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A1. Catálisis general ácida y básica - Biología

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Las reacciones en solución que no están catalizadas son lentas ya que el desarrollo de la carga y la separación se producen en el estado de transición. Cuando se forman o rompen enlaces, a menudo se forman intermedios cargados que son más energéticos que los reactivos. Dado que el intermedio tiene mayor energía que los reactivos, el estado de transición sería aún mayor en energía y, por lo tanto, se parecería más al intermedio cargado. Cualquier cosa que pueda estabilizar las cargas en el intermedio y, por lo tanto, las cargas en desarrollo en los estados de transición reducirá la energía del estado de transición y catalizará la reacción. En esta sección investigaremos el mecanismo subyacente a la catálisis por moléculas pequeñas de reacciones químicas. Presumiblemente, el catalizador macromolecular biológico (como las enzimas proteicas) utilizará mecanismos similares en sus efectos catalíticos (que se discutirán en la siguiente sección).

Los catalizadores, incluidas las enzimas, pueden emplear al menos 5 formas diferentes de estabilizar los estados de transición.

El desarrollo de carga en el TS puede reducirse mediante la donación de un protón de ácidos generales (como el ácido acético o un anillo de indol protonado) a un átomo como un carbonilo O que desarrolla una carga negativa parcial en el TS cuando está unido por un nucleófilo. La donación de protones disminuye el desarrollo negativo en el ST. Alternativamente, un nucleófilo, como el agua, que desarrolla una carga positiva parcial en el TS cuando comienza a formar un enlace a un C electrófilo en un carbonilo, puede estabilizarse mediante la presencia de una base general (como el acetato o el anillo indol desprotonado). . La abstracción de protones disminuye la carga positiva en desarrollo

Figura: DESARROLLO DE CARGA EN EL ESTADO DE TRANSICIÓN PARA LA HIDROLISIS DE ÉSTER

Figura: MECANISMO DE CATÁLISIS DE ÁCIDOS GENERALES

Figura: MECANISMO DE CATÁLISIS BÁSICA GENERAL


A1. Catálisis general ácida y básica - Biología

¿Cómo logran las enzimas mejoras tan elevadas en condiciones moderadas de pH, temperatura y presión?

Veamos algunas de las muchas formas en que las enzimas llevan a cabo la catálisis.

Recuerde que, en general, los mecanismos catalíticos no pueden observarse, ya que las estructuras de las proteínas se pueden realizar mediante cristalografía de rayos X, sino que se deducen de las estructuras de la costa y una variedad de otros enfoques.

1) Hidrólisis ácida general (hidrólisis básica general)

Es utilizado por muchas enzimas. Considere la hidrólisis del éster, que es catalizada por un ácido o una base.

(En las reacciones que se muestran a continuación, venga a clase para conocer algunos detalles).

La hidrólisis ácida general se refiere a una transferencia parcial de protones desde un donante de protones (un ácido general) a un sustrato, por ejemplo, para estabilizar el estado de transición. Las formas protonadas de His, Asp y Glu pueden funcionar como ácidos generales. También Tyr, Cys y Lys. El estado de transición en esta reacción sería una forma tetraédrica, similar a la que se muestra arriba.

De manera similar, la catálisis básica general se refiere a la abstracción parcial de protones por un aceptor de protones, que se muestra a continuación:

La catálisis básica general se puede realizar mediante las formas no protonadas de los aminoácidos enumerados anteriormente: Asp, Glu, His, Tyr, Cys, Lys.

Es posible que un solo residuo de aminoácido participe en la catálisis general ácida y básica en diferentes puntos de un solo ciclo enzimático.

Se forma un enlace covalente entre la enzima y el sustrato durante el ciclo de la enzima.

  • 1) ataque nucleofílico del sustrato por un grupo enzimático (por ejemplo, grupo amino)
  • 2) retirada electrofílica de electrones del sustrato
  • 3) hojas del grupo nucleofílico, que regenera la enzima original

En el texto se muestra un ejemplo: Fig. 11-9, para la descarboxilación de acetoacetato, catalizada por una amina.

Los residuos típicos utilizados en la catálisis covalente son Lys, His, Cys, Asp, Glu, Ser, también algunas coenzimas.

La forma nucleofílica de estos residuos es la no protonada.

Los iones metálicos se utilizan en la catálisis.

  • a) Fuertemente unido a enzimas, p. ej. Fe, Cu, Zn (ver ejemplo de FeS)
  • b) Ligeramente unido, como en complejos transitorios de Mg-ATP
  • orientación de la unión del sustrato (a través de la carga)
  • reacciones de oxidación-reducción (transferencia de electrones)
  • estabilización electrostática de carga negativa (en sustrato o estado de transición)

ejemplo anhidrasa carbónica

Zn 2+ necesita 4 ligandos. Tiene 3 ligandos His de la proteína y 1 molécula de agua en forma de OH-

El Zn 2+ estabiliza el hidróxido, lo que le permite atacar el CO2.

OH - es regenerado por el Zn 2+ del agua.

Para obtener más información sobre la anhidrasa carbónica, consulte el ejercicio interactivo de la figura 11-11 en el CD-ROM.

4) Catálisis electrostática

Esto se refiere a la mejora de las interacciones electrostáticas en el entorno no polar del interior de las enzimas.

H2El O generalmente se excluye de los sitios activos, excepto cuando se necesita catalíticamente. Esto crea un entorno de bajo dieléctrico donde las interacciones electrostáticas son más fuertes.

Se mejoran las interacciones enzima-estado de transición que implican estabilización de carga.

5) Proximidad y Orientación

Estos se refieren a la importancia de la disposición precisa de los grupos catalíticos en el sitio activo.

Los residuos catalíticos de tripsina son Ser e His, pero estas cadenas laterales (metanol e imidazol) no aumentan apreciablemente la tasa de proteólisis no enzimática en solución.

La proximidad es importante porque la enzima proporciona todos los grupos necesarios al sustrato cuando se une al sitio activo. Se aumenta la & quot; concentración efectiva & quot. La orientación también es importante. porque las cadenas laterales de las proteínas están relativamente "fijadas" y las consideraciones geométricas son importantes en la catálisis.

Enlace de estado de transición preferencial

Esto se refiere a las interacciones entre la enzima y el estado de transición que no existen en el complejo de sustrato enzimático.

Esto está relacionado con el concepto de & quotstrain & quot, que la enzima distorsionará el sustrato para hacerlo más parecido al estado de transición, p. geométricamente.

Para aumentar la catálisis por una enzima, es absolutamente necesario aumentar las interacciones enzima-estado de transición en relación con las interacciones enzima-sustrato.

Una enzima eficaz estabiliza el S & # 135 más que el S.

La enzima debe unirse al sustrato, con la orientación adecuada, pero no necesariamente con tanta fuerza.

Una enzima perfecta se parece a la siguiente, en la que todas las barreras son aproximadamente iguales. Entonces, la unión del sustrato y la liberación del producto ocurren a velocidades no más rápidas que la etapa de reacción.

Una consecuencia de la teoría del estado de transición es que los análogos del estado de transición deberían ser potentes inhibidores competitivos.

Los productos suelen ser inhibidores de la competencia, porque siempre se parecen a los sustratos, hasta cierto punto.

Esta línea de razonamiento ha llevado a la producción de anticuerpos catalíticos.

Los anticuerpos son proteínas sintetizadas por el sistema inmunológico, que presentan una unión específica de alta afinidad a otras moléculas.

Si un anticuerpo se une estrechamente a un análogo del estado de transición, también podría funcionar como una enzima para esa reacción en particular.

Sobre la base de esta estrategia, se han generado muchos anticuerpos catalíticos para una variedad de reacciones.

Es necesario sintetizar un análogo de estado de transición apropiado, inyectarlo en un conejo y recolectar el anticuerpo en unos pocos meses.

Ver enlace a Unión de antígeno por anticuerpo.

Dependencia del pH de la cinética enzimática:

Muchas enzimas exhiben tasas que varían con el pH. Esto refleja que el estado de carga o protonación de uno o más grupos puede influir en la catálisis.

1) El sitio activo de la enzima contiene un grupo que debe estar protonado o no protonado. Esto puede afectar tanto a los pasos catalíticos como a los de unión.

2) Puede ocurrir un cambio conformacional en la enzima debido a la protonación / desprotonación, y un estado es menos activo o inactivo. Esto podría ser la pérdida de un par de iones.

3) El sustrato puede contener un grupo cuyo estado de protonación afecta la unión a la enzima.

A continuación se muestran 3 tipos típicos de dependencia del pH de la actividad enzimática.

¿Qué podemos aprender de tales tramas?

Si la parcela tiene una meseta, el pKa El valor se revelará como el punto medio de la transición (mostrado como un punto).

Desde el pKa valor podemos adivinar el aminoácido involucrado, aunque no con certeza.

Por ejemplo, pKa 3-5 sugieren Asp o Glu

Sin embargo, estos pKa los valores de Asp o Glu podrían cambiarse, como se explicó anteriormente:

En un par de iones, el pKa del ácido se desplazará hacia abajo, porque será más difícil protonar el ácido (y perder la carga necesaria)

En un entorno no polar, el pKa del ácido se desplazará hacia arriba porque será más difícil desprotonar el ácido, creando una carga desfavorable.

A partir de la dependencia del pH, podemos determinar fácilmente si la forma protonada o no protonada es el estado activo. Si se produce una alta actividad a un pH alto, entonces la forma no protonada es el estado activo.


  • Aquí, la enzima protona o desprotona el sustrato para reducir la energía libre del estado de transición.
    • La enzima puede actuar como un ácido o una base.
    • Ejemplos de catálisis ácida / básica
      • ARNasa A
        • Una hidrolasa que hidroliza los enlaces fosfodiéster en el ARN.
        • Los sitios activos tienen dos histidinas
        • Implica un intermedio de nucleótidos cíclicos de 2 "3"
        • Mayormente hoja beta
        • His 12 actúa como base general y His 119 como ácido general para promover el ataque nucleofílico y la escisión de enlaces.
        • Un mecanismo catalítico que involucra un intermedio covalente enzima-sustrato.
        • La formación transitoria del complejo aumenta las velocidades de reacción.
        • La enzima ataca nucleofílicamente al sustrato (también llamada catálisis nucleofílica).
        • Reversible

        Abstracto

        Las histonas desacetilasas (HDAC) regulan procesos celulares como la diferenciación y la apoptosis y son el objetivo de las terapias contra el cáncer en desarrollo y en la clínica. El HDAC8 es un HDAC de clase I dependiente de metales y se propone utilizar un par catalítico ácido-base general en el mecanismo de hidrólisis del enlace amida. Aquí, informamos mutagénesis dirigida al sitio y mediciones enzimológicas para dilucidar el mecanismo catalítico de HDAC8. Específicamente, nos centramos en la función catalítica de Y306 y las díadas de histidina-aspartato H142-D176 y H143-D183. Además, informamos estructuras cristalinas de rayos X de cuatro mutantes HDAC8 representativos: D176N, D176N / Y306F, D176A / Y306F y H142A / Y306F. Estas estructuras proporcionan un marco útil para comprender las mediciones enzimológicas. La dependencia del pH de kgato/KMETRO para Co (II) -HDAC8 de tipo salvaje tiene forma de campana con dos pKa valores de 7,4 y 10,0. La parte superior pKa refleja la ionización de la molécula de agua unida al metal y cambia a 9,1 en Zn (II) -HDAC8. El mutante H142A tiene actividad 230 veces menor que la de HDAC8 de tipo salvaje, pero la pKa1 el valor no se modifica. Y306F HDAC8 es 150 veces menos activo que las estructuras cristalinas de la enzima de tipo salvaje que muestran que los enlaces de hidrógeno Y306 con el sustrato carbonilo unido a zinc, están preparados para la estabilización del estado de transición. Los mutantes H143A y H142A / H143A exhiben una actividad & gt80000 veces menor que la del HDAC8 de tipo salvaje; los mutantes D176N y D176A enterrados tienen efectos catalíticos significativos, con efectos más sutiles causados ​​por D183N y D183A. Estos estudios enzimológicos y estructurales sugieren fuertemente que el H143 funciona como un catalizador ácido de base general único, mientras que el H142 permanece cargado positivamente y sirve como un catalizador electrostático para la estabilización del estado de transición.


        Valor de la catálisis ácido-base general para la ribonucleasa A

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        CONCLUSIONES

        Los resultados de este estudio proporcionan evidencia bioquímica convincente de que HDAC8 emplea un mecanismo catalítico en el que H143 es un catalizador ácido general único de base general, mientras que H142 es un catalizador electrostático que también puede ayudar a posicionar correctamente H143 a través de interacciones estéricas. En la Figura 8 se presenta un mecanismo HDAC8 revisado basado en estos hallazgos. Este mecanismo difiere del propuesto originalmente basado en la estructura cristalina de la proteína similar a la histona desacetilasa de Aquifex aeolicus, en el que H142 sirve como catalizador básico general y H143 sirve como catalizador ácido general. 31 Es importante destacar que el mecanismo revisado predice diferentes estados de protonación de H142 y H143 en la enzima nativa que los propuestos originalmente, que pueden ser el objetivo de inhibidores de HDAC eficaces. El mecanismo revisado es consistente con los resultados de los estudios QM / MM informados por Zhang y colegas que sugieren que el H143 sirve como un ácido general de base general, 60,61 pero contrasta con las conclusiones de los estudios QM / MM informados por Wiest y colegas que sugieren que H142 sirve como base general y H143 sirve como ácido general. 62 Los estudios futuros investigarán y aclararán más los detalles de la química ácido-base para la catálisis y la unión del inhibidor a HDAC8, así como a otros miembros de la familia de enzimas HDAC.

        Los datos presentados en este documento apoyan un nuevo mecanismo en el que H143 es tanto la base general como el catalizador ácido general, y el H142 está protonado y sirve como catalizador electrostático. El ion metálico catalítico y Y306 orientan el sustrato carbonilo y estabilizan el intermedio tetraédrico y sus estados de transición flanqueantes.


        Catálisis homogénea

        Cuando el catalizador y las sustancias reaccionantes están presentes juntos en un solo estado de la materia, generalmente como un gas o un líquido, se acostumbra clasificar las reacciones como casos de catálisis homogénea. Los óxidos de nitrógeno sirven como catalizadores para la oxidación del dióxido de azufre en el proceso de la cámara de plomo para producir ácido sulfúrico, una instancia de catálisis homogénea en la que el catalizador y los reactivos son gases. Las trazas de vapor de agua catalizan algunas reacciones de los gases, por ejemplo, la interacción del monóxido de carbono y el oxígeno, que avanza lentamente en condiciones secas. El ácido sulfúrico utilizado como catalizador para la formación de éter dietílico a partir de alcohol etílico es un ejemplo de catálisis homogénea en la fase líquida (cuando los productos, agua y éter, se eliminan continuamente por destilación) mediante este método, se pueden extraer cantidades considerables de alcohol. convertido en éter con una sola carga de ácido sulfúrico. La inversión del azúcar de caña y la hidrólisis de ésteres por soluciones ácidas también son ejemplos de catálisis homogénea en fase líquida.

        La oxidación de las soluciones de sulfito de sodio por el oxígeno disuelto se acelera en gran medida por las diminutas trazas de iones de cobre en el sistema líquido homogéneo. Este sistema es de especial interés ya que se ha demostrado que el proceso es una reacción en cadena. En este caso, muchos miles de moléculas de sulfito de sodio pueden oxidarse a sulfato si el proceso de activación inicial se produce mediante la absorción de un número limitado de cuantos (medidas de energía discretas) de luz. El mejor ejemplo de una reacción en cadena iniciada por luz es la fotocombinación de hidrógeno (H2) y cloro (Cl2) se pueden formar hasta un millón de moléculas de cloruro de hidrógeno por absorción de un solo cuanto de luz (designado hν). Aquí la secuencia de reacción es

        con las reacciones 2 y 3 repetidas una y otra vez. Es interesante notar que tales reacciones en cadena pueden retardarse por la presencia de catalizadores negativos, más comúnmente denominados inhibidores. Estos son materiales que ralentizan la reacción general al acortar las cadenas de reacción, generalmente al entrar en una reacción no en cadena con uno de los componentes químicos que mantienen la cadena. Se ha descubierto que una amplia variedad de sustancias, incluidos alcoholes, azúcares y fenoles, actúan como inhibidores de la oxidación de soluciones de sulfito.

        El físico químico danés J.N. Brønsted a mediados de la década de 1920 sobre la base de su concepto de ácidos y bases. Según Brønsted, un ácido es una molécula que puede proporcionar un protón y una base es una molécula que absorbe un protón. En este supuesto, la gama de ácidos incluye materiales tan variados como ion bisulfato, HSO4 - ácido acético, CH3Agua COOH, H2O ion hidronio, H3O + e ion amonio, NH4 +. Las bases correspondientes son ion sulfato, SO4 2− ion acetato, CH3COO - ion hidróxido, OH - agua, H2O y amoniaco, NH3 (estas sustancias aceptan protones para producir los ácidos enumerados). Brønsted estudió una serie de reacciones catalizadas por ácidos y bases, que incluyen (1) la hidrólisis catalizada por ácido de un éster, el ortoacetato de etilo, (2) la catálisis básica de la descomposición de nitramida (H2N – NO2→ H2O + N2O) y (3) la catálisis ácido-base de la conversión (mutarrotación) de glucosa a una forma estrechamente relacionada. En cada caso, observó una relación directa entre la velocidad de la reacción catalizada y la concentración de la sustancia catalizadora.

        Basado en parte en las ideas de Brønsted, un esquema general para el cambio de una sustancia A a otra sustancia B catalizado por un material C se puede formular así:

        La designación Z se refiere a una etapa intermedia, que se forma con una velocidad indicada por k1 Z puede desaparecer ya sea para reformar A + C, con una velocidad k2, o puede descomponerse por la ruta 2, con velocidad k3, para dar el producto B y regenerar el catalizador C. Si k3 es mucho mayor que k2, el intermedio Z se consume casi tan rápido como se forma. Entonces, el producto se formará a una velocidad gobernada por la expresión k1[A][C], en el que los corchetes indican concentraciones de reactivo y catalizador. Si k2 es mucho más grande que k3, sin embargo, el proceso que determina la velocidad es la descomposición de Z, la tasa de formación del producto está representada por la expresión k3[Z], en el cual [Z] es la concentración del intermedio. Se han estudiado ejemplos de ambos tipos de cambio.

        En ciertos casos, dos o más catalizadores presentes al mismo tiempo producen efectos mayores que los que produciría cualquiera de ellos por sí solo. Entonces se acostumbra hablar de acción promotora. Por lo tanto, los iones de hierro en solución fortalecen la acción de los iones de cobre al catalizar una reacción entre el peróxido de hidrógeno y el yodo. Se supone que cada catalizador activa solo uno de los reactivos.

        Los ejemplos modernos más importantes de catalizadores homogéneos se encuentran en la industria petroquímica.La oxoreacción es uno de esos procesos: se añaden monóxido de carbono e hidrógeno a olefinas (hidrocarburos insaturados) a alrededor de 150 ° C (300 ° F) y 200 atmósferas de presión para formar aldehídos y alcoholes, compuestos orgánicos que contienen oxígeno. Un catalizador de cobalto carbonilo Co2(CO)8 se emplea este catalizador soluble en hidrocarburos se cree que activa el hidrógeno mediante la formación de HCo (CO)4, que luego reacciona con la olefina. Esta reacción ha dado lugar a varios estudios de química organometálica. También se sabe que los cationes de cobre, plata y mercurio (iones cargados positivamente) y los aniones permanganato (iones negativos) actúan como catalizadores homogéneos para la activación del hidrógeno. El cloruro de paladio se emplea industrialmente en la oxidación catalítica de etileno a acetaldehído en presencia de cloruro cúprico. Se supone que el paladio se convierte repetidamente de la sal al metal libre, siendo la función del cloruro cúprico participar en la reformación de la sal de paladio a partir del metal.

        Los ácidos fosfórico, sulfúrico, sulfónico y bromhídrico son agentes importantes en los procesos industriales de isomerización, polimerización, hidratación y deshidratación, así como en las clásicas reacciones de esterificación. Los radicales libres (fragmentos moleculares que llevan electrones desapareados) que se generan por la descomposición de peróxidos o alquilos metálicos también inician procesos catalíticos homogéneos.


        Catalizadores biológicos: las enzimas

        Las enzimas son sustancias que se encuentran en los sistemas biológicos y que son catalizadores de procesos bioquímicos específicos. Aunque se habían hecho descubrimientos anteriores de enzimas, en 1897 el químico alemán Eduard Buchner encontró una confirmación significativa de su importancia en los sistemas vivos, quien demostró que el licor libre de células filtrado de las células de levadura trituradas podría provocar la conversión de azúcar en dióxido de carbono. Desde entonces, se han reconocido más de 1000 enzimas, cada una específica para una reacción química particular que ocurre en los sistemas vivos. Se han aislado más de 100 de estos en forma relativamente pura, incluidas varias enzimas cristalizadas. Las primeras enzimas que se cristalizaron fueron la ureasa, aislada del frijol jack y cristalizada en 1926 por James Batcheller Sumner, y la pepsina, cristalizada en 1930 por John Howard Northrop, ambos ganadores del Premio Nobel de Química por su trabajo. Se demostró que estos materiales purificados eran proteínas, compuestos de cadena de aproximadamente 20 aminoácidos naturales RCH (NH2) COOH, que va desde el más simple, glicina, en el que R es hidrógeno, hasta triptófano, en el que R es

        No solo se han elaborado métodos para determinar los aminoácidos que se encuentran en una enzima, sino que también se puede dilucidar la secuencia de aminoácidos en una enzima mediante un método desarrollado por el bioquímico inglés Frederick Sanger para determinar la estructura de la hormona proteica insulina. La primera enzima en tener su secuencia completa de aminoácidos determinada de esta manera fue la ribonucleasa pancreática bovina, que tiene 124 aminoácidos en su cadena y un peso molecular de aproximadamente 14.000; la enzima cataliza la degradación del ácido ribonucleico, una sustancia activa en la síntesis de proteínas en Células vivas. En enero de 1969 se informó de la síntesis de esta misma enzima desde dos laboratorios diferentes. La actividad de una enzima depende de una estructura tridimensional o terciaria, pero esto, a su vez, parece depender únicamente de la secuencia lineal de aminoácidos. El éxito de la síntesis de una enzima puede comprobarse de forma inequívoca mediante la prueba de su actividad enzimática.

        Las enzimas son extremadamente reactivas, como puede demostrarse con una reacción muy simple — la división del peróxido de hidrógeno para formar agua y oxígeno — provocada por metales coloidales y por la enzima catalasa. Se ha encontrado que una molécula de este último provocará la descomposición de varios millones de moléculas de peróxido por minuto, una velocidad comparable a la obtenida con las mejores preparaciones coloidales. Esta velocidad de descomposición de la catalasa es probablemente la máxima para las enzimas. Las enzimas de acción más lenta normalmente reaccionan a velocidades de cientos de reacciones por minuto. La velocidad de reacción a menudo se expresa mediante una ecuación desarrollada por L. Michaelis y M.L. Menten de la forma

        en el cual V y K son constantes para el proceso enzimático particular, K siendo denominada la constante de Michaelis y [S] designado como la concentración del reactivo que experimenta cambios. A bajas concentraciones de S la tasa es V[S]/K o proporcional a la concentración de sustrato [S], mientras que a altas concentraciones de sustrato el [S] términos se cancelan y la reacción es esencialmente independiente de la concentración de sustrato.

        Una segunda característica de las enzimas es su extrema especificidad. Se ha sugerido que cada proceso bioquímico tiene su propia enzima específica. Los procesos bioquímicos inducidos por enzimas se clasifican en amplias clasificaciones, como hidrólisis, descomposición (o "escisión"), síntesis e hidrogenación-deshidrogenación, ya que con los catalizadores en general, las enzimas son activas tanto para reacciones directas como inversas.

        Al igual que los catalizadores de laboratorio, las enzimas suelen tener activadores: coenzimas, que pueden ser grupos prostéticos (firmemente unidos a la propia enzima) e iones inorgánicos. El trifosfato de adenosina (ATP) es una coenzima importante que participa en los procesos de producción de energía y el paso a través de las membranas celulares. Las coenzimas a menudo contienen vitaminas como parte de su estructura. Los iones de calcio y magnesio son importantes activadores de enzimas. También hay muchas sustancias que inhiben, o envenenan, las enzimas. El ion cianuro es un potente inhibidor en muchos procesos enzimáticos, al igual que los gases nerviosos y los insecticidas.


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        4.4 Algunas propiedades del grupo fosfato (conceptos generales)

        Para una mejor comprensión de las propiedades de los nucleótidos que se derivan de la presencia de un grupo fosfato en sus moléculas, primero debemos revisar los conceptos adoptados actualmente con respecto a la estructura del grupo fosfato y también discutir, utilizando análogos de nucleótidos tan simples como alquilfosfatos y compuestos similares como ejemplos, el mecanismo de sustitución nucleofílica en el átomo de fósforo como reacción más típica de los fosfatos. Esto no solo arrojará más luz sobre ciertas regularidades en las propiedades de los nucleótidos, sino que también permitirá conocer más sobre las propiedades especiales impartidas al grupo fosfato por el nucleósido. En esta sección, la estructura y propiedades del grupo fosfato se comparan, siempre que sea necesario, con las de su análogo formal, el grupo carboxilo, lo que nos permite enfatizar el peculiar comportamiento de los derivados orgánicos del ácido fosfórico.

        Además, los alquilfosfatos se utilizan como ejemplos para ilustrar las transformaciones de crucial importancia en la química de nucleótidos y ácidos nucleicos, a saber, hidrólisis y reacciones que involucran a los grupos vecinos.

        4.4.1 Estructura del grupo fosfato y mecanismo de Sustitución nucleofílica en el átomo de fósforo

        Como se sabe, la configuración electrónica del fósforo es 1s2 2s2 2pag6 3s2 3pag3. Su valencia está determinada por la estructura de la capa más externa que, característicamente, incluye no sólo 3s y 3pag pero también 3D orbitales (Fig. 4-2).

        El ácido fosfórico y sus ésteres pertenecen a compuestos con un átomo de fósforo de cuatro coordinados. Estas moléculas son tetraédricas. Los cuatro enlaces s con sp 3 la hibridación de los orbitales electrónicos se dirige hacia los ápices del tetraedro:

        Por tanto, la estructura del grupo fosfato difiere ampliamente de la del grupo carboxilo en los ácidos carboxílicos. Es bien sabido que este último grupo tiene una estructura bidimensional: la formación de los tres enlaces s en él implica la sp2 orbitales híbridos del átomo de carbono (se encuentran en el mismo plano y forman ángulos de 120 °), mientras que el cuarto enlace p resulta de la superposición de los orbitales p de los átomos de carbono y oxígeno en ángulo recto con este plano. El enlace p está polarizado debido a la pronunciada electronegatividad del átomo de oxígeno., en comparación con el carbono, el grado de polarización depende del efecto inductivo y el mesomerismo de los sustituyentes en el carbono del carbonilo.

        En la actualidad, no existe consenso sobre la naturaleza de los enlaces en compuestos con un átomo de fósforo tetraédrico. No obstante, todos los supuestos en este sentido se basan en los conceptos generales relativos a la estructura y propiedades de pag y D orbitales. Se ha especulado que el enlace p en el grupo fosforilo (P = O) puede involucrar 3D orbital. Como hay cinco orbitales de este tipo (véase la figura 4-2) y cada uno de ellos puede, en principio, recibir el quinto electrón, el átomo de fósforo puede interactuar con el del oxígeno de varias formas para formar un enlace p en el grupo fosforilo. Como resultado de la superposición parcial de los 3D y pag orbitales de los cuatro átomos de oxígeno en el grupo fosfato, el doble enlace no se localiza en el grupo fosforilo sino que se distribuye, aunque de manera desigual, entre todos los átomos de oxígeno del grupo fosfato. Por ejemplo, el conocimiento de las longitudes de los enlaces PO (datos estructurales de rayos X) en el fosfato de dibencilo, (C6H5CH2O) 2P (O) OH, ha llevado a la conclusión de que cada uno de los enlaces PO simples representa el 10% de los enlaces dobles. y el enlace P = O en el grupo fosforilo representa el 70%. Además, la diferencia entre los dobles enlaces en los grupos C = O y P = O radica en el hecho de que el último enlace está polarizado en un grado mucho mayor (el átomo de fósforo pierde fácilmente electrones de los orbitales d y probablemente por esta razón es menor electronegativo que el carbono). Tales características estructurales del grupo fosfato se manifiestan en la mayor nucleofilia del oxígeno fosforílico y electrofilia del átomo de fósforo. La transferencia de efectos electrónicos de los sustituyentes, especialmente el efecto de conjugación con participación del grupo fosforilo, en los ésteres de fosfato y sus derivados es mucho menos pronunciada que en los derivados del ácido carboxílico porque los sustituyentes no se encuentran en el mismo plano.

        Al mismo tiempo, los grupos fosfato y carboxilo comparten una característica común, a saber, su átomo central lleva una carga positiva parcial y, por lo tanto, es capaz de ser atacado por agentes nucleófilos. Cuando el átomo de fósforo sufre un ataque de este tipo, la sustitución nucleofílica de uno de los ligandos (como se suele llamar a los sustituyentes en el átomo de fósforo) puede tener lugar en los derivados del ácido fosfórico.

        Este proceso puede basarse en uno de los dos mecanismos: asociativo (A) y disociativo (B). En el primer caso, el sustrato se coordina con el nucleófilo en el paso que determina la velocidad de reacción. La asociación resultante es bastante estable y puede considerarse como un compuesto intermedio. Este proceso suele estar representado por el símbolo Snorte2. El mecanismo disociativo se caracteriza por el hecho de que el paso de determinación de la tasa de sustitución implica

        salida de uno de los sustituyentes y formación de un compuesto de fósforo activo con un número menor de sustituyentes en el átomo central. Este tipo de transformación está representado por el símbolo SN1. En algunos casos, sin embargo, el evento de sustitución es un proceso biomolecular sincrónico y no se forma ningún compuesto intermedio, en contraste con la sustitución SN2 en el átomo de carbono. El mecanismo de tales reacciones se conoce como intermedio y se denota Ia( Snortei) (& quota & quot indica que el proceso de sustitución sigue siendo asociativo en esencia). Los dos primeros mecanismos se discuten en lo que sigue aquí en esta sección mecanismo Ia se trata en el apartado que trata de las propiedades de las amidas del ácido fosfórico cuyas transformaciones llevaron a su descubrimiento en primer lugar.

        Mecanismo Snorte2 de sustitución nucleofílica en el átomo de fósforo tetraédrico ha sido corroborado por numerosos experimentos cinéticos con hidrólisis y alcoholisis de fosfatos de halógeno. Se ha especulado que, formalmente, la reacción procede de manera muy similar a la sustitución nucleófila en el carbono saturado: el nucleófilo Nu ataca el sitio de reacción desde atrás, con respecto al grupo saliente X.

        Después de la salida del sustituyente X, la configuración se invierte. Se ha demostrado una inversión de Walden durante la sustitución nucleofílica en el átomo de fósforo tetraédrico en muchos experimentos destinados a dilucidar la reactividad de compuestos que contienen fósforo ópticamente activos.

        Se cree que la estructura más probable del compuesto intermedio es una bipirámide trigonal en la que los grupos de entrada y salida (sustituidos) (Nu y X, respectivamente, en la figura 4-3A) ocupan una posición axial.

        Geométricamente, esta estructura recuerda el estado de transición que surge durante una reacción S, 2 en el átomo de carbono saturado (figura 4-3B). En el último caso, sin embargo, los cinco enlaces difieren notablemente en fuerza: los tres enlaces en la base de la bipirámide son bastante fuertes, mientras que los otros dos (C-X y C-Nu) están cerca de los enlaces iónicos. Al mismo tiempo, en virtud de la capacidad del átomo de fósforo para aceptar electrones en el 3D orbitales (ver Fig. 4-2), puede formar compuestos con cinco enlaces covalentes de fuerza comparable, si no idéntica. En compuestos intermedios de tipo A, por ejemplo (ver Fig.4-3), los tres enlaces en la base de la bipirámide (enlaces ecuatoriales), formados con la participación de sp2-orbitales híbridos, son más fuertes. Los otros dos enlaces (axiales) que involucran pd-los orbitales híbridos son más débiles.

        En consecuencia, estamos tratando aquí con una propiedad única importante del átomo de fósforo, a saber, su capacidad para formar enlaces adicionales que involucran a sus 3d orbitales. En este caso, la regla del octeto generalmente no se observa y el átomo de fósforo en estructuras similares puede estar rodeado por una capa de diez electrones.

        El mecanismo de sustitución nucleofílica en el átomo de fósforo, descrito en el contexto del grupo fosfato, difiere sustancialmente del de sustitución nucleofílica en el carbono carbonilo en derivados de ácido carboxílico, donde la formación de la estructura intermedia está asegurada por la ruptura del doble C = O enlace.

        El ataque nucleofílico del carbono en el grupo carbonilo procede en ángulo recto con el plano que aloja la molécula RCOX. La estructura que emerge después de la ruptura del enlace C = 0 se caracteriza por sp 3 hibridación de los orbitales de electrones en el átomo de carbono (con los cuatro enlaces s dirigidos hacia los ápices del tetraedro).

        La tasa de sustitución nucleofílica en el átomo de fósforo tetraédrico está determinada por los siguientes tres factores principales: (1) especies sustituyentes, (2) especies del grupo saliente y (3) especies del agente nucleófilo.

        Sustituyentes. La facilidad de sustitución nucleófila en el átomo de fósforo tetraédrico puede depender tanto de las propiedades donante-aceptor de los sustituyentes como de su estructura tridimensional.

        Se debe comenzar la discusión del efecto que ejercen los grupos alcoxi en los fosfatos comparándolos con derivados análogos de ácidos carboxílicos. Es un hecho bien conocido que los grupos alcoxi pueden producir efectos mesoméricos positivos e inductivos negativos sobre los átomos o grupos de átomos asociados. En los casos en que es posible la conjugación, el efecto mesomérico positivo es mucho más pronunciado que el inductivo negativo.

        Ya se ha mencionado anteriormente que los compuestos que contienen carbonilo tienen una estructura bidimensional. Esta es la razón por la que los electrones de par solitario de algunos átomos adyacentes al grupo carbonilo interactúan con él con bastante fuerza (están en conjugación):

        Una conjugación similar en fosfatos de configuración tetraédrica no es tan manifiesta (para las características estructurales del grupo fosforilo, ver más arriba). Sin embargo, también pueden mostrar la conjugación de los átomos de oxígeno y fósforo debido a los 3 vacantes.D orbitales de este último (los llamados) pag conjugación p -d p). Los electrones de par solitario del oxígeno en el grupo alcoxi pueden transferirse al 3D orbitales del átomo de fósforo, que, a su vez, deben dar lugar a más obstáculos para la interacción entre el fósforo y el nucleófilo. La presencia y el grado de dicha conjugación se confirman por los resultados de la hidrólisis de cloruros carboxílicos y fosfóricos:

        En un compuesto de carbonilo, el sustituyente que presenta propiedades de donante p ralentiza drásticamente el ataque nucleofílico. Por ejemplo, el clorocarbonato de etilo (1) se hidroliza a una velocidad 104 veces más lenta que el cloruro de acetilo (2). El efecto de tal sustituyente también se observa en un compuesto de fosforilo, pero en un grado mucho menor. La hidrólisis del derivado de metoxifosforilo (3), por ejemplo, es solo 15 veces más lenta que la de su análogo de alquilo (4).

        El hecho de que la conjugación pp-dp de sustituyentes con el átomo de fósforo afecte a la actividad de este último en reacciones de sustitución nucleófila se confirma mediante ejemplos bien conocidos de reactividad decreciente, ya que los radicales alquilo en compuestos de estructura similar son sustituidos por grupos alcoxi o amida. . Se ha encontrado que la reactividad durante la hidrólisis alcalina disminuye perceptiblemente en el siguiente orden: (C2H5) 2POCl & gt CH3O (C2H5) POCI & gt (CH3O) 2POCI. Los obstáculos estéricos que surgen durante la hidrólisis de estos compuestos son más o menos los mismos. Al igual que en el caso anterior, los cambios en la reactividad se atribuyen al hecho de que los electrones del par solitario del oxígeno en el grupo alcoxi se desplazan al 3d orbitales del átomo de fósforo. Desde el 3d Los orbitales del átomo de fósforo están bastante ocupados como resultado de tal conjugación que también conduce a una disminución en su carga positiva excedente, incorporación de los electrones del par solitario del agente nucleófilo en el 3d Los orbitales del átomo de fósforo se ven obstaculizados significativamente en el estado de transición con una caída asociada en la tasa de sustitución nucleofílica.

        Un efecto inhibidor aún más pronunciado sobre la sustitución nueleófila en el átomo de fósforo lo ejerce un grupo alquilamida (o dialquilamida). Por ejemplo, la hidrólisis alcalina de la diamida [(CH3) 2N] 2P (O) F procede a una velocidad más lenta en un factor de decenas de miles que en el caso del derivado metilmetoxi CH3O (CH3) P (O) F. Esta influencia del grupo amino en las fosfamidas se atribuye al hecho de que, en virtud de su efecto mesomérico positivo más pronunciado y uno inductivo negativo menos pronunciado, en comparación con el grupo alcoxi, debilita en gran medida las propiedades electrofílicas del átomo de fósforo asociado. mayor grado (debido a la p p -d p conjugación).

        En los fosfatos de halógeno (RO) 2P (O) X, los halógenos (X = F y Cl) también pueden estar en p p -d p conjugación con el átomo de fósforo. La evidencia experimental atestigua un menor grado de participación del átomo de cloro en dicha conjugación, en comparación con el flúor, a pesar de la mayor electronegatividad de este último (los cloruros de ácido son mucho más reactivos que los fluoruros de ácido).Por lo tanto, el grado de conjugación parece depender no solo de la electronegatividad, sino también de la estructura de la capa más externa del átomo asociado con el fósforo.

        También se ha observado una relación similar en el caso de fosfatos y tiofosfatos trisustituidos, (RO) 2P (O) OR 'y (RO) 2P (O) SR', que difieren en la estructura de un sustituyente. Los tiofosfatos de dialquilo son decenas de miles de veces más reactivos que los fosfatos de trialquilo.

        El curso exacto tomado por la sustitución nucleofílica en el átomo de fósforo tetraédrico se ve fuertemente afectado no solo por la capacidad de conjugación de los sustituyentes, sino también por su tamaño. En este caso, los obstáculos estéricos son más influyentes que en la serie de compuestos carboxílicos con estructura plana en el grupo carboxilo. En los ésteres del tipo (CH3O) 2P (O) X, la sustitución del grupo metilo por uno de terc-butilo conduce a una caída bastante pronunciada de la velocidad de hidrólisis alcalina.

        Saliendo del grupo. Este factor es tan importante en las reacciones de sustitución nucleofílica como la electrofilia del átomo de fósforo. El efecto del grupo saliente es bastante simple. Cuanto mayor sea la facilidad con la que se rompa su enlace con el sitio de reacción, más reactiva será la sustancia. Dado que el grupo saliente se marcha llevando consigo su par de electrones, todos los factores que conducen a su mayor electronegatividad suelen facilitar el curso de la reacción. En compuestos del tipo (RO) 2P (O) X, X es siempre el grupo saliente si está asociado con el átomo de fósforo mediante un enlace más débil que el que une el grupo alcoxi con este último. Ya hemos visto ejemplos en los que el grupo X estaba representado por un átomo de cloro, RS y otros grupos. Si la función del grupo saliente la realiza un anión de ácido fosfórico, cuando tiene lugar la sustitución nueleofílica en pirofosfatos, por ejemplo, el ataque termina en la liberación de un anión más estable, es decir, un anión de un ácido más fuerte. Por ejemplo, el pirofosfato de dibencildifenilo asimétrico reacciona con alcoholes para producir exclusivamente fosfatos de dibencilo (el ácido difenilfosfórico es más fuerte que el dibencilfosfórico).

        Agente nucleofílico. En el curso de la sustitución nucleofílica. el nucleófilo desplaza al grupo que está siendo sustituido de la molécula del sustrato (en nuestro caso, fosfato). Como ya se ha señalado, la facilidad con la que la sustancia nucleófila se une al átomo de fósforo que actúa como lugar de reacción depende de varios factores. Uno de ellos es nucleofilia o, en otras palabras, la capacidad de un reactivo de ceder su par de electrones para combinarse con el sitio de reacción. La nucleofilia está determinada por la movilidad de los electrones en la partícula nucleofílica, su polarizabilidad y factores estéricos. Los agentes nucleofílicos que reaccionan fácilmente con el átomo de fósforo tetraédrico pueden disponerse como sigue [con respecto a los clorofosfinatos del tipo R2P (O) CI]: HO- & gt C6H5O- & gt C2H5OH & gt C2H5S-, CH3COO-. La hidroxilamina y los ácidos hidroxámicos muestran una nucleofilicidad mucho más pronunciada. El aumento de la actividad de estos compuestos se debe al hecho de que el átomo involucrado en el ataque nucleofílico se encuentra junto a otro que tiene un par de electrones solitarios (efecto a). Esto parece asegurar una mayor polarización del agente nucleofílico. Naturalmente, dependiendo de cuán completamente 3d Los orbitales del átomo de fósforo están ocupados como resultado de pag pag -D p, conjugación con los sustituyentes. la basicidad y la polarización de los nucleófilos pueden influir en la velocidad de reacción de manera diferente. Se ha demostrado que cuanto más pronunciada es la conjugación de sustituyentes, por ejemplo, grupos alcoxi y dialquilamida con 3d orbitales, cuanto menos significativo es el efecto de basicidad del nucleófilo sobre la velocidad de reacción y mayor es la importancia de la polarizabilidad.

        Ya se ha mencionado que durante la sustitución basada en la Snorte2 en el estado de transición, los enlaces del átomo de carbono saturado (ver Fig. 4-3B) difieren ampliamente en fuerza, y es probable que el estado de transición no exista por un tiempo más o menos largo. Al mismo tiempo, el estado correspondiente del átomo de fósforo en los fosfatos (véase la figura 4-3A) se caracteriza por una diferencia mucho menor en la fuerza de unión y es comparativamente más estable. Son estas características específicas las que hacen posible la reestructuración del estado de transición (tipo A en la figura 4-3), que en última instancia puede afectar el resultado final de la sustitución. Tal reestructuración no está acompañada por la escisión de los enlaces sustituyentes de fósforo y se reduce a cambios en los ángulos y longitudes de los enlaces en un estado transitorio suficientemente persistente, como lo representa la bipirámide trigonal. Este tipo de reestructuración se muestra esquemáticamente a continuación.

        Deje que los sustituyentes E1, E2 y E3 en la bipirámide trigonal inicial ocupen posiciones ecuatoriales, con los sustituyentes Al y A2 en axiales.

        En un momento determinado, los sustituyentes A1 y A2 comienzan a moverse uno hacia el otro en el plano de la página. Simultáneamente, los sustituyentes E2 y E3 se mueven en un plano perpendicular al de la página de modo que E3 se mueve hacia arriba desde la página, mientras que E2 se mueve en la dirección opuesta. Como resultado, surge un estado (6) en el que los sustituyentes A1, A2 y E3 forman la base de una bipirámide tetragonal con vértice E1. Los cambios posteriores en los ángulos, que proceden en las mismas direcciones, conducen a un estado (7) donde los sustituyentes E3 y E2 se encuentran en la misma línea recta, mientras que El, A1 y A2 están dispuestos en el plano de la página en un ángulo. de 120 0. En la bipirámide trigonal resultante, las posiciones axiales ahora están ocupadas por los sustituyentes E3 y E2 y las posiciones ecuatoriales están ocupadas por El, A1 y A2. Tal reestructuración del estado transitorio, (5) (7), que, por supuesto, es reversible, se llama pseudorrotación. La línea que conecta el átomo central con el sustituyente El se conoce como eje de rotación. El fenómeno de pseudorotación se observa en compuestos en los que las energías de los enlaces sustituyentes fósforo están razonablemente próximas. En el estado (6), las longitudes de enlace están prácticamente igualadas (rehibridación de los tres sp2 ecuatorial y dos pd orbitales axiales, lo que lleva a cinco sp3D orbitales híbridos), y la función del eje de rotación puede ser realizada virtualmente por cualquier enlace sustituyente fósforo, siempre que no difiera marcadamente de los demás. Algunos ejemplos de seudorotación se examinan a continuación en la sección 4.4.4 que trata de los fosfatos cíclicos.

        Mecanismo SN1. Se cree que algunas reacciones de sustitución nucleofílica en un átomo de fósforo tetraédrico implican un mecanismo diferente del SN2 descrito anteriormente. La reacción aparentemente procede en dos pasos, en este caso: primero, uno de los sustituyentes (X) en el grupo fosfato se elimina con formación intermedia del metafosfato correspondiente, luego, el agente nucleófilo (Y -) se le une:

        Esto es lo que se conoce como mecanismo Snorte1 de sustitución de fósforo. Sin embargo, la prueba existente de esto último aún no puede considerarse suficientemente convincente. Ahora siga ejemplos de reacciones que se cree que se basan en este mecanismo.

        El fosfato de salicilo (8) se hidroliza mucho más rápidamente que el fosfato de fenilo no sustituido o paraca-carboxifenilfosfato (la tasa de hidrólisis es máxima a pH 5). Se asumió anteriormente que tiene lugar una catálisis nucleofílica y que el fosfato de saliciloilo (9) sufre hidrólisis. Como se estableció posteriormente. la reacción toma un curso diferente: el fosfato de salicilo (8) se hidroliza más rápidamente que el fosfato de saliciloilo (9) y es esencialmente un compuesto intermedio que se forma durante la hidrólisis de este último:

        La razón de una velocidad de reacción más rápida al pasar de (9) a (8) parece ser la catálisis ácida intramolecular que conduce a la formación de metafosfato [PO3 - ]:

        El monofosfato de 1,8-dihidroxinaftaleno se hidroliza de manera similar:

        La hidrólisis de acilfosfatos y pirofosfatos también parece involucrar el mecanismo SN1:

        Evidencia más sustancial a favor de la SnorteSe proporcionó un mecanismo de sustitución en el átomo de fósforo en estudios de hidrólisis de pirofosfato de tetraetilo. La reacción avanza rápidamente a valores de pH superiores a 9 y es catalizada por iones fosfato. Si el catalizador es un ion fosfato que contiene el isótopo de oxígeno 18 O, el marcador se detecta en la molécula del dietilfosfato emergente. Esto es indicativo de la formación intermedia de un anión metafosfato en esta reacción.

        Esta conclusión se ve confirmada por la formación de metilfosfato (11) cuando la reacción se realiza en metanol y también por trimetafosfato (10) en una solución acuosa concentrada.

        4.4.2 Catálisis de sustitución nucleofílica en el Átomo de fósforo

        Catálisis nucleofílica (aumentando la reactividad del átomo de fósforo). Se ha encontrado que muchas reacciones con la participación de derivados de fosfato implican catálisis nucleofílica por aminas terciarias. La alcoholisis del pirofosfato de tetrabencilo, por ejemplo, es acelerada por imidazol:

        La piridina produce un efecto similar; sin embargo, las aminas impedidas estéricamente, como la 2,6-lutidina, no catalizan tales reacciones.

        La catálisis con un agente nucleófilo reside en que la sustitución del grupo saliente con la formación de un compuesto intermedio y la subsiguiente sustitución del catalizador por el nucleófilo cuya entrada es facilitada por éste se produce a velocidades mucho más rápidas que en una reacción no catalizada. Esto tiene la siguiente explicación: la amina terciaria es un nucleófilo más fuerte que el alcohol, y el intermedio formador con un grupo amonio en el átomo de fósforo es más reactivo que el pirofosfato porque la conjugación pp-dp entre el fósforo y el sustituyente que contiene nitrógeno amónico es completamente molesto y este último ejerce un fuerte efecto de inducción negativa. Un ejemplo de compuestos inestables que pertenecen a esta categoría lo proporcionan los derivados de piridinio de alquilfosfatos:

        Catálisis básica general. Lo que distingue a este tipo de catálisis de la nucleofílica es el efecto isotópico de deuterio. Se sabe que las reacciones cuya velocidad está determinada por la escisión de los enlaces formados por los átomos de deuterio avanzan de cinco a ocho veces más lentamente que las reacciones correspondientes que involucran átomos de protio (en lugar de deuterio). La alcoholisis de pirofosfatos en presencia de bases se ralentiza de ROH a ROD. Esto indica que durante el paso que precede al ataque nucleofílico en el átomo de fósforo, el alcohol es activado por la base, la activación se reduce a la `` eliminación '' del protón:

        Dado que en este caso la base que sirve como catalizador no participa en el ataque nucleofílico en el átomo de fósforo, sus características estéricas no afectan la velocidad de reacción de manera significativa. Por ejemplo, la fosforilación de alcoholes con pirofosfatos (véase más arriba) es catalizada por aminas terciarias, incluidas las estéricamente impedidas como, por ejemplo, 2,6-lutidina.

        Catálisis ácida general. Una buena ilustración de la catálisis ácida de la sustitución nucleofílica en el átomo de fósforo es proporcionada por las reacciones entre el sarín (metilfosfonofluoridato de isopropilo) con fenoles. Por ejemplo, el monoanión pirocatecol reacciona con el sarín a una velocidad mucho más rápida que el ion fenolato.

        Una posible razón es el enlace de hidrógeno entre el grupo hidroxilo no disociado del pirocatecol y los átomos de fosforil oxígeno o sarín flúor, lo que altera la conjugación oxígeno-fósforo con el resultado de que el átomo de fósforo es más fácilmente atacado por el nucleófilo o el ion fenoxi para ser precisos. Parece probable una catálisis en líneas similares para reacciones en las que la función del grupo catalíticamente activo es realizada por el grupo amonio que contiene hidrógeno.

        La velocidad excepcionalmente alta de hidrólisis ácida de un análogo de sarín que contiene un grupo trialquil amino puede atribuirse a la catálisis intramolecular.

        La catálisis ácida general puede implicar grupos carboxilo no disociados. Dietilfenilfosfonato que contiene un grupo carboxilo en el orto la posición se hidroliza fácilmente, cuando se calienta con agua, a un fosfato libre:

        La estabilidad frente a la hidrólisis en las mismas condiciones de la sal de sodio (12) y los ésteres de alquilo (13) del mismo ácido, así como el correspondiente paraisómero (14), proporciona una prueba adicional para soportar la catálisis de ácido intramolecular con la participación de un ortocarboxilo. grupo.

        Catálisis electrofílica. Pueden usarse muchos ejemplos para ilustrar la catálisis de la hidrólisis de fosfato por iones metálicos. Un ejemplo de ello es la alcoholisis de pirofosfato de tetrabencilo con una mezcla de alcohol propílico y amina terciaria, cuya velocidad aumenta sustancialmente en presencia de iones de litio o calcio.

        Este efecto también parece ser una consecuencia de las propiedades electrofílicas mejoradas del átomo de fósforo después de extraer electrones del oxígeno fosforílico. Por tanto, el mecanismo de catálisis en este caso es cercano al ácido, con la diferencia de que el papel del protón lo desempeña el ión metálico. De manera similar, el fluorofosfato de diisopropilo y los compuestos relacionados se hidrolizan rápidamente en presencia de complejos formados por cobre bivalente y a, a '-dipiridilo:

        4.4.3 Hidrólisis de alquilfosfatos

        Dado que los nucleótidos y polinucleótidos permanecieron durante mucho tiempo compuestos relativamente poco conocidos, la mayoría de las conclusiones extraídas con respecto a los mecanismos de sus transformaciones asociadas con el grupo fosfato se basaron en la mayoría de las veces en analogías con las reacciones correspondientes que implican alquilfosfatos. A principios de los años cincuenta, por ejemplo, los mecanismos de hidrólisis de mono y dialquil fosfatos, así como los fosfatos de polioles simples, proporcionaron pruebas para explicar la diferencia en la estabilidad hidrolítica entre el ARN y el ADN. Los mismos hallazgos hicieron posible predecir y explicar muchas propiedades de los derivados de nucleótidos a partir de la estructura del nucleósido asociado y la posición del grupo fosfato en este último. Los datos acumulados hasta ahora no son suficientes para un análisis detallado de los mecanismos de muchas reacciones que involucran nucleótidos y sus derivados, especialmente reacciones enzimáticas con participación del grupo fosfato. No hay duda, sin embargo, de que una contribución importante a la investigación de estos procesos será realizada por las reacciones minuciosamente estudiadas que involucran análogos de nucleótidos tales como alquilfosfatos y fosfatos de polioles. En consecuencia, esta sección se ocupa de las reacciones que implican mono-, di- y trialquil fosfatos y también las de los polioles. Las reacciones discutidas aquí son de gran importancia en la química de los nucleótidos y sus derivados. Se presta especial atención a los procesos con participación de los grupos vecinos, es decir, acompañados de catálisis intramolecular. La mayoría de las reacciones consideradas en esta sección se basan en el mecanismo de sustitución nucleofílica en el átomo de fósforo tetraédrico. Sin embargo, dependiendo de la forma exacta en la que el grupo fosfato participa en la reacción (anión, molécula neutra), esta última también puede tomar un curso diferente. También se discuten los conceptos generales con respecto a tales reacciones.

        Hidrólisis de fosfatos de monoalquilo. La velocidad de hidrólisis de la mayoría de los fosfatos de monoalquilo simples pasa por un máximo que se encuentra en el intervalo de pH de 3 a 5. En la figura 4-4 se muestra una curva típica que muestra la velocidad de hidrólisis de fosfato de alquilo frente al pH del medio.

        A valores de pH alcalino, la tasa de hidrólisis desciende drásticamente. A valores de pH ácido, se observa un mínimo (a pH 1), luego la tasa de hidrólisis aumenta nuevamente con la acidez del medio. Dado que los valores de pKa para el primer y segundo paso de disociación del metilfosfato son 1,54 y 6,31, respectivamente, se puede suponer que la velocidad máxima de hidrólisis a pH 4 corresponde a la concentración de monoanión más alta en la solución. La tasa de hidrólisis decreciente en un medio alcalino sugiere que el dianión no está activo (aparentemente porque la repulsión electrostática dificulta el ataque del dianión por el ion hidroxilo). Un ácido no disociado es menos activo que su monoanión. A pH & lt 1, se puede observar la hidrólisis catalizada por ácido con formación de un ácido conjugado:

        El mecanismo de hidrólisis del monoanión de metilfosfato ha estado en el centro de prolongados debates que terminaron en el rechazo de la hipótesis de sustitución bimolecular (SN2). La tasa de hidrólisis del monoanión de metilfosfato es mucho más alta que la del monoanión de dimetilfosfato (ver más abajo). Esto ha llevado a especulaciones de que para que una molécula muestre algún tipo de reactividad "especial", en un fosfato sustituido, un hidroxilo no disociado debe coexistir con un átomo de oxígeno cargado negativamente. Se han discutido dos mecanismos S, 1 muy similares de catálisis ácida intramolecular general con participación del grupo hidroxilo no disociado en el monoanión. Se ha asumido que el protón puede transferirse al grupo saliente con la participación de agua, a través de la aparición de un estado de transición cíclico de seis miembros, o sin dicha participación, a través de la migración intramolecular:

        Ambos mecanismos incluyen la formación de un metafosfato hipotético. No hay prueba directa de formación de metafosfato durante la hidrólisis de fosfatos de monoalquilo a pH

        4, sin embargo, la hipótesis está respaldada por alguna evidencia indirecta. La estabilidad de los dianiones de monofosfato, si se supone que su hidrólisis se basa en un S similarnorte1, parece derivar del hecho de que muchos grupos alcoxi se eliminan pero con dificultad y pueden "separarse" sólo si están protonados de antemano, como es el caso de los monoaniones. La disociación en un medio alcalino con formación de un anión RO - ocurre solo en el caso de ésteres que contienen grupos aceptores de electrones fuertes, por ejemplo:

        A pesar de las muchas dificultades que surgen en la investigación de la hidrólisis de la forma neutra de los fosfatos de monoalquilo, ROPO3H2, se encontró que iba acompañada de la ruptura del enlace oxígeno-carbono en el radical R. Así, en este caso, el monofosfato actúa como un agente alquilante, al igual que los alquilsulfatos. La sustitución procede como una SnorteReacción de tipo 2 en el átomo de carbono saturado:

        En cuanto a tert-butilfosfato y a -D-glucosa 1-fosfato, cuyas formas neutras se hidrolizan a una velocidad 105 veces más rápida que el metilfosfato pero también con la escisión del enlace C-O, se cree que su hidrólisis se basa en el Snorte1 mecanismo.

        El mecanismo de hidrólisis de tales ésteres parece estar determinado por la facilidad de formación del carbocatión intermedio.

        La hidrólisis de monofosfatos de alcoholes primarios a pH 1 se basa en un mecanismo bimolecular. Experimentos con H2 18 0 han demostrado que ocurren dos procesos paralelos. El primer proceso implica la ruptura del enlace C-0 (73%), mientras que en el segundo proceso es el enlace P-O el que se rompe (27%):

        Los monofosfatos formados por alcoholes secundarios y terciarios se hidrolizan en un medio ácido mediante un mecanismo monomolecular con escisión del enlace C-O únicamente, por ejemplo:

        La Tabla 4-2 es un breve resumen del efecto de la estructura molecular de los fosfatos de monoalquilo sobre su comportamiento durante la hidrólisis.

        Figura 4-5. Tasa de hidrólisis de dimetilfosfato versus pH del medio a 100 0 C

        Tabla 4-2.Efecto de la estructura molecular de los fosfatos de monoalquilo sobre su comportamiento durante la hidrólisis.

        Hidrólisis de dialquil fosfatos. Los fosfatos de dialquilo se encuentran entre los ésteres menos reactivos. La curva que representa su constante de velocidad de hidrólisis en función del pH no tiene un máximo (Fig. 4-5), lo que es indicativo de la hidrólisis extremadamente lenta del monoanión de dialquil fosfato.

        La hidrólisis del diéster en su forma neutra procede predominantemente (70-80%) con ruptura del enlace CO [ecuación (1)], mientras que el PO se rompe solo en el 20 al 30 por ciento de los casos [ecuación (2)] .

        A medida que el medio se vuelve más ácido, la tasa de hidrólisis de fosfato de dialquilo aumenta con la concentración de ácido. La forma protonada del diéster se hidroliza, principalmente, en el enlace C-O (hasta un 90%), al igual que la forma neutra, y el enlace P-O se ve afectado de manera insignificante (10%):

        Por tanto, la diferencia más amplia en la velocidad de hidrólisis de di y monofosfatos se observa en el caso de la forma monoaniónica. Las diferencias en las velocidades de hidrólisis de otras formas iónicas no son tan pronunciadas.

        Hidrólisis de fosfatos de trialquilo. Los trifosfatos se someten a hidrólisis tanto en medios ácidos como alcalinos. A valores de pH alcalino, el mecanismo de reacción es bimolecular e incluye un ataque nucleofílico del átomo de fósforo tetraédrico por un ion hidroxilo (experimentos con H2 18 O han demostrado que el enlace P-O generalmente se rompe en este caso):

        La estructura geométrica del estado de transición es una bipirámide trigonal en la que los grupos entrantes y salientes ocupan posiciones axiales. Esto se corrobora por el hecho de que la hidrólisis alcalina de trifosfatos ópticamente activos suele ir acompañada de inversión. La formación del estado de transición implica la polarización de enlaces: el nueleófilo (anión) dona electrones al átomo de fósforo. Cuando el sustituyente sale en forma aniónica, el fósforo pierde estos electrones y pasa al estado inicial. Debido a la alta sensibilidad de la conjugación hacia la inversión de carga, es más pronunciada en el estado de transición que en el suelo. En presencia de un grupo RO con efecto inductivo negativo en la molécula de triéster, se observan dos efectos de signo opuesto, a saber: efecto inductivo, que lleva al desplazamiento de un electrón del átomo de fósforo a lo largo del enlace PO (en el grupo POR) , y un aumento en la conjugación pp-dp, con el desplazamiento de los electrones del par solitario del oxígeno en el grupo RO al 3d orbitales del átomo de fósforo. A medida que la propiedad donadora de electrones de los radicales (R) en el trifosfato se vuelve más pronunciada, aumenta el mesomerismo positivo de los grupos RO, lo que conduce a enlaces P-O más cortos en los grupos P-O-R y una tasa de hidrólisis alcalina mucho más lenta.

        En soluciones neutras y ácidas, la velocidad de hidrólisis de los trifosfatos depende débilmente de la concentración de protones, lo que sugiere que la forma no protonada del fosfato se hidroliza a una velocidad más rápida. Experimentos con H2 18 0 han demostrado que es el enlace C-O el que se rompe predominantemente en un medio ácido:

        Hidrólisis de fosfatos cíclicos. A diferencia de los dialquilfosfatos simples, los difosfatos cíclicos de cinco miembros son extremadamente reactivos. El fosfato de etileno, por ejemplo, se hidroliza en casos extremos tanto en medios ácidos como alcalinos. En tales condiciones, la velocidad de hidrólisis de este compuesto es aproximadamente 10 7 o 10 8 veces más rápida que la del dimetilfosfato (ver más arriba), y solo se rompe el enlace P-O.

        La alta reactividad de los fosfatos cíclicos, en comparación con los no cíclicos, puede explicarse por la deformación del anillo. El esfuerzo parece ocurrir sólo en los fosfatos cíclicos de cinco miembros, en vista del hecho de que la reactividad de los compuestos con un anillo más grande (seis y siete miembros) es igual a la del dimetilfosfato o es incluso menor. La naturaleza exacta de la conjugación en fosfatos cíclicos de cinco miembros aún no se ha dilucidado, sin embargo, la mayor facilidad de su hidrólisis, en comparación con los derivados acíclicos, sugiere que la formación del estado de transición va acompañada de la eliminación del estado tenso. Esta hipótesis está respaldada por el hecho de que el tratamiento de fosfato de etileno con agua marcada con 18 O en un medio ácido junto con la incorporación del isótopo en el grupo fosfato como resultado de la hidrólisis también conduce al intercambio de oxígeno sin romper el anillo, este último la reacción avanza a la misma velocidad que la hidrólisis (khidr/ kintercambiar =5).

        En consecuencia, se ha postulado la emergencia de un estado de transición para ambas reacciones, que tiene la estructura de una bipirámide trigonal (15) (ver más abajo) en la que los enlaces P-O del anillo de cinco miembros ocupan una posición axial y una ecuatorial. En este anillo no plano, el ángulo O-P-O es 90 0, en contraposición a 99 0 en el fosfato cíclico inicial.

        Los cálculos del esfuerzo angular han demostrado que la ganancia de energía. resultante de la eliminación del estado de deformación durante la emergencia del estado de transición (15), varía de 12 a 25 kJ / mol (3-6 kcal / mol). De acuerdo con las reglas de sustitución nucleofílica en el átomo de fósforo tetraédrico, los grupos entrantes y salientes ocupan posiciones axiales. En consecuencia, la hidrólisis del fosfato cíclico de etileno debe ir acompañada de la ruptura del enlace P-O en la posición axial, así como de la formación de fosfato de hidroxietileno que contiene un isótopo de oxígeno en el grupo fosfato:

        Por otro lado, el intercambio de oxígeno en el fosfato de etileno con el anillo de cinco miembros que permanece intacto también debe ocurrir de acuerdo con la regla general, es decir, la salida del grupo sustituido (en este caso, hidroxilo) de la posición axial. Por tanto, en el estado de transición de tipo (15), resultante de la sustitución nucleofílica en la molécula de fosfato de etileno, las posiciones axiales pueden estar ocupadas no solo por grupos -O-CH2- sino también hidroxilos con átomos de oxígeno marcados y no marcados. Esto también puede ocurrir como resultado de la reestructuración del estado de transición, conocido como pseudorrotación. En el caso considerado, la transformación correspondiente se puede escribir de la siguiente manera:

        Se puede ver que el intercambio de oxígeno puede ocurrir sin abrir el anillo. La probabilidad de otra posible reestructuración de la bipirámide trigonal inicial, durante la cual el grupo O-P-O se encuentra en la posición ecuatorial, es baja porque en tal caso el ángulo O-P-O sería igual a 120 0 y eso haría que el sistema fuera mucho más tenso.

        Un mecanismo similar también parece estar involucrado en la hidrólisis del fosfato cíclico de metiletileno que se ha encontrado que experimenta no solo la ruptura del ciclo y el intercambio de oxígeno sino también una rápida hidrólisis del grupo exocíclico con el anillo intacto.

        Reacciones acompañadas de formación de estructuras cíclicas que incluyen un grupo fosfato. Se sabe que en un medio ácido el grupo fosfato de los hidroxiaminoácidos N-fosforilados sufre una migración de N 0. Por ejemplo:

        En este caso, se podría esperar la aparición de un estado de transición que incorpore un anillo de cinco miembros:

        Sin embargo, los tres átomos constituyentes en el anillo de cinco miembros resultante deben estar en la misma línea recta (el grupo saliente X y el grupo entrante Y deben estar en una posición axial o, en otras palabras, el ángulo XPY debe ser 180 0), lo cual es imposible. Dado que dicha migración provoca la separación de ambos grupos isopropilo, es más probable esperar una secuencia de pasos que incluya hidrólisis y ciclación con salida de los grupos isopropoxi y apertura del anillo:

        Se observó una migración similar del grupo fosfato durante el tratamiento alcalino de glicero-1-metilfosfato (16):

        La formación de cantidades iguales de glicerol I- y 2-fosfatos se debe a la aparición de un fosfato cíclico de cinco miembros como resultado del ataque nucleófilo sobre el átomo de fósforo por el hidroxilo adyacente. Como ya se ha mencionado, tales compuestos son muy inestables y experimentan hidrólisis prácticamente a la misma velocidad a lo largo de los dos caminos posibles (a) y (b).

        El (b -hidroxietil) fosfato de metilo se convierte completamente en fosfato de hidroxietilo de manera similar:

        En las mismas condiciones, el (b -metoxietil) fosfato de metilo, que no puede transformarse en una estructura cíclica, no se hidroliza. Los hallazgos anteriores sugieren que la hidrólisis de difosfatos bastante estable en un medio alcalino (ver más arriba) se facilita sustancialmente en los casos en los que se pueden formar fosfatos cíclicos como productos intermedios de hidrólisis.

        El hecho de que la hidrólisis alcalina de glicero-1-metilfosfato no produzca glicero-2-metilfosfato, siendo el proceso principal la eliminación del grupo metoxi para producir el correspondiente fosfato cíclico, es indicativo de un posible mecanismo de esta transformación. El estado de transición parece surgir como resultado del ataque del átomo de fósforo por el grupo 2-hidroxilo del glicerol. Además del grupo entrante, el grupo metoxilo también se encuentra en la posición axial. La reacción termina con la salida del último grupo.

        Si la estructura intermedia (17) hubiera experimentado una pseudorotación [formación de la estructura (18)], los productos de reacción habrían incluido glicero-2-metilfosfato, la ausencia de este último indica que no tiene lugar una pseudorotación en este caso (este fenómeno se discutirá en mayor extensión en lo que sigue).

        La migración del grupo fosfato puede ocurrir en el caso de monofosfatos de glicol no alquilados:

        Este proceso sólo es posible en un medio ácido, que concuerda bien con el mecanismo de sustitución nucleofílica descrito anteriormente en el átomo de fósforo tetraédrico (es la molécula de agua el grupo saliente en un medio ácido).

        Los fosfatos de glicero-1 y glicero-2 no son capaces de interconvertirse en medios alcalinos. En consecuencia, no se forma fosfato cíclico en este caso. La razón es la falta de un grupo saliente adecuado. Lo más probable es que aunque se forme una estructura cíclica similar a la que emerge en el estado de transición, no sea capaz de sufrir pseudorrotaciones, lo que también descarta la posibilidad de isomerización.

        4.4.5 b -Reacciones de eliminación

        Los alquilfosfatos que contienen sustituyentes electronegativos tales como C = -N, COOH, COOR y otros en la posición b en el grupo alquilo experimentan fácilmente la b -eliminación del grupo fosfato en un medio alcalino. Si el fosfato de etilo prácticamente no se degrada durante la hidrólisis alcalina suave, el fosfato de b -cianetilo y sus ésteres lo hacen fácilmente en las mismas condiciones.

        b -La eliminación del grupo fosfato siempre va acompañada de la ruptura del enlace C-O y la formación del correspondiente compuesto insaturado. Este último sufre transformaciones posteriores en algunos casos. Por ejemplo, durante la eliminación b del grupo fosfato, el fosfato de serina se convierte en ácido pirúvico:


        Laboratorio de muestra AP 2 Catálisis 2

        Las enzimas son proteínas producidas por células vivas. Son catalizadores bioquímicos, lo que significa que reducen la energía de activación necesaria para que se produzca una reacción bioquímica. Debido a la actividad enzimática, las células pueden realizar actividades químicas complejas a temperaturas relativamente bajas. El sustrato es la sustancia sobre la que se actúa en una reacción catalizada por enzima y puede unirse de forma reversible al sitio activo de la enzima. El sitio activo es la porción de la enzima que interactúa con el sustrato, de modo que cualquier sustrato que bloquee o cambie la forma del asiento activo afecte la actividad de la enzima. El resultado de esta unión temporal es una reducción en la cantidad de energía requerida para activar la reacción de la molécula del sustrato para que se formen productos. La siguiente ecuación demuestra este proceso: E + S ↔ ES ↔ E + P Las enzimas siguen la ley de la reacción de masas. Por lo tanto, la enzima no cambia en la reacción y puede reciclarse para descomponer moléculas de sustrato adicionales.

        Varios factores pueden afectar la acción de una enzima: concentración de sal, pH del ambiente, temperatura, activaciones e inhibidores. Si la concentración de sal es cercana a cero, las cadenas laterales de aminoácidos cambiadas de las moléculas de enzima se atraerán entre sí. Luego, la enzima se desnaturalizará y formará un precipitado inactivo. La desnaturalización ocurre cuando el exceso de calor destruye la estructura terciaria de las proteínas. Esto suele ocurrir entre 40 y 50º Celsius. Si la concentración de sal es alta, se bloqueará la interacción normal de los grupos cargados. Una concentración de sal intermedia es normalmente la óptima para la actividad enzimática. La concentración de sal de la sangre y el citoplasma son buenos ejemplos de concentraciones intermedias. La escala de pH es una escala logarítmica que mide la acidez o concentración de H + en una solución y va de 0 a 14, siendo 0 la más alta en acidez y 14 la más baja. Las cadenas laterales de aminoácidos contienen grupos como –COOH que ganan o pierden fácilmente iones H +. A medida que se reduce el pH, una enzima tenderá a ganar iones H +, alterando la forma de la enzima. Si se eleva el pH, la enzima perderá iones H + y eventualmente perderá su forma activa. Las reacciones suelen funcionar de forma óptima en entornos neutrales. Las reacciones químicas generalmente se aceleran a medida que aumenta la temperatura. Más de las moléculas que reaccionan tienen suficiente energía cinética para experimentar la reacción a medida que aumenta la temperatura. Sin embargo, si la temperatura supera la temperatura óptima, la conformación de las moléculas de la enzima se interrumpe. Un activador es una coenzima que aumenta la velocidad de la reacción y puede regular la rapidez con la que actúa la enzima. También hace que el sitio activo se adapte mejor al sustrato. Un inhibidor tiene el mismo poder de regulación del activador pero disminuye la velocidad de reacción. Un inhibidor también reduce el número de puentes S-S y reacciona con las cadenas laterales cerca de los sitios de activación, bloqueándolos.

        La enzima utilizada en este laboratorio es la catalasa. Tiene cuatro cadenas polipeptídicas que están compuestas cada una de más de 500 aminoácidos. Una función de la catalasa es prevenir la acumulación de niveles tóxicos de peróxido de hidrógeno formados como subproducto de procesos metabólicos. Muchas reacciones de oxidación que ocurren en las células involucran catalasa. La siguiente es la reacción principal catalizada por la catalasa, la descomposición del peróxido de hidrógeno para formar agua y oxígeno:

        2 H2O2 → 2 H2O + O2 (gas) Sin catalasa, esta reacción se produce de forma espontánea pero muy lenta. La catalasa acelera notablemente la reacción.

        La dirección de una reacción catalizada por enzimas depende directamente de la concentración de enzima, sustrato y producto. Por ejemplo, mucho sustrato con poco producto produce más producto. Otro ejemplo es que muchos productos con un poco de enzima forman más sustrato. Se puede aprender mucho sobre las enzimas mediante el estudio de la cinética de la reacción catalizada por enzimas. Es posible medir la cantidad de producto formado, o la cantidad de sustrato utilizado, desde el momento en que se juntan los reactivos hasta que se detiene la reacción.

        La enzima catalasa, cuando trabaja en condiciones óptimas, aumenta notablemente la velocidad de descomposición del peróxido de hidrógeno.

        Los materiales necesarios para el ejercicio 2A del laboratorio son: 30 mL de H2O2 al 1.5% (0.44 M), un vaso de precipitados de 50 mL, 6 mL de solución de catalasa recién hecha, un tubo de ensayo, baño de agua hirviendo, 1 cm³ de hígado, un cuchillo para maceración, toallas de papel, gafas de seguridad, delantal de laboratorio, lápiz, goma de borrar y papel para anotar los resultados.

        Los materiales necesarios para el ejercicio 2B son: 10 mL de H2O2 al 1.5%, dos vasos de precipitados limpios, 1 mL de H2O, 10 mL de H2SO4, una hoja de papel blanca, una jeringa de 5 mL, aproximadamente 5 mL de KMnO4, papel, lápiz , borrador, gafas de seguridad y delantales de laboratorio.

        Los materiales necesarios para el ejercicio 2C del laboratorio son: 20 mL de H2O2 al 1.5%, dos vasos de precipitados de vidrio, 1 mL de H2O, 10 mL de H2SO4, una hoja de papel blanca, una jeringa de 5 mL, aproximadamente 5 mL de KMnO4, papel , lápiz, goma de borrar, gafas de seguridad y delantales de laboratorio.

        Para esta parte del experimento, los materiales necesarios son 12 tazas etiquetadas como 10, 30, 60, 120, 180 y 360 en dos de cada una, seis tazas etiquetadas como ácido, 60 ml de H2O2 al 1,5%, un vaso de precipitados limpio de 50 ml, 6 mL de extracto de catalasa, dos jeringas de 5 mL, KMnO4, cronómetro, papel, lápiz, marcador negro, borrador, gafas de seguridad y delantales de laboratorio.

        Transfiera 10 mL de H2O2 al 1.5% a un vaso de precipitados de vidrio de 50 mL y agregue 1 mL de solución de catalasa recién preparada. Recuerde mantener la solución de catalasa en hielo en todo momento. Registre los resultados. Luego transfiera 5 mL de extracto de catalasa purificado a un tubo de ensayo y colóquelo en un baño de agua hirviendo durante cinco minutos. Transfiera 10 mL de H2O2 al 1.5% a un vaso de precipitados de 50 mL y agregue 1 mL de la solución de catalasa hervida enfriada. Registre nuevamente los resultados. Para demostrar la presencia de catalasa en tejido vivo, corte 1 cm de hígado, macere y transfiera a un vaso de precipitados de 50 mL que contenga 10 mL de H2O2 al 1.5%. Registre estos resultados.

        Ponga 10 ml de H2O2 al 1,5% en un vaso de precipitados de vidrio limpio. Agregue 1 mL de H2O. Agregue 10 mL de H2SO4 (1.0 M) con extrema precaución. Mezcle bien esta solución. Retire una muestra de 5 ml y colóquela en otro vaso de precipitados. Ensaye la cantidad de H2O2 de la siguiente manera. Coloque el vaso de precipitados que contiene la muestra sobre papel blanco. Use una jeringa de 5 ml para agregar KMnO4 gota a gota a la solución hasta obtener un color rosado o marrón persistente. Recuerde agitar suavemente la solución después de agregar cada gota. Registre todos los resultados. Consulte con otro grupo antes de continuar para ver si los resultados son similares.

        Para determinar la tasa de conversión espontánea de H2O2 en H2O y O2 en una reacción no catalizada, coloque aproximadamente 20 mL de H2O2 al 1.5% en un vaso de precipitados. Guárdelo sin tapar a temperatura ambiente durante aproximadamente 24 horas. Repita los pasos del ejercicio 2B, utilizando el H2O2 sin catalizar, para determinar la cantidad proporcional de H2O2 restante después de 24 horas. Registre los resultados.

        Si ha pasado un día o más desde que se realizó el ejercicio B, es necesario restablecer la línea de base. Repita el ensayo y registre los resultados. Compare con otros grupos para comprobar que los resultados sean similares. Para determinar el curso de una reacción enzimática, se debe medir cuánto sustrato está desapareciendo con el tiempo. Primero, coloque las tazas con los tiempos y la palabra ácido. Agregue 10 mL de H2SO4 a cada una de las tazas marcadas como ácido. A continuación, ponga 10 ml de H2O2 al 1,5% en la taza marcada como 10 seg. Agrega 1 mL de extracto de catalasa a esta taza. Gire suavemente durante 10 segundos. (Calcule el tiempo usando el temporizador para mayor precisión). A los 10 segundos, agregue el contenido de uno de los vasos llenos de ácido. Retirar 5 mL y colocar en la segunda taza marcada 10 seg. Analice la muestra de 5 ml agregando KMnO4 gota a gota hasta que la solución adquiera un color rosado o marrón. Repita los pasos anteriores, excepto que permita que las reacciones continúen durante 30, 60, 120, 180 y 360 segundos, respectivamente. Utilice las copas marcadas correspondientes a los tiempos. Registre todos los resultados y observaciones.


        Ver el vídeo: Catálisis Enzimática ácido base general. (Junio 2022).