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7.25D: Western Bolts - Biología

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Objetivos de aprendizaje

  • Muestre los usos de Western Blots

La transferencia de Western (a veces llamada inmunotransferencia de proteínas) es una técnica analítica ampliamente aceptada que se utiliza para detectar proteínas específicas en una muestra determinada de homogeneizado o extracto de tejido. Las muestras de transferencia Western se pueden tomar de tejido completo o de cultivo celular. Los tejidos sólidos primero se descomponen mecánicamente usando un mezclador (para volúmenes de muestra más grandes), un homogeneizador (volúmenes más pequeños) o mediante sonicación. Pueden emplearse una variedad de detergentes, sales y tampones para estimular la lisis de las células y solubilizar las proteínas. La técnica usa electroforesis en gel para separar proteínas nativas por estructura 3-D o proteínas desnaturalizadas por la longitud del polipéptido.

A continuación, las proteínas se transfieren a una membrana (normalmente nitrocelulosa o PVDF), donde se tiñen con anticuerpos específicos de la proteína diana. En la actualidad, hay muchas empresas de reactivos que se especializan en proporcionar anticuerpos (anticuerpos monoclonales y policlonales) contra decenas de miles de proteínas diferentes que pertenecen a vías de señalización o antígenos de receptores de superficie celular, u otros componentes celulares o solubles. Los anticuerpos comerciales pueden ser costosos, aunque el anticuerpo no unido se puede reutilizar entre experimentos. Este método se utiliza en los campos de la biología molecular, la bioquímica, la inmunogenética y otras disciplinas de la biología molecular. Otras técnicas relacionadas incluyen el uso de anticuerpos para detectar proteínas en tejidos y células mediante inmunotinción y ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Este método se originó en el laboratorio de George Stark en Stanford. El nombre Western blot fue dado a la técnica por W. Neal Burnette y es un juego con el nombre Southern blot, una técnica para la detección de ADN desarrollada anteriormente por Edwin Southern. La detección de ARN se denomina transferencia Northern.

Puntos clave

  • Después de la separación por electroforesis en gel usando SDS-PAGE, las proteínas se transfieren a una hoja de papel secante especial llamado nitrocelulosa, aunque se pueden usar otros tipos de papel o membranas. Las proteínas conservan el mismo patrón de separación que tenían en el gel.
  • La mancha se incuba con una proteína genérica (como las proteínas de la leche) para unirse a cualquier lugar pegajoso restante en la nitrocelulosa. Luego se agrega un anticuerpo a la solución que puede unirse a su proteína específica. El anticuerpo está conjugado con fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante.
  • La ubicación del anticuerpo se revela incubándolo con un sustrato incoloro que la enzima adherida convierte en un producto coloreado que se puede ver y fotografiar.

Términos clave

  • electroforesis: un método para la separación y análisis de moléculas grandes (como las proteínas) mediante la migración de una solución coloidal de las mismas a través de un gel; electroforesis en gel

Electroforesis en gel de poliacrilamida

Electroforesis en gel de poliacrilamida (PÁGINA) es una técnica muy utilizada en bioquímica, química forense, genética, biología molecular y biotecnología para separar macromoléculas biológicas, normalmente proteínas o ácidos nucleicos, según su movilidad electroforética. La movilidad electroforética es función de la longitud, conformación y carga de la molécula. La electroforesis en gel de poliacrilamida es una poderosa herramienta que se utiliza para analizar muestras de ARN. Cuando el gel de poliacrilamida se desnaturaliza después de la electroforesis, proporciona información sobre la composición de la muestra de las especies de ARN. [1]

La hidratación del acrilonitrilo da como resultado la formación de moléculas de acrilamida (C
3 H
5 NO) por nitrilo hidratasa. [2] El monómero de acrilamida está en forma de polvo antes de la adición de agua. La acrilamida es tóxica para el sistema nervioso humano, por lo que deben seguirse todas las medidas de seguridad al trabajar con ella. La acrilamida es soluble en agua y tras la adición de iniciadores de radicales libres se polimeriza dando como resultado la formación de poliacrilamida. [2] Es útil preparar un gel de poliacrilamida mediante la hidratación con acrilmida porque se puede regular el tamaño de los poros. El aumento de las concentraciones de acrilamida da como resultado una disminución del tamaño de los poros después de la polimerización. El gel de poliacrilamida con poros pequeños ayuda a examinar mejor las moléculas más pequeñas, ya que las moléculas pequeñas pueden ingresar a los poros y viajar a través del gel, mientras que las moléculas grandes quedan atrapadas en las aberturas de los poros.

Al igual que con todas las formas de electroforesis en gel, las moléculas se pueden ejecutar en su estado nativo, preservando la estructura de orden superior de las moléculas. Este método se llama Native-PAGE. Alternativamente, se puede agregar un desnaturalizante químico para eliminar esta estructura y convertir la molécula en una molécula no estructurada cuya movilidad depende solo de su longitud (porque todos los complejos proteína-SDS tienen una relación masa-carga similar). Este procedimiento se llama SDS-PAGE. La electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) es un método de separación de moléculas basado en la diferencia de su peso molecular. Al pH al que se lleva a cabo la electroforesis en gel, las moléculas de SDS están cargadas negativamente y se unen a las proteínas en una proporción establecida, aproximadamente una molécula de SDS por cada 2 aminoácidos. [3]: 164–79 De esta manera, el detergente proporciona a todas las proteínas una relación de carga a masa uniforme. Al unirse a las proteínas, el detergente destruye su estructura secundaria, terciaria y / o cuaternaria desnaturalizándolas y convirtiéndolas en cadenas polipeptídicas lineales cargadas negativamente. Cuando se somete a un campo eléctrico en PAGE, las cadenas polipeptídicas cargadas negativamente viajan hacia el ánodo con diferente movilidad. Su movilidad, o la distancia recorrida por las moléculas, es inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. [4] Al comparar la relación relativa de la distancia recorrida por cada proteína con la longitud del gel (Rf), se pueden sacar conclusiones sobre el peso molecular relativo de las proteínas, donde la longitud del gel está determinada por la distancia recorrida por una pequeña molécula como un tinte de rastreo. [5]

Para los ácidos nucleicos, la urea es el desnaturalizante más utilizado. Para las proteínas, el dodecilsulfato de sodio (SDS) es un detergente aniónico que se aplica a las muestras de proteínas para recubrir las proteínas con el fin de impartir dos cargas negativas (de cada molécula de SDS) a cada dos aminoácidos de la proteína desnaturalizada. [3]: 161-3 El 2-mercaptoetanol también se puede usar para romper los enlaces disulfuro que se encuentran entre los complejos de proteínas, lo que ayuda a desnaturalizar aún más la proteína. En la mayoría de las proteínas, la unión de SDS a las cadenas polipeptídicas imparte una distribución uniforme de carga por unidad de masa, lo que da como resultado un fraccionamiento por tamaño aproximado durante la electroforesis. Las proteínas que tienen un mayor contenido hidrófobo, por ejemplo, muchas proteínas de membrana y aquellas que interactúan con los tensioactivos en su entorno nativo, son intrínsecamente más difíciles de tratar con precisión con este método, debido a la mayor variabilidad en la proporción de SDS unidas. [6] Desde el punto de vista del procedimiento, el uso de Native y SDS-PAGE juntos puede usarse para purificar y separar las diversas subunidades de la proteína. Native-PAGE mantiene intacta la forma oligomérica y mostrará una banda en el gel que es representativa del nivel de actividad. SDS-PAGE desnaturalizará y separará la forma oligomérica en sus monómeros, mostrando bandas que son representativas de sus pesos moleculares. Estas bandas se pueden utilizar para identificar y evaluar la pureza de la proteína. [3]: 161–3


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