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Escamas de mamíferos

Escamas de mamíferos



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Muchos pequeños mamíferos tienen la piel escamosa en la cola y, a veces, en las extremidades. Los ejemplos se pueden encontrar entre roedores (ratas, degu, ardillas de cola escamosa), insectívoros (musarañas, desmans), zarigüeyas, canguro de rata almizclada. Hay ejemplos mucho más destacados como las escamas de pangolín, pero me gustaría concentrarme en cosas tan simples como sea posible.

Me gustaría saber las respuestas o al menos lo que se sabe sobre las siguientes preguntas.

  1. ¿Son las escamas de estos diferentes mamíferos algo similar o es solo una ilusión?
  2. ¿Representa el patrón escamoso, al menos en algunos casos, alguna característica primitiva de un ancestro mamífero común?
  3. En caso de respuesta positiva a la pregunta anterior, ¿existe alguna conexión con las escamas de los reptiles diápsidos? Según tengo entendido, estos últimos se construyen a partir de $ beta $ -queratina ausente en los mamíferos, pero tal vez todavía haya similitudes o incluso un origen común.

Por ahora, mi búsqueda sobre este tema resultó en algunas afirmaciones contradictorias sin referencias sólidas. Actualizaría en caso de que encuentre algo que parezca relevante.


Los pelos, las plumas y las escamas tienen mucho en común

El posible vínculo evolutivo entre los pelos de los mamíferos, las plumas de las aves y las escamas de los reptiles se ha debatido durante décadas. Hoy, investigadores de la Universidad de Ginebra (UNIGE) y el Instituto Suizo de Bioinformática SIB, Suiza, demuestran que todos estos apéndices de la piel son homólogos: comparten una ascendencia común. Sobre la base de nuevos análisis del desarrollo embrionario, los biólogos suizos evidenciaron firmas moleculares y microanatómicas que son idénticas entre pelos, plumas y escamas en sus primeras etapas de desarrollo. Estas nuevas observaciones, publicadas en Avances de la ciencia, indican que las tres estructuras evolucionaron a partir de su ancestro reptil común.

Los pelos de los mamíferos y las plumas de las aves se desarrollan a partir de una estructura primordial similar llamada 'placode': un engrosamiento local de la epidermis con células columnares que reducen su tasa de proliferación y expresan genes muy específicos. Esta observación ha desconcertado a los biólogos evolutivos y del desarrollo durante muchos años porque las aves y los mamíferos no son grupos hermanos: evolucionaron a partir de diferentes linajes de reptiles. Sin embargo, según estudios anteriores, las escamas de los reptiles no se desarrollan a partir de una placa anatómica. Esto implicaría que las aves y los mamíferos han "inventado" placodes de forma independiente durante su evolución.

El único origen evolutivo de placodes revelado

En 2015, un equipo de la Universidad de Yale (EE. UU.) Publicó un artículo que mostraba que las escamas, los pelos y las plumas comparten firmas moleculares durante su desarrollo. Estos resultados alimentaron un viejo debate entre dos escuelas. Uno defiende que estas firmas moleculares sugieren un origen evolutivo común de los apéndices de la piel, mientras que el otro propone que los mismos genes se reutilicen para desarrollar diferentes apéndices de la piel.

Hoy, Nicolas Di-Po & iuml y Michel C. Milinkovitch, del Departamento de Genética y Evolución de la Facultad de Ciencias de la UNIGE y del SIB, pusieron fin a esta larga controversia al demostrar que las escamas en los reptiles se desarrollan a partir de un placode con todas las características anatómicas y moleculares. firmas de placas de aves y mamíferos. Los dos científicos observaron y analizaron con precisión las características morfológicas y moleculares de la piel durante el desarrollo embrionario de cocodrilos, serpientes y lagartos. “Nuestro estudio no solo proporciona nuevos datos moleculares que complementan el trabajo del equipo estadounidense, sino que también revela hechos microanatómicos clave, explica Michel Milinkovitch. De hecho, hemos identificado en reptiles nuevas firmas moleculares idénticas a las observadas durante el desarrollo de pelos y plumas, así como la presencia de la misma placa anatómica que en mamíferos y aves. Esto indica que los tres tipos de apéndices de la piel son homólogos: las escamas de reptil, las plumas de ave y los pelos de mamíferos, a pesar de sus formas finales muy diferentes, evolucionaron a partir de las escamas de su antepasado común reptil.

Un gen clave para el desarrollo de los apéndices de la piel.

Durante su nuevo estudio, los investigadores de UNIGE y SIB también investigaron al dragón barbudo, una especie de lagarto que se presenta en tres variantes. La primera es la forma normal de tipo salvaje. El segundo tiene escamas de tamaño reducido porque lleva una copia de una mutación genética natural. El tercero tiene dos copias de la mutación. y carece de todas las escamas. Comparando el genoma de estas tres variantes, Di-Po & iuml y Milinkovitch han descubierto el gen afectado por esta mutación. 'Identificamos que el aspecto peculiar de estos lagartos desnudos se debe a la alteración de la ectodisplasina-A (EDA), un gen cuyas mutaciones en humanos y ratones son conocidas por generar anomalías sustanciales en el desarrollo de dientes, glándulas, uñas y pelos. ', dice Michel Milinkovitch. Los investigadores suizos han demostrado que, cuando la EDA no funciona correctamente en los lagartos, no logran desarrollar una placoda de escala adecuada, exactamente como los mamíferos o aves afectados con mutaciones similares en ese mismo gen no pueden desarrollar placodas de pelos o plumas adecuadas. Todos estos datos indican coherentemente la ascendencia común entre escamas, plumas y pelos.

El próximo desafío para el equipo suizo, y muchos otros investigadores de todo el mundo, es descifrar los finos mecanismos que explican la diversidad de formas de apéndices de la piel. ¿Cómo ha dado lugar la ancestral piel escamosa a las muy distintas morfologías de escamas, plumas y pelos, así como a la asombrosa variedad de formas que pueden adoptar estos apéndices? Es de esperar que estos estudios futuros afinen nuestra comprensión de los mecanismos físicos y moleculares que generan la complejidad y diversidad de la vida durante la evolución.


LABORATORIO DE BIOLOGÍA Y DESARROLLO DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS

La epidermis de la piel es lo que nos permite sobrevivir como seres terrestres. Actúa como un sello envolvente de sarán para la superficie de nuestro cuerpo, excluyendo los microbios y reteniendo los fluidos corporales. Sometidas constantemente a estrés mecánico, las células epidérmicas se protegen produciendo un citoesqueleto elaborado que se conecta a uniones celulares especializadas y permite que las células formen láminas adhesivas de tejido elástico. La epidermis también produce apéndices protectores, como plumas en aves, escamas en peces y folículos pilosos en mamíferos. La piel humana ha evolucionado para tener glándulas sudoríparas, lo que nos permite regular la temperatura corporal y sobrevivir en climas más amplios que otros mamíferos. Para resistir el desgaste normal, la epidermis se renueva constantemente, convirtiéndola en uno de los principales depósitos de células madre del cuerpo. Cuando la barrera cutánea y rsquos se rompe debido a una lesión, las células madre epidérmicas también deben comunicarse con las células inmunitarias residentes para hacer frente a las células inmunitarias inflamatorias, prevenir infecciones y reparar el tejido dañado. Por último, en la superficie del cuerpo y los rsquos, las células madre de la piel también están sujetas a los dañinos rayos ultravioleta y, como era de esperar, los cánceres epidérmicos son los más comunes de todos los cánceres humanos.

En el laboratorio de Fuchs, estamos tratando de comprender cómo las células madre de la piel de los mamíferos dan lugar a la epidermis, los folículos pilosos y las glándulas sudoríparas. Estudiamos cómo las células madre de la piel responden a diferentes señales de su entorno y orquestan los cambios en la cromatina, la transcripción, la traducción, la polaridad celular, la adhesión y la dinámica citoesquelética en el desarrollo normal de la piel, la homeostasis y la reparación de heridas. Elucidar el proceso normal de la dinámica de los tejidos nos está proporcionando una base para comprender cómo estos procesos van mal en el envejecimiento, así como en las enfermedades genéticas de la piel, incluida la cicatrización crónica de heridas, los trastornos hiperinflamatorios y los cánceres. pantallas y probar la relevancia funcional de nuestros hallazgos. Sin embargo, también nos ayuda nuestra capacidad de cultivar células madre epiteliales de piel humana y de ratón en condiciones en las que conservan su capacidad para regenerar tejido tras el injerto. En nuestros enfoques de investigación, utilizamos una amplia gama de técnicas que abarcan la biología celular, molecular y del desarrollo.

Consulte la película de formación de la lámina epidérmica en nuestra sección multimedia.

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Enterotoxina de Clostridium perfringens

Breve introducción a las vías de muerte de células de mamíferos

Las células de mamíferos a veces responden a agresiones letales desencadenando apoptosis, una muerte celular programada que implica la activación de proteasas específicas (a menudo caspasa 3/7), condensación nuclear y escisión del ADN en un patrón de escisión en escalera de incrementos de 200 pb (Majno y Joris , 1995). La apoptosis a menudo (aunque no siempre) implica la despolarización de la membrana mitocondrial y la posterior liberación de citocromo C. Cuando ocurre, la despolarización de la membrana mitocondrial puede resultar de la activación de la caspasa (es decir, ser un proceso dependiente de la caspasa) o puede desencadenar por sí misma la activación de la caspasa (es decir, ser un proceso independiente de la caspasa).

Alternativamente, las células de mamíferos expuestas a agresiones extremas pueden desarrollar oncosis (anteriormente denominada necrosis), que es una ruptura caótica de la integridad celular acompañada de una escisión aleatoria del ADN en un patrón "cortado" (Majno y Joris, 1995). La oncosis no implica la despolarización de la membrana mitocondrial ni la liberación de citocromo C y, a menudo, puede ser bloqueada transitoriamente por la glicina. Una forma especial de oncosis, llamada pirotosis, requiere la activación de caspasa-1 (Cookson y Brennan, 2001).


Amortiguadores

La mayoría de las células de nuestro cuerpo operan dentro de una ventana muy estrecha de la escala de pH, que normalmente varía entre 7,2 y 7,6. Si el pH del cuerpo está fuera de este rango, el sistema respiratorio funciona mal, al igual que otros órganos del cuerpo. Las células ya no funcionan correctamente y las proteínas se degradarán. La desviación fuera del rango de pH puede inducir coma o incluso causar la muerte.

Entonces, ¿cómo es que podemos ingerir o inhalar sustancias ácidas o básicas y no morir? Los amortiguadores son la clave. Los tampones absorben fácilmente el exceso de H + u OH -, manteniendo el pH del cuerpo cuidadosamente mantenido en el rango estrecho antes mencionado. El dióxido de carbono es parte de un sistema tampón prominente en el cuerpo humano que mantiene el pH dentro del rango adecuado. Este sistema tampón implica ácido carbónico (H2CO3) y bicarbonato (HCO3 -) anión. Si entra demasiado H + en el cuerpo, el bicarbonato se combinará con el H + para crear ácido carbónico y limitar la disminución del pH.

Asimismo, si se introduce demasiado OH - en el sistema, el ácido carbónico se disociará rápidamente en iones bicarbonato e H +. Los iones H + pueden combinarse con los iones OH -, limitando el aumento de pH. Si bien el ácido carbónico es un producto importante en esta reacción, su presencia es fugaz porque el ácido carbónico se libera del cuerpo como gas de dióxido de carbono cada vez que respiramos. Sin este sistema de amortiguación, el pH de nuestros cuerpos fluctuaría demasiado y no podríamos sobrevivir.

En resumen: tampones, pH, ácidos y bases

El pH de una solución es una medida de la concentración de iones de hidrógeno en la solución. Una solución con un alto número de iones de hidrógeno es ácida y tiene un valor de pH bajo. Una solución con un elevado número de iones hidróxido es básica y tiene un valor de pH elevado. La escala de pH varía de 0 a 14, siendo un pH de 7 neutro. Los tampones son soluciones que moderan los cambios de pH cuando se agrega un ácido o una base al sistema tampón. Los tampones son importantes en los sistemas biológicos debido a su capacidad para mantener condiciones de pH constantes.

Pregunta de práctica

Usando un medidor de pH, encuentra que el pH de una solución desconocida es 8.0. ¿Cómo describiría esta solución?

El pH del jugo de limón es de aproximadamente 2,0, mientras que el pH del jugo de tomate es de aproximadamente 4,0. Aproximadamente, ¿cuánto aumento en la concentración de iones de hidrógeno hay entre el jugo de tomate y el jugo de limón?


Temperatura corporal

La masa corporal y la temperatura son los principales determinantes de la tasa metabólica (Gillooly et al., 2001). Aunque no existe un vínculo funcional en las endotermas entre la tasa metabólica y TB Dentro de la zona térmica neutra, donde se mide la TMB, se han hecho repetidos intentos para explicar las diferencias de TMB entre aves y mamíferos, y euterios y marsupiales, en términos de diferencias en TB (Hemmingsen, 1960 Dawson y Hulbert, 1970 White y Seymour, en prensa). En endotermos, el nivel de TMB está determinado por factores actualmente inciertos pero aparentemente relacionados con la función celular (Hulbert y Else, 2000), mientras que TB está claramente regulado por el sistema nervioso central (Bligh, 1976). Como se define, las condiciones de medición para BMR no tienen en cuenta TB diferencias entre especies, por lo que la escala descriptiva de BMR no debe compensarse por ellas. Sin embargo, la compensación es necesaria cuando se comparan grupos que difieren en TB o buscando explicaciones uniformes para los efectos de escala que no dependen de TB. TB está significativamente correlacionado (r≈0.55) con la variación residual en la TMB de mamíferos (White y Seymour, 2003) y, cuando se normaliza a un valor común TB según la Q10 En principio, los valores de TMB de aves y mamíferos no difieren en coeficiente o exponente alométrico, ni tampoco los valores de TMB de euterios y marsupiales (White y Seymour, en prensa). Un enfoque que da cuenta TB diferencias tiene dos beneficios adicionales: en primer lugar, permite investigar la influencia de la masa corporal en la TMB sin la influencia confusa de TB, que también se correlaciona positivamente con la masa corporal (Withers et al., 2000 White y Seymour, 2003). En segundo lugar, la incorporación de TB en modelos predictivos de regresión múltiple permite una estimación mejorada de la TMB cuando se dispone de masa corporal y temperatura.


Biología

Trematodos (trematodos) Opisthorchis viverrini (Duela hepática del sudeste asiático) y Opisthorchis felineus (duela del hígado de un gato).

Ciclo vital:

Los trematodos adultos depositan huevos completamente desarrollados que se eliminan en las heces. Después de la ingestión por parte de un caracol adecuado (primer huésped intermedio), los huevos liberan miracidios, que experimentan en el caracol varias etapas de desarrollo (esporocistos, rediae, cercariae). Las cercarias se liberan del caracol y penetran en los peces de agua dulce (segundo huésped intermedio) y se enquistan como metacercarias en los músculos o debajo de las escamas. El huésped definitivo de los mamíferos (gatos, perros y varios mamíferos que se alimentan de pescado, incluidos los seres humanos) se infecta al ingerir pescado poco cocido que contiene metacercarias. Después de la ingestión, las metacercarias se eliminan en el duodeno y ascienden a través de la ampolla de Vater hacia los conductos biliares, donde se adhieren y se convierten en adultos, que ponen huevos después de 3 a 4 semanas. Las aletas adultasO. viverrini: 5 mm a 10 mm por 1 mm a 2 mm Felineus: 7 mm a 12 mm por 2 mm a 3 mm) residen en los conductos biliares y pancreáticos del huésped mamífero, donde se adhieren a la mucosa.


Biosíntesis y biología de proteínas ancladas a GPI de mamíferos

Al menos 150 proteínas humanas son proteínas ancladas en glicosilfosfatidilinositol (GPI-AP). El resto de proteína de los GPI-AP que carecen de dominios transmembrana está anclado a la membrana plasmática con GPI unido covalentemente al extremo C-terminal. El GPI consta del núcleo conservado de las cadenas laterales de glucano, fosfatidilinositol y glucano. Todo el GPI-AP se ancla a la valva exterior de la bicapa lipídica mediante la inserción de cadenas grasas de fosfatidilinositol. Debido al anclaje de membrana dependiente de GPI, los GPI-AP tienen algunas características únicas. La característica más destacada de los GPI-AP es su asociación con microdominios de membrana o balsas de membrana. En las células polarizadas, como las células epiteliales, muchos GPI-AP se expresan exclusivamente en las superficies apicales, mientras que algunos GPI-AP se expresan preferentemente en las superficies basolaterales. Varios GPI-AP actúan como transportadores transcitóticos que llevan sus ligandos de un compartimento a otro. Algunos GPI-AP se desprenden de la membrana después de la escisión dentro del GPI por una fosfolipasa específica de GPI o una glicosidasa. En esta revisión, resumiré la comprensión actual de la biosíntesis de GPI-AP en células de mamíferos y discutiré ejemplos de funciones dependientes de GPI de los GPI-AP de mamíferos.

1. Introducción

Al menos 150 proteínas humanas son proteínas ancladas al glicosilfosfatidilinositol (GPI-AP) [1]. Los GPI-AP son proteínas integrales de membrana presentes en la superficie celular. El resto de proteína de los GPI-AP es básicamente hidrófilo que carece de dominios transmembrana y está anclado a la membrana plasmática (PM) con el resto de GPI unido covalentemente al extremo C-terminal (figura 1). Los tamaños de las proteínas varían ampliamente desde solo 12 aminoácidos (CD52 [2]) hasta más de 200 kDa (alfa-tectorina [3]). Sus funciones también varían, incluyendo enzimas hidrolíticas, receptores, moléculas de adhesión, inhibidores de proteasa, reguladores del complemento y priones (tabla 1).

Figura 1. GPI-AP de mamíferos. El glucano central conservado de GPI de mamífero, que consta de EtNP unido a la proteína, tres Mans, EtNP unido a Man1 y GlcN, está unido al resto lipídico, que es PI. En algunos GPI-AP, el glucano central se modifica mediante cadenas laterales de Man4 y / o GalNAc. La cadena lateral de GalNAc puede ser alargada por Gal y Sia. Todo el GPI-AP está anclado al prospecto exterior de PM solo por cadenas de hidrocarburos de PI.

Tabla 1. Ejemplos de GPI-AP de mamíferos.

El resto GPI de los GPI-AP consta de las cadenas laterales de glucano, fosfatidilinositol (PI) y glucano del núcleo conservado. La estructura del glucano central es EtNP-6Manα2-Manα6- (EtNP) 2Manα4-GlNα6-myoIno-P-lipid (EtNP, etanolamina fosfato Man, manosa GlcN, glucosamina Ino, inositol) [4] (figura 1). El GPI está unido al C-terminal a través de un enlace amida generado entre el grupo carboxilo C-terminal y un grupo amino del EtNP terminal [4]. Todo el GPI-AP se ancla al prospecto exterior de la bicapa lipídica mediante la inserción de cadenas de hidrocarburos de PI (figura 1).

El anclaje GPI es una modificación postraduccional. El núcleo GPI se ensambla en la membrana del retículo endoplásmico (ER) y se transfiere en bloque a las proteínas precursoras inmediatamente después de su translocación ER (figura 2). Los GPI-AP nacientes, en los que la estructura de GPI es inmadura, se someten a varios pasos de remodelación en el RE y el aparato de Golgi (figura 3). Para muchos GPI-AP, se agrega un glicano de cadena lateral en el Golgi. Finalmente, los GPI-AP se transportan al PM (figura 3).

Figura 2. Biosíntesis de GPI de mamíferos en el RE. El precursor de GPI completo competente para la unión a proteínas se sintetiza a partir de PI mediante reacciones escalonadas (1) - (11). La cadena lateral Man4 está unida en la sala de emergencias a algún GPI (paso (12)). El GPI preensamblado se transfiere en bloque a proteínas (paso (13)). Los genes involucrados en estos pasos de reacción se muestran debajo de los números de los pasos.

Figura 3. Maduración de GPI-AP de mamíferos durante el transporte de ER-PM. Los GPI-AP nacientes generados por la transferencia de GPI a proteínas (paso 12) se someten a dos reacciones, desacilación de inositol (paso 14) y eliminación de la cadena lateral EtNP de Man2 (paso 15) en el RE. El transporte ER-Golgi de GPI-AP está mediado por vesículas recubiertas de COPII (paso 16). En el aparato de Golgi, los GPI-AP experimentan una remodelación de ácidos grasos (pasos 17 y 18). Algunos GPI-AP son modificados por la cadena lateral de GalNAc (pasos 19-21). Los GPI-AP maduros se transportan al PM donde se asocian con microdominios en balsa. Los genes involucrados en estos pasos de reacción se muestran debajo de los números de los pasos.

Debido al anclaje de membrana dependiente de GPI, los GPI-AP tienen algunas características únicas. Una característica destacada de los GPI-AP es su asociación con microdominios de membrana o balsas de membrana [5,6]. Los microdominios de membrana son dominios dinámicos de 20-100 nm de ancho [7]. Los esfingolípidos y el colesterol están enriquecidos en el prospecto exterior de la bicapa lipídica en los microdominios. Se cree que los GPI-AP se asocian con glucoesfingolípidos y colesteroles a través de interacciones lípido-lípido y glucano-glucano. Para las interacciones lípido-lípido, las cadenas lipídicas saturadas tanto de esfingolípidos como de anclajes de GPI son críticas [8,9]. Dentro de los microdominios de la membrana, los GPI-AP forman dímeros con una vida media de 100 ms [10]. Para la formación de homodímeros GPI-AP, las interacciones proteína-proteína son críticas [10,11]. Los microdominios que contienen GPI-AP están regulados por actina cortical [12]. Para la regulación por la actina cortical, la interacción transbicapa entre la fracción lipídica de los GPI-AP en la valva exterior y la fosfatidilserina en la valva interior es fundamental [13]. Las tirosina quinasas de la familia Src [14] y otras proteínas como la fosfolipasa Cγ (PLCγ) están asociadas con microdominios de membrana en el prospecto interno. Tras la ligadura, GPI-APs forman grupos más grandes que conducen a la activación de Src-tirosina quinasas y PLCγ [15, 16].

En las células polarizadas, como las células epiteliales, muchos GPI-AP se expresan exclusivamente en las superficies apicales [17], mientras que algunos GPI-AP se expresan preferentemente en las superficies basolaterales [18] (consulte las revisiones para conocer los mecanismos de clasificación de GPI-AP [ 19-22]). Varios GPI-AP actúan como transportadores transcitóticos que llevan sus ligandos de un compartimento a otro [23-25]. Algunos GPI-AP se desprenden de la membrana después de la escisión dentro del GPI por una fosfolipasa específica de GPI o una glicosidasa [26-29].

En esta revisión, resumiré la comprensión actual de la biosíntesis de GPI-AP en células de mamíferos y discutiré ejemplos de funciones dependientes de GPI de los GPI-AP de mamíferos.

2. Biogénesis de GPI-AP: modificación postraduccional de proteínas con la GPI mediada por la transamidasa de GPI

2.1. Translocación de las proteínas precursoras al RE

Las proteínas precursoras de GPI-AP, preproproteínas, tienen un péptido señal N-terminal para la translocación del RE y un péptido señal C-terminal para la unión de GPI (figura 4) [30]. El péptido señal N-terminal que consta de unos 20 aminoácidos hidrófobos es similar a los de otras proteínas secretoras [30]. El péptido señal de unión de GPI C-terminal abarca 20-30 aminoácidos a partir del aminoácido ω + 1 (el aminoácido al que se une GPI se denomina aminoácido del sitio ω [30]). El péptido señal de unión a GPI consta de un tramo de aproximadamente 10 aminoácidos hidrófilos y un tramo de aproximadamente 20 aminoácidos hidrófobos. Los aminoácidos en el sitio ω son siempre pequeños, incluidos Ser, Asn, Asp, Ala, Gly, Cys y Thr, y el aminoácido ω + 2 también es pequeño [31-33]. En algunos GPI-AP, se identificaron más de dos ω sitios [33]. El péptido señal de unión a GPI puede dirigir la unión de GPI a AP que no son GPI si se fusiona con el extremo C-terminal (consulte la revisión para una discusión más detallada [34]). Tras la translocación de una preproproteína al lumen del RE, el péptido señal N-terminal se elimina de los precursores que generan proproteínas (figura 4). El péptido señal C-terminal es reconocido por la transamidasa de GPI, que lo escinde y lo reemplaza con un GPI preensamblado por transamidación, generando GPI-AP nacientes [30,35,36].

Figura 4. Pasos en la biogénesis de GPI-AP. La preproproteína de GPI-AP tiene el péptido señal N-terminal para la localización de ER (caja marrón) y el péptido señal C-terminal para la unión de GPI (caja amarilla). El sitio ω es el residuo de aminoácido, al que se une GPI. Tras la translocación al RE, el péptido señal N-terminal se escinde, generando proproteína. La GPI preensamblada se une al sitio ω reemplazando el péptido señal C-terminal por la transamidasa de GPI, generando GPI-AP naciente. El GPI-AP naciente experimenta reacciones de maduración para convertirse en GPI-AP maduro.

Los mecanismos de translocación ER de dos GPI-AP, la proteína priónica y CD59, son diferentes. El prión requiere Sec62 y Sec63 mientras que CD59 no lo hace [37,38], lo que sugiere que el prión se transloca en una partícula de reconocimiento de señal (SRP) de manera independiente, mientras que CD59 se transloca de una manera dependiente de SRP [37]. La dependencia del prión sobre Sec62 y Sec63 está determinada por su secuencia de señal N-terminal [37]. Estudios sobre la translocación ER de Saccharomyces cerevisiae Los GPI-AP mostraron que su translocación ER es principalmente dependiente de Sec62 y Sec63 [39]. El estudio demostró además que se trasladan al RE a través de un mecanismo postraduccional, al que también contribuye el péptido señal de unión GPI C-terminal [39]. Para el precursor de GPI-AP que lleva un péptido C-terminal fuertemente hidrofóbico, están involucrados componentes de la vía GET, que tienen un papel en la incorporación de proteínas ancladas a la cola en el ER [40]. La translocación del ER co-traduccional dependiente de SRP tiene un papel menor en relación con un mecanismo postraduccional en la levadura [39]. Aún no se ha caracterizado si la translocación ER de los GPI-AP de mamíferos, distintos de la proteína prión, está mediada por un mecanismo postraduccional o cotraduccional.

2.2. Transamidasa de GPI

La transamidasa de GPI es un complejo enzimático residente en el ER que media la unión del anclaje de GPI a las proteínas [41,42]. La transamidasa de GPI escinde el péptido señal de unión de GPI entre los aminoácidos ω y ω + 1, generando un intermedio sustrato-enzima unido por un enlace tioéster entre el grupo carboxilo del aminoácido ω y una cadena lateral de cisteína catalítica de la enzima. El enlace tioéster es atacado por un grupo amino del EtN terminal de GPI, completando una transferencia de GPI por transamidación [35].

La transamidasa GPI consta de cinco subunidades, PIGK (inicialmente denominada GPI8) [43], GPAA1 (denominada inicialmente GAA1) [44], PIGS [45], PIGT [45] y PIGU [46] (tabla 2). PIGK, una única proteína transmembrana, es una cisteína proteasa que escinde el péptido C-terminal y produce un intermedio carbonilo [43]. GPAA1, una proteína transmembrana múltiple que tiene homología de secuencia con una enzima formadora de péptidos de la familia M28, parece catalizar la formación de un enlace amida entre el aminoácido ω y el EtN de GPI [47]. PIGT, una única proteína transmembrana, se asocia con PIGK a través de un enlace disulfuro, por lo que desempeña un papel en la formación del complejo [48]. Se desconocen las funciones de PIGS y PIGU, ambas proteínas transmembrana múltiples, sin embargo, ambas son esenciales para la actividad de la transamidasa GPI [45].

Tabla 2. Proteínas de mamíferos implicadas en la biogénesis de GPI -AP.

2.3. Ensamblaje biosintético de precursores de GPI

La biosíntesis de GPI es una secuencia escalonada de 11 reacciones (figura 2 y tabla 2). La vía se inicia en el lado citoplásmico del RE por la GPI N-acetilglucosaminil transferasa (GPI-GnT), que cataliza la transferencia de N-acetilglucosamina (GlcNAc) de difosfato de uridina (UDP) -GlcNAc a la posición 6 del inositol para generar GlcNAc-PI. GPI-GnT es la monoglucosiltransferasa más compleja, que consta de siete subunidades, PIGA [49], PIGC [50], PIGH [51], PIGQ (inicialmente denominada GPI1) [52], PIGP [53], PIGY [54] y DPM2 [53], de la cual PIGA es una subunidad catalítica. PIGC, PIGH, PIGP y PIGY son esenciales para la actividad de GPI-GnT aunque sus funciones específicas no están claras [50,51,53,54]. PIGQ estabiliza un complejo central de PIGA, PIGC y PIGH [55], mientras que DPM2 mejora la actividad de GPI-GnT en tres veces [53]. GlcNAc-PI es des-N-acetilada por PIGL, una GPI desacetilasa residente en ER, que genera el segundo intermedio glucosaminil (GlcN) -PI [56,57]. GlcN-PI se voltea hacia el lado luminal, se desconoce el mecanismo de volteo. La posición 2 del anillo de inositol de GlcN-PI es acilada por la aciltransferasa PIGW, una proteína transmembrana múltiple, para generar GlcN- (acil) PI [58]. Los aminoácidos funcionalmente importantes en PIGW y su ortólogo de levadura Gwt1p residen en el lado luminal, lo que sugiere que el palmitoil-CoA está disponible en el lado luminal [58, 59].

PI, GlcNAc-PI y GlcN-PI en células de mamíferos contienen diacilglicerol, mientras que GlcN- (acil) PI contiene 1-alquil-2-acilglicerol como forma principal y diacilglicerol como forma secundaria, lo que sugiere que diacil a 1-alquil-2 -La remodelación de los acil-lípidos se produce en la etapa de GlcN- (acil) PI [60]. El análisis de la cadena de acilo graso demostró que la composición de la cadena de diacilglicerol de GlcN- (acil) PI es claramente diferente de la de PI, GlcNAc-PI y GlcN-PI [61]. En este último, el 1-estearoil-2-araquidonoil (38: 4) PI es, con mucho, la forma más abundante. Por el contrario, menos del 30% de GlcN- (acil) PI tenía una composición de cadena de 38: 4 mientras que el resto de GlcN- (acil) PI tenía una composición de cadena de 36: 4, 38: 5 y 40: 5. Por lo tanto, es muy probable que la remodelación de lípidos sea de diacilo a diradilo, en la que no sólo 1-alquil-2-acil PI sino también diacil GlcN- (acil) PI son los productos remodelados [61]. Para la generación de la forma 1-alquil-2-acilo, se requiere la vía sintética del 1-alquilfosfolípido en el peroxisoma [61]. Aunque la reacción enzimática exacta de la remodelación de lípidos no está clara, es concebible que el resto de diacilglicerol o diacilfosfatidilo sea reemplazado por una estructura de diradilo correspondiente. También se desconoce un donante de estructura de diradilo, sin embargo, la composición de la cadena grasa de GlcN- (acil) PI es algo similar a la de diradilfosfatidiletanolaminas (PE), lo que sugiere su posible contribución [61].

Se transfieren secuencialmente dos manosas (Man1 y Man2) de dolicol-fosfato-manosa (Dol-P-Man) a GlcN- (acil) PI para generar Manα6Manα4GlcN- (acil) PI. PIGM y PIGV son GPI-manosiltransferasa (MT) I y II, respectivamente, que catalizan estas reacciones [62,63]. PIGM funciona en asociación con PIGX, que estabiliza PIGM [64]. GPI-etanolaminatransferasa I (ETI), PIGN, transfiere EtNP desde PE a la posición 2 del primer Man unido a α4 que genera Manα6 (EtNP) 2Manα4GlcN- (acil) PI [65]. El tercer Man (Man3) se transfiere luego de Dol-P-Man por PIGB, que es GPI-MTIII, para generar Manα2 Manα6 (EtNP) 2Manα4GlcN- (acyl) PI [66]. Dos EtNP se transfieren secuencialmente a las 6 posiciones de Man3 y luego Man2 por PIGO [46] y PIGG (inicialmente denominado GPI7) [67], subunidades catalíticas de GPI-ETII y GPI-ETIII. Tanto PIGO como PIGG se estabilizan por asociación con PIGF [46,67,68]. El EtNP6Manα2 (EtNP) 6Manα6 (EtNP) 2Manα4GlcN- (acil) PI resultante es un precursor de GPI maduro competente para la unión a proteínas.

El cuarto Man (Man4) se puede transferir de Dol-P-Man a la posición 2 de Man3 en el precursor GPI maduro como cadena lateral para generar Manα2 (EtNP) 6Manα2 (EtNP) 6Manα6 (EtNP) 2Manα4GlcN- (acyl ) PI, que también es competente para la unión a proteínas. La transferencia de Man4 está mediada por PIGZ (inicialmente denominado SMP3), GPI-MTIV [69]. Los cuatro GPI-MT (PIGM, PIGV, PIGB y PIGZ) son múltiples proteínas transmembrana que llevan sitios catalíticos dentro de las regiones luminales [63]. Tres GPI-ET (PIGN, PIGO y PIGG) son también múltiples proteínas transmembrana que llevan sitios catalíticos dentro de las regiones luminales [67]. El estudio bioinformático identificó una región común de reconocimiento de GPI en los dominios transmembrana de PIGW, PIGM, PIGV, PIGB, PIGZ, PIGN, PIGO y PIGG, y sugirió una familia de genes que los comprenda [70].

3. Vía de maduración de GPI-AP y transporte de ER a Golgi de GPI-AP

3.1. Remodelación de GPI en el ER y transporte ER-a-Golgi

El resto de GPI en los GPI-AP nacientes es inmaduro en su estructura y experimenta reacciones de remodelación para madurar durante el transporte al PM (figura 3 y tabla 2). Poco después de la generación de los GPI-AP nacientes, la cadena de acilo unida al anillo de inositol suele eliminarse mediante GPI-desacilasa PGAP1 (para Post GPI Attachment to Proteins 1), una proteína transmembrana múltiple residente en ER [71]. En algunos casos, la cadena de acilo permanece en los GPI-AP maduros [72]. Por ejemplo, los GPI-AP en los eritrocitos mantienen la cadena de acilo unida a inositol [73,74]. Los GPI-AP que tienen (acil) PI, que tiene tres cadenas de hidrocarburos, se asocian con la membrana de manera más estable que los que tienen PI, que tiene dos cadenas de hidrocarburos. The former structure might be useful for maintaining levels of GPI-APs during the very long life of erythrocytes by reducing spontaneous release from the PM.

While still in the ER, EtNP linked to Man2 is removed by a phosphodiesterase PGAP5/MPPE1 [75]. PGAP5, a membrane protein bearing two transmembrane domains, exists near the ER exit sites in the ER and in the ERGIC [75]. After the remodelling of the GPI by PGAP1 and PGAP5, GPI-APs are recruited into the COPII-coated transport vesicles that are directed towards the Golgi apparatus [75,76]. A complex of p24α2, p24β1, p24γ2 and p24δ1 of the p24 family of proteins acts as a cargo receptor for recruitment of GPI-APs into the transport vesicles at the ER exit sites [76–78]. The remodelling reactions by PGAP1 and PGAP5 are important to generate the proper structure of the GPI for association with the cargo receptor [76]. A defect in PGAP1 or PGAP5 results in slowed transport of GPI-APs from the ER to the Golgi. After arrival at the Golgi, GPI-APs are released from the cargo receptors under acidic conditions.

3.2. Fatty acid remodelling in the Golgi

As described in the previous section, the PI moiety of GPI-APs is initially derived from cellular PI and is subjected to lipid remodelling at the stage of GlcN-(acyl)PI, in which the original diacyl PI moiety is remodelled to a mixture of diacyl and 1-alkyl-2-acyl PIs, with the latter being the major form [60,61] (step 5 in figure 2). The fatty chain composition of the remodelled diradyl PI should correspond to that in the donor lipid, possibly PE, used in the lipid remodelling reaction [61]. The alkyl chain and the 1-acyl chain in the diradyl PIs are mostly saturated C18 or C16 alkyl and C18 acyl chains, whereas the 2-acyl chains are unsaturated fatty acids of the C16–C24 chains [61]. In the Golgi apparatus, the unsaturated 2-acyl chain is replaced with a saturated fatty acid, mostly stearic acid by fatty acid remodelling [79] (steps 17 and 18 in figure 3). In the first step of the fatty acid remodelling, the unsaturated 2-acyl chain is removed by a GPI-specific phospholipase A2 PGAP3, a Golgi-resident multiple transmembrane protein, generating a lyso form intermediate [79]. In the second step, a saturated chain is transferred back to the sn2-position. PGAP2, a multiple transmembrane Golgi protein, is required for the reacylation [80]. Whether PGAP2 is the acyltransferase itself remains unclear.

As described in the Introduction, GPI-APs are typical components of membrane microdomains or rafts on the cell surface. In the outer leaflet of the PM, GPI-APs interact with glycosphingolipids and cholesterol forming dynamic membrane microdomains of 20–100 nm. Presumably, microdomains are formed through lipid–lipid interactions. The fatty acid remodelling that forms GPI-APs bearing two saturated fatty chains is critical for raft association of GPI-APs [79].

3.3. Side chain modification

In many GPI-APs, βGalNAc is transferred to the 4-position of Man1 as a side chain [81]. This modification occurs in the Golgi after fatty acid remodelling (figure 3) [82]. The GalNAc side chain can be elongated by β1–3Gal and Sia (figure 3) [81]. Certain GPI-APs, such as Thy1 [4], always have non-elongated GalNAc as a side chain whereas other GPI-APs, such as the prion and dipeptidase, have mixed GalNAc side chains containing those without elongation and those elongated by Gal or by Gal and Sia [83,84]. The physiological and functional roles of the GalNAc side chains have remained largely unknown. For the prion, a study reported by one group indicated that Sia in the side chain is involved in the conversion of PrP c to pathogenic PrP sc [85].

Transfer of GalNAc is mediated by PGAP4/TMEM246, a Golgi-resident GPI-specific GalNAc transferase [82]. PGAP4 is widely expressed in various tissues/organs with higher expression in the brain. All Golgi-resident glycosyltransferases (GTs) are type 2 single transmembrane proteins (i.e. they have a short cytoplasmic segment at the N-terminus, followed by a transmembrane domain and a luminal catalytic GT domain [86,87]). By contrast, PGAP4 has three transmembrane domains [82]. Similar to other type 2 GTs, PGAP4 has a short cytoplasmic segment at the N-terminus that is followed by the first transmembrane domain and a GT domain. The GT domain of PGAP4, of the GT-A type, is split into two regions, and between the regions there are tandem transmembrane domains linked by a short stretch of hydrophilic residues. The tandem transmembrane domains inserted into the GT domain locate the GT domains close to the membrane, which may facilitate the interaction of the GT domain with the substrate GPI, which is inserted into the membrane. The tandem transmembrane domain might also be involved in binding the lipid moiety of the GPI [82].

Recently, the Gal transferase was identified to be B3GALT4 [88], the Golgi-resident Gal transferase previously known to synthesize GM1 from GM2 [89,90]. B3GALT4 also synthesizes GA1 and GD1 from GA2 and GD2, respectively [89]. In these substrate glycosphingolipids, position 3 of GalNAc β1–4-linked to Gal in the lactosylceramide (LacCer) moiety is the acceptor for βGal. Similarly, position 3 of GalNAc β1–4-linked to Man1 is the acceptor in the GPI for βGal. Whereas UDP-Gal and GM2 are sufficient for B3GALT4 to generate GM1, the presence of LacCer is required for Gal transfer to the βGalNAc side chain of the GPI [88]. Because LacCer is a common partial structure of the acceptor substrates of B3GALT4 (GM2, GA2 and GD2), LacCer might directly bind to B3GALT4 and might modulate substrate specificity towards GPI. Sia transferase mediating Sia transfer to the Gal-GalNAc-side chain of the GPI has not been identified.

4. Free, non-protein-linked GPI

Protozoan parasites such as Toxoplasma gondii, Plasmodium falciparum, Trypanosoma cruzi y Leishmania species have non-protein-linked GPIs as free glycolipids on the cell surface (see the reviews for more details [81,91]). In mammalian cells, there have been few reports about the expression of the un-linked GPI on the cultured cell surface [92–95]. Recently, this issue was revisited [96] using a monoclonal antibody T5_4E10 that was originally generated against T. gondii free GPI [97]. T5_4E10 mAb recognizes the non-protein-linked GPI bearing the Man1-linked GalNAc side chain without Gal elongation [82]. Because the T5_4E10 antibody does not bind to the protein linked GPI, it is useful to detect the free GPI bearing non-elongated GalNAc side chain (free GPI-GalNAc from now on) in mammalian cells by flow cytometry or western blotting [96]. Relatively higher levels of free GPI-GalNAc were expressed in the pons, medulla oblongata, spinal cord, testis, epididymis and kidney of adult mice and Neuro2a and CHO cells [96]. In cells defective in GPI transamidase, high levels of free GPI-GalNAc are expressed on the cell surface. Studies using mutant CHO cells, defective in GPI transamidase and one of the genes involved in GPI maturation reactions, demonstrated that free GPIs follow the same structural remodelling pathway as do protein linked GPIs [96]. Therefore, non-protein-linked GPIs exist as glycolipids of some mammalian cell membranes. The physiological roles of the free GPIs are yet to be clarified. By contrast, the pathological effects of abnormally accumulated free GPIs in cells defective in GPI transamidase have been demonstrated in patients with PIGT mutations (see below) [98].

5. Comparison of mammalian and yeast GPI biosynthesis

In yeast S. cerevisiae, the GPI undergoes two types of lipid remodelling reaction that occur in the ER after attachment to proteins. Fatty acid remodelling of the GPI occurs to the sn2-linked acyl chain of diacyl PI, in that the C16/C18 chain is exchanged with the C26 chain by PER1- and GUP1-dependent reactions [99,100]. PER1 is orthologous to PGAP3 [79], whereas GUP1 is not orthologous to PGAP2 but is a member of the MBOAT family of acyl transferases [100]. The other lipid remodelling of the GPI is its change from a diacylglycerol form to a ceramide form. CWH43 is required for this lipid remodelling [101,102]. The ceramide form of the GPI is not known in mammalian cells however, parts of CWH43 are homologous to two mammalian proteins. The N-terminal part of CWH43 corresponds to mammalian PGAP2 [101,102], whereas the C-terminal part of CWH43 corresponds to the PGAP2-interacting protein. Although the latter is termed the PGAP2-interacting protein, there is no evidence for interaction with PGAP2. PGAP2 is localized in the Golgi whereas the PGAP2-interacting protein is localized in the ER [80]. Whether the PGAP2-interacting protein has any functional relation to mammalian GPI biogenesis, for example, involvement in lipid remodelling at the stage of GlcN-(acyl)PI, is yet to be determined.

Yeast defective in ARV1 (for A RE2 r equired for v iability 1 ) accumulates GlcN-(acyl)PI, suggesting that the first mannosylation of GPI is defective [103]. ARV1 is an ER membrane protein involved in the homeostasis of sterols [104] and sphingolipids [105]. Proper conditions for Dol-P-Man-dependent mannose transfer to GlcN-(acyl)PI might not be generated when ARV1 does not function. Mammalian ARV1 cDNA complemented ARV1-defective yeast, which shows the functional role of mammalian ARV1 [105,106]. Recently, patients with biallelic loss-of-function mutations in ARV1 have been reported [107,108]. The affected children had similar symptoms to those with inherited GPI deficiencies, such as developmental delay and seizures, which is consistent with mammalian ARV1 having a putative role in GPI biosynthesis.

Gpi18p, the yeast PIGV homologue, requires Pga1p for GPI-MTII activity [109]. Gpi18p and Pga1p form a complex. The PGA1 homologue is not found in the mammalian genome. The reason for Gpi18p, but not PIGV, requiring a partner protein is not known.

Yeast has two homologues of PGAP5: TED1 and CDC1. Like PGAP5, TED1 is involved in the removal of EtNP from Man2 [110] whereas CDC1 is required for the removal of EtNP from Man1 [111]. In mammalian cells, EtNP linked to Man1 remains as a conserved side chain in mature GPI-APs. By contrast, some yeast GPI-APs do not have EtNP on Man1. There is a hypothesis that the removal of EtNP from Man1 is necessary for the incorporation of GPI-APs into the cell wall (see [112] for further discussion).

6. Quality control of GPI-APs

When the precursor proteins of GPI-APs are not processed by GPI transamidase for GPI attachment, they are retrotranslocated for degradation by ubiquitin- and proteasome-dependent ER-associated degradation (ERAD) [113]. It is likely that the GPI attachment signal sequence is recognized as an unfolded region, which leads to ubiquitination.

By contrast, when protein folding fails after attachment of the GPI, the misfolded GPI-APs are mainly transported out of the ER for degradation in the lysosomes [114,115]. The process is termed RESET (for rapid ER stress-induced export) [114]. When the ER stress is induced by thapsigargin, the RESET pathway functions efficiently. The ER exit of the misfolded GPI-APs is facilitated by p24 family proteins, which act as cargo receptors of GPI-APs. The misfolded GPI-APs appear transiently on the cell surface before degradation [114]. During the transport through the secretory pathway, misfolded GPI-APs are escorted by ER-derived chaperones, such as BiP and calnexin, and p24 proteins [116]. Most GPI-APs have at least one N-glycan and their folding is mediated by N-glycan-dependent calnexin cycle [117]. Calnexin also binds to PGAP1 and facilitates PGAP1-mediated removal of the acyl chain from inositol [117]. When the calnexin cycle is inefficient, GPI-APs bearing inositol-linked acyl chain appear on the cell surface.

In yeast, misfolded GPI-APs are targeted to ERAD to some extent, while a sizable fraction of the misfolded GPI-APs exit the ER for degradation in vacuoles [115,118]. For efficient ER–Golgi transport of GPI-APs mediated by p24 cargo receptors, remodelling of both lipid and glycan moieties is required [119]. These GPI remodelling reactions occur even when the protein moiety is misfolded, allowing efficient recruitment into COPII-coated transport vesicles. In this regard, quality control of GPI-APs in the ER is limited and the misfolded GPI-APs pass other compartments in the secretory pathway [115].

7. Shedding of GPI-APs mediated by GPI cleaving/processing enzymes (GPIases)

A prominent characteristic of GPI-APs is their shedding from the cell surface. There are several pairs of GPI-APs and GPI cleaving/processing enzymes, GPIases, that are responsible for their shedding. RECK (for reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs) is a GPI-anchored inhibitor of matrix metalloproteinases, such as MMP-9 and ADAM10 [120]. GDE2 is a member of the glycerophosphodiester phosphodiesterase family, having six transmembrane domains and an extracellular phosphodiester domain [121]. There is evidence that GDE2 has RECK-specific GPI phospholipase C activity [26]. RECK suppresses ADAM10 on certain neuronal progenitor cells [122]. When RECK is released by GDE2, ADAM10 cleaves a Notch ligand, such as the Delta-like 1, on the same cell, which in turn shuts down Notch signalling into the neighbour neuronal progenitor cell, leading to initiation of neuronal differentiation [26,123].

The urokinase receptor (uPAR), a GPI-AP, mediates degradation of the extracellular matrix through protease recruitment and enhances cell adhesion, migration and invasion. Cell surface activity of the uPAR is negatively regulated by its shedding from the cell surface, which is mediated by GDE3, another member of the glycerophosphodiester phosphodiesterase family [27]. GDE3 mediates cleavage and release of the uPAR by its GPI-specific phospholipase C activity. Interestingly, the uPAR is resistant to GDE2 [27], suggesting that substrate specificities of GDE2 and GDE3 are dependent upon the protein portions of RECK and the uPAR, respectively.

PGAP6/TMEM8A is a GPI-specific phospholipase A2 expressed on the surface of some cells, including embryonic cells. PGAP6 has sequence similarity to PGAP3, a Golgi-resident GPI-specific phospholipase A2 involved in fatty acid remodelling of the GPI [28]. PGAP6 and PGAP3 belong to the CREST (for alkaline ceramidase, PAQR receptor, Per1, SID-1 and TMEM8) superfamily of hydrolases [124]. The substrate of PGAP6 is CRIPTO-1 [28], a GPI-anchored co-receptor of TGFβ receptors [125]. CRYPTIC, a GPI-AP closely related to CRIPTO-1, is resistant to PGAP6, suggesting that PGAP6 is a CRIPTO-1-specific phospholipase A2 [28]. When CRIPTO-1 and PGAP6 are expressed on the same cell, CRIPTO-1 is processed by PGAP6's phospholipase A2 activity, loses one fatty acyl chain (lyso form of GPI) and is spontaneously released from the cell surface. When GPI-specific phospholipase D (GPI-PLD) is present in the surrounding medium or is expressed in the cell, the lyso form of CRIPTO-1 is cleaved and more efficiently released [28]. The released CRIPTO-1 possessed its activity as a co-receptor of TGFβ receptors [126]. CRIPTO-1 is involved in various steps in embryogenesis. In an early mouse embryonic stage (6.5 days post coitum), Cripto-1 is essential in the generation of the anterior–posterior axis [127]. A fraction of PGAP6 knockout embryos do not form the anterior–posterior axis, confirming the critical role of PGAP6-dependent shedding of CRIPTO-1 in Nodal signalling regulation en vivo [28].

A complex of two GPI-APs, LY6 K and TEX101, is required for sperm migration into the oviduct. Males of LY6 K knockout mice and TEX101 knockout mice are infertile. Their sperm are defective in binding to an egg's zona pellucida in vitro as well as in migration into the oviduct en vivo [128]. A testis form of angiotensin-converting enzyme (ACE) is essential for the maturation of spermatids. Similar to LY6 K knockout and TEX101 knockout male mice, ACE knockout male mice are infertile and their sperm does not pass through the uterotubal junction en vivo and does not bind to the zona pellucida in vitro. ACE cleaves GPI by its putative endomannosidase activity, which seems to reside in a different site from the well-characterized carboxy dipeptidase catalytic site for conversion of angiotensin [129]. TEX101 is a specific target for the GPIase activity of ACE [29]. Shedding of TEX101 by ACE is critical for spermatozoa to become fertilization competent [29,128].

Pairs of the GPI-AP substrates and GPIases described above are examples of the protein specific cleavage/processing of the GPI. By contrast, GPI-PLD has been known for a long time as a GPIase that is active against a wide variety of GPI-APs [130,131]. However, GPI-PLD requires a detergent for its GPIase activity towards the cell surface GPI-APs [132]. As described above, GPI-PLD cleaves the lyso form of GPI-APs in the absence of a detergent, facilitating their shedding from the cell surface [28]. Further, GPI-PLD is able to cleave GPI-APs within the intracellular secretory pathway [133]. These results suggest that when GPI-APs are associated with the membrane microdomains, they are resistant to GPI-PLD. Studies with GPI-PLD knockout mice suggested that GPI-PLD generates diacylglycerol by cleaving GPI within hepatocytes where GPI-PLD expression is most abundant [134]. Diacylglycerol might activate PKCε, which in turn binds to the insulin receptor and inhibits its tyrosine kinase activity, leading to insulin resistance. GPI-PLD knockout ameliorated glucose intolerance and hepatic steatosis under a high-fat and high-sucrose diet through a reduction of diacylglycerol and a subsequent decrease of PKCε activity [134].

8. Transcytotic endocytosis of GPI-anchored receptors

Several GPI-anchored receptors act as transcytotic receptors that transport ligands from one membrane domain to another in endothelial and epithelial cells. GPIHBP1 (GPI-anchored heparin-binding protein 1) binds lipoprotein lipase (LPL) on the basolateral surface of capillary endothelial cells and transport it to the apical (vascular) surface [23]. On the apical surface of capillary endothelial cells, LPL acts on lipoproteins to liberate fatty acids to fuel tissues (see the review for further discussion [135]). Folate receptor 1, a GPI-anchored type of folate receptors, binds 5-methyltetrahydrofolate (5MHF) on the vascular (basolateral) side of the epithelial cells of the choroid plexus in the brain and is endocytosed. The folate receptor 1 and 5MHF complexes are released from the apical surface into the cerebrospinal fluid as exosomes, which then pass the ependyma and enter the brain parenchyma. This is a critical route of 5MHF incorporation from the blood to the brain parenchyma [24]. Glycoprotein 2 (GP2) is selectively expressed on the surface of M cells, cells in the mucosal lymphoid tissue Peyer's patch. GP2 is involved in sampling foreign antigens into the mucosal immune system (see the review for further discussion [136]). Botulinum toxin produced by the food-borne botulism-causing bacteria Clostridium botulinum in the intestine binds to GP2 on the apical surface of M cells and traverses the intestinal epithelial layer via transcytosis [25].

9. Lessons from GPI deficiencies

9.1. Molecular genetics of GPI deficiencies

Defective biosynthesis of the GPI is caused by several different genetic mechanisms. The first GPI deficiency that was clarified at the molecular genetics level is paroxysmal nocturnal haemoglobinuria (PNH) (table 3) [137]. GPI deficiency in PNH is caused by somatic mutations in PIGA that occur in the haematopoietic stem cells (HSCs) [138]. PIGA is the only X-linked gene among all genes involved in GPI biosynthesis. Because of its X-linkage, one loss-of-function somatic mutation in PIGA causes a GPI defective phenotype [138]. This is true for both male and female cells because one X chromosome in female cells was inactivated during embryogenesis and hence a mutation in PIGA in the active X chromosome is sufficient to cause the phenotype. Because PIGA mutation exists only in the affected blood cells but not in germ cells, PNH is not an inherited disease. PIGA somatic mutations found in patients with PNH cause complete loss or a severe reduction of GPI-APs on the cell surface. It should be pointed out that the somatic PIGA mutation alone does not cause PNH because the generation of one GPI-AP-defective HSC among many hundreds of HSCs should not affect the blood system. Indeed, similar PIGA somatic mutations are found in blood granulocytes from healthy individuals [139]. When the mutant haematopoietic stem cell exhibits clonal expansion and generates large numbers of GPI-AP-defective blood cells, clinical PNH is manifested (see reviews for further discussion about clonal expansion [137]).

Table 3. Diseases caused by loss-of-function mutations in PIG and PGAP genes.

a Numbers of published patients as of December 2019.

b Chr, chromosome location.

c PNH, paroxysmal nocturnal haemoglobinuria.

e HSC, haematopoietic stem cell.

f IGD, inherited GPI deficiency.

g MCAHS, multiple congenital anomalies-hypotonia-seizures syndrome.

i DD/ID, developmental delay/intellectual disability.

l HPMRS, hyperphosphatasia mental retardation syndrome/Mabry syndrome.

Another form of GPI deficiency is inherited GPI deficiency (IGD) (table 3). The first inherited form of GPI deficiency was reported in 2006 [140]. A homozygous hypomorphic mutation in PIGM located in chromosome 1q was found in three children from two consanguineous families. The affected children suffered from seizures and thrombosis in the hepatic or portal vein. The mutation was within the promoter region of the PIGM gene and disrupted an Sp1-binding site important for PIGM transcription in some cell types, such as blood granulocytes, B-lymphocytes and fibroblasts. In those cells, the cell surface levels of some GPI-APs are reduced.

In 2010 when the application of whole-exome sequencing to rare inherited diseases became feasible, biallelic (homozygous or compound heterozygous) mutations in PIGV located in chromosome 1p were found in several affected children with Mabry syndrome, also known as hyperphosphatasia with mental retardation syndrome (HPMRS) [141]. The affected children inherited loss-of-function mutations from their parents who were heterozygotes of wild-type and mutant alleles. GPI-APs in blood cells and fibroblasts from affected individuals were partially lost by these biallelic PIGV mutations.

To date, pathogenic germ line mutations causing IGD have been found in 21 out of 27 genes in GPI biosynthesis [140–157] and the GPI-AP maturation pathway [158–161] (table 3). Inheritance of IGDs caused by mutations in autosomal genes, such as PIGB-IGD [151] and PIGC-IGD [147], is autosomal recessive. Inheritance of IGD caused by germ line mutations of PIGA (PIGA-IGD) is X-linked recessive, in which all affected individuals are boys [145]. Their mothers who were heterozygous carriers of a PIGA mutation, were phenotypically mosaic at the cell level (blood cells were mixtures of normal and GPI-AP-deficient cells) but did not have clear symptoms of IGD [162].

More recently, cases of PNH caused by mutations of PIGT were found [98,163,164]. These cases did not have the somatic PIGA mutation found in the affected blood cells from patients with PNH, but instead had biallelic loss-of-function mutations of the PIGT gene. One PIGT allele had germ line mutations whereas the other PIGT was lost by deletion of the 8–24 Mb region of chromosome 20q, which somatically occurred in a haematopoietic stem cell [98]. Therefore, GPI-APs were lost by a combination of germ line mutation and somatic mutation. The somatic mutation is always caused by a Mb scale deletion because simultaneous deletion of the myeloid common deleted region [98], implicated in clonal expansion of the HSCs [165,166], is required for clinical manifestation of PIGT-PNH.

9.2. Genotype–phenotype relationship

Twenty-one genes whose mutations caused IGD cover almost all steps in the biosynthesis of the core GPI, its transfer to proteins and maturation of the GPI, for which genes are known except a step mediated by PGAP5 [140–146,149,151,153,158,161]. It seems, therefore, that every step in GPI-AP biogenesis is critical for human health. There has been no report of pathogenic mutations in genes involved in side chain modifications (i.e. PIGZ and PGAP4) therefore, it is unknown what roles the side chains of the GPI play in human health.

Complete loss of GPI biosynthesis in the whole body of the mouse caused early embryonic lethality, as demonstrated by knockout of the Piga gene [167]. Complete GPI deficiency would also cause a similar phenotype in a human being. A partial but severe reduction in GPI biosynthesis would also cause embryonic lethality. A homozygous PIGC mutation associated with a family with recurrent foetal loss seems highly likely to be such a case [168]. If the reduction in GPI biosynthesis is less severe, the outcome would be IGD. In fact, hypomorphic mutations of PIGC have been associated with epilepsy and intellectual disability [147]. As summarized in recent articles, the most prominent clinical symptoms of IGD are neurological ones, including seizures, developmental delay/intellectual disability, cerebral atrophy and hypotonia [169,170]. Many GPI-APs, such as contactins, tissue non-specific alkaline phosphatase (TNAP) and Thy1, are expressed on neurons, oligodendrocytes and other glial cells. Partial reduction of these GPI-APs impairs neurological development and functions, highlighting the importance of GPI-APs in the neuronal system. One example is a causal role of defective expression of TNAP in seizures [171,172]. TNAP is involved in cellular uptake of pyridoxal phosphate, active vitamin B6, where TNAP dephosphorylates pyridoxal phosphate to generate membrane permeable pyridoxal. Once in the cytoplasm, pyridoxal is reverted to pyridoxal phosphate by pyridoxal kinase and is used by many B6-dependent enzymes including GABA (γ-aminobutyric acid) synthetic enzyme. Therefore, the reduction of cell surface TNAP might result in reduced GABA synthesis, leading to the easy occurrence of seizures.

Concerning genes required for the biosynthesis of the core GPI, many mutations found in individuals with IGD are null or nearly null [173]. Heterozygotes of such null alleles in the same families are healthy, suggesting that 50% of normal levels of GPI biosynthesis may be sufficient for not causing clinical symptoms. When the null allele is combined with a hypomorphic allele, GPI levels further decrease, resulting in symptoms of IGD.

Concerning the PGAP1 and PGAP3 genes involved in the maturation of the GPI, homozygous null alleles do not cause embryonic lethality, but do cause IGD [158,161]. The cell surface levels of GPI-APs do not decrease, or only slightly decrease, in PGAP1 or PGAP3 knockout cells, whereas structures of GPI moiety in GPI-APs are different from those in wild-type cells. In PGAP1 knockout cells, the inositol-linked acyl chain remains in GPI-APs [71]. In PGAP3 knockout cells, the fatty acid remodelling does not occur (i.e. the sn2-linked fatty acid remains as unsaturated fatty acid [79]). These structural abnormalities are probably causally related to the functional impairment of certain GPI-APs, resulting in clinical symptoms. Recently, it was demonstrated that fatty acid remodelling of GPI-APs is required for the generation of nanoclusters of GPI-APs, which is critical for activation of β1-integrins on lymphocytes and their subsequent spreading and migration [174]. The role of GPI fatty acid remodelling in cellular physiology might be causally related to clinical symptoms of IGD caused by PGAP3 mutations.

Concerning genes of GPI transamidase, such as PIGT, mutations that cause complete or nearly complete loss of GPI transamidase activity of a cell lead not only to complete or nearly complete lack of GPI-APs but also to the accumulation of unlinked free GPI in the cell. By contrast, mutations that cause partial loss of GPI transamidase activity lead to partial reduction of cell surface GPI-APs. The same germ line PIGT mutation has been found in IGD [175,176] and PNH [164]. PIGT bearing c.250G>T, p.E84X is a genetic variant found in the East Asian population at an allele frequency of 0.00023. PIGT E84X has very weak activity due to read through of the nonsense codon. Two Japanese children with IGD, who had no familial relationship, inherited this variant PIGT and different PIGT variants from their parents. Both of the other variant PIGTs had partially reduced activities [175,176]. Their cells had subnormal levels of GPI-APs [175,176]. A Japanese adult patient with PIGT-PNH had the same E84X variant in the germ line [164]. In his clonal PNH blood cells, the wild-type allele of PIGT was lost somatically as described above. This combination of a nearly null germ line mutation and somatic loss of the normal allele caused a nearly complete lack of GPI-APs, resulting in PNH [164]. The two children with IGD did not have PNH symptoms, such as intravascular haemolysis, because their blood cells had nearly normal levels of GPI-anchored complement regulators, CD59 and CD55 [175,176].

Patients with PIGT-PNH had typical complement-mediated intravascular haemolysis and, in addition, recurrent autoinflammatory symptoms, such as urticaria, arthralgia and noninfectious meningitis, associated with elevated IL18 and serum amyloid A [98]. Unlinked free GPIs were expressed on affected erythrocytes, monocytes, granulocytes and B-lymphocytes. Both intravascular haemolysis and autoinflammatory symptoms were controlled by anti-complement C5 antibody drug eculizumab, suggesting the involvement of terminal complement activation for both. Studies comparing PIGT- and PIGA-knockout monocyte/macrophage cell lines showed that accumulated free GPI on PIGT-knockout cells caused enhanced complement activation and subsequent IL1β secretion. Therefore, although free GPI is normal component of certain cells, abnormally accumulated free GPI is pathogenic. It is conceivable that when free GPI levels are abnormally high, interactions with some unknown protein(s) involved in complement activation, such as lectin pathway components, may be enhanced due to multivalent binding.

10. Concluding remarks

Biogenesis of mammalian GPI-APs have been studied well, but some points remain to be clarified: mechanisms of ER translocation of preproproteins of mammalian GPI-APs genes involved in flip of GlcN-PI into the luminal side of the ER mechanisms and genes involved in lipid remodelling of GlcN-(acyl)PI identification of the sialyl transferase for elongation of GalNAc-Gal side chain and functions of individual components of GPI-GnT and GPI transamidase. Physiological roles of Man4 and GalNAc side chains need to be studied. Physiological roles of unlinked free GPI found in some tissues by T5_4E10 monoclonal antibody need to be understood. Because T5_4E10 antibody binds only to free GPI bearing GalNAc as a side chain, probes for other forms of potentially expressed free GPIs, such as those lacking a side chain and those bearing GalNAc side chain with elongation by Gal and Sia, are required to elucidate an entire picture of free GPIs. There might be more examples of biologically important GPI-AP shedding mediated by GPIases that are specific to the target GPI-APs.


Mammalian scales - Biology

Home » Unraveling the mammalian protein secretion pathway

In the mammalian genome, roughly 1/3 of the protein-coding genes make products that directly mediate most interactions between cells, organs, and pathogens. These include hormones, membrane proteins, immune factors, extracellular matrix proteins, enzymes, etc. All of these proteins are synthesized and secreted through the secretory pathway, a system localized predominantly to the endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, and other components of the endomembrane system in eukaryotic cells. Hundreds of proteins are known to facilitate protein production in the secretory pathway, but the complexity of the pathway obfuscates how each part of the pathway impacts the synthesis and secretion of the various hormones, antibodies, and diverse proteins. Indeed, it is expected that only subsets of the secretory pathway machinery will be necessary to synthesize each protein. Can we capture all of the steps and unique machinery required to make any given secreted protein? A detailed systems-level view of the secretory pathway would be invaluable to unravel how protein synthesis is controlled and to help elucidate the causes of amyloid diseases, to control post-translational modifications such as glycosylation, and to aid in engineering mammalian cells that more efficiently produce immunotherapies and other high-value biopharmaceuticals.

To begin addressing these questions, we are establishing a systems biology platform to study the mammalian secretory pathway. This includes the generation of experimental omics data and the development of systems biology models of the pathway (Gutierrez and Lewis, Biotech J, 2015 Kuo, Curr Opin in Biotech). As one example, we have developed a systems-level mechanistic understanding of the mammalian secretory pathway is necessary given its importance in the synthesis, folding and delivery of recombinant proteins in Chinese hamster ovary (CHO) cells. With this model, we can estimate the theoretical energetic trade-off between growth and productivity in CHO cells producing a set of recombinant proteins with relevance in the biopharmaceutical industry. We have shown a dependence of the growth-productivity trade-off upon protein size, amino acid composition, and complexity. This model can be used to predict potential knock-out targets that could free up resources and boost productivity.


What is a Vertebrate?

Perhaps a better question would be “what does vertebrate mean”? The Latin term for the bony joint of the spinal column is vertebratus. We have all seen pictures, models, and reconstructions of various skeletons online, in textbooks, or in museums. The spine is instantly recognizable even in very different classes of animals.

Vertebrate characteristics begin at the notochord – a supportive, elastic rod found on all Chordates. When this notochord becomes covered with bony material during fetal development, the result is a vertebrate.


Mammalian Synthetic Biology: Engineering Biological Systems

The programming of new functions into mammalian cells has tremendous application in research and medicine. Continued improvements in the capacity to sequence and synthesize DNA have rapidly increased our understanding of mechanisms of gene function and regulation on a genome-wide scale and have expanded the set of genetic components available for programming cell biology. The invention of new research tools, including targetable DNA-binding systems such as CRISPR/Cas9 and sensor-actuator devices that can recognize and respond to diverse chemical, mechanical, and optical inputs, has enabled precise control of complex cellular behaviors at unprecedented spatial and temporal resolution. These tools have been critical for the expansion of synthetic biology techniques from prokaryotic and lower eukaryotic hosts to mammalian systems. Recent progress in the development of genome and epigenome editing tools and in the engineering of designer cells with programmable genetic circuits is expanding approaches to prevent, diagnose, and treat disease and to establish personalized theranostic strategies for next-generation medicines. This review summarizes the development of these enabling technologies and their application to transforming mammalian synthetic biology into a distinct field in research and medicine.


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