tejidos dañados. El beneficio de la clonación en este caso es que las células utilizadas para regenerar nuevos tejidos coincidirían perfectamente con el donante del ADN original. Por ejemplo, un paciente con leucemia no necesitaría un hermano con un tejido compatible para un trasplante de médula ósea.

    Figura 5.22 La oveja Dolly fue el primer animal agrícola en ser clonado. Para crear Dolly, se extrajo el núcleo de un óvulo de donante. El huevo enucleado se colocó junto a la otra celda, luego se sorprendieron para fusionarse. Se sorprendieron nuevamente al comenzar la división. Se permitió que las células se dividieran durante varios días hasta que se alcanzó una etapa embrionaria temprana, antes de ser implantadas en una madre sustituta.

    ¿Por qué Dolly era una finlandesa Dorset y no una oveja escocesa Blackface?

    Porque a pesar de que la célula original provenía de una oveja escocesa Blackface y la madre sustituta era una escocesa Blackface, el ADN provenía de un Finn-Dorset.

    Ingeniería genética

    El uso de tecnología de ADN recombinante para modificar el ADN de un organismo a fin de lograr rasgos deseables se denomina ingeniería genética. La adición de ADN extraño en forma de vectores de ADN recombinante que se generan mediante clonación molecular es el método más común de ingeniería genética. Un organismo que recibe el ADN recombinante se llama organismo modificado genéticamente (OMG). Si el ADN extraño que se introduce proviene de una especie diferente, el organismo huésped se denomina transgénico. Las bacterias, las plantas y los animales se han modificado genéticamente desde principios de la década de 1970 con fines académicos, médicos, agrícolas e industriales.

    Mire este breve video que explica cómo los científicos crean un animal transgénico.

    Aunque los métodos clásicos de estudiar la función de los genes comenzaron con un fenotipo dado y determinaron la base genética de ese fenotipo, las técnicas modernas permiten a los investigadores comenzar en el nivel de la secuencia de ADN y preguntarse: "¿Qué hace este gen o elemento de ADN?" Esta técnica, llamada genética inversa, ha dado lugar a invertir la metodología genética clásica. Un ejemplo de este método es análogo a dañar una parte del cuerpo para determinar su función. Un insecto que pierde un ala no puede volar, lo que significa que la función del ala es volar. El método genético clásico compara insectos que no pueden volar con insectos que sí pueden volar y observa que los insectos que no vuelan han perdido alas. De manera similar, en un enfoque de genética inversa, la mutación o eliminación de genes proporciona a los investigadores pistas sobre la función de los genes. Alternativamente, la genética inversa puede usarse para hacer que un gen se sobreexprese a sí mismo para determinar qué efectos fenotípicos pueden ocurrir.

    Tecnología CRISPR

    CRISPR representa repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadasy representa una familia de secuencias de ADN que se encuentran dentro de los genomas de organismos procarióticos como bacterias y arqueas. Estas secuencias se derivan de fragmentos de ADN de bacteriófagos que han infectado previamente al procariota y se utilizan para detectar y destruir ADN de fagos similares durante infecciones posteriores. Por tanto, estas secuencias juegan un papel clave en el sistema de defensa antiviral de los procariotas.

    5.23 Estructura cristalina de un complejo de vigilancia guiado por ARN CRISPR, Cascade, unido a un objetivo de ADNss. Sistema CRISPR Cascade subunidades de proteínas CasA, CasB, CasC, CasD y CasE (cian) unidas a CRISPR ARN (verde) y ADN viral (rojo) basado en PDB 4QYZ y renderizado con PyMOL.

    Cas9 (o & # 8220CRISPR-associated protein 9 & # 8221) es una enzima que utiliza secuencias CRISPR como guía para reconocer y escindir hebras específicas de ADN que son complementarias a la secuencia CRISPR. Las enzimas Cas9 junto con las secuencias CRISPR forman la base de una tecnología conocida como CRISPR-Cas9 que se puede utilizar para editar genes dentro de organismos.Este proceso de edición tiene una amplia variedad de aplicaciones que incluyen investigación biológica básica, desarrollo de productos biotecnológicos y tratamiento de enfermedades.

    Figura 5.24 Diagrama del mecanismo de defensa antiviral procariota CRISPR.

    El sistema CRISPR-Cas es un sistema inmunológico procariota que confiere resistencia a elementos genéticos extraños, como los presentes en plásmidos y fagos, que proporciona una forma de inmunidad adquirida. El ARN que alberga la secuencia espaciadora ayuda a las proteínas Cas (asociadas a CRISPR) a reconocer y cortar el ADN patógeno extraño. Otras proteínas Cas guiadas por ARN cortan ARN extraño. CRISPR se encuentran en aproximadamente el 50% de los genomas bacterianos secuenciados y casi el 90% de las arqueas secuenciadas.

    5.4 Microarrays de ADN

    A Micromatriz de ADN(también conocido como chip de ADN o biochip) es una colección de manchas de ADN microscópicas adheridas a una superficie sólida. Los científicos usan microarrays de ADN para medir los niveles de expresión de un gran número de genes simultáneamente o para genotipar múltiples regiones de un genoma. Cada mancha de ADN contiene picomoles (10-12 moles) de una secuencia de ADN específica, conocida como sondas (o reporteros o oligos). Estos pueden ser una sección corta de un gen u otro elemento de ADN que se usa para hibridar una muestra de ADNc o ARNc (también llamado ARN antisentido) (llamado objetivo) en condiciones muy rigurosas. La hibridación sonda-diana generalmente se detecta y cuantifica mediante la detección de dianas marcadas con fluoróforo, plata o quimioluminiscencia para determinar la abundancia relativa de secuencias de ácido nucleico en la diana. Las matrices de ácidos nucleicos originales eran matrices macro de aproximadamente 9 cm x 12 cm y el primer análisis basado en imágenes computarizado se publicó en 1981. Fue inventado por Patrick O. Brown.

    Figura 5.25 Esquema de microarrays de ADN. Dentro de los organismos, los genes se transcriben y empalman para producir transcripciones maduras de ARNm (rojo). El mRNA se extrae del organismo y la transcriptasa inversa se utiliza para copiar el mRNA en ds-cDNA estable (azul). En los microarrays, el ds-cDNA está fragmentado y marcado con fluorescencia (naranja). Los fragmentos marcados se unen a una matriz ordenada de oligonucleótidos complementarios y la medición de la intensidad fluorescente a través de la matriz indica la abundancia de un conjunto predeterminado de secuencias. Estas secuencias se eligen típicamente específicamente para informar sobre genes de interés dentro del genoma del organismo.

    El principio central detrás de los microarrays es la hibridación entre dos cadenas de ADN, la propiedad de las secuencias de ácidos nucleicos complementarias para emparejarse específicamente entre sí formando enlaces de hidrógeno entre pares de bases de nucleótidos complementarios. Un alto número de pares de bases complementarios en una secuencia de nucleótidos significa un enlace no covalente más estrecho entre las dos cadenas. Después de lavar las secuencias de unión no específicas, solo las hebras fuertemente emparejadas permanecerán hibridadas. Las secuencias diana marcadas con fluorescencia que se unen a una secuencia de sonda generan una señal que depende de las condiciones de hibridación (como la temperatura) y del lavado después de la hibridación. La fuerza total de la señal, desde un punto (característica), depende de la cantidad de unión de la muestra objetivo a las sondas presentes en ese punto. Los micromatrices utilizan cuantificación relativa en la que la intensidad de una característica se compara con la intensidad de la misma característica en una condición diferente, y la identidad de la característica se conoce por su posición.

    Figura 5.26 Hibridación del ADN diana con el ADN de la sonda durante el análisis de micromatrices

    Existen muchos tipos de matrices y la distinción más amplia es si están dispuestas espacialmente en una superficie o en cuentas codificadas:

    • La matriz de fase sólida tradicional es una colección de & # 8220spots & # 8221 microscópicos ordenados, llamados rasgos, cada uno con miles de sondas idénticas y específicas unidas a una superficie sólida, como un biochip de vidrio, plástico o silicio (comúnmente conocido como un chip de genoma, Chip de ADN o matriz de genes). Miles de estas características se pueden colocar en ubicaciones conocidas en una única micromatriz de ADN.
    • La matriz de perlas alternativa es una colección de perlas de poliestireno microscópicas, cada una con una sonda específica y una proporción de dos o más tintes, que no interfieren con los tintes fluorescentes utilizados en la secuencia objetivo.

    Las micromatrices de ADN se pueden usar para detectar ADN (como en la hibridación genómica comparativa) o detectar ARN (más comúnmente como ADNc después de la transcripción inversa) que puede o no traducirse en proteínas. El proceso de medir la expresión génica a través del ADNc se denomina análisis de expresión o perfil de expresión.

    Fabricación

    Los microarrays se pueden fabricar de diferentes formas, según el número de sondas que se examinen, los costes, los requisitos de personalización y el tipo de pregunta científica que se plantee. Las matrices de proveedores comerciales pueden tener tan solo 10 sondas o hasta 5 millones o más de sondas a escala micrométrica.

    Manchado vs. en el lugar matrices sintetizadas

    Los microarrays se pueden fabricar usando una variedad de tecnologías, incluida la impresión con alfileres de punta fina en portaobjetos de vidrio, fotolitografía usando máscaras prefabricadas, fotolitografía usando dispositivos de microespejos dinámicos, impresión por chorro de tinta o electroquímica en arreglos de microelectrodos.

    En microarrays manchados, las sondas son oligonucleótidos, ADNc o pequeños fragmentos de productos de PCR que corresponden a ARNm. Las sondas se sintetizan antes de depositarlas en la superficie de la matriz y luego se & # 8220 manchadas & # 8221 sobre vidrio. Un enfoque común utiliza una matriz de alfileres o agujas finos controlados por un brazo robótico que se sumerge en pozos que contienen sondas de ADN y luego deposita cada sonda en ubicaciones designadas en la superficie de la matriz. La & # 8220grid & # 8221 de sondas resultante representa los perfiles de ácido nucleico de las sondas preparadas y está lista para recibir & # 8220dianas & # 8221 cDNA o cRNA complementarios derivados de muestras experimentales o clínicas. Esta técnica es utilizada por científicos de investigación de todo el mundo para producir microarrays impresos & # 8220in-house & # 8221 de sus propios laboratorios. Estas matrices se pueden personalizar fácilmente para cada experimento, porque los investigadores pueden elegir las sondas y las ubicaciones de impresión en las matrices, sintetizar las sondas en su propio laboratorio (o instalación colaboradora) y detectar las matrices. Luego pueden generar sus propias muestras etiquetadas para la hibridación, hibridar las muestras con la matriz y, finalmente, escanear las matrices con su propio equipo. Esto proporciona una micromatriz de costo relativamente bajo que puede personalizarse para cada estudio y evita los costos de comprar matrices comerciales a menudo más caras que pueden representar un gran número de genes que no son de interés para el investigador. Existen publicaciones que indican que las micromatrices de manchas internas pueden no proporcionar el mismo nivel de sensibilidad en comparación con las matrices de oligonucleótidos comerciales, posiblemente debido a los tamaños de lote pequeños y la eficiencia de impresión reducida en comparación con los fabricantes industriales de matrices de oligonucleótidos.

    En micromatrices de oligonucleótidos, las sondas son secuencias cortas diseñadas para coincidir con partes de la secuencia de marcos de lectura abiertos conocidos o previstos. Aunque las sondas de oligonucleótidos se utilizan a menudo en microarrays & # 8220spotted & # 8221, el término & # 8220oligonucleotide array & # 8221 se refiere con mayor frecuencia a una técnica específica de fabricación. Las matrices de oligonucleótidos se producen imprimiendo secuencias de oligonucleótidos cortas diseñadas para representar un solo gen o una familia de variantes de corte y empalme de genes sintetizando esta secuencia directamente en la superficie de la matriz en lugar de depositar secuencias intactas. Las secuencias pueden ser más largas (sondas de 60 unidades como el diseño de Agilent) o más cortas (sondas de 25 unidades producidas por Affymetrix) según el propósito deseado, las sondas más largas son más específicas para los genes diana individuales, las sondas más cortas pueden detectarse con mayor densidad a lo largo de la matriz y son más baratos de fabricar. Una técnica utilizada para producir matrices de oligonucleótidos incluye la síntesis fotolitográfica (Affymetrix) sobre un sustrato de sílice donde se utilizan la luz y agentes enmascaradores sensibles a la luz para & # 8220build & # 8221 una secuencia de un nucleótido a la vez en toda la matriz. Cada sonda aplicable es & # 8220desenmascarada & # 8221 selectivamente antes de bañar la matriz en una solución de un solo nucleótido, luego tiene lugar una reacción de enmascaramiento y el siguiente conjunto de sondas se desenmascara en preparación para una exposición de nucleótidos diferente. Después de muchas repeticiones, las secuencias de cada sonda se construyen completamente. Más recientemente, Maskless Array Synthesis de NimbleGen Systems ha combinado la flexibilidad con una gran cantidad de sondas.

    Figura 5.27 Diagrama de un experimento típico de microarrays de dos colores. Dentro de una micromatriz de dos colores, el ADN de la sonda se hibrida típicamente con el ADNc preparado a partir de dos muestras diferentes, cada una marcada con una sonda fluorescente diferente. El análisis producirá fluorescencia verde para una muestra que regula al alza la expresión génica, mientras que la otra muestra etiquetada con un marcador de fluorescencia rojo indicará que la otra condición provoca la expresión génica en esa ubicación. El amarillo indica la expresión génica en ambas muestras.

    Imagen A modificada de Larssono e Imagen B de Guillaume Paumier

    Microarrays de dos colores o microarrays de dos canales se hibridan típicamente con ADNc preparado a partir de dos muestras para comparar (por ejemplo, tejido enfermo frente a tejido sano) y que se marcan con dos fluoróforos diferentes. Los tintes fluorescentes comúnmente utilizados para el etiquetado de ADNc incluyen Cy3, que tiene una longitud de onda de emisión de fluorescencia de 570 nm (correspondiente a la parte verde del espectro de luz), y Cy5 con una longitud de onda de emisión de fluorescencia de 670 nm (que corresponde a la parte roja de la luz). espectro). Las dos muestras de ADNc marcadas con Cy se mezclan y se hibridan en una única micromatriz que luego se escanea en un escáner de micromatrices para visualizar la fluorescencia de los dos fluoróforos después de la excitación con un rayo láser de una longitud de onda definida. A continuación, pueden usarse intensidades relativas de cada fluoróforo en un análisis basado en proporciones para identificar genes regulados por incremento y regulados por disminución.

    Las micromatrices de oligonucleótidos a menudo llevan sondas de control diseñadas para hibridar con picos de ARN. El grado de hibridación entre las puntas y las sondas de control se usa para normalizar las medidas de hibridación de las sondas diana. Aunque los niveles absolutos de expresión génica pueden determinarse en la matriz de dos colores en raras ocasiones, las diferencias relativas en la expresión entre diferentes puntos dentro de una muestra y entre muestras es el método preferido de análisis de datos para el sistema de dos colores. Entre los ejemplos de proveedores para dichos microarrays se incluyen Agilent con su plataforma Dual-Mode, Eppendorf con su plataforma DualChip para etiquetado colorimétrico Silverquant y TeleChem International con Arrayit.

    En microarrays de un solo canal o microarrays de un color, las matrices proporcionan datos de intensidad para cada sonda o conjunto de sondas que indican un nivel relativo de hibridación con el objetivo marcado. Sin embargo, no indican realmente los niveles de abundancia de un gen, sino una abundancia relativa en comparación con otras muestras o condiciones cuando se procesan en el mismo experimento. Cada molécula de ARN encuentra un protocolo y un sesgo específico del lote durante las fases de amplificación, etiquetado e hibridación del experimento, lo que hace que las comparaciones entre genes para el mismo microarray no sean informativas. La comparación de dos condiciones para el mismo gen requiere dos hibridaciones separadas de un solo colorante. Varios sistemas populares de un solo canal son Affymetrix & # 8220Gene Chip & # 8221, Illumina & # 8220Bead Chip & # 8221, matrices monocanal Agilent, las matrices Applied Microarrays & # 8220CodeLink & # 8221, y Eppendorf & # 8220DualChip & amp # 8 Silver221quant . Una fortaleza del sistema de un solo tinte radica en el hecho de que una muestra aberrante no puede afectar los datos brutos derivados de otras muestras, porque cada chip de matriz está expuesto a una sola muestra (a diferencia de un sistema de dos colores en el que una sola baja -la muestra de calidad puede afectar drásticamente la precisión general de los datos, incluso si la otra muestra fue de alta calidad). Otro beneficio es que los datos se comparan más fácilmente con las matrices de diferentes experimentos siempre que se hayan tenido en cuenta los efectos por lotes.

    5.5 Hibridación in situ

    En el lugar hibridación (ISH) es un tipo de hibridación que utiliza una cadena de ADN, ARN o ácidos nucleicos modificados complementarios marcados (es decir, una sonda) para localizar una secuencia de ADN o ARN específica en una porción o sección de tejido (en el lugar) o si el tejido es lo suficientemente pequeño (por ejemplo, semillas de plantas, Drosophila embriones), en todo el tejido (montaje completo de ISH), en las células y en las células tumorales circulantes (CTC). Esto es distinto de la inmunohistoquímica, que generalmente localiza proteínas en secciones de tejido.

    La hibridación in situ se utiliza para revelar la ubicación de secuencias específicas de ácidos nucleicos en cromosomas o tejidos, un paso crucial para comprender la organización, regulación y función de los genes. Las técnicas clave actualmente en uso incluyen en el lugar hibridación a ARNm con oligonucleótidos y sondas de ARN (tanto radiomarcadas como con hapteno), análisis con microscopios ópticos y electrónicos, montaje completo en el lugar hibridación, doble detección de ARN y ARN más proteína y fluorescente en el lugar hibridación para detectar secuencias cromosómicas. El ADN ISH se puede utilizar para determinar la estructura de los cromosomas. La ISH de ADN fluorescente (FISH) se puede utilizar, por ejemplo, en diagnósticos médicos para evaluar la integridad cromosómica. ARN ISH (ARN en el lugar hibridación) se utiliza para medir y localizar ARN (ARNm, lncRNA y miARN) dentro de secciones de tejido, células, montajes completos y células tumorales circulantes (CTC). En el lugar La hibridación fue inventada por Mary-Lou Pardue y Joseph G. Gall.

    Figura 5.28 Hibridación in situ de tipo salvaje Drosophila embriones en diferentes etapas de desarrollo para el ARN de un gen llamado jorobado.

    Para la histoquímica de hibridación, las células y los tejidos de la muestra se tratan generalmente para fijar las transcripciones diana en su lugar y aumentar el acceso a la sonda. Como se señaló anteriormente, la sonda es un ADN complementario marcado o, ahora más comúnmente, un ARN complementario (ribosonda). La sonda se hibrida con la secuencia diana a temperatura elevada, y luego el exceso de sonda se elimina por lavado (después de la hidrólisis previa usando RNasa en el caso de la sonda de ARN en exceso sin hibridar). Los parámetros de la solución, como la temperatura, la sal y / o la concentración de detergente, se pueden manipular para eliminar cualquier interacción no idéntica (es decir, solo quedarán unidas las coincidencias de secuencia exacta). Luego, la sonda que se marcó con bases marcadas con radio, fluorescencia o antígeno (por ejemplo, digoxigenina) se localiza y cuantifica en el tejido mediante autorradiografía, microscopía de fluorescencia o inmunohistoquímica, respectivamente. ISH también puede usar dos o más sondas, marcadas con radiactividad u otras etiquetas no radiactivas, para detectar simultáneamente dos o más transcripciones.

    Se puede utilizar una tecnología alternativa, el ensayo de ADN ramificado, para el ARN (ARNm, ARNlnc y ARNm) en el lugar Ensayos de hibridación con sensibilidad de una sola molécula sin el uso de radiactividad. Este enfoque (por ejemplo, ensayos ViewRNA) se puede utilizar para visualizar hasta cuatro dianas en un ensayo, y utiliza un diseño de sonda patentado y amplificación de la señal de bDNA para generar señales sensibles y específicas. Las muestras (células, tejidos y CTC) se fijan y luego se tratan para permitir la accesibilidad del objetivo del ARN (desenmascaramiento del ARN). Las sondas específicas de la diana se hibridan con cada ARN diana. La posterior amplificación de la señal se basa en la hibridación específica de sondas adyacentes (oligonucleótidos [oligos] individuales que se unen uno al lado del otro en los objetivos de ARN). Una sonda específica de diana típica contendrá 40 oligonucleótidos, lo que dará como resultado 20 pares de oligonucleótidos que se unen uno al lado del otro en la diana para la detección de mRNA y lncRNA, y 2 oligonucleótidos o un solo par para la detección de miRNA. La amplificación de la señal se logra mediante una serie de pasos de hibridación secuenciales. Una molécula de preamplificador se hibrida con cada par de oligo en el ARN específico de la diana, luego múltiples moléculas de amplificador se hibridan con cada preamplificador. A continuación, múltiples oligonucleótidos de sonda marcadora (conjugados con fosfatasa alcalina o directamente con fluoróforos) se hibridan con cada molécula amplificadora. Una estructura de amplificación de señal completamente ensamblada "Árbol" tiene 400 sitios de unión para las sondas marcadoras. Cuando todas las sondas específicas de la diana se unen al transcrito de ARNm diana, se produce una amplificación de señal de 8.000 veces para ese transcrito. Los sistemas de amplificación de señales separados pero compatibles permiten los ensayos multiplex. La señal se puede visualizar usando un microscopio de fluorescencia o de campo claro.

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    ¿Cuál es la razón detrás de la elección del gen reportero cuando se experimenta con el gen de interés? - biología

    Al igual que la transcripción, la traducción está controlada por proteínas que se unen e inician el proceso. En la traducción, antes de que pueda comenzar la síntesis de proteínas, debe completarse el ensamblaje de los ribosomas. Este es un proceso de varios pasos.

    En el ensamblaje de ribosomas, las subunidades ribosómicas grandes y pequeñas y un ARNt iniciador (ARNtI) que contienen el primer aminoácido de la cadena polipeptídica final, todos se juntan en el codón de inicio de la traducción en un ARNm para permitir que comience la traducción. Primero, la pequeña subunidad ribosómica se une al ARNtI que transporta metionina en eucariotas y arqueas y transporta N-formil-metionina en bacterias. (Porque el tRNAI lleva un aminoácido, se dice que está cargado.) A continuación, la subunidad ribosómica pequeña con el ARNt cargadoI exploraciones aún enlazadas a lo largo de la cadena de ARNm hasta que alcanza el codón de inicio AUG, que indica dónde comenzará la traducción. El codón de inicio también establece el marco de lectura para la cadena de ARNm, que es crucial para sintetizar la secuencia correcta de aminoácidos. Un cambio en el marco de lectura da como resultado una mala traducción del ARNm. El anticodón del ARNtI luego se une al codón de inicio a través del emparejamiento de bases. El complejo que consta de ARNm, ARNt cargadoI, y la subunidad ribosómica pequeña se une a la subunidad ribosómica grande, que completa el ensamblaje del ribosoma.Estos componentes se unen con la ayuda de proteínas llamadas factores de iniciación que se unen a la pequeña subunidad ribosómica durante la iniciación y se encuentran en los tres dominios de la vida. Además, la célula gasta energía GTP para ayudar a formar el complejo de iniciación. Una vez que se completa el ensamblaje del ribosoma, el ARNt cargadoI se coloca en el sitio P del ribosoma y el sitio A vacío está listo para el siguiente aminoacil-tRNA. La síntesis de polipéptidos comienza y siempre avanza desde el N-terminal al C-terminal, llamado dirección N-a-C.

    En eucariotas, varias proteínas del factor de iniciación eucariotas (eIF) ayudan en el ensamblaje de los ribosomas. El factor de iniciación eucariota-2 (eIF-2) es activo cuando se une al trifosfato de guanosina (GTP). Con GTP unido a él, la proteína eIF-2 se une a la pequeña subunidad ribosómica 40S. A continuación, el tRNA inicial cargado con metionina (Met-tRNAI) se asocia con el complejo de ribosoma GTP-eIF-2 / 40S, y una vez que todos estos componentes se unen entre sí, se denominan colectivamente complejo 43S.

    Los factores de iniciación eucariotas eIF1, eIF3, eIF4 y eIF5 ayudan a traducir el complejo 43S a la tapa 5 & # 8242-m 7 G de un ARNm. Una vez unido al mRNA & # 8217s 5 & # 8242 m 7 G cap, el complejo 43S comienza a viajar por el mRNA hasta que alcanza el codón de iniciación AUG al comienzo del marco de lectura del mRNA & # 8217s. Las secuencias alrededor del AUG pueden ayudar a garantizar que se utilice el AUG correcto como codón de iniciación en el ARNm.

    Una vez que el complejo 43S está en el AUG de iniciación, el tRNAi-Met se coloca sobre el AUG. El anticodón del ARNtI-Combina pares de bases con el codón AUG. En este punto, el GTP unido a eIF2 en el complejo 43S se hidroliza a GDP + fosfato y se libera energía. Esta energía se utiliza para liberar el eIF2 (con GDP unido a él) del complejo 43S, dejando la subunidad ribosómica 40S y el tRNA.I-Se encuentra en el sitio de inicio de la traducción del ARNm.

    A continuación, eIF5 con GTP unido se une a la subunidad ribosómica 40S complejada con el ARNm y el ARNt.I-Reunió. El eIF5-GTP permite que la subunidad ribosómica grande 60S se una. Una vez que llega la subunidad ribosómica 60S, eIF5 hidroliza su GTP unido a GDP + fosfato y se libera energía. Esta energía impulsa el ensamblaje de las dos subunidades ribosómicas en el ribosoma 80S intacto, con tRNAi-Met en su sitio P mientras que también se empareja con el codón de iniciación AUG en el mRNA. La traducción está lista para comenzar.

    La unión de eIF-2 a la subunidad ribosómica 40S está controlada por fosforilación. Si eIF-2 está fosforilado, sufre un cambio conformacional y no puede unirse a GTP. Por lo tanto, el complejo 43S no se puede formar correctamente y se impide la traducción. Cuando eIF-2 permanece sin fosforilar, se une a la subunidad ribosómica 40S y traduce activamente la proteína.

    Complejo de iniciación a la traducción: La expresión génica puede controlarse mediante factores que se unen al complejo de iniciación de la traducción.

    La capacidad de ensamblar completamente el ribosoma afecta directamente la velocidad a la que se produce la traducción. Pero la síntesis de proteínas también está regulada en varios otros niveles, incluida la síntesis de ARNm, la síntesis de ARNt, la síntesis de ARNr y la síntesis del factor de iniciación eucariota. La alteración en cualquiera de estos componentes afecta la velocidad a la que puede ocurrir la traducción.


    20 ventajas y desventajas de la terapia génica

    La terapia genética es una técnica experimental en la ciencia médica que usa genes para prevenir o tratar enfermedades. El objetivo de este enfoque es crear un mundo futuro en el que los médicos puedan tratar trastornos específicos insertando genes en las células del paciente en lugar de utilizar cirugía, medicamentos u otras intervenciones para mejorar la salud.

    En la actualidad, se están investigando varios enfoques diferentes de la terapia génica. Un método implica el reemplazo de un gen mutado por una copia sana del mismo. Existe la posibilidad de que un gen mutado pueda inactivarse para que su funcionamiento inadecuado se detenga. Los médicos incluso podrían introducir nuevo material genético en el cuerpo de un paciente para ayudarlo a combatir una enfermedad.

    Las ventajas y desventajas de la terapia génica muestran que esta prometedora opción de tratamiento es potencialmente útil para algunos trastornos hereditarios, cánceres e infecciones virales. También es una técnica que conlleva un conjunto de riesgos más significativo que los enfoques convencionales. Los investigadores todavía están estudiando el enfoque para determinar si es seguro y efectivo para su uso regular al atacar enfermedades que no tienen otras curas.

    Lista de las ventajas de la terapia génica

    1. Ofrece la posibilidad de un resultado médico positivo.
    Aproximadamente el 3% de los nacimientos en los Estados Unidos involucran una condición que es potencialmente tratable mediante el uso de técnicas de terapia génica. Muchos de los niños nacidos en este grupo demográfico mueren poco después del nacimiento debido a los efectos devastadores de su condición. Los defectos de nacimiento también son potencialmente prevenibles con esta opción, que impacta alrededor del 20% de las familias cada año. En lugar de pagar por los cuidados paliativos o verse obligados a despedirse de inmediato, los médicos y científicos están dando a los padres más esperanzas de un futuro mejor gracias a la disponibilidad de esta tecnología.

    2. Podemos tratar enfermedades o dolencias de manera significativa.
    Aproximadamente 1 de cada 10 personas en los Estados Unidos tiene una afección o enfermedad clasificada como rara. Eso significa que hay más de 33 millones de estadounidenses que podrían beneficiarse de la terapia genética. Estas intervenciones podrían reducir o eliminar el dolor y el sufrimiento que se produce cuando una anomalía genética está presente en el cuerpo de una persona. Casi 4 de cada 5 enfermedades que tienen un impacto adverso en la salud humana también tienen una base genética. Cuando los médicos pueden reemplazar o desactivar las células defectuosas que llevaron a condiciones perjudiciales, las personas y sus familias pueden encontrar el alivio que necesitan para vivir una vida más plena.

    3. Podría mejorar la vida de una persona de otras formas.
    El enfoque de la investigación de la terapia génica es crear nuevos medicamentos y enfoques de tratamiento que puedan aliviar el sufrimiento. Si se trata de una solución curativa o no, es menos importante que los cambios positivos que se producen para las personas que necesitan esta ayuda. Cuando descubramos procesos beneficiosos a través de este trabajo, entonces podríamos aplicarlo a la agricultura, las causas ambientales, la salud de las mascotas y el transporte de alimentos para garantizar que todos tengamos acceso a la mejor vida posible. Los cambios simples podrían generar resultados profundos en casi todas las industrias.

    4. Ya sabemos que puede ser una opción de tratamiento exitosa.
    Siempre hay una cierta cantidad de incógnitas que experimentan los pacientes en el mundo médico. Los cuerpos individuales reaccionan de manera diferente a la misma opción de tratamiento. Lo que sabemos sobre la terapia génica es que los ensayos clínicos de esta intervención han mostrado cierto éxito en el tratamiento de algunas enfermedades específicas. Si tiene hemofilia, leucemia, ceguera causada por retinitis pigmentosis o un problema grave de inmunodeficiencia combinada, entonces podría ser un candidato viable para esta opción de terapia.

    5. Hay opciones de tratamiento extracorporal disponibles.
    Si su médico recomienda la terapia génica extracorporal, los investigadores o técnicos tomarán médula ósea o sangre para comenzar a separar las células inmaduras de la muestra. Luego, les agregarán el gen necesario antes de inyectar las células nuevamente en el torrente sanguíneo. Una vez que regresan al cuerpo, las células inmaduras van a la médula ósea, comienzan a madurar y, finalmente, a multiplicarse para reemplazar todas las células defectuosas. Esta técnica parece ser especialmente útil para las personas que padecen la enfermedad de células falciformes o algo similar.

    6. La terapia genética podría ser útil en el tratamiento de múltiples enfermedades.
    Aunque no hay ningún producto de terapia génica que esté disponible actualmente en el mercado de la salud de los Estados Unidos, hay estudios clínicos que sugieren que este enfoque podría ser útil en el tratamiento de una variedad de afecciones. Estudios recientes sugieren que una forma rara de ceguera llamada amaurosis congénita de Leber podría tratarse con ella, y también hay datos que sugieren que la enfermedad de Parkinson responde bien a la terapia.

    A medida que conozcamos más sobre las capacidades generales de lo que puede hacer la terapia génica, podría haber cientos de enfermedades diferentes que se puedan tratar con este enfoque.

    7. El impacto médico de la terapia génica puede generar resultados permanentes.
    Una vez que la genética defectuosa es reemplazada por los genes correctos, este enfoque terapéutico obtiene la ventaja de ser un resultado duradero, a veces permanente. Aunque esta ventaja no se aplica en todas las situaciones, muchos pacientes pueden revertir sus molestos síntomas en un corto período de tiempo, ya sea en el enfoque dentro del cuerpo o fuera del cuerpo. Incluso existe la posibilidad de que algunos de los cambios sean heredables para la próxima generación, lo que reduciría su riesgo de sufrir un futuro similar.

    8. Todo el tiempo surgen nuevas opciones de tratamiento.
    En mayo de 2019, la Administración de Drogas y Alimentos aprobó el medicamento de terapia génica llamado Zolgensma. Este producto está aprobado para tratar la atrofia muscular espinal en niños menores de 2 años. Varios productos adicionales, incluidos Luxturna, Novartis y Yescarta, también han salido al mercado desde 2017. Estos artículos crean nuevas opciones para tratar el linfoma y la leucemia. y algunos problemas de pérdida de la visión relacionados con la genética.

    9. Puede funcionar en combinación con técnicas de terapia celular.
    La terapia genética implica la transferencia de material genético. La terapia celular es el proceso de transferir células con una función relevante al paciente cuando, en primer lugar, falta ese material genético. Algunos protocolos utilizan ambos, lo que puede brindar a los pacientes una forma poderosa de recuperarse de su afección médica. Las células madre pueden aislarse de un paciente y luego modificarse genéticamente en cultivo de tejidos para iniciar la expresión de un nuevo gen. Una vez que el tratamiento se expande a un número adecuado, el paciente recibe la terapia como parte de su atención general.

    Lista de las desventajas de la terapia génica

    1. Puede haber reacciones no deseadas del sistema inmunológico.
    El sistema inmunológico del cuerpo puede ver los diversos virus que usamos para reemplazar genes no deseados como invasores que deben extinguirse antes de que causen daño. Cuando los glóbulos blancos atacan el material genético recién introducido, no es inusual que un paciente experimente problemas de salud como inflamación, mareos y dolores de cabeza. En reacciones graves, incluso es posible que la respuesta inmunitaria se dirija a los órganos del cuerpo y los haga fallar.

    Es por eso que las opciones de tratamiento incluyen un inmunosupresor, pero este medicamento puede hacer que alguien sea más susceptible a infecciones y enfermedades.

    2. Los métodos actuales de terapia génica a veces pueden apuntar a las células equivocadas.
    Los virus tienen la capacidad de afectar a más de un tipo de célula en el cuerpo humano durante un tratamiento de terapia génica. Es muy posible que los virus alterados que entregan la información a las células puedan infectar a otros, no solo a los que contienen los genes mutados o faltantes. Cuando ocurre esta desventaja, las células sanas pueden sufrir daños que pueden tener resultados impredecibles. Existe la posibilidad de que el resultado pueda involucrar el desarrollo de una enfermedad, sensibilidad a la enfermedad o incluso cáncer.

    La terapia génica extracorporal para la inmunodeficiencia combinada grave, que es el síndrome del niño en una burbuja, ya ha experimentado esta desventaja. Cinco de los 30 niños que recibieron terapia génica para su afección desarrollaron leucemia. Uno de ellos no pudo vencer la enfermedad resultante.

    3. Los virus de transmisión pueden recuperar su capacidad de crear enfermedades.
    Hay virus específicos que se utilizan para crear resultados durante las terapias génicas. El portador, que se conoce como vector, recibe ingeniería genética para que pueda realizar su trabajo. Pueden administrarse por vía intravenosa o inyectarse en los tejidos corporales específicos que requieren ayuda adicional. Es posible que la infección inicial se desarrolle una vez que se introduzca en el cuerpo, lo que podría crear problemas para la transferencia de información. Aunque los científicos no usarían virus potencialmente mortales para este proceso, existe el riesgo de enfermarse por otros problemas además de los problemas genéticos que los médicos están tratando de tratar.

    Actualmente, los investigadores utilizan virus adenoasociados para transmitir información genética. Aunque no se sabe que cause ninguna enfermedad en humanos, está relacionada con aquellas que pueden causar resfriados.

    4. Las terapias genéticas podrían causar un tumor potencial.
    Si la nueva información genética de un virus se inserta en el lugar equivocado de su cuerpo, existe el riesgo de que el proceso de tratamiento pueda conducir a la formación de un tumor. También existe un riesgo de malignidad con esta desventaja. Esta desventaja está presente incluso cuando no se utilizan vectores para entregar información a las células. Los científicos pueden usar células madre para terapia génica o las partículas grasas llamadas liposomas.

    5. No hay garantía de que la terapia génica funcione.
    La mayoría de las opciones de terapia génica aún se encuentran en la etapa experimental o de desarrollo. Varios de los estudios clínicos que están disponibles se basaron en la investigación con animales en lugar de en seres humanos. Ya ha habido numerosos fracasos de medicamentos prometedores porque los resultados que experimentaron los animales no se transfirieron a los humanos durante la parte clínica del proceso de aprobación.

    Cuando ocurre la terapia génica, puede suceder cualquier cosa. Es muy posible que el tratamiento falle. Algunos pacientes pueden ver una limitación en su capacidad para realizar las actividades de la vida diaria. Incluso podría empeorar su salud.

    6. Algunos pacientes pueden experimentar problemas de incompatibilidad.
    Hay muchas similitudes en nuestro ADN que hacen posible la terapia genética. Cada persona también tiene alrededor de 300,000 puntos únicos en su perfil celular que lo convierten en un individuo completamente único. Incluso cuando una sesión de tratamiento de terapia génica proporciona resultados positivos para otros, no hay garantía de que cada persona que reciba esta opción experimente un resultado similar. Los médicos pueden inyectar un virus con material genético y es posible que no ocurra nada como resultado.

    7. Los seres humanos podrían desarrollar una resistencia a la terapia génica.
    Los beneficios de la terapia génica pueden ser de corta duración. Ya hemos visto cómo la resistencia a los antibióticos cambia nuestro enfoque de la medicina. Esta opción de tratamiento podría ser efectiva en este momento porque es muy nueva. A medida que más personas descubran sus beneficios y reciban la vía intravenosa o inyecciones que entregan genes actualizados, el cuerpo humano podría desarrollar resistencia a la transferencia de información. Es posible que algunos pacientes no experimenten un resultado positivo incluso si su sistema inmunológico no ataca los nuevos genes. Esta desventaja significa que podríamos tratar los trastornos actuales de manera eficaz, pero es posible que la próxima generación no pueda experimentar el mismo beneficio.

    8. El costo de la terapia génica es prohibitivo para varias familias.
    Las tarifas de la terapia génica pueden superar fácilmente el millón de dólares en los Estados Unidos. Aunque la competencia puede limitar estos costos a lo largo del tiempo, el impacto de este gasto significa que algunas personas pueden no considerar esta opción de tratamiento a pesar de que es la mejor solución para sus necesidades. Si el precio no baja, se creará una nueva capa de segregación económica que enfrentará a los ricos contra todos los demás. Las leyes de patentes en los EE. UU. También reducen la disponibilidad inmediata de genéricos, lo que significa que cada persona debe administrar sus costos si esta opción es necesaria.

    9. Existen preocupaciones éticas sobre la terapia génica.
    La mayoría de la gente diría que la introducción de la terapia génica proporciona varios beneficios que vale la pena considerar. También hay quienes tienen preocupaciones éticas sobre el uso de esta tecnología para corregir enfermedades. Al cambiar la naturaleza del perfil genético de una persona, incluso si es para mejor, funciona para eliminar las variaciones naturales que ocurren dentro de la raza humana.

    ¿Es correcto que la gente "juegue a ser Dios"? ¿Podría este trabajo comenzar a reducir el acervo genético disponible hasta el punto en que se produzcan cuellos de botella genéticos? Es posible que no tengamos respuestas a algunas de estas preguntas hasta que sepamos más sobre los impactos a largo plazo de la terapia génica.

    10. Por lo general, funciona mejor en mutaciones de un solo gen.
    Hay algunas enfermedades que tienen predisposición hereditaria a padecerlas. El Alzheimer, el Parkinson y algunos cánceres son ejemplos de este rasgo. Su causa puede deberse a varias mutaciones o variaciones que ocurren en varios genes diferentes. Algunas personas también pueden verse influenciadas por causas ambientales. En este momento, las opciones de tratamiento para estas situaciones complejas no son tan refinadas como lo son para aquellos que tienen un solo defecto genético. Algunas enfermedades, como la fibrosis quística, también pueden afectar simultáneamente diferentes áreas del cuerpo. Eso significaría que sería necesario administrar el tratamiento en todos los tipos de tejidos para comenzar el trabajo de recuperación.

    11. Hay desafíos de financiamiento a considerar en esta categoría.
    Mover las intervenciones de terapia génica a la etapa de ensayo clínico es el desafío fiscal más abrumador que enfrentan estos nuevos enfoques. El financiamiento adicional necesario para producir reactivos de grado clínico, estudios de toxicología formales, preparación de documentos y necesidades de fabricación adicionales pueden limitar el impacto de este enfoque antes de que tenga la oportunidad de comenzar. Muchas de las terapias más prometedoras se ven ralentizadas por la falta de financiación en este momento, lo que significa que las personas que podrían beneficiarse de este enfoque médico se ven obligadas a esperar.

    Veredicto sobre las ventajas y desventajas de la terapia génica

    Antes de que las empresas puedan comercializar productos de terapia génica para su uso en humanos, el artículo en cuestión debe someterse a pruebas para determinar su seguridad y eficacia. La Administración de Alimentos y Medicamentos es el área del gobierno responsable de esta supervisión. Luego, los resultados de cada estudio se examinan cuidadosamente para determinar si los riesgos de la terapia son aceptables en comparación con las posibles recompensas.

    Las ventajas y desventajas de la terapia génica prometen transformar la medicina tal como la conocemos. Esta opción podría crear más opciones para los pacientes que actualmente viven con enfermedades desafiantes o incluso incurables. Con los científicos haciendo numerosos descubrimientos cada año en este campo, puede haber un aumento en la cantidad de tratamientos innovadores que estarán disponibles en los próximos años.

    Si cree que su salud y bienestar podrían beneficiarse de la terapia génica, hable con su médico sobre los puntos clave de esta guía para determinar si su plan de tratamiento mejoraría con esta opción.

    Biografía del autor
    Keith Miller tiene más de 25 años de experiencia como director ejecutivo y emprendedor en serie. Como empresario, ha fundado varias empresas multimillonarias. Como escritor, el trabajo de Keith ha sido mencionado en CIO Magazine, Workable, BizTech y The Charlotte Observer. Si tiene alguna pregunta sobre el contenido de esta publicación de blog, envíe un mensaje a nuestro equipo de edición de contenido aquí.


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