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¿Los fármacos antimuscarínicos aumentan el cAMP o cGMP?

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La activación de los receptores muscarínicos M2 y M4 inhibe la adenilato ciclasa que reduce los niveles de AMPc. Se esperaría que los antimuscarínicos como el ipratropio aumentaran los niveles de AMPc. Sin embargo, se dice que la acción farmacológica del ipratropio está mediada por el aumento de los niveles de GMPc [1]. ¿Por qué es este el caso?

[1] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/138578


Los dinucleótidos cíclicos se unen al conector C de HCN4 para controlar la capacidad de respuesta del AMPc del canal

AMPc media la regulación autónoma de la frecuencia cardíaca por medio de canales activados por hiperpolarización cíclicos activados por nucleótidos (HCN), que subyacen a la corriente del marcapasos IF. La unión de AMPc al dominio de unión de nucleótidos cíclicos C-terminal aumenta la probabilidad de apertura de HCN a través de un cambio conformacional que alcanza el poro a través del enlazador C. Utilizando análisis estructural y funcional, identificamos un bolsillo de unión en el conector C de HCN4. Los dinucleótidos cíclicos, una clase emergente de segundos mensajeros en los mamíferos, se unen al bolsillo del conector C (CLP) y antagonizan la regulación del AMPc del canal. En consecuencia, los dinucleótidos cíclicos previenen la regulación de AMPc de IF en los miocitos del nódulo sinoauricular, reduciendo la frecuencia cardíaca en un 30%. Por tanto, la ocupación del CLP constituye un mecanismo eficaz para dificultar la estimulación β-adrenérgica en IF. Nuestros resultados destacan el papel regulador del enlazador C e identifican un objetivo farmacológico potencial en HCN4. Además, estos datos amplían el alcance de la señalización de los dinucleótidos cíclicos en mamíferos más allá de su primer papel informado en el sistema inmunológico innato.


Introducción

El óxido nítrico (NO) fue descrito por primera vez por Stuehr y Marletta (1985) 1 como un producto de macrófagos murinos activados. Además, la sustancia conocida como factor relajante derivado del endotelio (EDRF), descrita por Furchgott y Zawadzki (1980) 2, 3, ha sido identificada como NO.

La guanilato ciclasa soluble (sGC), responsable de la conversión enzimática de guanosina-5-trifosfato (GTP) en guanosina-3 ', 5′-monofosfato cíclico (cGMP), se identificó por primera vez como un componente de las células de mamíferos hace casi tres décadas. 4

El NO y el cGMP juntos comprenden un sistema de transducción de señales especialmente amplio cuando se consideran los muchos papeles del cGMP en la regulación fisiológica, incluida la relajación del músculo liso, la transducción visual, el transporte de iones intestinales y la función plaquetaria. 5

La disfunción eréctil (DE) se define como la incapacidad constante para lograr o mantener una erección suficiente para un desempeño sexual satisfactorio y se considera un proceso natural de envejecimiento. 6 Los estudios han demostrado que la disfunción eréctil es causada por una relajación inadecuada del cuerpo cavernoso con un defecto en la producción de NO. 7

Está claro que el NO es el neurotransmisor predominante responsable de la relajación del músculo liso cavernasal y, por tanto, de la erección del pene. Su acción está mediada por la generación del segundo mensajero cGMP. El NO derivado de las neuronas se ha establecido como un mediador de la relajación del músculo liso en el pene, y se cree que las formas constitutivas de la óxido nítrico sintasa (NOS) actúan para mediar la erección. 8 El NO liberado activa la sGC, que cataliza la conversión de GTP en el segundo mensajero intracelular cGMP en las células del músculo liso. Un aumento de cGMP modula los eventos celulares, como la relajación de las células del músculo liso. 9

Esta revisión describirá el conocimiento actual de los eventos celulares involucrados en la relajación cavernosa y la variedad de factores putativos involucrados en la relajación mediada por NO.


Abstracto

El GMP cíclico (cGMP) elaborado en respuesta al péptido natriurético auricular (ANP) o al óxido nítrico (NO) es un regulador importante de los cambios a corto plazo en el tono del músculo liso y las respuestas a largo plazo al tratamiento farmacológico crónico o señales proliferativas. La capacidad de las células de músculo liso (SMC) para utilizar diferentes combinaciones de isoenzimas de fosfodiesterasa (PDE) permite que cGMP medie en estos múltiples procesos. Por ejemplo, la PDE5 como una de las principales PDE que hidroliza cGMP controla eficazmente el desarrollo de la relajación del músculo liso. Para que se produzca la contracción, la PDE5 se activa y el cGMP cae. Por el contrario, el bloqueo de la actividad de la PDE5 permite prolongar y mejorar el ciclo de relajación. Una activación directa de PDE5 recientemente demostrada por la unión de cGMP al dominio GAF A sugiere que este sitio regulador podría ser un objetivo para el desarrollo de nuevos fármacos. El aumento de calcio asociado con la contracción iniciada por vasoconstrictor también activa una PDE dependiente de calcio / calmodulina (PDE1A). Juntas, PDE5 y PDE1A reducen el cGMP lo suficiente como para permitir la contracción. A más largo plazo, tanto el ARNm de PDE5 como de PDE1A son inducidos por la estimulación crónica de la guanilil ciclasa. Esta inducción es una de las principales causas de la tolerancia que se desarrolla a los fármacos liberadores de NO. Finalmente, los altos niveles de cGMP o cAMP también actúan como un freno para atenuar la respuesta proliferativa de las SMC a muchos mitógenos. Después del daño de los vasos, para que se produzca la proliferación de SMC, deben disminuirse los niveles de cGMP y cAMP. En los seres humanos, esta disminución se debe en gran parte a la inducción de otra PDE dependiente de Ca 2+ / calmodulina (PDE1C) que permite que se libere el freno y comience la proliferación.

Se ha demostrado que los segundos mensajeros de nucleótidos cíclicos, cAMP y cGMP, regulan una amplia variedad de procesos en muchos tejidos diferentes del cuerpo y se ha sugerido que regulan muchos más. De hecho, se han propuesto para modular tantos procesos diferentes que, hasta hace poco, ha sido difícil entender cómo estas moléculas simples, pequeñas y de segundo mensajero podrían proporcionar tanto la especificidad de acción como la diversidad de funciones necesarias para tal regulación. Particularmente problemático ha sido comprender cómo tanto los procesos muy rápidos como los muy lentos pueden ser modulados por los mismos mecanismos.

Un avance conceptual importante en nuestra comprensión de los mecanismos mediante los cuales se pueden controlar estos procesos espaciales y temporales tan dispares fue la constatación de que en el organismo están presentes muchas isoenzimas diferentes para la síntesis (ciclasas) y la degradación (fosfodiesterasas, PDE) de cAMP y cGMP. 1 Por ejemplo, se han identificado al menos 10 genes de adenilil ciclasa diferentes y casi 20 genes de PDE diferentes en especies de mamíferos. Cualquier tipo de célula en particular podría expresar dos o tres ciclasas diferentes y tres o cuatro PDE diferentes. Más importante aún, el número de posibles combinaciones que se pueden expresar en cualquier compartimento de la celda es muy grande. Por lo tanto, la expresión diferencial y la localización de combinaciones únicas de enzimas degradativas y sintéticas proporcionan a cada célula soluciones moleculares para estos problemas.

En el músculo liso arterial, varios procesos están controlados por cAMP y cGMP. Incluyen eventos metabólicos y mecánicos que están regulados en una escala de tiempo relativamente rápida. El tono contráctil del músculo es quizás el mejor ejemplo de esto. 2 Tanto el cAMP como el cGMP provocan la relajación del músculo liso en gran parte a través de sus efectos para reducir el calcio intracelular o activar la miosina fosfatasa. Los cambios más lentos que están regulados por nucleótidos cíclicos incluyen la proliferación alterada en respuesta a una lesión o incluso la desensibilización a largo plazo a la estimulación crónica por fármacos u hormonas. Como ocurre con todos los mensajeros reguladores, la amplitud y duración de las señales de nucleótidos cíclicos se rigen por sus tasas de síntesis y degradación. En este artículo, revisamos algunos de los pensamientos actuales sobre la regulación de la función del músculo liso por los nucleótidos cíclicos y especialmente los roles que desempeñan las fosfodiesterasas que hidrolizan o responden a cGMP.

Regulación de la función del músculo liso por fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos

Ahora se sabe que hay 11 familias de genes PDE diferentes expresadas en tejidos de mamíferos (Figura 1). La mayoría de las familias contienen más de un gen y la mayoría de los genes codifican más de un ARNm (mediante empalme alternativo o sitios alternativos de inicio de la transcripción). Dependiendo un poco de la especie, las principales fosfodiesterasas presentes en el músculo liso arterial son PDEs1A, 1B y 1C, PDEs3A y 3B y PDE5. En unas pocas especies, una cantidad sustancial de actividad de PDE4 también se expresa en el músculo liso. Como la PDE4 es específica para cAMP y no está regulada por cGMP, no discutiremos su papel más en esta revisión. En condiciones basales (es decir, niveles bajos de calcio), se cree que la PDE hidrolizante de cGMP más activa en el músculo liso es la PDE de unión a cGMP específica de cGMP, PDE5. En condiciones de calcio más altas (por ejemplo, durante la contracción muscular y posiblemente en las células que se estimulan para dividirse), una o más de las variantes de PDE1 pueden convertirse en la PDE predominante. Aunque la PDE3 no tiene una capacidad catalítica total tan grande como las otras dos, todavía puede desempeñar un papel en el control de cAMP y quizás cGMP en compartimentos específicos de la célula. Esta enzima es fuertemente inhibida por cGMP y se ha denominado PDE inhibida por cGMP en muchos estudios previos. En todos los casos, debe recordarse que estas diversas PDE no comparten necesariamente la misma localización subcelular y, por lo tanto, a menudo sirven, al menos en parte, diferentes compartimentos funcionales en la célula.

Figura 1. Organización de dominios de 11 familias de genes PDE. Todas las PDE comparten una homología significativa en su dominio catalítico, pero difieren mucho en sus partes N-terminales, que contienen diferentes tipos de dominios reguladores. El dominio UCR es una región conservada corriente arriba que se encuentra solo en PDE4. Los dominios GAF y PAS se derivan de las primeras letras de los miembros iniciales de sus grupos correspondientes. Los dominios GAF (fosfodiesterasas reguladas por c G MP, varias a denilil ciclasas y F hlA) se definieron originalmente en PDE2, PDE5 y PDE6 y luego se mostraron en PDE10 y PDE11. El dominio PAS (proteínas P er, A RNT y S im) se encontró solo en PDE8.

PDE5: fosfodiesterasa de unión a cGMP, específica de cGMP

PDE5 y relajación del músculo liso

Está bien establecido que el óxido nítrico (NO), el péptido natriurético auricular (ANP) y varios otros vasodilatadores endógenos regulan el tono del músculo liso mediante la activación de la guanilil ciclasa, la elevación de cGMP y la activación de la proteína cinasa dependiente de cGMP (PKG) (Figura 2). Los efectos de NO / cGMP sobre la contracción en el músculo liso parecen estar mediados específicamente por PKG pero no por la proteína quinasa dependiente de cAMP (PKA), porque en ratones con deficiencia de PKG-I, la relajación inducida por cGMP del músculo liso aórtico está completamente abolida, mientras que cAMP -la relajación dependiente no se ve afectada. 2 Existen varios sustratos fisiológicos específicos para PKG en el músculo liso, incluida la subunidad reguladora de unión a miosina de la miosina fosfatasa, 3 maxi K + activado por calcio (BKCalifornia) canales, 4 e IRAG (IP3 sustrato cinasa cGMP asociado al receptor). 5 La fosforilación de todos estos objetivos contribuye a una reducción de la concentración de Ca 2+ intracelular o una reducción de la sensibilidad al Ca 2+ y, por lo tanto, a una disminución del tono del músculo liso. 6

Figura 2. cGMP es un regulador importante de la función del músculo liso. El óxido nítrico (NO) y otros vasodilatadores endógenos regulan el tono del músculo liso a través de la vía de señalización cGMP / PKG. I, PDE5 controla eficazmente el desarrollo de la relajación del músculo liso. El bloqueo de la actividad de la PDE5 permite que el músculo liso mejore y prolongue el ciclo de relajación. II, Las respuestas a más largo plazo al tratamiento crónico con nitroglicerina (nitro-tolerancia) producen cambios en PDE1A y PDE5 y, por lo tanto, menor capacidad de respuesta a cGMP. III, PDE1C se induce sólo en células de músculo liso humano del fenotipo proliferativo y su inhibición da como resultado la supresión de la proliferación de SMC.

La PDE5, como una de las principales PDE que hidroliza cGMP expresada en células de músculo liso, está en condiciones de controlar eficazmente esta vía de señalización de cGMP / PKG, especialmente en condiciones de bajo contenido de calcio. Como se comenta más adelante, en condiciones de mayor contenido de calcio, es probable que las PDE1 desempeñen un papel cada vez más importante. La PDE5 se ha encontrado en todos los tipos de SMC vasculares y viscerales (útero, intestino delgado). La importancia fisiológica de la PDE5 en la regulación del tono del músculo liso se ha demostrado de manera más eficaz mediante el uso clínico exitoso de su inhibidor específico, sildenafil (Viagra, Pfizer Pharmaceuticals), en el tratamiento de la disfunción eréctil. 7 La relajación del músculo liso del cuerpo cavernoso es inducida por la liberación de NO de las células endoteliales y las neuronas no adrenérgicas no colinérgicas (NANC) que rodean las arterias y los sinusoides en los cuerpos cavernosos. Al inhibir la actividad hidrolítica de la PDE5, el sildenafil provoca una mayor tasa de acumulación de cGMP en respuesta al NO, mejorando así la respuesta eréctil. 8

PDE5 y vasculatura pulmonar

Recientemente, el tratamiento de la hipertensión pulmonar ha surgido como una nueva área potencial para la aplicación clínica de los inhibidores de la PDE5. La hipertensión pulmonar es una enfermedad potencialmente mortal caracterizada por una alta presión arterial pulmonar y resistencia vascular. 9 En la vasculatura pulmonar, el NO juega un papel importante como vasorrelajante. Actualmente, el óxido nítrico inhalado es una de las terapias más eficaces para el tratamiento de la hipertensión pulmonar. 10 Una de las ventajas del NO administrado de forma exógena es que tiene poco efecto sobre la presión arterial sistémica. Sin embargo, la vida media del NO es relativamente corta y, por lo tanto, el tratamiento eficaz del NO requiere su administración múltiple. Desafortunadamente, la taquifilaxia comúnmente se observa en unos pocos días.

El uso de sildenafil para el tratamiento de la hipertensión pulmonar ha mostrado resultados positivos en humanos. Un estudio clínico de pacientes con hipertensión pulmonar primaria grave mostró una mejora espectacular de la presión sistólica pulmonar después del tratamiento con sildenafil oral. 11 En otro informe, se descubrió que el sildenafil es un potente vasodilatador pulmonar y superior al NO inhalado para disminuir la presión de la arteria pulmonar y reducir la resistencia vascular pulmonar. 12 La combinación de sildenafil y tratamiento con NO produjo un efecto sinérgico aún mayor.

PDE5 y la vasculatura sistémica

Originalmente, el sildenafil se probó como un fármaco antianginoso, dirigido a la PDE5 en la vasculatura sistémica. 13 Sin embargo, en los primeros ensayos clínicos pronto se hizo evidente que el sildenafil tenía solo un efecto modesto sobre la reducción de la presión arterial sistémica. Sin embargo, este pequeño efecto puede convertirse en hipotensión grave para los pacientes que toman una combinación de sildenafil y nitroglicerina u otros nitratos orgánicos. Esto es coherente con la aparición generalizada de PDE5 en todos los lechos de músculo liso. Debido a que el sildenafil puede potenciar en gran medida los efectos de los compuestos generadores de NO, el uso de sildenafil está contraindicado para la mayoría de los pacientes que también usan cualquier nitrato orgánico. 14

Por tanto, al igual que con todos los inhibidores de la PDE5, el sildenafil es más eficaz cuando se activa la vía de señalización de NO / cGMP, lo que sugiere que el uso clínico de estos inhibidores podría expandirse potencialmente a otras enfermedades asociadas con cambios en la señalización de cGMP.

Recientemente, se ha informado del desarrollo de otros dos inhibidores específicos de la PDE5, tadalafil (Cialis, Lilly ICOS LLC) y vardenafil (Levitra, Bayer y GlaxoSmithKline). 15,16 Cada uno es capaz de inhibir la actividad de la PDE5 con IC50s en el rango de concentración de nmol / L, y actualmente, ambos se utilizan para el tratamiento de la disfunción eréctil. Cada uno de ellos tiene afinidades muy similares por la PDE5, pero varía algo en su farmacocinética y selectividad hacia otras PDE. 17 Aún no está claro si estas diferencias proporcionarán alguna ventaja en la eficacia clínica o la aparición de efectos secundarios.

Variantes de empalme PDE5 y organización del dominio

Se han informado tres isoformas diferentes de PDE5A, PDE5A1, PDE5A2 y PDE5A3 (tabla). Todas las variantes de PDE5 difieren solo en el extremo N-terminal. La primera PDE5 que se purificó hasta homogeneidad fue la enzima soluble de pulmón bovino. 18 Originalmente llamada PDE de unión a cGMP, específica de cGMP, esta isoforma ahora se conoce como PDE5A1. Parece ser la forma predominante expresada en la mayoría de los tejidos que contienen PDE5. La PDE5A1 humana es muy similar a la PDE5A1 bovina, excepto que contiene un inserto adicional de 10 aminoácidos en el extremo N-terminal. 19-21 Otra variante, PDE5A2, contiene un fragmento N-terminal de aminoácido significativamente más corto y también se ha mostrado en varias especies. 22 PDE5A3 se ha informado solo en tejidos humanos según los datos de RT-PCR. 23

Tabla 1. Las isoformas de PDE5 difieren en sus extremos N-terminales

La PDE5 es altamente específica para la hidrólisis de cGMP y contiene dos dominios reguladores N-terminales homólogos, recientemente definidos como GAF A y GAF B en base a su homología de secuencia con motivos reguladores similares que ahora se sabe que están presentes en un gran grupo de proteínas. 24 Los miembros iniciales de este grupo incluían las fosfodiesterasas reguladas por c G MP (PDE2, PDE5 y PDE6), varias a denilil ciclasas y un factor de transcripción bacteriano llamado F hlA. El acrónimo GAF se deriva de las primeras letras de estos grupos. Una búsqueda reciente en la base de datos muestra que casi mil otras proteínas contienen dominios GAF. Muchos, sin embargo, se expresan solo en procariotas.

El dominio GAF A de PDE5 es más homólogo al dominio GAF B de PDE2 que también se une a cGMP con alta especificidad. Muy recientemente se ha resuelto la estructura cristalina de los dominios GAF A / B de PDE2 con cGMP unido. 25 Se cree que la estructura de los dominios GAF de PDE5 será muy similar.

Mecanismos de regulación de la actividad de la PDE5

Fosforilación de PDE5 inducida por PKG

Hace varios años se demostró mediante estudios in vitro que la PDE5 está fosforilada en su parte N-terminal (serina 92) y que la unión de cGMP a un dominio GAF no catalítico de PDE5 era necesaria para las tasas máximas de fosforilación por PKA o PKG. 26,27 Este sitio de fosforilación se conserva en todas las isoformas de la PDE5, incluidas la PDE5 bovina, humana, canina, de ratón y de rata. Sin embargo, quedaban dudas sobre si la fosforilación tenía algún significado fisiológico in vivo. Pronto se demostró que en células de músculo liso de rata cultivadas se podía incorporar 32 P en PDE5 después del premarcado con 32 P-ATP y el tratamiento con ANP. 28

Más recientemente, un enfoque más cuantitativo que usa anticuerpos específicos para el sitio de fosforilación de PDE5 mostró una buena correlación de actividad con un aumento de la fosforilación por PKG pero no por PKA tanto in vitro como en células intactas. La adición de 8-Br-cGMP a células de músculo liso humano cultivadas condujo a una acumulación gradual de la forma fosforilada de PDE5 (Figura 3A). Cuando se comparó la fosforilación de PDE5 con la fosforilación de fosfoproteína estimulada por vasodilatadores (VASP), un sustrato bien caracterizado para PKA y PKG, se encontró que el curso temporal de la fosforilación de PDE5 era similar al de VASP.Se demostró que después de la activación de PKG se fosforiló del 25% al ​​30% de la PDE5 total, y que la PDE5 inmunoprecipitada tenía una actividad de 2 a 2,5 veces mayor que la forma basal no fosforilada cuando se analizó a una concentración de sustrato de GMPc de 1 μmol / L.

Figura 3. En células intactas, la activación de PKG, pero no de PKA, conduce a la fosforilación de PDE5. Se añadió 1 mmol / l de 8-Br-cGMP a las células de músculo liso uterino humano cultivadas, y las células se recogieron en diferentes momentos después de la adición de 8-Br-cGMP. La acumulación de fosfo-PDE5 se detectó mediante análisis de transferencia Western usando un anticuerpo PDE5 específico de fosfo. La fosforilación del sitio preferible de PKG en VASP, serina 239, se detectó usando un anticuerpo VASP específico de fosfoserina 239 monoclonal. B, Se incubaron células de músculo liso aórtico de ratón de ratones de control (+ / +) y ratones deficientes en PKG I (- / -) con 1 mmol / L de 8-Br-cGMP (1), 1 mmol / L de 8-Br- cAMP (2), o ambos (3) durante 30 y 60 minutos. La acumulación de fosfo-PDE5 se detectó mediante análisis de transferencia Western usando un anticuerpo PDE5 específico de fosfo. Adaptado de Rybalkin SD, Rybalkina IG, Feil R, Hofmann F, Beavo JA. Regulación de la fosforilación de la fosfodiesterasa específica de GMPc (PDE5) en células de músculo liso. J Biol Chem. 2002277:3310–3317.

Para responder a la pregunta de la especificidad de la proteína quinasa para PDE5 en SMC intactas, se utilizaron SMC aórticas de ratones que tenían una alteración en el gen PKG I. La incubación de células PKG I - / - con 8-Br-cGMP no produjo ninguna fosforilación de PDE5, mientras que en las células PKG I + / + se observó una fosforilación significativa de PDE5 (Figura 3B). La adición de 8-Br-cAMP solo o una combinación de 8-Br-cAMP y 8-Br-cGMP no estimuló la fosforilación de PDE5 en PKG I - / - SMC aórticas. Estos experimentos proporcionan evidencia inequívoca de que la fosforilación de PDE5 in vivo está mediada predominantemente por cGMP / PKG I, y no por la vía de cAMP / PKA. 29

En estudios relacionados, se ha demostrado que la PDE5 es un importante regulador de la señalización de cGMP en plaquetas. En estas células donantes de NO como GSNO (S-nitrosoglutatión) producen un aumento extremadamente rápido seguido de una rápida disminución de cGMP intracelular. Un cambio dependiente del tiempo de la actividad de la PDE5 y la fosforilación se correlacionó con esta rápida disminución, aunque no se observó desensibilización de la guanilil ciclasa. 30

La unión de cGMP al dominio GAF activa directamente la actividad catalítica de PDE5

Debido a que la unión de cGMP a PDE2 provoca la activación de su actividad catalítica, 31 surgió la pregunta de si la unión de cGMP al dominio GAF de PDE5 causa una activación similar. Aunque se sospechaba, durante muchos años no se había encontrado evidencia que apoyara esta idea.

Un enfoque a este problema hizo uso de un análogo fluorescente de cGMP (Ant-cGMP-2′-O-antraniloil cGMP), que se unía pobremente al dominio GAF pero era un sustrato razonable para el dominio catalítico. Sin embargo, la activación de la actividad catalítica por la unión de cGMP no se demostró directamente.

Más recientemente, se informó la activación directa de PDE5 tras la unión de cGMP al dominio GAF A regulador en un estudio que utilizó PDE5 recombinante. Cuando la PDE5 se preincubó con cGMP, se observó una gran activación (hasta 10 veces) dependiente del tiempo de la PDE5 (Figura 4A). La 33 PDE5 también podría reactivarse después de la adición de otra porción de cGMP a la mezcla de preincubación. La activación de la PDE5 inducida por cGMP fue la más alta cuando la actividad de la PDE5 se ensayó a 0,1 µmol / L de cGMP (de 9 a 11 veces). A 1.0 μmol / L de cGMP, la activación de PDE5 fue solo de 2 a 3 veces, y a 10 μmol / L de cGMP, no se detectó activación (Figura 4B). La activación observada de PDE5 no fue el resultado de la fosforilación de PDE5 porque la mutación del sitio de fosforilación (serina 92) a alanina no cambió el patrón de activación de PDE5 por cGMP.

Figura 4. A, la PDE5 se activa directamente mediante la unión de cGMP al dominio GAF A de la PDE5. La PDE5 recombinante de ratón expresada en células HEK 293 se preincubó con 50 μmol / L de cGMP en hielo (triángulos rellenos) y, después de las diluciones apropiadas, se ensayó la actividad de la PDE5 con 0,1 μmol / L de cGMP durante 5 minutos a 30 ° C. Se añadió una porción adicional de 50 µmol / L de cGMP a la mezcla de preincubación a los 60 minutos después del inicio de la preincubación, como indica una flecha (triángulos abiertos). La actividad de la PDE5 se expresó como pmol · min -1 · µg -1 de proteína. B, El pretratamiento de PDE5 con mAb / P3B2 bloquea la activación de PDE5 inducida por cGMP y reduce la actividad de PDE5 basal. La actividad de la PDE5 se midió a 0,1 μmol / L, 1,0 μmol / L o 10 μmol / L de cGMP. Las muestras se analizaron sin ningún tratamiento (control) o después de la preincubación con 50 μmol / L de cGMP en hielo (+ cGMP), o después de la preincubación con mAb / P3B2 durante 30 minutos en hielo (+ mAb / P3B2), o con mAb / P3B2 para 30 minutos y luego con 50 μmol / L cGMP (+ mAb / P3B2 + cGMP). La actividad de la PDE5 se expresó como porcentaje del control, y la actividad de la PDE5 de control (no estimulada) se definió como 100%. Adaptado de Rybalkin SD, Rybalkina IG, Shimizu-Albergine M, Tang X-B, Beavo JA. La PDE5 se convierte en un estado activado tras la unión de cGMP al dominio GAF A. EMBO J. 200322:469–478.

Para verificar que el efecto de la activación de PDE5 se debió a un efecto directo de la ocupación de cGMP de los sitios de unión de cGMP, se encontró que un anticuerpo monoclonal de ratón (mAb / P3B2), generado contra el dominio GAF de PDE5, podía bloquear sustancialmente Unión de cGMP al dominio GAF A de PDE5. Cuando se aplicó este anticuerpo monoclonal bloqueador de cGMP antes de la preincubación de cGMP, evitó por completo la activación de PDE5 y redujo en gran medida la actividad hidrolítica de PDE5 (Figura 4B). Estos datos indican claramente que el cGMP unido a su dominio GAF exhibe un gran efecto estimulante sobre el dominio catalítico de la PDE5, y sin tal efecto, la PDE5 tiene solo una actividad hidrolítica intrínseca muy baja.

La unión de cGMP parece ser necesaria y suficiente para lograr la activación completa de la PDE5, porque la fosforilación in vitro de la PDE5 activada no mostró ninguna activación adicional. Se sabe que la unión de cGMP al dominio GAF es necesaria para la fosforilación por PKG y que la fosforilación aumenta la afinidad aparente por la unión de cGMP. 27 Por lo tanto, parece que lo que la fosforilación de la PDE5 realmente hace in vivo es estabilizar el estado activado de la enzima, unido a cGMP. Esto probablemente explica por qué la mayoría de los estudios muestran una activación 2 veces o menos cuando se analizan con sustrato de 1 μmol / L. Además, debido a que la PDE5 es un sustrato selectivo de la PKG, el estado de fosforilación de la PDE5, que se correlaciona positivamente con los cambios en la actividad de la PKG, se puede utilizar como marcador específico in vivo para la activación de la PKG en tejidos como el músculo liso, las plaquetas y el cerebelo. que contienen PKG y PDE5.

Juntos, estos datos sugieren que la PDE5 puede existir en al menos dos estados conformacionales diferentes in vivo: no activada y activada tras la unión de cGMP (Figura 5). La PDE5 no activada se encuentra en un estado con baja actividad catalítica intrínseca que puede convertirse reversiblemente a un estado activado tras la unión de cGMP. Estos estados conformacionales reversibles de la PDE5 poseen diferentes propiedades cinéticas e inhibidoras. Por ejemplo, la PDE5 activada por cGMP demostró una mayor sensibilidad hacia el inhibidor específico de la PDE5, sildenafil, en comparación con la PDE5 no activada. El IC50 para la inhibición de sildenafil se redujo de 2,1 a 0,63 nmol / L cuando se ensayó la actividad de la PDE5 a una concentración de sustrato de 0,1 µmol / L de cGMP.

Figura 5. La PDE5 se activa directamente tras la unión de cGMP a su dominio GAF A. Sin cGMP unido, PDE5 está en un estado no activado. La PDE5 se convierte en un estado activado después de la unión de cGMP al dominio GAF A. Solo la PDE5 activada es fosforilada por PKG. Adaptado de Rybalkin SD, Rybalkina IG, Shimizu-Albergine M, Tang X-B, Beavo JA. La PDE5 se convierte en un estado activado tras la unión de cGMP al dominio GAF A. EMBO J. 200322:469–478.

Muy recientemente, se ha demostrado que la unión de cGMP a los sitios de unión de cGMP podría aumentar la unión de 3 H-sildenafil al sitio catalítico. 34 Utilizando un método de disociación por intercambio de 3 H-sildenafil se encontraron dos valores de KD (12 y 0,83 nmol / L), lo que implica la existencia de dos "conformadores" del sitio catalítico de la PDE5.

Curiosamente, también se ha descubierto que la capacidad de la PDE5 para ser activada directamente por cGMP estaba limitada a preparaciones relativamente nuevas. 33 La PDE5 perdió gradualmente su capacidad de respuesta a la estimulación de cGMP después de una semana de almacenamiento en hielo. Aunque no se ha determinado el mecanismo de este cambio, este efecto probablemente explica por qué la activación de PDE5 inducida por cGMP no se había informado anteriormente, ya que tradicionalmente se han utilizado protocolos de purificación de múltiples pasos para su aislamiento. Queda por determinar si la PDE5 activada por almacenamiento representa un estado "artificial" no reversible u otro estado conformacional.

La activación de PDE5 independiente de PKG inducida por cGMP también se ha informado en plaquetas con depleción de PKG. 35 Después de la adición de 500 µmol / L de cGMP a estas células, la actividad de la PDE5, analizada a 1,0 µmol / L de cGMP, se incrementó aproximadamente 2,5 veces. Se observó un nivel similar de activación de PDE5 (2,9 veces) en muestras de control, donde la PDE5 fue fosforilada por PKG. Curiosamente, la cinética de la acumulación de cGMP en las plaquetas deficientes en PKG I tratadas con 300 μmol / L de GSNO fue la misma que en las plaquetas de ratones de tipo salvaje, es decir, un aumento muy rápido de cGMP en 5 segundos seguido de la desaparición completa de cGMP. en 15 segundos. Mientras que la PDE5 en las plaquetas de control estaba sustancialmente fosforilada, la PDE5 en las plaquetas de ratones PKG - / - solo estaba ligeramente fosforilada, probablemente por PKA.

¿Es el dominio GAF A de la PDE5 un objetivo probable para el desarrollo de nuevos fármacos?

Todos los inhibidores de la PDE5 descritos hasta la fecha se han desarrollado como inhibidores competitivos en el sitio activo. El hecho de que la unión de cGMP al dominio GAF de la PDE5 pueda provocar la activación sugiere que tanto los antagonistas como los agonistas de la actividad de la PDE5 podrían desarrollarse basándose en la unión a este sitio. Debido a que todas las PDE comparten un alto grado de similitud de secuencia en su dominio catalítico, los perfiles de selectividad de la mayoría de los inhibidores se superponen al menos parcialmente. Por ejemplo, zaprinast, un conocido antagonista del sitio catalítico de la PDE5, también es un inhibidor relativamente bueno de las PDE1. Cuanto mayor sea la homología entre las PDE, mayor será la probabilidad de que se unan a los mismos inhibidores. Por esta razón, muchos inhibidores de la PDE5 también son inhibidores de la PDE6. Incluso el sildenafil, que es uno de los inhibidores más específicos de la PDE5, aún puede inhibir el fotorreceptor PDE6 en el rango de concentración de nmol / L. Es probable que esta inhibición pueda explicar los efectos secundarios visuales que informan algunos pacientes después del uso clínico de sildenafil. 8 Se ha informado que el tadalafil, un inhibidor de la PDE5 más nuevo, es mucho más específico para la PDE5 que para la PDE6, pero es un inhibidor relativamente bueno de la PDE11, con un IC50 de 37 nmol / L. Uno de los inhibidores selectivos de la PDE5 más nuevos, el vardenafil, tiene un IC50 para la inhibición de PDE11 de 162 nmol / L. El sildenafil inhibe la PDE11 con un CI50 de 2730 nmol / L. 17

Por lo tanto, una posible ventaja de dirigir la unión de cGMP al dominio GAF A de PDE5 (antagonistas de cGMP) podría ser un perfil de selectividad diferente al logrado con los antagonistas del sitio catalítico. Por el contrario, también podría ser posible un agonista del sitio de unión de cGMP. Se esperaría que tal agente mantuviera los niveles de GMPc intracelular muy bajos. Esto podría ser ventajoso, por ejemplo, en el tratamiento de la excitotoxicidad o toxicidad neuronal asociada con isquemia y reperfusión.

PDE1: fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos estimulados por calcodulina

Variantes de empalme PDE1 y organización de dominio

Las PDE estimuladas por Ca 2+ / calmodulina (CaM-PDE) constituyen una gran familia de enzimas, codificadas por tres genes, PDE1A, PDE1B y PDE1C. 36 Se han identificado múltiples variantes de corte y empalme amino-terminales o carboxi-terminales dentro de cada gen. Las CaM-PDE contienen dos dominios de unión de Ca 2+ / calmodulina y se requiere la unión tanto de Ca 2+ como de calmodulina para la activación completa de estas PDE. El grado de activación por Ca 2+ / CaM varía de 3 a 10 veces o incluso más, dependiendo de la fuente, el tejido y la pureza de la preparación enzimática. In vitro, se obtiene un estado basal no estimulado de las PDE1 mediante la eliminación de Ca 2+ con un quelante de Ca 2+ (por ejemplo, EGTA).

Las CaM-PDE son capaces de hidrolizar tanto cGMP como cAMP, pero la especificidad del sustrato difiere entre los diferentes genes. PDE1A y PDE1B comparten la misma alta afinidad por cGMP, pero tienen afinidades diferentes y más bajas por cAMP. La afinidad de PDE1B por cAMP es mayor que la de PDE1A. PDE1C difiere tanto de PDE1A como de PDE1B por su capacidad para hidrolizar cGMP y cAMP igualmente bien. Las variantes de empalme de la misma familia de genes conservan características de sustrato similares. Sin embargo, se ha descubierto que las variaciones en el extremo amino terminal tienen efectos profundos sobre la capacidad de la calmodulina para inducir la activación de PDE1. Por ejemplo, la PDE1A1 y la PDE1A2 bovina comparten una secuencia de proteína idéntica excepto por los 18 aminoácidos del extremo N, pero la mitad de la activación máxima de PDE1A1 por la calmodulina es de 0,1 nmol / L, mientras que para la PDE1A2 es 10 veces mayor. 37

Tolerancia a PDE1A y nitratos

Se ha demostrado previamente que la actividad de la enzima PDE estimulada por Ca 2+ / CaM es importante para la regulación de los niveles y la reactividad de cGMP vasculares (Figura 2). 38 La mayoría de los vasoconstrictores, como la noradrenalina (NE), la angiotensina II (Ang II) y la endotelina-1 (ET-1) aumentan el Ca 2+ intracelular, que se cree que es el principal mecanismo de la contracción del músculo liso mediada por vasoconstrictores. Por consiguiente, se descubrió que una PDE estimulada por Ca 2+ / CaM es la principal enzima responsable de la hidrólisis de cGMP en la aorta de conejo estimulada con vasoconstrictores como la NE. 39 Se ha demostrado la activación de PDE1A1 mediante aumentos en la concentración de Ca 2+ en SMC aórticas de rata cultivadas. Por ejemplo, se ha encontrado que Ang II estimula la actividad de PDE1A1 en SMC aórticas de rata, probablemente a través de un aumento mediado por Ang II en la concentración de Ca 2+. 40 La inhibición de PDE1A1 bloqueó la atenuación mediada por Ang II de la acumulación de cGMP evocada por ANP, lo que sugiere que PDE1A1 media el efecto inhibidor de Ang II sobre la acumulación de cGMP.

Además de la rápida regulación alostérica de PDE1A1 y PDE5A1 por Ca 2+ y cGMP, respectivamente, los niveles de expresión a más largo plazo de PDE1A1 y 5A1 están regulados por diversos reactivos farmacológicos o entornos fisiopatológicos. Por ejemplo, la actividad de la enzima PDE1A1, el nivel de proteína y la expresión de ARNm se regulan positivamente de forma selectiva en el modelo de rata tolerante a nitratos inducido por el tratamiento crónico con nitroglicerina (NTG). 40 NTG sigue siendo uno de los fármacos más importantes en el tratamiento de la angina de pecho estable e inestable. 41 Cuando se administra de forma aguda, NTG tiene una potente capacidad vasodilatadora en arterias, venas y vasos colaterales coronarios. La administración crónica de NTG, sin embargo, está limitada debido al rápido desarrollo de tolerancia a los nitratos. 42,43 Se han propuesto varios mecanismos para explicar este fenómeno, como la contrarregulación neurohormonal (la denominada pseudotolerancia), 44 o mecanismos intrínsecos al propio tejido vascular como la depleción intracelular del grupo SH, la desensibilización de la guanilil ciclasa soluble (sGC ), 45 aumentos en la producción vascular de especies reactivas de oxígeno, 46 ​​o aumentos en la actividad de la PDE (la llamada tolerancia vascular verdadera). 47 El tratamiento crónico con NTG también se ha asociado con un aumento de la sensibilidad a vasoconstrictores como catecolaminas, Ang II, KCl y serotonina 48, todos los cuales pueden comprometer la capacidad vasodilatadora de NTG, contribuyendo así a la tolerancia.

NTG induce vasorrelajación liberando NO. El NO puede activar la sGC y aumentar los niveles tisulares de cGMP. 49 Como se describió anteriormente, cGMP a su vez activa PKG, que se ha demostrado que media la vasorrelajación a través de la fosforilación de proteínas que regulan la contractilidad. Independientemente de los mecanismos de tolerancia, parece estar asociado no solo con una disminución de la elevación de cGMP en respuesta a la exposición posterior a nitratos, sino también en respuesta a vasoconstrictores como la NE. 45 Curiosamente, las consecuencias funcionales de la disminución de los niveles de GMPc intracelular explicarían muy bien ambos fenómenos observados en el marco de la tolerancia, es decir, la disminución de la sensibilidad a la NTG y el aumento de la sensibilidad a los vasoconstrictores. Por lo tanto, como se mencionó anteriormente, la actividad y expresión de PDE1A1 estimulada por Ca 2+ / CaM, pero no PDE5A1, se indujo selectivamente en aortas de ratas tratadas durante 3 días con una dosis clínicamente relevante (10 μg · kg −1 · min −1) de NTG. 40 El inhibidor de la PDE, vinpocetina, restauró parcialmente la sensibilidad de la vasculatura tolerante a la exposición posterior a NTG. En la vasculatura, PDE1A1 está presente principalmente en las SMC. 50 Por lo tanto, los cambios en la expresión de PDE1A1 en las aortas intactas después del tratamiento con NTG ocurren con mayor probabilidad en las SMC. En vasos tolerantes a nitratos, se ha encontrado que un aumento en la sensibilidad a NE se debe a un mayor efecto de disminución de GMPc de NE en vasos tolerantes a nitratos. 45 Estas observaciones juntas apoyan firmemente la idea de que la inducción de PDE1A1 en vasos tolerantes a nitratos puede ser uno de los mecanismos por los cuales se desensibiliza la vasodilatación mediada por NO / GMPc y se sensibiliza la vasoconstricción mediada por Ca 2+. Por tanto, la inhibición selectiva de la expresión y / o actividad de PDE1A1 podría ser un nuevo enfoque terapéutico para limitar la tolerancia a los nitratos.

Finalmente, en SMC de rata cultivadas, el tratamiento con Ang II regula al alza rápida y transitoriamente la expresión de ARNm de PDE1A1 y PDE5A1, que es seguida por niveles de proteína y actividades enzimáticas aumentadas. 51 El mecanismo molecular para la regulación de Ang II de la expresión de PDE1A1 y PDE5A1 parece muy similar al del gen temprano inmediato, c-fos. Estas observaciones sugieren que la alteración de la expresión de ARNm de PDE1A1 y PDE5A1 es un mecanismo importante para la regulación de la actividad hidrolizante de cGMP en las SMC de vasculatura en condiciones fisiológicas y patológicas. Sin embargo, como se analiza en la siguiente sección, las SMC humanas y no humanas (por ejemplo, rata o mono) tienen diferentes perfiles de expresión de PDE. Por lo tanto, debido a que los modelos tolerantes a los nitratos se basan principalmente en experimentos con tejidos no humanos, es necesario realizar estudios en vasos humanos.

PDE1C y proliferación de células de músculo liso arterial humano
La PDE1C se induce en la proliferación de CML humanas

Como se mencionó anteriormente, todas las isoformas de PDE1, PDE1A, PDE1B y PDE1C, pueden expresarse en SMC arteriales en diferentes condiciones y en diferentes especies. Sin embargo, la expresión de PDE1A y PDE1B no parece estar regulada por el estado proliferativo de las SMC. 52 Esta sección se centrará en PDE1C, una isoforma que es activada por Ca 2+ / calmodulina como todas las demás PDE1 pero, a diferencia de PDE1A y PDE1B, tiene la capacidad de hidrolizar tanto el cGMP como el cAMP con la misma eficacia. 53

El músculo liso de la aorta torácica humana intacta de donantes adultos o recién nacidos no expresa PDE1C. 52 Por el contrario, la PDE1C se expresa en gran medida en el músculo liso de la aorta fetal humana intacta, que contiene abundantes células en proliferación según se mide mediante la expresión del antígeno nuclear de células en proliferación (Figura 2).54 Además, existe una marcada inducción de la expresión y actividad de PDE1C en las CML aórticas humanas adultas y recién nacidas que han sido estimuladas para proliferar en cultivo. 52 Por tanto, en marcado contraste con la aorta humana intacta del adulto o del recién nacido, cuando se cultivaron y analizaron las SMC mediante HPLC, se observó una alta actividad de PDE1C (Figura 6A). Como se esperaba, PDE1C hidroliza tanto cGMP como cAMP en presencia de Ca 2+ / calmodulina (indicada por símbolos sólidos en la Figura 6A), y la proteína PDE1C es reconocida por anticuerpos generados contra el extremo C de la PDE1C recombinante (Figura 6A), pero no por anticuerpos contra PDE1A o PDE1B. La PDE1C inducida en SMC humanas proliferativas en cultivo constituye hasta el 85% de la actividad hidrolizante de cGMP total y el 80% de la actividad hidrolizante de cAMP total (a bajas concentraciones de sustrato) en presencia de Ca 2+ / calmodulina. Palmer y Maurice han confirmado recientemente la presencia de alta actividad de PDE1C en SMC aórticas humanas cultivadas. También se ha encontrado abundante actividad de PDE1C en SMC humanas cultivadas aisladas de la arteria carótida, y en varias SMC humanas proliferantes de diferentes órganos que contienen músculo liso, lo que demuestra que la inducción de PDE1C no se limita a las SMC aórticas cultivadas. 52

Figura 6. Las CML humanas y de mono tienen diferentes patrones de expresión de PDE: la PDE1C se induce en las CML humanas en cultivo primario pero no en las CML de mono. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC): perfil de elución de la actividad de PDE en ausencia o presencia de Ca 2+ / calmodulina de CML aórticas humanas (A) y de mono (B) en cultivo primario. La actividad de PDE en cada fracción se analizó con 1 μmol / L de cAMP (triángulos) o 1 μmol / L de cGMP (cuadrados) sin Ca 2+ (en presencia de símbolos abiertos de 1 mmol / L de EDTA) o con 1 mmol / L de CaCl2 y 4 μg / mL de calmodulina (símbolos rellenos). Las inmunotransferencias con bandas detectables de PDE1A, PDE1B, PDE1C y PDE5 se muestran encima de sus respectivas fracciones cromatográficas. Adaptado de Rybalkin SD, Bornfeldt KE, Sonnenburg WK, Rybalkina IG, Kwak KS, Hanson K, Krebs EG, Beavo JA. La nucleótido fosfodiesterasa cíclica estimulada por calcodulina (PDE1C) se induce en células de músculo liso arterial humano del fenotipo proliferativo sintético. J Clin Invest. 1997100:2611–2621.

Los estudios anteriores mostraron una clara correlación entre la inducción de la expresión y actividad de PDE1C, por un lado, y la capacidad proliferativa de las CML humanas en la aorta fetal y las CML humanas cultivadas. Para verificar aún más que la expresión de PDE1C está regulada por el estado proliferativo de la célula, se colocaron en placas SMC humanas sobre colágeno fibrilar tipo I. Este tipo de colágeno da como resultado la detención completa del crecimiento de las SMC 56 y un fenotipo similar a las SMC que se encuentran en la aorta intacta. 57 De acuerdo con la hipótesis de que la expresión de PDE1C está regulada por el estado proliferativo, las SMC humanas cultivadas en placa sobre colágeno fibrilar tipo I tienen una expresión de PDE1C marcadamente reducida. 54 Por otro lado, las CML humanas cultivadas expuestas a condiciones séricas bajas no regulan a la baja la expresión de PDE1C en un grado significativo. Curiosamente, la quiescencia inducida por el colágeno fibrilar de tipo I es más pronunciada que la inducida por la abstinencia de suero. Por tanto, las células que se han plaqueado sobre colágeno fibrilar requieren más tiempo para entrar en la fase S después de la liberación del colágeno fibrilar en comparación con las células que no se han expuesto previamente al colágeno fibrilar. Es probable que la estructura fibrilar del colágeno dé como resultado la salida de las células del ciclo celular (la mayoría de las células estarían en G0), mientras que la abstinencia de suero da como resultado G1 arrestar. Por lo tanto, la expresión de PDE1C se regula a la baja primero cuando el SMC sale del ciclo celular a G0.

Finalmente, existe una clara correlación entre el tiempo requerido para la inducción de la síntesis de ADN y la inducción de la expresión de PDE1C en SMC que se han liberado de colágeno fibrilar tipo I y se han vuelto a colocar en plástico de cultivo de tejidos en presencia de suero (Figura 7A). Juntos, estos experimentos muestran que la expresión de PDE1C no solo se regula al alza cuando las SMC ingresan al ciclo celular, sino que también se regula a la baja cuando se induce la quiescencia celular, y sugieren que la quiescencia completa o la salida de las SMC del ciclo celular a G0 es necesario para reducir la expresión de PDE1C.

Figura 7. A, la inducción de PDE1C se correlaciona con la progresión del ciclo celular. Se colocaron en placa SMC aórticas humanas inmortalizadas (células FLTR) sobre colágeno fibrilar durante 2 días. A continuación, las células se volvieron a sembrar en bandejas de 24 pocillos sin revestir en presencia de FBS al 10%. La síntesis de ADN se midió como incorporación de [3 H] timidina y se expresó como media ± DE de muestras por triplicado. La expresión de PDE1C se midió en muestras duplicadas mediante análisis de transferencia Western. B, los oligonucleótidos antisentido de PDE1C inhiben la proliferación de SMC. Las células FLTR sembradas en placas sobre colágeno fibrilar durante 2 días para reducir la expresión de PDE1C basal se trataron con oligonucleótidos antisentido o de control (invertidos) de PDE1C. La expresión de PDE1C se midió mediante análisis de transferencia Western en células antes de sembrar (control) o las células se volvieron a sembrar durante 3 días en placas no recubiertas. También se contaron las células tratadas con oligonucleótidos antisentido de PDE1C u oligonucleótidos de control (invertidos). El control (células sobre colágeno fibrilar) se fijó al 100%. Adaptado de Rybalkin SD, Rybalkina I, Beavo JA, Bornfeldt KE. La fosfodiesterasa de nucleótidos cíclicos 1C promueve la proliferación de células de músculo liso arterial humano. Circ Res. 200290:151–157.

PDE1C regula la proliferación de CML humanas

Los estudios descritos anteriormente muestran que la expresión de PDE1C está marcadamente regulada por el ciclo celular en las SMC humanas. ¿Significa esto que se requiere la inducción de PDE1C para la progresión del ciclo celular y la proliferación celular? Actualmente, hay dos medios disponibles para abordar esta cuestión: la inhibición de la actividad de PDE1C utilizando inhibidores farmacológicos y la reducción de la expresión de PDE1C mediante técnicas de interferencia de ARN o antisentido de PDE1C. Las isoformas específicas de PDE muestran una respuesta diferente a los inhibidores farmacológicos. 53 Sin embargo, debido a que no se disponía de inhibidores específicos de PDE1C, se utilizó 8-metoximetil 3-isobutil-1-metilxantina (8MM-IBMX) en concentraciones de 10 a 30 μmol / L para inhibir la actividad de PDE1C. El tratamiento de SMC humanas cultivadas con 8MM-IBMX dio como resultado una reducción significativa de la síntesis de ADN. 54 Es probable que estos efectos de 8MM-IBMX se deban a la inhibición de PDE1C, porque las mismas concentraciones no inhiben significativamente las otras PDE de cAMP (PDE3 y PDE4). Además, los inhibidores de la PDE5 no imitaron los efectos de 8MM-IBMX. Para verificar aún más un papel regulador de PDE1C en la proliferación de SMC humanas, se realizaron estudios antisentido de PDE1C. El tratamiento con oligonucleótidos antisentido de PDE1C dio como resultado una expresión disminuida de PDE1C sin afectar la expresión de PDE5, y también inhibió significativamente la proliferación de SMC (Figura 7B). Juntos, estos resultados sugieren fuertemente que la inducción de PDE1C promueve la proliferación de SMC arteriales humanas y puede ser necesaria para que ocurra.

¿El efecto de PDE1C sobre la proliferación de SMC está mediado por la hidrólisis de cAMP o cGMP, o ambos? In vivo, se cree que las CML están expuestas tanto a agentes elevadores de AMPc como de GMPc liberados por el endotelio. Prostaciclina (PGI2) es un ejemplo de un agente inductor de cAMP liberado desde el endotelio, mientras que el NO actúa, al menos en parte, elevando los niveles de cGMP en las células diana (Figura 2). Se sabe que tanto el cGMP como el cAMP inhiben la proliferación de SMC in vitro e in vivo. 58 Por consiguiente, la proliferación de SMC humanas puede inhibirse mediante inhibidores farmacológicos selectivos para las PDE que hidrolizan cAMP o para las PDE que hidrolizan cGMP. 54 El efecto de cGMP sobre la proliferación de SMC parece ser más complejo que el de cAMP. 59,60 En contraste con la supresión completa del recorrido del ciclo celular inducida por 8-Br-cAMP (un análogo de cAMP parcialmente resistente a la hidrólisis mediada por PDE), 8-Br-cGMP parece retrasar, pero no bloquear, la G1Transición de -a-S en SMC de arteria umbilical neonatal humana. 60 Estas células expresan tanto PKA como PKG, efectores de la señalización de cAMP y cGMP. Por tanto, las rutas moleculares reguladas por cAMP y cGMP pueden ser distintas. Este concepto fue respaldado por los hallazgos de que tanto el 8-Br-cAMP como el 8-Br-cGMP suprimieron completamente la actividad de cdk4 estimulada por el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), pero que solo el 8-Br-cAMP dio como resultado la inducción de la cdk. inhibidor p27 Kip1 y una supresión sostenida de la activación de cdk2. 60 Alternativamente, 8-Br-cAMP y 8-Br-cGMP pueden hidrolizarse a diferentes velocidades por las PDE expresadas en las SMC de la arteria umbilical humana, lo que da como resultado un efecto más transitorio de 8-Br-cGMP en comparación con 8-Br-cAMP . En este contexto, también puede ser relevante que los análogos de cAMP y la activación posterior de PKA puedan ejercer una retroalimentación negativa sobre la actividad de PDE1C. 61

En las SMC humanas, la inhibición de PDE1C da como resultado niveles aumentados tanto de AMPc como de GMPc, 54 como se esperaría basándose en las características enzimáticas de PDE1C. De hecho, las acciones de cAMP y cGMP no siempre están relacionadas. Por ejemplo, un estudio reciente muestra que los inhibidores de la PDE5 reducen la proliferación de las SMC de las arterias coronarias bovinas mediante la elevación de cGMP y la posterior inhibición de PDE3, una PDE que hidroliza cAMP inhibible por cGMP. 62 A través de este mecanismo, el aumento de los niveles intracelulares de cGMP puede resultar en un aumento de los niveles de cAMP (ver la sección sobre PDE3). Por tanto, los efectos de PDE1C sobre la proliferación de SMC pueden deberse a la hidrólisis tanto de cGMP como de cAMP.

¿Por qué la PDE1C se induce en la proliferación de CML humanas pero no en las CML de otras especies?

Hasta la fecha, la actividad PDE1C detectable solo se ha observado en las CML humanas en proliferación y, curiosamente, no en las CML aórticas en proliferación de primates no humanos (mono coleta, Macaca nemestrinay babuino), SMC bovino, SMC porcino, SMC de rata o SMC ovino. 52,63 Por otro lado, todas estas especies expresan PDE1A y / o PDE1B. Como se muestra en la Figura 6B, el perfil de actividad de la PDE en las SMC aórticas proliferantes aisladas de mono coleta es sorprendentemente diferente del de las SMC aisladas de la aorta humana (Figura 6A). Tanto las SMC humanas como las de mono expresan PDE5 y PDE3 / 4, pero mientras que las SMC humanas expresan PDE1C, las SMC de mono expresan PDE1B (Figura 6). Estos hallazgos muestran que existen marcadas diferencias en la expresión y actividades de PDE1C en SMC de diferentes especies. Solo podemos especular sobre el motivo de la inducción de PDE1C en las CML humanas en proliferación, a diferencia de las CML derivadas de otras especies. Es posible que las SMC humanas tengan la necesidad de una hidrólisis de cAMP y cGMP más extensa y controlada durante la progresión del ciclo celular que las SMC de muchas otras especies. Los niveles de calcio intracelular están estrechamente regulados durante la progresión del ciclo celular, 64 y la inducción de PDE1C puede servir como un medio para coordinar la señalización del calcio mitógeno con una disminución concomitante en los niveles de las acciones inhibidoras del crecimiento tanto de cGMP como de cAMP. Independientemente del motivo de la inducción de PDE1C en las CML humanas en proliferación, se debe tener especial cuidado al extrapolar los resultados obtenidos con inhibidores selectivos de PDE en estudios con animales a ensayos clínicos en humanos.

Dado el papel clave aparentemente desempeñado por PDE1C en la regulación de la proliferación del músculo liso humano, no sería sorprendente que se pudieran desarrollar agentes terapéuticos que se dirijan a la actividad de PDE1C. Se esperaría que tales agentes minimizaran el exceso de respuesta proliferativa del músculo liso que se produce en respuesta a la lesión y la inflamación causadas por la angioplastia con balón o la colocación de un stent y quizás incluso por la hipertensión. Es probable que también sean menos tóxicos que muchos agentes que se utilizan actualmente.

PDE3: PDE inhibida por cGMP

Tanto la PDE3A como la 3B se expresan en la mayoría de los lechos de músculo liso vascular. Aunque pueden no ser los contribuyentes predominantes a la hidrólisis de cGMP en estos lechos vasculares, o para el caso en el cardiocito, las PDE3 probablemente están reguladas por cGMP in vivo. Las PDE3 no tienen dominios de unión a GMPc alostéricos separados y no están reguladas por GMPc de la misma manera que el dominio GAF que contiene PDE (PDE2 y PDE5). Sin embargo, los sitios catalíticos de PDE3 tienen una afinidad alta similar por cAMP y cGMP, pero el Vmax para cAMP es mucho mayor (4 a 10 veces) que para cGMP. Por lo tanto, el mecanismo por el cual cGMP inhibe la actividad catalítica de PDE3 es a través de la competencia con cAMP en el sitio catalítico. Por tanto, el cGMP actúa como un interruptor transitorio que provoca la inhibición de la actividad hidrolítica del cAMP por parte de la PDE3 hasta que se hidroliza.

Organización y función del dominio PDE3

La familia PDE3 contiene dos genes, PDE3A y PDE3B. La organización del dominio de ambos es bastante similar e incluye un dominio catalítico conservado, una región N-terminal divergente con su dominio de asociación de membrana y un extremo hidrófilo C-terminal (Figura 1). PDE3A y PDE3B comparten la mayor parte de la homología en el dominio catalítico, incluida una inserción única de 44 aminoácidos, que no se encuentra en los dominios catalíticos de las PDE de ninguna otra familia. Sin embargo, estas isoformas difieren mucho en sus extremos N-terminal y C-terminal. 65 Los estudios de diferentes formas de PDE3 truncadas revelaron que el extremo N-terminal no era necesario para mantener la actividad catalítica completa y la sensibilidad a los inhibidores específicos de PDE3, aunque podría ser importante para la localización. sesenta y cinco

Las dos isoformas de PDE3 se expresan diferencialmente. La PDE3A se expresa en músculo liso vascular, plaquetas, cardiocitos y ovocitos. En el músculo liso vascular de rata y humano, se expresan tanto PDE3A como PDE3B, pero tienen distintas localizaciones subcelulares. 55,66 La PDE3A se encontró principalmente en la fracción soluble, mientras que la PDE3B se asoció con las fracciones de partículas. La PDE3B también se expresa en gran medida en células adiposas, hepatocitos y espermatocitos. 67

Por lo general, se cree que la PDE3 media principalmente en procesos regulados por AMPc, como la contractilidad cardíaca, la agregación plaquetaria, la relajación del músculo liso y la regulación hormonal. 67 Se sabe mucho menos sobre la participación de PDE3 en la regulación de la señalización de cGMP. Algunos estudios han demostrado que los agentes elevadores de cGMP pueden producir un aumento en los niveles de cAMP al inhibir la actividad de PDE3. Por ejemplo, la inhibición de la agregación plaquetaria de conejo inducida por NO fue causada en parte por la acumulación de AMPc como resultado de la inhibición de PDE3. 68 También se ha sugerido que en los miocitos auriculares humanos, los efectos estimulantes de los donantes de NO sobre la corriente de calcio cardíaco se debieron a la inhibición de cGMP de la actividad de PDE3. 69 La PDE3 también se ha sugerido como un determinante importante de los efectos del NO en la vasculatura renal. 70

Sin embargo, estudios recientes de ratones deficientes en PKG I mostraron que altas concentraciones de donantes de NO pudieron producir suficiente cGMP para obtener la activación directa de PKA, mientras que bajas concentraciones de cGMP indujeron la relajación del músculo liso exclusivamente a través de la vía de señalización de cGMP. 71 Por lo tanto, se necesitan más estudios para determinar bajo qué condiciones el cGMP mejora la actividad de PKA por activación directa en oposición a indirectamente a través de la inhibición de PDE3.

PDE3 y desarrollo de fármacos cardiovasculares

Se descubrió que la primera generación de inhibidores de PDE3 (milrinona, vesnarinona, enoximona) tiene importantes efectos vasodilatadores e inotrópicos in vitro y en estudios con animales. 53 En los ensayos clínicos iniciales, se creía que estos inhibidores tenían un efecto positivo en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca congestiva crónica. 72 Sin embargo, los efectos a largo plazo de la administración oral de milrinona revelaron un aumento de la morbilidad y la mortalidad de los pacientes con insuficiencia cardíaca crónica grave. 73 Aunque no se sabe si se utilizaron las dosis correctas o incluso si el efecto cardiotóxico se debió únicamente a la inhibición de la PDE3, este ensayo clínico fallido presentó un desafío adicional para el desarrollo de inhibidores de la PDE3. A pesar de estos resultados, se ha aprobado el uso clínico a corto plazo de milrinona para el tratamiento de pacientes con insuficiencia cardíaca aguda descompensada. 74 La inyección intravenosa de lactato de milrinona (Primacor, Sanofi-Synthelabo Inc) puede proporcionar un efecto clínico significativo, pero muy limitado en el tiempo (no más de 48 horas) y requiere una estrecha observación de los parámetros electrocardiográficos de estos pacientes.

Otro inhibidor de la PDE3, el cilostazol (Pletal, Otsuka America Pharmaceutical, Inc / Pharmacia Corporation), ha sido aprobado para el tratamiento de la claudicación intermitente, una enfermedad vascular caracterizada por dolor en las piernas. 75 Nuevamente, este medicamento está contraindicado para pacientes con insuficiencia cardíaca congestiva. Las generaciones más nuevas de inhibidores específicos de PDE3 probablemente tendrán que demostrar especificidad tisular o isoforma que debería minimizar los efectos sobre el tejido cardíaco para lograr la aprobación.

Conclusiones y perspectiva

Se espera que en los próximos años aprendamos mucho más sobre los roles específicos que desempeñan las isoenzimas PDE individuales en la función del músculo liso. También deberíamos ser capaces de identificar cómo se regula la transcripción de estas PDE, qué papel (s) pueden desempeñar algunas de las PDE recientemente descubiertas (p. Ej., PDE9) y, en particular, cómo las diferentes especies utilizan diferentes combinaciones de PDE para regular su Procesos dependientes de nucleótidos cíclicos. Parece muy posible que se identifiquen nuevos usos para los inhibidores de PDE de músculo liso "tradicionales" como Viagra y tal vez se desarrollen nuevos fármacos que actúen en otros sitios de PDE5 o en los sitios activos de otras PDE expresadas en el músculo liso vascular.

Original recibido el 6 de mayo de 2003 Revisión recibida el 7 de julio de 2003 aceptado el 8 de julio de 2003.

Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención de la American Heart Association Washington Affiliate y NIH Grant HL62887 a Karin E. Bornfeldt, NIH subvenciones DK21723 y HL44948 a Joseph A. Beavo, y American Heart Association Grant 0030302T a Chen Yan .


Un fármaco actualmente en ensayos clínicos para el Parkinson fortalece las contracciones cardíacas en animales

Un fármaco que se encuentra actualmente en ensayos clínicos para tratar los síntomas de la enfermedad de Parkinson puede que algún día tenga valor para tratar la insuficiencia cardíaca, según los resultados de los primeros estudios en animales realizados por investigadores de Johns Hopkins Medicine.

El fármaco, un miembro de una clase de compuestos conocidos como inhibidores de la fosfodiesterasa (PDE) tipo I, muestra efectos prometedores en los corazones de perros y conejos, así como en las células cardíacas aisladas de los conejos, sobre todo un aumento en la fuerza de las contracciones del músculo cardíaco. , dicen los investigadores.

La insuficiencia cardíaca humana es una afección crónica que a menudo se caracteriza por el debilitamiento del músculo cardíaco y su consiguiente incapacidad para bombear suficiente sangre. Actualmente, hay decenas de medicamentos disponibles para tratar o controlar los síntomas de la insuficiencia cardíaca, pero los medicamentos que mejoran la fuerza de las contracciones del músculo cardíaco, como la dobutamina, conllevan el riesgo de complicaciones peligrosas como el desarrollo de latidos cardíacos irregulares.

Sin embargo, en su estudio, descrito en un informe publicado en la revista Circulación el 20 de julio, los investigadores de Johns Hopkins demostraron que el nuevo compuesto funciona de manera diferente a los medicamentos actuales, lo que sugiere que su uso puede ser una forma más segura de aumentar la fuerza de la contracción del corazón.

La insuficiencia cardíaca afecta a aproximadamente 5,7 millones de personas en EE. UU.adultos, según los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, y contribuye a aproximadamente una de cada nueve muertes. El tratamiento estándar incluye diuréticos que aumentan la producción de orina para evitar que el corazón se convierta en inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ECA) agrandados que reducen la presión arterial y reducen la carga de trabajo del corazón y betabloqueantes que protegen contra el daño cardíaco causado por niveles altos de la hormona del estrés adrenalina que son comunes con la insuficiencia cardíaca y que ayudan a reducir la carga de trabajo del corazón. No existe cura.

"Nuestros resultados son intrigantes porque hasta ahora ha sido un territorio en gran parte inexplorado encontrar una forma de aumentar la contractilidad que en última instancia no dañe a los pacientes", dice David Kass, MD, profesor de cardiología Abraham y Virginia Weiss en la Universidad Johns Hopkins. Facultad de Medicina e investigador principal del estudio.

El fármaco explorado en el nuevo estudio, ITI-214, inhibe la enzima PDE1, que es parte de la familia más grande de fosfodiesterasas (PDE) de más de 100 de tales proteínas. Todas las PDE funcionan descomponiendo una o ambas moléculas: cAMP y cGMP, cada una de las cuales sirve como mensajeros moleculares dentro de las células. Cada PDE tiene características muy específicas, incluido el tipo de celda en la que existen y su ubicación dentro de esa celda, lo que les permite ajustar cAMP y / o cGMP con mucha precisión.

Los inhibidores de PDE funcionan deteniendo la descomposición de cAMP y cGMP, lo que hace que estas moléculas se acumulen para que puedan influir en las proteínas para alterar la célula. En la enfermedad cardíaca, la actividad de la PDE puede limitar los efectos beneficiosos de cAMP o cGMP, por lo que los inhibidores tienen el potencial de actuar como terapia.

En ratones, señala Kass, se informó que los inhibidores de la PDE1 encogen el músculo cardíaco anormalmente grueso causado por la presión arterial alta y dilatan los vasos sanguíneos. Sin embargo, en los ratones, el corazón tiene principalmente una forma diferente de la enzima PDE1 que la que se encuentra en los humanos, por lo que los inhibidores de la PDE1 probablemente afecten a los ratones de manera diferente a los humanos.

Los perros y conejos, en los que se centró esta investigación, tienen una composición de PDE1 más similar a la de los humanos, dice Kass.

Para sus experimentos, los investigadores utilizaron seis perros equipados quirúrgicamente con sensores y marcapasos cardíacos, y probaron los efectos de ITI-214 en ellos antes y después de inducir la insuficiencia cardíaca haciendo funcionar el marcapasos rápidamente durante aproximadamente tres semanas. El fármaco se probó en diferentes dosis, tanto por vía oral como por vía intravenosa. A los perros se les dio al menos un día entre pruebas.

Cuando se administra en una dosis oral de 10 miligramos por cada kilogramo a través de una pastilla cubierta de mantequilla de maní, ITI-214 aumentó la cantidad de sangre bombeada por el corazón cada minuto en un 50 por ciento en los corazones sanos y en un 32 por ciento en los corazones que fallaron. . Hizo esto, dice Kass, aumentando la fuerza de las contracciones del corazón en casi un 30 por ciento y dilatando los vasos sanguíneos. La administración intravenosa del fármaco produjo efectos similares, pero más rápidos.

"Éramos bastante agnósticos sobre lo que íbamos a encontrar y no necesariamente esperábamos nada de esa novela", dice Kass. "Hasta donde yo sé, ningún estudio había reportado antes un aumento de la fuerza de la contracción del corazón por una inhibición de PDE1. Pero entonces, todos los estudios previos en los que esto podría haberse probado habían usado ratones, y sabíamos que se había encontrado una forma diferente de PDE1 en mamíferos más grandes. y humanos. Así que tuvimos que probarlo y los resultados fueron muy interesantes ".

En perros sanos, advierte Kass, el medicamento también elevó su frecuencia cardíaca en aproximadamente 40 latidos por minuto en promedio, lo que puede ser peligroso para los pacientes con insuficiencia cardíaca. Sin embargo, los perros con problemas cardíacos no tuvieron una diferencia significativa en la frecuencia cardíaca antes y después de la administración del fármaco.

Incluso con estos resultados prometedores, existía una gran preocupación. Otros medicamentos para la insuficiencia cardíaca diseñados para fortalecer las contracciones cardíacas tienen complicaciones potencialmente fatales, como el desarrollo de latidos cardíacos extremadamente irregulares. Los inhibidores de una PDE diferente, PDE3, incluidas la amrinona y la milrinona, son especialmente infames por esto.

"Este era el hombre del saco en la habitación", dice Kass. "El nuevo fármaco produjo muchos de los mismos cambios en el corazón y las arterias que hacen los inhibidores de la PDE3, por lo que, naturalmente, nos preocupamos si funcionaba de manera similar y también podría tener complicaciones. Así que los probamos uno al lado del otro".

Cuando compararon los efectos de ITI-214 con un inhibidor de PDE3 en células musculares aisladas de 13 corazones de conejo, la forma en que actuaron los dos fármacos se veía diferente.

Una de las principales formas en que se cree que funcionan los inhibidores de la PDE3 es aumentando la cantidad de calcio dentro de la célula muscular, lo que hace que las proteínas clave ejerzan más fuerza sobre la célula y hace que la célula se contraiga con más fuerza.

Como era de esperar, cuando los investigadores aplicaron un inhibidor de PDE3 a las células del corazón, los niveles de calcio aumentaron y las células se contrajeron con más fuerza que sin el inhibidor.

Por sí solo, la inhibición de la PDE1 no tuvo ningún efecto sobre las células musculares, pero los investigadores pensaron que esto podría deberse a que la actividad de la PDE1 es demasiado baja en una célula en reposo. Entonces, usaron un medicamento para aumentar ligeramente los niveles de AMPc, y esto aumentó la actividad de la PDE1 lo suficiente como para observar los efectos de ITI-214.

Con el fármaco añadido, ITI-214 hizo que la célula se contrajera con más fuerza. Sin embargo, los niveles de calcio de la célula no aumentaron, lo que indica claramente que ITI-214 aumenta las contracciones musculares a través de un mecanismo diferente al de los inhibidores de PDE3.

"Nuestros resultados muestran que la inhibición de la PDE1 produce cambios diferentes que el bloqueo de la PDE3, por lo que esperamos poder evitar las arritmias mediadas por calcio y potencialmente mortales que han afectado a los inhibidores de la PDE3", dice Grace Kim, coautora principal y becaria postdoctoral en el laboratorio de Kass. "Anticipamos beneficios positivos similares sobre la función cardíaca, pero con mucha menos toxicidad".

Kass dice que ITI-214 también parece funcionar de manera diferente a la dobutamina, que fortalece las contracciones cardíacas en personas con insuficiencia cardíaca, pero también puede causar ritmos cardíacos irregulares fatales. La dobutamina actúa estimulando el sistema beta adrenérgico, el mismo sistema que es activado por la adrenalina. La dobutamina actúa sobre el mismo grupo de moléculas mensajeras que aumentan el cAMP que degrada la PDE3, por lo que sus efectos cardíacos son similares a los de un inhibidor de la PDE3.

Cuando los investigadores bloquearon los receptores beta adrenérgicos en 11 conejos sanos anestesiados y luego aplicaron ITI-214, todos los efectos, excepto su impacto en la frecuencia cardíaca, permanecieron. Si ITI-214 estuviera actuando a través del sistema beta adrenérgico, el bloqueo de los receptores debería haber bloqueado sus acciones.

En cambio, parece que el medicamento podría estar funcionando con el cAMP generado por un sistema de señalización diferente en el corazón que usa adenosina. Cuando los investigadores utilizaron un fármaco para bloquear los receptores en el sistema de adenosina en un grupo separado de siete conejos anestesiados, se eliminaron todos los efectos del fármaco, incluido el aumento de la frecuencia cardíaca.

Otros estudios han demostrado que la vía de la adenosina puede tener efectos protectores en el corazón, dice Kass. En el mismo número de Circulation, otros investigadores de la Universidad de Rochester también encontraron que la PDE1 controla la vía de la adenosina y que la inhibición de la PDE1 podría proteger al corazón de la toxicidad de algunos medicamentos contra el cáncer.

ITI-214 se encuentra ahora en ensayos clínicos iniciales y se está probando en pacientes con insuficiencia cardíaca en Johns Hopkins Medicine y Duke University. Ya pasó las pruebas de seguridad de fase 1 en individuos sanos.

Otros investigadores involucrados en el estudio incluyen a Toru Hashimoto, Richard Tunin, Tolulope Adesiyun, Steven Hsu, Ryo Nakagawa, Guangshuo Zhu y Dong Lee de Johns Hopkins, y Jennifer O'Brien, Joseph Hendrick, Robert Davis, Wei Yao, David Beard, Helen. Hoxie y Lawrence Wennogle de terapias intracelulares.

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (HL135827-01, P01HL107153, HL119012), la Beca de Investigación en el Extranjero de la Sociedad Japonesa de Circulación y la Beca de Investigación de la Fundación Uehara Memorial, el Programa de Capacitación T32, una beca de becas de la Asociación Americana del Corazón e Intra -Cellular Therapies, que aportó el fármaco y la financiación de la investigación.

La financiación y los medicamentos para el estudio fueron proporcionados por Intra-Cellular Therapies. Kass es un consultor remunerado de terapias intracelulares. Este arreglo ha sido revisado y aprobado por la Universidad Johns Hopkins de acuerdo con sus políticas de conflicto de intereses.


Funciones de la vía de señalización cAMP-PKA-CREB en tumores

La señalización de cAMP-PKA-CREB tiene efectos paradójicos en los tumores, actúa como supresor o promotor de tumores en diferentes tipos de tumores (Tabla 1). El papel de la vía de señalización cAMP-PKA-CREB en el cáncer de hígado y otros tumores se describe a continuación.

Cáncer de hígado

Mientras que algunos estudios sugieren que el aumento de los niveles de AMPc puede inhibir el crecimiento de las células de CHC [51,52,53], se ha informado que la PKA promueve la invasión de CHC y la metástasis al fosforilar múltiples sustratos como CIP4 [29]. El carcinoma hepatocelular fibrolamelar (FL-HCC) es un cáncer de hígado primario que se presenta principalmente en niños y adultos jóvenes. El 80% -100% de los pacientes con FL-HCC tienen la fusión del gen DNAJB1-PRKACA, lo que da como resultado la deleción de un fragmento del gen de 400 kb en el cromosoma 19 y la producción de una proteína quimérica que retiene la actividad de la PKA quinasa [54]. Los ratones knock-in DNAJB1 – PRKACA pueden desarrollar tumores característicos de FL-HCC [55]. Además, PRKACA se sobreexpresa en aproximadamente el 80% del HCC mutado en el gen BAP1 (que codifica la proteína 1 asociada a BRCA1), que exhibe manifestaciones clínicas y características histológicas similares a las del FL-HCC relacionado con la fusión DNAJB1-PRKACA [56]. La disfunción de la vía PKA juega un papel importante en el desarrollo y progresión de estos dos tipos de CHC. La infección por el virus de la hepatitis B (VHB) es un factor de riesgo importante para el desarrollo de HCC. La proteína X del VHB juega un papel importante en el HCC relacionado con el VHB. Mecánicamente, el VHBx puede promover la carcinogénesis hepática a través de la vía de señalización CREB-miR-3188 y ZHX2-Notch [57], promover el crecimiento de las células del HCC activando el eje CREB-YAP [58] y promover la invasión y metástasis del HCC relacionado con el VHB por -regular la expresión de FOXM1 a través de la vía Erk-CREB [59]. En conjunto, estos estudios indican que la vía PKA-CREB puede promover la progresión del HCC. De hecho, el análisis de tumores de CHC de rata y muestras de hígado normal emparejadas mostró un aumento significativo en los niveles de fosforilación de CREB y CREB en el CHC [60].

Sin embargo, las funciones del AMPc en el HCC parecen ser algo paradójicas. Como describimos anteriormente, el aumento de los niveles de AMPc por los inhibidores de PDE puede detener el crecimiento de las células de HCC. El tratamiento de las células HepG2 con análogos de AMPc reduce significativamente la transcripción y los niveles de proteína de ciclina A e induce la detención del ciclo celular [61]. Además, el inhibidor de PDE4 rolipram y DC-TA-46 pueden regular al alza la expresión de p21, p27 y p53 y regular a la baja la expresión de ciclina A, inhibiendo así la proliferación y promoviendo la apoptosis de las células HepG2 [52]. Por el contrario, el péptido intestinal vasoactivo podría reducir la concentración de AMPc, la expresión de CREB y la fosforilación de Ser 133 e inhibir la expresión de Bcl-xL, lo que provocaría la apoptosis de las células Huh7 [62]. Las funciones versátiles de cAMP en HCC pueden deberse a la multiplicidad de sus objetivos con diversas funciones. Por tanto, si el AMPc promueve o inhibe el HCC puede depender del contexto. La homeostasis en los niveles de cAMP puede ser crítica para la progresión del HCC.

Cáncer de cerebro

Las funciones de la PKA quinasa activadora de CREB en los tumores cerebrales también son paradójicas. Varios estudios han demostrado que la PKA desempeña un papel supresor de tumores en la línea celular de glioblastoma A-172. La activación de PKA mediante el aumento de los niveles de cAMP o el suministro de análogos de cAMP (dcAMP y 8-Br-cAMP) puede reducir la tasa de proliferación de las células A-172, promover la diferenciación e inducir la apoptosis [63]. El aumento de los niveles intracelulares de AMPc por rolipram, un inhibidor de la PDE, puede regular al alza la expresión de p21 y p27, y activar la señalización de PKA y Epac1-Rap1, lo que conduce a la detención y apoptosis del crecimiento celular A-172 [64, 65]. La vía del AMPc también juega un papel contra el cáncer en el meduloblastoma. La adenilil ciclasa hipofisaria inhibe la proliferación de células de meduloblastoma a través de la vía PKA-Gli1 [66], y las proteínas neurociliares inhiben el crecimiento del meduloblastoma a través de la vía PDE4D-PKA-Hedgehog [67]. La proteína ARHGAP36, un miembro de la familia RhoGAP, puede unirse a la subunidad catalítica PKA e inhibir su actividad, activando así la vía Hedgehog y promoviendo el crecimiento del meduloblastoma [68]. Los efectos supresores de tumores de cAMP y PKA pueden estar mediados por Epac1, Rap1 y Gli1, en lugar de CREB.

La fosforilación de CREB puede ser inhibida directamente por PTEN, una proteína fosfatasa anticancerígena que con frecuencia está mutada o inactivada en muchos cánceres, incluidos los tipos más agresivos de cáncer de cerebro, glioblastoma multiforme y astrocitoma [69, 70]. La deficiencia de PTEN puede mejorar la actividad de CREB e inducir la expresión de PAX7, promoviendo así la conversión de células madre neurales humanas en células madre de glioblastoma [71]. Además, CREB puede regular a la baja recíprocamente a PTEN. Tan y col. informaron de que CREB se expresaba altamente en muestras clínicas y líneas celulares de glioma, y ​​CREB podría inhibir la expresión de PTEN a través de miR-23, promoviendo así el desarrollo de glioma [72]. Además, EGFR puede activar CREB a través de la vía MAPK-RSK2 y luego promover el crecimiento y la invasión de células de glioma [73].

El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), el mutante EGFRvIII y el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR) pueden promover el desarrollo y la invasión del glioblastoma a través de la vía de señalización PKA-Dock180 [74, 75]. Además, miR-33a mejora la señalización de cAMP-PKA inhibiendo la expresión de PDE8A, promoviendo así el crecimiento y la autorrenovación de las células madre del glioma inicial [76]. En la línea celular de glioblastoma humano MGR3, la activación de PKA conduce a un aumento significativo de la fosforilación y actividad de GSTP1, lo que puede conducir a la resistencia al fármaco y al fracaso del tratamiento [77].

Cáncer de pulmón

En el cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), existe una regulación positiva significativa de la expresión y fosforilación de CREB en los tejidos tumorales en comparación con los tejidos normales adyacentes. El aumento de la expresión de CREB se correlaciona con un período de supervivencia corto de los pacientes [78]. El cAMP podría regular negativamente la expresión de SIRT6 y, por tanto, reducir la apoptosis de las células de CPCNP inducida por radioterapia [79]. En el cáncer de pulmón de células pequeñas de alta malignidad (CPCP), el aumento de la actividad de CREB ayuda a mantener sus características neuroendocrinas y su proliferación [80]. La RGS17 aumenta en el 80% de los tejidos del cáncer de pulmón en comparación con el tejido pulmonar normal compatible y promueve la proliferación celular a través de la vía cAMP-PKA-CREB [81]. Además, la transducción de señalización PKA-Smurf1-PIPKIγ promueve la progresión del cáncer de pulmón in vivo [82]. La vía cAMP-PKA-CREB podría regular la respuesta de hipoxia en las células de cáncer de pulmón [83]. Los inhibidores de PKA H-89 y la eliminación de PKACA antagonizan la transformación epitelio-mesenquimatosa inducida por hipoxia, la migración celular y la invasión de las células de cáncer de pulmón [84]. Además, el estrés oxidativo juega un papel importante en la patogénesis de las enfermedades pulmonares, incluida la fibrosis pulmonar y el cáncer de pulmón. Las interacciones entre PKA, Erk1 / 2 y CREB median la supervivencia celular en el estrés oxidativo [85].

Contrariamente a la inhibición de la apoptosis de células de CPCNP inducida por radioterapia por la vía cAMP-Sirt6 [79], la vía cAMP-PKA-CREB parece desempeñar un papel anticanceroso en la radioterapia. El pretratamiento de ratones BALB / c con forskolina podría inhibir ATM y NF-κB mediante la fosforilación de PP2A inducida por PKA, dando como resultado un aumento de la apoptosis inducida por radioterapia [86]. En la línea celular de cáncer de pulmón H1299, la proteína Gs promueve la expresión de Bak a través de la vía PKA-CREB-AP1 y aumenta la apoptosis inducida por radioterapia [87]. Estos estudios sugieren que la vía cAMP-PKA-CREB también puede ejercer efectos opuestos en diferentes circunstancias del mismo tipo de tumor.

Cancer de prostata

La subunidad PKA puede ser un biomarcador para predecir la respuesta del cáncer de próstata a la radioterapia y la quimioterapia. El análisis de 456 muestras clínicas de cáncer de próstata encontró que PKA RIα se expresa altamente en 80 casos (17,5%), y la sobreexpresión de PKA RIα se asocia con una eficacia deficiente de la radioterapia y la terapia de privación de andrógenos a corto o largo plazo, metástasis a distancia y alteraciones bioquímicas índice [88]. En las células PC3M de la línea celular de cáncer de próstata, la sobreexpresión de PKA RIIβ de tipo salvaje o PKA RIα-P de tipo mutante (funcionalmente similar a PKA RIIβ) conduce a la inhibición del crecimiento y la apoptosis in vitro e inhibe el crecimiento tumoral in vivo [89]. La señalización del receptor de andrógenos (AR) es fundamental para la carcinogénesis de próstata. La testosterona estimula directamente GPR56 y luego activa la vía cAMP / PKA, que promueve la señalización de AR [90]. PKA también fosforila el residuo Thr 89 en HSP90, lo que lleva a la liberación de AR de HSP90 y la unión de AR a HSP27, que transfiere AR al núcleo para transactivar sus objetivos [91]. Además, la vía de señalización de la PKA participa en la diferenciación neuroendocrina del cáncer de próstata, un marcador temprano del desarrollo de la independencia de los andrógenos [92, 93]. Además, las altas expresiones de osteocalcina y ostesialina en la línea celular de cáncer de próstata independiente de andrógenos C4-2B dependen de la vía de señalización de cAMP-PKA [94]. PAK4 puede ser activado por cAMP-PKA para mejorar la actividad de transcripción CREB independientemente de la fosforilación en el residuo Ser 133, y la eliminación de PAK4 en células PC-3 y DU145 inhiben la formación de tumores en ratones desnudos [95]. Además, RGS17 se sobreexpresa en muestras de cáncer de próstata y promueve la proliferación celular a través de la vía cAMP-PKA-CREB [81]. Además, se ha informado de que la depresión y el estrés conductual pueden acelerar la progresión del cáncer de próstata a través de la PKA quinasa [30, 96].

Cáncer de ovarios

Aproximadamente el 54% de los tumores de ovario humanos derivados del epitelio en micromatrices de tejido tienen niveles moderados o altos de expresión de CREB, mientras que no se observó expresión en muestras de ovario normales. La eliminación de la expresión de CREB reduce significativamente la proliferación de células de cáncer de ovario, pero no tuvo ningún efecto sobre la apoptosis [97]. El cáncer de ovario epitelial es uno de los tumores malignos ginecológicos más mortales. PKA RIα se expresa en gran medida en el cáncer de ovario epitelial [98]. Durante la diseminación metastásica de la línea celular de cáncer de ovario epitelial SKOV3, la invasión de la matriz extracelular necesita actividad de PKA y anclaje de AKAP, y la inhibición de la actividad de PKA o el anclaje de PKA RI y RII puede bloquear la invasión de matriz [99]. Además, la PKA reduce la intensidad de la unión estrecha en la línea celular de cáncer de ovario epitelial OVCA433 al fosforilar la claudina-3 [100]. Además, la gonadotropina promueve la metástasis de las células epiteliales del cáncer de ovario a través de las vías PKA y PI3K [101].Mientras que los estudios mencionados anteriormente sugieren que PKA-CREB desempeña un papel promotor de tumores en el cáncer de ovario epitelial, un estudio sugiere que PKA puede fosforilar EZH2 en el residuo Thr 372, lo que conduce a una disfunción mitocondrial, la unión de EZH2 a STAT3 y luego inhibe STAT3. fosforilación y crecimiento de células de cáncer de ovario epitelial [102].

Cáncer de mama

La sobreexpresión de la subunidad R, especialmente el RI de PKA, se asocia con la proliferación celular en la mama normal, la transformación maligna de las células epiteliales de la mama, el mal pronóstico del cáncer de mama y la tolerancia a la terapia antiestrógeno. Un estudio reciente demuestra que la localización nuclear de la PKA activada se correlaciona con la metástasis del cáncer de mama [103]. La integrina α9 mantiene la estabilidad de la β-catenina a través de la señalización de ILK / PKA / GSK3 y, por lo tanto, promueve el crecimiento y la metástasis de las células de cáncer de mama triple negativas [104]. Además, el éxito de la terapia antiestrógeno se asocia con una expresión reducida de ARNm de RI, y los oligonucleótidos antisentido de RI pueden reducir la tasa de crecimiento de las células de cáncer de mama [105]. En el cáncer de mama con receptor de estrógeno positivo, la fosforilación de ERα Ser 305 y PAK1 inducida por PKA se asocian con la resistencia al tamoxifeno y la progresión del cáncer de mama [106, 107]. En las células de cáncer de mama positivas para Her-2, la activación de la PKA se asocia con la resistencia a trastuzumab [108]. Además, la vía cAMP-PKA-CREB también juega un papel importante en la regulación metabólica del cáncer de mama. La serotonina promueve la biosíntesis mitocondrial a través de la vía AC-PKA en las células del cáncer de mama [109]. El receptor de estrógeno acoplado a proteína G citoplasmática promueve la glucólisis aeróbica a través de la vía cAMP-PKA-CREB [110]. Contrariamente a los estudios anteriores, se ha informado de que la IL-24 induce la apoptosis de las células del cáncer de mama mediante la activación de TP53 y el estrés del retículo endoplásmico a través de la PKA [111]. Por lo tanto, la PKA también puede tener funciones paradójicas en el cáncer de mama según el contexto.

Leucemia

El papel del AMPc es bastante diferente en diversos tipos de linfoma. Los inhibidores de PDE4 bloquean la señalización de TLR intracelular y promueven la apoptosis de las células de leucemia linfocítica crónica (LLC) mediante el aumento de la concentración de AMPc [112, 113]. Curiosamente, los inhibidores de PDE4 inducen apoptosis en la CLL de células B pero no en la CLL de células T o en las células hematopoyéticas circulantes normales, probablemente debido a que los inhibidores de PDE4 sólo aumentan los niveles de receptor de glucocorticoides y cAMP en la CLL de células B [114, 115]. cAMP-PKA podría promover la apoptosis a través de vías dependientes de mitocondrias, reduciendo la expresión de las proteínas antiapoptóticas Bcl-2 y survivina, y aumentando la expresión de la proteína proapoptótica Bax en las células de linfoma [116,117,118]. Las quimiocinas CXCR4 y CXCL12 liberadas del microambiente pueden unirse a los GPCR conjugados con Gαi en las células de CLL, lo que reduce la síntesis de cAMP y aumenta la tasa de supervivencia de las células de CLL [119, 120]. La PDE7B se sobreexpresa en la CLL, y los inhibidores de PDE7 (BRL-50481 e IR-202) y un inhibidor dual de PDE4 / PDE7, IR-284, aumentan la apoptosis de las células de CLL, que se atenúa mediante la inhibición de PKA [121].

CREB se sobreexpresa en la médula ósea de la mayoría de las líneas celulares de leucemia y de pacientes con leucemia mieloide aguda (LMA) y leucemia linfoblástica aguda (LLA) [122]. Estudios anteriores también muestran que CREB se expresa en gran medida en la mayoría de las células de leucemia mieloide en pacientes con LMA y se asocia con un pronóstico precario [123]. El inhibidor de jmjd3 / UTX GSKJ4 puede promover la degradación de CREB e inhibir el crecimiento de células de AML [123]. La sobreexpresión de CREB puede promover la proliferación de células AML regulando al alza la expresión de ciclina A1. Además, los ratones transgénicos CREB muestran enfermedades mieloproliferativas pero no leucemia, lo que sugiere que CREB está involucrado en el fenotipo de leucemia durante la germinación de la leucemia, pero no es suficiente para transformarse completamente en leucemia [124]. Por el contrario, el AMPc puede proteger a las células de leucemia promielocítica aguda de la apoptosis inducida por el trióxido de arsénico y las antraciclinas [124]. En la línea celular de LMA IPC-81, el AMPc puede inducir la apoptosis a través de la regulación positiva de Bim por CREB y CDK [125].

Otros tumores

Los niveles de ARNm y proteínas de PKA RIα y AKAP10 aumentan significativamente en los tejidos del cáncer colorrectal, lo que se correlaciona con la profundidad de la invasión, el grado de diferenciación y la supervivencia corta [126]. El receptor del factor de crecimiento similar a la insulina de tipo I (IGF-IR) está estrechamente implicado en la tumorigénesis y la resistencia a los fármacos [127]. La señalización de IGF-IR induce la fosforilación de ezrin en el residuo Thr 567 y, por lo tanto, promueve la activación de PKA dependiente de AMPc y la supervivencia de las células de cáncer colorrectal [128]. La sobreexpresión de PKA RIα y AKAP10 en varias líneas celulares de cáncer colorrectal se correlaciona directamente con la metástasis. Además, la resistencia de las células de cáncer colorrectal a un inhibidor selectivo de MEK1 / 2, el selumetinib, es inducida por la activación de PKA [129], y la resistencia de las células de cáncer colorrectal al metotrexato puede inducirse mediante la señalización de AMPc [130]. Los antagonistas de PKA podrían inhibir la translocación nuclear de β-catenina y la expresión de c-myc y COX2 en el cáncer colorrectal mutante APC, inhibiendo así el desarrollo de tumores [131].

Los experimentos inmunohistoquímicos encontraron que los melanocitos normales no expresaban proteínas PKA RIα, pero se expresa en gran medida en muestras de melanoma humano y algunas líneas celulares de melanoma. La activación de RII o el silencio de RIα pueden inhibir la proliferación y aumentar la apoptosis promovida por la caspasa 3 [132]. La PKA puede promover la migración de células de melanoma. Los estudios han encontrado que la hipoxia puede inducir la expresión de la proteína de andamiaje AKAP12 en el melanoma, y ​​la fosforilación regulada por PKA durante la hipoxia depende de la presencia de AKAP12. La inactivación de AKAP12 conduce a la reducción del crecimiento, la migración y la invasión tumorales en modelos de ratón con melanoma [133]. La vía PKA también juega un papel importante en la síntesis de melanina. El dietilestilbestrol puede promover la producción de melanina a través de la regulación por incremento de tirosinasa y MITF mediada por cAMP-PKA en la línea celular de melanoma de ratón B16 [134], y el gingerol inhibe la producción de melanina mediante la regulación negativa de MAPK y PKA [135].


MATERIALES Y MÉTODOS

Drosophila

Drosophila melanogaster Los meigen se criaron en medio estándar a 25 ° C, con un fotoperiodo claro: oscuro de 12 h: 12 h y una humedad relativa del 55%. Las líneas utilizadas en este estudio fueron: wild-type, Canton S blanco mutantes: w 1118 (eliminación parcial, pérdida de función: http://flybase.bio.indiana.edu/reports/FBal0018186.html) y w H (alelo hipomórfico) (Zachar y Bingham, 1982) conductor de GAL4 específico de la célula principal del túbulo, c42 (Broderick et al., 2004) transgénico w:: Líneas de eYFP D4, E5 y H8 (generadas para este estudio).

Mutante w Drosophila (w 1118 y w H ) fueron 'cantonizados' cruzando moscas de ojos blancos con moscas de tipo salvaje Canton S. isogeneizadas. Las crías fueron recolectadas y cruzadas para producir crías recesivamente de ojos blancos. Este proceso se repitió cinco veces, eliminando así el 97% de las mutaciones compensatorias que pudieran haberse acumulado desde que se aislaron por primera vez las cepas mutantes.

Para la disección, las moscas se anestesiaron enfriándolas en hielo y se decapitaron antes de retirar los túbulos en medio de Schneider (Invitrogen Ltd, Paisley, Escocia). Todos los productos químicos y fármacos se obtuvieron de Sigma (Sigma-Aldrich, Gillingham, Dorset, Reino Unido), a menos que se indique lo contrario.

Generación de transgénicos Drosophila

Las líneas de sobreexpresión que contienen etiqueta blanca con proteína fluorescente amarilla mejorada (eYFP) en el extremo C se generaron de la siguiente manera:

La secuencia codificante de eYFP (Clontech UK Ltd, Basingstoke, Hampshire, Reino Unido) se amplificó utilizando cebadores que incorporaron Noyo y KpnI sitios en los extremos 5 'y 3', respectivamente (GCGGCCGCCATGGTGAGCAAGGGCGAGG / GGTACCCTACTTGTACAGCTCGTCCATGC). El fragmento resultante se clonó en el Noyo y KpnYo sitios de pagPAG usando métodos estándar para formar pP. los blanco El marco de lectura abierto, excluyendo el codón de terminación, se amplificó por PCR a partir de una plantilla de ADNc de túbulos utilizando cebadores: AGATCTATGGGCCAAGAGGATCAGGAG / GCGGCCGCCTCCTTGCGTCGGGCCCGAAG, que incorporaba EcoRI y NoI sitios en los extremos 5 ′ y 3 ′, respectivamente. Este fragmento fue clonado en pagPAG utilizando el EcoRI y NoI sitios de restricción para formar plásmido pagP <w - eYFP-UAST>. El inserto se secuenció para verificar errores de PCR y el plásmido se inyectó en wDrosophila los embrionesw 1118 ) por técnicas estándar (Vanedis Drosophila servicio de inyecciones, www.vanedis.no). Los transformantes se seleccionaron y mantuvieron usando estándares Drosophilatécnicas genéticas.

Ensayos de transporte de fluidos

Los ensayos de transporte de fluidos se realizaron como se describió previamente (Dow et al., 1994b) en túbulos intactos de Canton S, w 1118 y cantonizado w 1118 Moscas adultas de 7 días. Las velocidades basales de transporte de líquidos se establecieron durante 30 minutos, después de lo cual se añadieron 100 μmol l –1 cGMP a los túbulos y se midieron las velocidades de transporte de líquidos durante 60 minutos más. Los datos se muestran como tasas medias de transporte de fluidos ± s.e.m., norte=7.

Ensayos de transporte cíclico de nucleótidos

Los ensayos de transporte para cGMP y cAMP se basaron en un ensayo de transporte de fluido modificado. Se calcularon las tasas de transporte como se describió anteriormente (Day et al., 2006). La velocidad de transporte proporciona una medida lineal del flujo unidireccional basal a apical, mientras que una relación secretada: baño de & gt1 indica que los túbulos concentran el sustrato de transporte (Maddrell et al., 1974). Las tasas máximas de transporte de cGMP y cAMP se produjeron a 100 μmol l -1 (Evans, 2007), por lo que todos los ensayos de transporte se realizaron con una concentración final de 100 μmol l -1 de nucleótido cíclico. Las tasas máximas de transporte de cAMP son significativamente más altas que las de cGMP: una relación de transporte de ∼5 a 100 μmol l –1 cAMP, vs ∼3 para cGMP a 100 μmol l –1 cGMP.

Los túbulos se diseccionaron en solución salina (Dow et al., 1994a) y se dejaron recuperar durante 30 min antes de la adición de nucleótidos cíclicos: cGMP o cAMP `` frío '' a 100 μmol l -1, y cGMP tritiado o cAMP añadido como trazador (Amersham Pharmacia, Biotech UK Ltd, Amersham, Bucks, Reino Unido). Cuando se incluyeron competidores o fármacos, estos se añadieron 30 min antes que el sustrato radiomarcado. Donde se investigó la eliminación de aminoácidos y citrato, un mínimo Drosophila se utilizó solución salina (Linton y O'Donnell, 1999) para la cual los ingredientes faltantes de Drosophila la solución salina (Dow et al., 1994a) se reintrodujo en las concentraciones normalmente utilizadas.

En todos los ensayos de transporte, la relación y la velocidad de transporte se midieron 1 h después de que se añadió el nucleótido cíclico radiomarcado (Evans, 2007). Se permitió que los túbulos se secretaran durante 1 h antes de que se midiera la gota secretada y se retirara a tubos Eppendorf que contenían líquido de centelleo (Fisher Scientific, Loughborough, Reino Unido). También se extrajo una muestra de 1 μl de cada gota de depósito y se midió la radiactividad en el contador de centelleo (Beckman, High Wycombe, Reino Unido).

Bioensayo de quinasa dependiente de cGMP para cGMP secretado

Con el fin de determinar si el cGMP inalterado se transporta a través del túbulo desde la gota de baño al lumen, se analizó la capacidad del fluido secretado para estimular la actividad de la proteína quinasa dependiente de cGMP (cGK). in vitro. Se llevó a cabo un ensayo de secreción con 80 túbulos en la gota de baño estándar de Drosophila solución salina / medio de Schneiders (control) o solución salina / medio de Schneiders con 100 μmol l –1 cGMP. Después de permitir que los túbulos secretaran durante 1 h, se juntaron las gotitas secretadas (~ 2 ml en total), se retiraron de la placa de ensayo de secreciones y se colocaron en un tubo Eppendorf. Para eliminar cualquier aceite mineral residual derivado del ensayo de secreción, se centrifugaron las muestras y se desechó el aceite (capa superior). A continuación, se llevó a cabo un ensayo de cGK utilizando el Drosophila cGK, DG2 (MacPherson et al., 2004), que se había expresado en células S2 como fuente de DG2 y, por lo tanto, actividad cGK (MacPherson et al., 2004). Las reacciones de quinasa estándar se establecieron en un volumen total de 44 μl con 5 μl de muestra de proteína DG2, 39 μl de tampón de ensayo de quinasa (MacPherson et al., 2004) y 1 μl de líquido secretado de muestras de control o 1 μl de secreción líquido de los túbulos incubados en 100 μmol l –1 cGMP. Los controles positivos se establecieron añadiendo 1 μl de 100 μmol l -1 cGMP (concentración final 2,2 mmol l -1) a la mezcla de ensayo como se describe anteriormente. Se realizaron tres experimentos separados para cada condición y los resultados se expresaron en pmol ATP min -1 mg -1 proteína (media ± s.e.m.).

PCR cuantitativa en tiempo real (Q-PCR)

La Q-PCR se realizó como se describió anteriormente (McGettigan et al., 2005), utilizando ARNm preparado a partir de túbulos de adultos de 7 días. Drosophila. Cuando se estaba investigando el efecto de cGMP sobre la expresión génica, los túbulos se incubaron con o sin 100 μmol l -1 cGMP en medio de Schneider durante 3 h antes de que se extrajera el mRNA. La transcripción inversa se llevó a cabo usando Superscript II (Invitrogen) usando cebadores oligo (dT). Para cada muestra, se añadieron 500 ng de ADNc a 25 μl de mezcla de reacción SYBR Green (Finnzyme, Oy Espoo, Finlandia) con una concentración adecuada de los cebadores - WhiteF: GCCACCAAAAATCTGGAGAAGC / WhiteR: CACCCACTTGCGTGAGTTGTTG. Las reacciones se llevaron a cabo en un termociclador Opticon 2 (MJ Research Inc., Waltham, MA, EE.UU.). El ribosomal rp49(rpl32) (cebadores rp49F: TGACCATCCGCCCAGCATAC / rp49R: TTCTTGGAGGAGGACGCCGTG) se utilizó como patrón de referencia en todos los experimentos (McGettigan et al., 2005).

Inmunocitoquímica

La inmunocitoquímica en túbulos de Malpighi intactos se llevó a cabo como se describió previamente (MacPherson et al., 2001). Un anticuerpo anti-GFP primario monoclonal de ratón que reconoce variantes de GFP (Zymed, Invitrogen Ltd) diluido 1: 1000 en PAT [Triton X-100 al 0,05% (v / v) y BSA al 0,5% (p / v) en PBS con 14 mmol l - 1 NaCl, 0,2 mmol l –1 KCl, 1 mmol l –1 Na2HPO4 y 0,2 mmol l –1 KH2correos4, pH 7,4], seguido de la adición de anticuerpo secundario, IgG anti-ratón marcado con Alexa Fluor® 568 (Molecular Probes, Invitrogen Ltd), diluido 1: 500 en PAT. La tinción nuclear 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato (DAPI) se aplicó a los túbulos durante 1 min a 500 ng ml -1 en PBS. Las muestras se visualizaron utilizando un sistema confocal Zeiss 510 Meta y las imágenes se procesaron utilizando el software de imagen LMS. Todas las imágenes se tomaron con la misma ganancia y exposición.


¿Qué es cAMP Boost?

Nutraville describe cAMP Boost como una fórmula potente y segura para quemar grasa que utiliza los inhibidores de PDE-4 más potentes disponibles. Estos inhibidores eliminan las enzimas que bloquean la pérdida de grasa al tiempo que aumentan los mensajes de quema de grasa enviados por las moléculas de AMPc. A través de estos mecanismos, cAMP Boost puede supuestamente decirle a sus células que deben quemar grasa hora a hora, sin parar.

cAMP Boost tiene un precio de $ 67 por botella y está respaldado por una garantía de devolución de dinero de 365 días. Cada botella debe durar un mes. Sin embargo, la compañía recomienda duplicar la dosis para maximizar la efectividad de la fórmula para quemar grasa.

¿Cómo funciona cAMP Boost?

cAMP Boost utiliza seis ingredientes activos para ayudarlo a perder peso, incluido el extracto de pomelo, el extracto de semilla de guaraná, el extracto de granos del paraíso y el extracto de pimienta negra.

El fabricante recomienda tomar una cápsula dos veces al día (por la mañana y al mediodía) para ayudarlo a perder una cantidad significativa de peso. El fabricante también recomienda duplicar la dosis para maximizar los efectos quemagrasas de la fórmula.

Aquí & rsquos cómo Nutraville, el fabricante de cAMP Boost, describe los efectos de cAMP Boost:

& ldquocAMP Boost es una poderosa fórmula de pérdida de grasa que utiliza ingredientes que se muestran en estudios para aumentar las señales de amplificación cíclica a las células grasas. Ese amplificador cíclico alerta a las células para que liberen y quemen grasa para que puedas perder grasa sin esfuerzo hora tras hora.

Todos tenemos una enzima en nuestro cuerpo llamada PDE-4. Esta enzima impide que su cuerpo envíe señales de quema de grasa a su monofosfato de adenosina cíclico (cAMP). AMPc es el mensajero más importante para enviar señales a sus células para quemar grasa. Cuando la PDE-4 está presente en su cuerpo, le impide maximizar la quema de grasa.

Aquí le mostramos cómo el sitio web c-AMP Boost explica los efectos de cAMP y PDE-4 en su pérdida de peso:

"Hay una cierta" molécula de señalización "en el cuerpo llamada cAMP" y esta molécula de señalización envía mensajes a las células para quemar grasa. Sin embargo, también existe una enzima silenciadora de señales en el cuerpo llamada PDE-4 que se dirige y bloquea las señales de quema de grasa enviadas por las moléculas de AMPc.& rdquo

Cuando la PDE-4 bloquea las señales de cAMP, es difícil quemar grasa, incluso si necesita comer bien y hacer ejercicio.

Desafortunadamente, a medida que envejecemos, el cuerpo crea más PDE-4, que es una de las causas del aumento de peso no deseado con la edad. Nutraville afirma que cAMP Boost detiene la PDE-4, inhibe la enzima y desbloquea la pérdida de peso efectiva.

¿Cómo cAMP Boost detiene la PDE-4?

cAMP Boost funciona como un inhibidor de PDE-4, lo que ayuda a desbloquear sus capacidades para quemar grasa.

Para bloquear la PDE-4, cAMP Boost combina Sinetrol con ingredientes naturales. El Sinetrol en cAMP Boost desactiva las enzimas PDE-4 y aumenta las señales de cAMP para quemar grasa a las células grasas.

cAMP Boost también contiene Bioperine, un extracto de pimienta negra que se ha demostrado que mejora la absorción de ingredientes.

  • Pierda peso de forma segura y rápida
  • Aplana tu vientre
  • Quemar calorías
  • Convierta la antiestética grasa corporal blanca en grasa marrón quemagrasas
  • Ayude a sus células a quemar grasa hora tras hora, sin parar

Nutraville afirma que los ingredientes de su fórmula actúan como "los inhibidores de PDE-4 más potentes disponibles" y eliminan las enzimas responsables de bloquear la pérdida de grasa. Estos ingredientes también aumentan los mensajes de quema de grasa enviados por las moléculas de AMPc, diciéndoles a sus células que quemen grasa hora tras hora, sin parar.

La importancia de la grasa marrón

cAMP Boost también se enfoca en la grasa marrón dentro de su cuerpo, convirtiendo su grasa corporal blanca en grasa marrón que quema grasa. Sí, existe una diferencia entre los tipos de grasa dentro de su cuerpo. Algunos tipos de grasas son mejores que otros.

La grasa blanca, por ejemplo, contiene solo una o dos mitocondrias. Mientras tanto, la grasa marrón contiene una docena de mitocondrias, lo que la convierte en una fuente inagotable de quema de grasa.

Al aumentar la cantidad de actividad de las grasas pardas dentro de su cuerpo, puede facilitar la pérdida de peso. Cuanta más grasa marrón tenga, más calorías quemará su cuerpo.

cAMP Boost contiene una especia africana que supuestamente "destruye" el tejido graso blanco dentro de su cuerpo. Aquí & rsquos cómo Nutraville explica los efectos de ese ingrediente:

& ldquoMe gusta pensar en ello como asar un malvavisco sobre un fuego crepitante porque hay una cierta especia africana caliente que & ldquotoast & rdquo tejido graso blanco & # 8230 Y nosotros & rsquove agregamos esto a nuestra fórmula cAMP Boost para ayudar literalmente a transformar la grasa corporal obstinada en esta grasa que adelgaza el cuerpo que remodela tu figura y te da toneladas de energía. & rdquo

Este ingrediente y otros ingredientes dentro de cAMP Boost pueden supuestamente reactivar esta grasa marrón que quema grasa, lo que facilita la pérdida de peso.

¿Cuánto peso puede perder con cAMP Boost?

Según Nutraville, puedes despertarte luciendo más delgado, más joven y más sexy en el espejo cada mañana. En lugar de comenzar cada día frustrado por su progreso en la pérdida de peso, puede despertarse sintiéndose motivado.

Aquí & rsquos cuánto peso puede perder, según el sitio web c-AMPBoost.com:

& ldquoYou & rsquoll repentinamente pierde 10, 20, incluso 30 libras o más de grasa corporal pesada y fea y sorprende a su familia con una transformación alucinante que en realidad fue bastante fácil & # 8230Vuelva a subir su par de jeans favoritos más allá de sus muslos & # 8230 y mire bootylicious (de una manera sexy).& rdquo

Otras afirmaciones de pérdida de peso realizadas en la página de ventas de cAMP Boost incluyen:

En un estudio sobre un ingrediente dentro de cAMP Boost, los participantes perdieron hasta un 677% más de grasa corporal que el grupo placebo & # 8211 simplemente tomando un suplemento inhibidor de PDE-4

En otro estudio, los participantes perdieron grasa 6 veces más rápido que el grupo de placebo mientras perdían el 5,53% de su grasa corporal después de solo 4 semanas, reduciendo un total del 15,6% de su grasa corporal después de 12 semanas, los investigadores de este grupo tomaron un compuesto de fruta ácida que funciona. como inhibidor de PDE-4

En otro estudio, los investigadores encontraron que los participantes quemaban 180 calorías adicionales y, literalmente, sin esfuerzo, después de tomar uno de los ingredientes de cAMP Boost, los participantes de ese estudio perdieron el 63% de su masa grasa durante un período de 4 meses.

Una mujer presentada en el sitio web c-AMPBoost.com afirma que perdió 22 libras de grasa corporal después de 8 semanas mientras tomaba cAMP Boost, o alrededor de 2,5 a 3,5 libras por semana.

Algunas píldoras para adelgazar hacen afirmaciones poco realistas sobre la pérdida de peso, lo que sugiere que puede perder 50 libras en un mes sin hacer dieta ni hacer ejercicio. El sitio web de cAMP Boost es más realista, y cita estudios científicos, investigaciones revisadas por pares y experiencias reales de los clientes. Al igual que otras píldoras para adelgazar, cAMP Boost debe complementar la dieta saludable y los hábitos de ejercicio y no reemplazarlos.

Ingredientes de cAMP Boost

cAMP Boost utiliza Sinetrol y otros ingredientes para ayudarlo a perder peso. Algunos de estos ingredientes inhiben la PDE-4. Otros ingredientes aumentan la señalización de cAMP. Juntos, estos efectos pueden ayudarlo a quemar más grasa las 24 horas del día.

Estos son los ingredientes de cAMP Boost y cómo funcionan, según Nutraville:

Sinetrol

Sinetrol es una fórmula patentada que se enfoca en la causa raíz de la grasa abdominal rebelde: la enzima llamada PDE-4. Esta enzima bloquea la actividad quemagrasa del AMPc, lo que dificulta la pérdida de peso. Sinetrol se ha estudiado por sus beneficios para la pérdida de peso, y múltiples estudios han demostrado que Sinetrol puede tener efectos poderosos sobre la pérdida de peso.

Granos del paraíso

Granos del paraíso es una hierba originaria del sur de Etiopía. Esta es la "especia africana caliente" mencionada en la sección de grasa parda anterior. Según Nutraville, los granos del paraíso pueden activar la grasa marrón dentro de su cuerpo. La grasa marrón quema más energía que la grasa blanca. Al convertir su grasa blanca en grasa marrón, los granos del paraíso supuestamente pueden tener efectos poderosos sobre la pérdida de peso. Los participantes que tomaron granos del paraíso quemaron 100 calorías por día más que un grupo de placebo en un estudio.

Semilla de guaraná

cAMP Boost también contiene semilla de guaraná, un extracto natural vinculado a la pérdida de peso en múltiples estudios. En un estudio, los participantes que tomaron semillas de guaraná perdieron 16,3 libras y el 5,1% de su grasa corporal durante un período de 8 semanas. El guaraná parece funcionar ayudándote a quemar más calorías, lo que conduce a una "pérdida rápida y segura de grasa", según Nutraville.

Extracto de pomelo

cAMP Boost contiene extracto de toronja, una superfruta ácida popular para bajar de peso. El Dr. Oz elogió recientemente los beneficios de pérdida de peso de la toronja y rsquos, afirmando que este ingrediente está de vuelta para la pérdida de peso y mejor que nunca. Según Nutraville, el extracto de toronja ayuda a controlar el peso corporal al aumentar las señales de AMPc enviadas a las células, creando una grasa segura y rápida. pérdida. En un estudio, los participantes que tomaron extracto de pomelo perdieron un 333% más de peso que el grupo de placebo.

Bioperina

El ingrediente final de cAMP Boost es Bioperine, un tipo especial de extracto de pimienta negra. Nutraville agregó este ingrediente para mejorar la absorción y biodisponibilidad de otros ingredientes en cAMP Boost. Según Nutraville, Bioperine & ldquoworks como un escudo alrededor de cada ingrediente, & rdquo ayudando a cada ingrediente a brindar sus máximos beneficios a su cuerpo.

La historia detrás de cAMP Boost

cAMP Boost fue creado por Carly Johnson, una esposa y madre que estaba frustrada con su aumento de peso. El marido de Carly & rsquos la dejó por una mujer más delgada. Esa mujer más tarde se burló del peso de Carly y le enseñó a su hijo a llamar gorda a Carly.

Humillada y molesta, Carly decidió actuar. Comenzó a investigar curas naturales para bajar de peso. Sintió que hizo todo bien, incluida la dieta y el ejercicio, pero no estaba perdiendo peso.

Finalmente, Carly se topó con los inhibidores de PDE-4 y los ingredientes anteriores. Se asoció con su amigo, John, para crear los ingredientes en forma de suplemento. Después de tomar la fórmula, Carly perdió 22 libras en 8 semanas.

Motivada por su éxito en la pérdida de peso, Carly decidió vender el suplemento en línea en forma de cAMP Boost.

Carly tiene cuidado de explicar que no es médico ni nutricionista: es solo una mujer normal que decidió crear un suplemento para bajar de peso. Hoy en día, cualquiera puede comprar cAMP Boost en línea a través del sitio web oficial, y potencialmente disfrutar de resultados de pérdida de peso similares a los de Carly.

Etiqueta de ingredientes de cAMP Boost

Nutraville publica su lista completa de ingredientes y dosis por adelantado, lo que facilita la comparación del suplemento con estudios científicos y compite por ayudas para la pérdida de peso.

  • 450 mg de extracto de pomelo, extracto de semilla de guaraná, extracto de cítrico Sinensis y concentrado de naranja sanguina (en forma de Sinetrol Xpur)
  • 40 mg de extracto de granos del paraíso (en forma de CaloriBurn)
  • 5 mg de extracto de pimienta negra (en forma de Bioperine)
  • Otros ingredientes, que incluyen celulosa vegetal, dióxido de titanio, polvo de arroz, estearato de magnesio y dióxido de silicio.

Evidencia científica de cAMP Boost

Nutraville afirma que todos los ingredientes de cAMP Boost & ldquo han sido probados en estudios para ser seguros y efectivos. & Rdquo La compañía cita docenas de estudios en c-AMPBoost.com que respaldan sus beneficios anunciados.

En este estudio de 2006, por ejemplo, los investigadores discutieron los efectos de los inhibidores de la fosfodiesterasa (PDE). Las fosfodiesterasas son una familia diversa de enzimas que desempeñan un papel clave en la regulación de los niveles intracelulares de los segundos mensajeros cAMP y cGMP, lo que hace que las PDE sean cruciales para la función celular. Hay tres tipos principales de inhibidores de la PDE, incluidos los inhibidores de la PDE-3 (para la insuficiencia cardíaca congestiva), los inhibidores de la PDE-4 (para la enfermedad inflamatoria de las vías respiratorias) y los inhibidores de la PDE-5 (para la disfunción eréctil).

También es cierto que la actividad de la PDE-4 disminuye con la edad. En este estudio de 2016, los investigadores observaron diferencias relacionadas con la edad en la actividad de la PDE, lo que provocó cambios notables en la señalización celular. Los investigadores estaban analizando los efectos sobre la salud cardiovascular de esta actividad PDE-4 y no los efectos de pérdida de peso. Sin embargo, es cierto que la actividad de la PDE-4 cambia con la edad.

Uno de los ingredientes más importantes dentro de cAMP Boost es Sinetrol. Sinetrol es una mezcla patentada de extractos de cítricos respaldada por múltiples ensayos clínicos. Como se explica en Sinetrol.com, se ha demostrado que el compuesto mejora la composición corporal y la pérdida de grasa en tres ensayos clínicos. En un estudio en el que participaron 77 sujetos con sobrepeso y obesidad, los sujetos redujeron un promedio del 63% de su exceso de masa corporal grasa. y quemó 180 calorías adicionales por día después de tomar Sinetrol. Los sujetos también ganaron significativamente masa magra, lo que llevó a una composición corporal más saludable.

También es cierto que la grasa parda es más metabólicamente activa que la grasa blanca, lo que posiblemente le ayude a quemar más calorías en reposo. Como se explica en este estudio de 2009 publicado en Diabetes, el tejido adiposo pardo metabólicamente activo (grasa parda) contribuye al gasto energético. De hecho, la grasa parda es un mecanismo de supervivencia. Disipa la energía en forma de calor e influye en el gasto energético diario, lo que la hace valiosa para la pérdida de peso.

cAMP Boost contiene una forma patentada de extracto de granos del paraíso llamado CaloriBurn. Como puede adivinar por el nombre, CaloriBurn está diseñado específicamente para mejorar los efectos quemagrasas de los granos del paraíso. En este estudio de 2014, los investigadores dieron granos del paraíso a los participantes durante un período de 4 semanas. Aunque los investigadores no observaron una pérdida de peso significativa en comparación con un placebo, los investigadores encontraron que los granos del paraíso aumentaron el gasto energético de todo el cuerpo. Con base en estos resultados, los investigadores concluyeron que el extracto de granos del paraíso puede ser una herramienta eficaz y segura para reducir la grasa corporal. Los participantes tomaron 30 mg de extracto de granos del paraíso por día, que es un poco menos que los 40 mg de extracto de granos del paraíso en cada cápsula de cAMP Boost.

En general, cAMP Boost contiene ingredientes y dosis que han demostrado ayudar con la pérdida de peso. Aunque Nutraville no ha completado ensayos clínicos específicamente sobre cAMP Boost, la compañía se ha vinculado a muchos estudios que demuestran que los ingredientes de cAMP Boost pueden ayudarlo a perder peso.

Precios de cAMP Boost

cAMP Boost tiene un precio de $ 67 por botella, aunque el precio cae tan bajo como $ 41 por botella cuando se piden varias unidades.

  • 1 botella: $ 67 + $ 9.95 de envío
  • 3 botellas: $ 171 + envío gratis
  • 6 botellas: $ 246 + envío gratis

Cada frasco contiene un suministro para 30 días (60 cápsulas). Toma una cápsula dos veces al día para inhibir la PDE-4, activar el cAMP y perder peso.

Política de reembolso de cAMP Boost

Puede solicitar un reembolso completo de su compra (menos los costos de envío originales) dentro de los 365 días posteriores a la fecha de compra original.

Si no perdió una cantidad significativa de peso mientras tomaba cAMP Boost, o si no está satisfecho con los resultados del suplemento por cualquier motivo, puede solicitar un reembolso completo sin preguntas y sin problemas.

Sobre Nutraville

cAMP Boost es elaborado por una compañía de suplementos nutricionales llamada Nutraville. Nutraville tiene su sede en Valencia, California. La compañía fabrica tres suplementos, incluidos Amyl Guard, Gluta Raise y cAMP Boost.


Materiales y métodos

Expresión y purificación de proteínas

Se clonó una secuencia de ADN que codifica la PKG humana I & # x003b2 (92 & # x02013227) en pQTEV [33]. La proteína se produjo en BL21 (DE3) E. coli que se cultivaron a 37 & # x000b0C hasta OD600 de 0,6 y luego se indujo con IPTG 0,4 mM. Los cultivos se hicieron crecer durante 18 horas más a 18 ° C. Las células se suspendieron en Tris 50 mM, NaCl 150 mM, DTT 1 mM (pH 7,9) y se lisaron usando un disruptor celular (Constant Systems). Se purificó PKG I & # x003b2 (92 & # x02013227) marcada con His con una resina BioRad IMAC en un sistema de purificación Bio-Rad Profinia & # x02122. La proteína se eluyó con tampón de suspensión celular que contenía imidazol 250 mM. La muestra se incubó con 1,0 mg / ml de proteasa TEV a 4 ° C durante 48 horas para eliminar la etiqueta His. La proteína se purificó adicionalmente con Q sepharose HP seguido de filtración en gel en una columna Hi-load 16/60 Superdex-75 (GE Healthcare) en Tris-HCl 25 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM y TCEP-HCl 1 mM.

Cristalización

Para la cristalización de los cristales de apo parcial, la muestra de proteína se concentró a 20 mg / ml usando un Amicon Ultra de corte de 10 kDa (Millipore). Los cristales de apo parcial se obtuvieron usando el método de difusión de vapor en fosfato de sodio / potasio 1,4 M (pH 5,6) a 22 ° C. La optimización del cristal se realizó utilizando un robot Orxy6 & # x02122 (Douglas Instruments LTD). Los cristales bipiramidales aparecieron en fosfato de sodio / potasio 1,4 M (pH 8,1) a 22 ° C en 2 días. La cocristalización con cGMP se logró añadiendo cGMP (Aral Biosynthetics) a una concentración final de 5 mM a la muestra de proteína purificada, que luego se concentró a 33 mg / ml usando un Amicon Ultra de corte de 10 kDa (Millipore). Los cristales del complejo PKG I & # x003b2: cGMP se obtuvieron usando el método de difusión de vapor en malonato de sodio 0,1 M (pH 5,0), 12 & # x00025 PEG 3350 a 4 & # x000b0C. De manera similar, la cocristalización con AMPc se logró añadiendo AMPc a una concentración final de 5 mM a la muestra de proteína, que se concentró con un límite de 10 kDa Amicon Ultra (Millipore) a 17 mg / ml. Los cristales del complejo PKG I & # x003b2: cAMP se obtuvieron usando el método de difusión de vapor en fosfato de sodio / potasio 1,4 M (pH 5,6) a 4 & # x000b0C.

Todos los cristales se transfirieron a una solución crioprotectora (glicerol al 25%) y se enfriaron instantáneamente en nitrógeno líquido. Los datos de difracción de rayos X se recopilaron en la línea de luz 8.2.1 (Advanced Light Source, Berkeley, CA, EE. UU.). Los datos de difracción se procesaron y escalaron utilizando HKL2000, lo que resultó en un conjunto de datos aceptable con estadísticas resumidas satisfactorias (Tabla 1).

La estructura cristalina de PKG I & # x003b2 (92 & # x02013227): cAMP se determinó por reemplazo molecular usando un modelo truncado de PKA RI & # x003b1 (91 & # x02013379) (PDB: 1RGS) como sonda de reemplazo molecular [8]. Las fases posteriores, la modificación de la densidad y la construcción del modelo se llevaron a cabo con phenix.autosol [34]. El modelo resultante se completó manualmente en Coot [35] y el refinamiento de la estructura restringida implementando el refinamiento de TLS [36] resultó en el modelo cAMP con Rtrabaja y Rgratis de 20,6 & # x00025 y 23,0 & # x00025 respectivamente. Refinamiento del 2.9 & # x000c5 PKG I & # x003b2 (92 & # x02013227): el complejo cGMP se llevó a cabo en PHENIX (dev-403) [10] utilizando restricciones diedras de referencia derivadas del complejo cAMP de mayor resolución, como se describe en la siguiente sección . El uso del modelo de referencia de mayor resolución en el refinamiento mejoró los valores libres de R y R, así como los criterios de validación de MolProbity, dando como resultado un modelo final con Rtrabaja y Rgratis de 20,4 & # x00025 y 26,0 & # x00025, respectivamente [37]. Para todos los Fo-Fc omitir mapas que se muestran en las figuras, generamos mapas de omisión de recocido simulado, omitiendo una región con un borde de 2 & # x000c5 alrededor de cada ligando como se describe en Terwilliger et al. [38].

Refinamiento del modelo de referencia en phenix.refine

Para mejorar la estabilidad del refinamiento y la calidad del modelo asociado en el refinamiento de baja resolución, las estructuras cGMP y apo parcial se refinaron con phenix.refine utilizando restricciones diedras obtenidas a partir de la estructura PKG I & # x003b2: cAMP de mayor resolución. Las restricciones diedras obtenidas del modelo de referencia se impusieron en el modelo de trabajo si la desviación angular absoluta caía dentro de un umbral definido por el usuario. Para este refinamiento, se utilizó un valor umbral de 15 & # x000b0. Estas restricciones sirvieron para dirigir la topología general del modelo y evitar un sesgo injustificado hacia el modelo de alta resolución. El esquema de refinamiento es similar en concepto a las restricciones de simetría no cristalográficas adoptadas en SHELXL y al enfoque de red elástica deformable presentado en la siguiente referencia [39].

Calorimetría de titulación isotérmica

Para eliminar el cAMP residual, todas las muestras se desnaturalizaron incubando en guanidina HCl 6 M durante 24 horas a 4 ° C, luego se renaturalizaron mediante diálisis escalonada contra primero 2 M y luego 0,5 M de guanidina HCl durante 48 h. A continuación, las muestras se purificaron en Tris 10 mM (pH 8,0) y NaCl 150 mM en una columna Hi-load 16/60 Superdex 75 (GE Healthcare). Las mediciones calorimétricas de cAMP y de la unión de cGMP a PKG I & # x003b2 (92 & # x02013227) se llevaron a cabo usando un calorímetro VP-ITC (MicroCal LLC, Northampton, MA). La proteína se colocó en la celda de muestra a una concentración de 15 & # x000b5M en el tampón de columna. Se colocaron nucleótidos cíclicos en la jeringa de inyección a una concentración de 250 & # x000b5M. El volumen de inyección fue de 5 & # x003bcl. Los datos se procesaron utilizando el software Origin con una subrutina ITC de complemento personalizado proporcionada por el fabricante. Los resultados informados se repitieron al menos por duplicado.

Códigos de acceso al banco de datos de proteínas

Las coordenadas para las estructuras descritas en este documento se han depositado en el Protein Data Bank con los códigos de acceso 3OD0, 3OCP y 3OGJ para PKG I & # x003b2: cGMP, PKG I & # x003b2: cAMP y las estructuras de apo parcial, respectivamente.


Papel y funciones de los segundos mensajeros | Farmacodinamia

Después de leer este artículo, aprenderá sobre el papel y las funciones de los segundos mensajeros.

Muchas hormonas, neurotransmisores, autacoides y fármacos actúan sobre receptores de membrana específicos, cuya consecuencia inmediata es la activación de un componente citoplasmático del receptor, que puede ser una enzima como la adenilato ciclasa, la guanilato ciclasa o la activación de un sistema de transporte o la apertura de un canal de iones.

Estos componentes citoplasmáticos que transmiten el estímulo de los receptores se conocen como segundos mensajeros, siendo el primer mensajero el propio receptor. Ejemplos de segundos mensajeros son -cAMP, cGMP, ca 2+, proteínas G, IP3, DAG, etc.

El papel de cAMP como segundo mensajero fue revelado por primera vez por el trabajo de Sutherland a finales de 1950 & # 8217s. Este descubrimiento derribó las barreras que existían entre la bioquímica y la farmacología. El AMPc es un nucleótido sintetizado dentro de la célula a partir del ATP por la acción de la adenilato ciclasa en respuesta a la activación de muchos receptores. Se inactiva por hidrólisis a 5 & # 8242-AMP, por la acción de la enzima fosfodiesterasa.

El AMPc tiene diversos efectos reguladores sobre las funciones celulares, por ejemplo, el metabolismo energético, la división celular y la diferenciación celular, el transporte de iones, la función de los canales de iones, la contractilidad del músculo liso, etc. varias proteína quinasas por AMPc.

Muchos fármacos diferentes, hormonas de neurotransmisores, producen sus efectos aumentando o disminuyendo la actividad catalítica de la adenilato ciclasa y, por lo tanto, disminuyendo o aumentando la concentración de AMPc dentro de la célula. Los niveles de AMPc en la célula también pueden elevarse inhibiendo la enzima metabolizadora fosfodiesterasa.

El monofosfato de guanosina cíclico es otro mensajero intercelular sintetizado por la enzima guanilato ciclasa de GTP. Se ha identificado en células cardíacas, células de músculo liso bronquial y otros tejidos. Para la mayoría de los efectos producidos, el cAMP parece ser estimulante mientras que el cGMP parece ser de naturaleza inhibidora.

Cuando los sistemas cAMP y cGMP están presentes en una sola célula o tejido, están vinculados a receptores a través de los cuales los fármacos producen efectos opuestos. Por ejemplo, en las células del tejido cardíaco, los adrenorreceptores β aumentan la frecuencia y la fuerza de contracción al aumentar los niveles de cAMP, mientras que los receptores colinérgicos tienen un efecto opuesto al aumentar los niveles de cGMP.

La IP3 y el sistema DAG es otro importante sistema de segundo mensajero intracelular, y fue identificado por primera vez por Michell en 1975. Ambos son productos de degradación de los fosfolípidos de membrana por una enzima fosfolipasa C. IP3 actúa de forma muy eficaz para liberar calcio de las reservas intracelulares.Se sabe que este Ca 2+ regula la función de varias enzimas, proteínas contráctiles y canales iónicos.

DAG activa directamente la proteína quinasa C y controla la fosforilación de los aminoácidos de una variedad de proteínas intracelulares. Esto provoca la liberación de hormonas de las glándulas endocrinas o modula la liberación del transmisor neurológico y tímido o modula la contractibilidad del músculo liso o las respuestas inflamatorias o el transporte de iones o la promoción de tumores, etc. Existen al menos seis tipos diferentes de PKC distribuidos de manera desigual en diferentes células.

Activación de otras enzimas fosfolipasa A2 conduce a la producción de ácido araquidónico a partir de los fosfolípidos de la membrana, que luego se descomponen en prostaglandinas, leucotrienos, tromboxanos, etc.

Son bien conocidos por su papel como hormonas locales, pero es interesante que recientemente se haya demostrado que el ácido araquidónico y sus metabolitos funcionan como mensajeros intracelulares, controlando la función de los canales de potasio en ciertas neuronas.

Los iones de calcio son de gran importancia entre muchos otros segundos mensajeros intracelulares. Muchas acciones reguladoras están mediadas por Ca 2+ unido a su proteína reguladora intracelular, calmodulina. Los iones Ca 2+ también participan en la liberación de ácido araquidónico de los fosfolípidos de membrana por las fosfolipasas activadas y así inician la síntesis de prostaglandinas y leucotrienos. Se ha demostrado que el Ca 2+ en sinergia con la PKC activa la función celular como la glucogenólisis de los hepatocitos, la liberación de insulina del páncreas. El Ca 2+ también juega un papel importante en la contracción y relajación de los músculos esqueléticos y lisos del cuerpo.

Las proteínas G representan el nivel de gestión media en la organización celular y son capaces de comunicarse entre los receptores y las enzimas efectoras o canales iónicos. Se denominaron proteínas G debido a su interacción con los nucleótidos de guanina, GTP y GDP.

Las proteínas G están unidas a la superficie citoplásmica de la membrana plasmática. Son moléculas heterotriméricas que constan de 3 subunidades α, β y γ (fig. 3.10). Su clasificación como estimulante o inhibitoria se basa en la identidad de su subunidad α distinta.

Las subunidades β y γ permanecen asociadas como un complejo β γ con la superficie citoplásmica de la membrana cuando el sistema está inactivo o en estado de reposo, el GDP se une a la subunidad α.

Siempre que un agonista interactúa con el receptor, esto facilita la unión de GTP a la subunidad α y promueve la disociación de GDP de su lugar. La unión de GTP activa la subunidad α y luego se cree que α-GTP se disocia de β e interactúa con un efector unido a la membrana.

El proceso finaliza cuando se produce la hidrólisis de GTP a GDP a través de la actividad GTpasa de la subunidad α. El α-GDP resultante luego se disocia del efector y se reúne con β γ completando el ciclo de respuesta. La unión de la subunidad a una molécula efectora en realidad aumenta su actividad GTpasa, la magnitud de este aumento varía para diferentes tipos de efector.

Los mecanismos de este tipo en general dan como resultado la amplificación porque un solo complejo receptor agonista puede activar varias moléculas de proteína G a su vez, y cada una de ellas puede permanecer asociada con la enzima efectora durante el tiempo suficiente para producir muchas moléculas de producto.

El producto es a menudo un segundo mensajero y se produce una mayor amplificación antes de que se produzca la respuesta celular final. Es la adaptación biológica de un organismo para el uso juicioso de sus sustancias transmisoras.

Las proteínas G no son todas idénticas, la subunidad α en particular muestra variabilidad. Se cree que hay tres variedades principales de proteína G, a saber. GRAMOs, GI y Gq. GRAMOs y Gi producen respectivamente estimulación e inhibición del sistema efector (fig. 3.11). No es inusual que varios receptores en una célula individual activen una sola proteína G y un solo receptor que regula más de una proteína G.


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