Información

¿Por qué CRISPR / Cas9 solo muestra indirectamente la actividad de dsDNA nucleasa?

¿Por qué CRISPR / Cas9 solo muestra indirectamente la actividad de dsDNA nucleasa?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

En Jinek et al., Los autores muestran la actividad nucleasa de su sistema CRISPR / Cas9 utilizando el llamado Ensayo de topógrafo método. Este ensayo reconoce pequeños desajustes en el dsDNA que se introducen por uniones de extremos no homólogos propensos a errores después de que algún agente extraño (como Cas9) haya introducido roturas del dsDNA. Luego, el ensayo Surveyor rompe el ADN en los puntos en los que reconoce los desajustes. Los fragmentos de ADN recién rotos se pueden analizar y, por lo tanto, se puede identificar la posición de la rotura inicial dependiente de Cas9.

Mi pregunta es: para la demostración directa de la actividad de Cas9 en la posición programada, ¿por qué no primero silenciar los mecanismos de reparación de unión de extremos no homólogos en la célula y luego analizar directamente el lisado? ¿Es esto técnicamente imposible? ¿O no se hace para no introducir otro cambio en la celda para el que no habría control?


Edición del genoma: una perspectiva sobre la aplicación de CRISPR / Cas9 para estudiar enfermedades humanas (Revisión)

1 Universidad Aut & # x000f3noma de Nuevo Le & # x000f3n, Departamento de Bioquímica y Medicina Molecular, Facultad de Medicina y Hospital Universitario & # x02018Dr. Jos & # x000e9 E. Gonz & # x000e1lez & # x02019, Monterrey, Nuevo Le & # x000f3n 64460, M & # x000e9xico

Ramiro Ram & # x000edrez-Sol & # x000eds

2 Laboratorios centrales institucionales, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en San Antonio, San Antonio, TX, EE. UU.

Mario Alberto Garza-Elizondo

3 Universidad Aut & # x000f3noma de Nuevo Le & # x000f3n, Servicio de Reumatología, Facultad de Medicina y Hospital Universitario & # x02018Dr. Jos & # x000e9 E. Gonz & # x000e1lez & # x02019, Monterrey, Nuevo Le & # x000f3n 64460

Mar & # x000eda De Lourdes Garza-Rodr & # x000edguez

1 Universidad Aut & # x000f3noma de Nuevo Le & # x000f3n, Departamento de Bioquímica y Medicina Molecular, Facultad de Medicina y Hospital Universitario & # x02018Dr. Jos & # x000e9 E. Gonz & # x000e1lez & # x02019, Monterrey, Nuevo Le & # x000f3n 64460, M & # x000e9xico

Hugo Alberto Barrera-Salda & # x000f1a

1 Universidad Aut & # x000f3noma de Nuevo Le & # x000f3n, Departamento de Bioquímica y Medicina Molecular, Facultad de Medicina y Hospital Universitario & # x02018Dr. Jos & # x000e9 E. Gonz & # x000e1lez & # x02019, Monterrey, Nuevo Le & # x000f3n 64460, M & # x000e9xico

4 Vitag & # x000e9nesis, SA de CV, Monterrey, Nuevo Le & # x000f3n 64630

5 Tecnológico de Monterrey, Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Monterrey, Nuevo Le & # x000f3n 64710, M & # x000e9xico


Fondo

Las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) es el sistema inmunológico adaptativo bacteriano para defender las infecciones por bacteriófagos [1, 2, 3]. Durante la infección, el ADN invasor se captura e integra en el genoma bacteriano como una matriz CRISPR. Las secuencias de la matriz CRISPR se transcriben y procesan en ARN CRISPR (ARNcr), que dirigen las proteínas asociadas a CRISPR (Cas) a ácidos nucleicos extraños [1, 2]. Los sistemas CRISPR-Cas de tipo II funcionan con componentes optimizados que comprenden una sola proteína nucleasa como Cas9 [4]. Las características modulares y programables hacen de CRISPR-Cas9 una de las herramientas más utilizadas para aplicaciones de ingeniería del genoma [5,6,7,8]. Sin embargo, CRISPR-Cas9 se asocia con escisión fuera del objetivo [9], reordenamiento cromosómico [10] y genotoxicidad [11]. Estos efectos secundarios surgen principalmente de la expresión excesiva o prolongada de CRISPR-Cas9 [12,13,14]. Como agente terapéutico, CRISPR-Cas9 se expresa a menudo de forma constitutiva en las células huésped [15], lo que hace que la actividad inactiva elevada sea un problema de seguridad importante. El control temporal de la actividad de SpCas9 se ha investigado como un enfoque para mejorar su especificidad en células humanas. Las tecnologías que permiten el control temporal de CRISPR-Cas9 incluyen herramientas optogenéticas, sistema de empalme de inteína, inductores o inhibidores de moléculas pequeñas [16,17,18,19,20] y proteínas anti-CRISPR (Acrs) [21, 22].

Los inhibidores de CRISPR-Cas más investigados son los Acrs derivados de fagos de origen natural. Los bacteriófagos pueden utilizar Acrs para antagonizar la inmunidad CRISPR-Cas en bacterias [23, 24]. Se han identificado varios Acrs para sistemas CRISPR-Cas tipo I [23, 25,26,27,28], tipo II [29,30,31,32] y tipo V [28, 33]. Acrs se puede adaptar para regular las actividades de CRISPR-Cas en bacterias [34], levaduras [35] y células de mamíferos [29, 31, 34, 36,37,38]. Biosensor [39] y circuitos sintéticos [40] pueden diseñarse basados ​​en sistemas CRISPR-Cas acoplados a Acr. Además, Acrs se puede aprovechar para permitir el control de la actividad CRISPR-Cas sensible a la temperatura [41] y optogenético [42]. Es importante destacar que Acrs puede mejorar la edición [38] y las especificidades del tipo de célula [43] y reducir la citotoxicidad [11] de la edición del genoma mediada por CRISPR-Cas. También se ha informado de que Acrs puede facilitar la producción de vectores virales portadores de CRISPR al restringir la auto-escisión de CRISPR [44].

Los Acrs actualmente conocidos inhiben los sistemas CRISPR-Cas al interferir con la vigilancia o división del ADN mediada por proteínas Cas [21]. Por ejemplo, AcrIIA4 imita el ADN bicatenario (dsDNA) y ocupa el sitio de reconocimiento del motivo adyacente protospacer (PAM) de SpCas9, evitando así que la proteína Cas9 se una al ADN diana [38, 45, 46]. Usando un mecanismo diferente, AcrIIC3 perturba la unión del ADN induciendo la dimerización de la proteína Cas9 [36]. Una estrategia alternativa de inactivación de Cas por parte de Acrs es interactuar con proteínas Cas unidas al ADN y bloquear la posterior escisión del ADN, como se observa con AcrF3 [47, 48] y AcrIIC1 [36]. Además, algunos Acrs pueden funcionar como acetiltransferasa e inactivar la actividad CRISPR-Cas mediante modificaciones postraduccionales [49]. Diferentes Acrs pueden inactivar CRISPR-Cas a través de mecanismos idénticos mientras poseen similitudes de secuencia baja [21]. Los Acrs caracterizados hasta la fecha no comparten motivos de secuencia común, excepto por un elemento transcripcional putativo denominado genes anti-CRISPR asociados (Acas) que se encuentran comúnmente aguas abajo de los genes Acr en el genoma del bacteriófago [26]. La escasa comprensión de la relación secuencia-estructura-actividad dificulta en gran medida el descubrimiento sistémico de nuevos Acrs. Además de los inhibidores basados ​​en proteínas, se han desarrollado inhibidores CRISPR-Cas de molécula pequeña utilizando una plataforma de cribado de alto rendimiento [20]. Estas pequeñas moléculas son permeables a las células y pueden interrumpir a la inversa la interacción SpCas9-ADN, lo que permite el control temporal y de dosis de SpCas9. Sin embargo, se requieren concentraciones relativamente altas de 10 µM o más para que las moléculas pequeñas logren una inhibición eficaz [20].

Junto con pequeñas moléculas y proteínas, los péptidos representan una clase alternativa de agentes inhibidores de CRISPR con características bioquímicas distintas. En este estudio, informamos del descubrimiento de péptidos inactivadores de Cas9 de bacteriófagos inoviridae. En un intento de desarrollar anticuerpos anti-CRISPR utilizando tecnología de presentación de fagos bien establecida [50], nos sorprende encontrar que la cepa de bacteriófagos de laboratorio comúnmente utilizada M13 sirvió como fuente de agente inactivador de Cas9. Los análisis posteriores mostraron que el dominio periplásmico de la proteína de cubierta principal G8P (G8PPD) de varios bacteriófagos inoviridae, que contienen el fago M13, inhibieron la actividad in vitro e in vivo de SpCas9 de forma alostérica. Por lo tanto, nuestro estudio amplía la caja de herramientas del inhibidor para el control temporal de la actividad CRISPR-Cas.


Mecanismo Cas9

El paso clave en la edición del genoma de un organismo es el direccionamiento selectivo de una secuencia específica de ADN. Dos macromoléculas biológicas, la proteína Cas9 y el ARN guía, interactúan para formar un complejo que puede identificar secuencias diana con alta selectividad.

La proteína Cas9 es responsable de localizar y escindir el ADN diana, tanto en sistemas CRISPR / Cas naturales como artificiales. La proteína Cas9 tiene seis dominios, REC I, REC II, Bridge Helix, PAM Interacting, HNH y RuvC (Figura 1) (Jinek et al. 2014 Nishimasu et al. 2014).

El dominio Rec I es el más grande y es responsable de la unión del ARN guía. El papel del dominio REC II aún no se comprende bien. La hélice puente rica en arginina es crucial para iniciar la actividad de escisión tras la unión del ADN diana (Nishimasu et al. 2014). El dominio que interactúa con PAM confiere especificidad a PAM y, por lo tanto, es responsable de iniciar la unión al ADN diana (Anders et al. 2014 Jinek et al. 2014 Nishimasu et al. 2014 Sternberg et al. 2014). Los dominios HNH y RuvC son dominios nucleasa que cortan el ADN monocatenario. Son altamente homólogos a los dominios HNH y RuvC que se encuentran en otras proteínas (Jinek et al. 2014 Nishimasu et al. 2014).

Figura 1: Proteína Cas9. La proteína Cas9 se compone de seis dominios: Rec I, Rec II, Bridge Helix, RuvC, HNH y PAM Interacting. Los dominios se muestran en forma esquemática, cristalina y de mapa. (figura original) (imagen de cristal renderizada de PDB: 4CMP Jinek et al.2014).

La proteína Cas9 permanece inactiva en ausencia de ARN guía (Jinek et al. 2014). En los sistemas CRISPR diseñados, el ARN guía está compuesto por una sola hebra de ARN que forma una forma de T compuesta por un tetraloop y dos o tres bucles de tallo (Figura 2) (Jinek et al.2012 Nishimasu et al.2014). El ARN guía está diseñado para tener un extremo 5 & # 8242 que es complementario a la secuencia de ADN diana.

Figura 2: ARN guía diseñado. El ARN guía diseñado es una sola hebra de ARN. Forma un tetraloop y dos o tres bucles de vástago (se muestran tres). La región complementaria de destino se muestra en rojo. (figura original) (imagen de cristal renderizada de PDB: 4UN3 Anders et al.2014).

Este ARN guía artificial se une a la proteína Cas9 y, al unirse, induce un cambio conformacional en la proteína (Figura 3). El cambio conformacional convierte la proteína inactiva en su forma activa. El mecanismo del cambio conformacional no se comprende completamente, pero Jinek y sus colegas plantean la hipótesis de que las interacciones estéricas o la unión débil entre las cadenas laterales de proteínas y las bases de ARN pueden inducir el cambio (Jinek et al. 2014).

Figura 3: Activación de la proteína Cas9 mediante la unión de ARN guía. La unión del ARN guía induce un cambio conformacional en la proteína Cas9. El cambio conformacional provoca la activación de la actividad nucleasa Cas9 (Jinek et al. 2014). (figura original) (imagen de cristal renderizada de PDB: 4UN3 Anders et al.2014)

Una vez que se activa la proteína Cas9, busca estocásticamente el ADN diana uniéndose a secuencias que coinciden con su secuencia de motivo adyacente al protoespaciador (PAM) (Sternberg et al. 2014). Una PAM es una secuencia de dos o tres bases ubicada dentro de un nucleótido corriente abajo de la región complementaria al ARN guía. Los PAM se han identificado en todos los sistemas CRISPR, y los nucleótidos específicos que definen los PAM son específicos de la categoría particular de sistema CRISPR (Mojica et al. 2009). El PAM en Streptococcus pyogenes es 5 & # 8242-NGG-3 & # 8242 (Jinek et al. 2012). Cuando la proteína Cas9 encuentra una secuencia diana potencial con el PAM apropiado, la proteína derretirá las bases inmediatamente aguas arriba del PAM y las emparejará con la región complementaria en el ARN guía (Sternberg et al. 2014). Si la región complementaria y la región diana se emparejan correctamente, los dominios de nucleasa RuvC y HNH cortarán el ADN diana después de la tercera base de nucleótidos corriente arriba de la PAM (Anders et al. 2014) (Figura 4).

Figura 4: Unión y escisión del ADN diana por Cas9. 1) Cas9 escanea el ADN objetivo potencial para el PAM apropiado (estrellas amarillas). (2) Cuando la proteína encuentra el PAM, el complejo proteína: ARN guía derretirá las bases inmediatamente aguas arriba del PAM y las emparejará con la región complementaria diana en el ARN guía (Sternberg et al. 2014). (3) Si la región complementaria y la región diana se emparejan correctamente, los dominios RuvC y HNH cortarán el ADN diana después de la tercera base de nucleótidos corriente arriba de la PAM. (figura original) (imágenes de cristal: Inferior izquierda y derecha renderizadas de PDB: 4UN3 Anders et al.2014 Superior izquierda renderizada de PDB: 4CMP Jinek et al.2014)


Contenido

Secuencias repetidas Editar

El descubrimiento de repeticiones de ADN agrupadas se produjo de forma independiente en tres partes del mundo. La primera descripción de lo que luego se llamaría CRISPR es del investigador de la Universidad de Osaka Yoshizumi Ishino y sus colegas en 1987. Ellos clonaron accidentalmente parte de una secuencia CRISPR junto con el "gen iap " (conversión de isoenzimas de fosfatasa alcalina) del genoma de Escherichia coli [14] [15] ese era su objetivo. La organización de las repeticiones fue inusual. Las secuencias repetidas se organizan típicamente de forma consecutiva, sin secuencias diferentes intercaladas. [15] [11] No conocían la función de las repeticiones agrupadas interrumpidas.

En 1993, investigadores de Tuberculosis micobacteriana en los Países Bajos publicó dos artículos sobre un grupo de repeticiones directas interrumpidas (RD) en esa bacteria. Reconocieron la diversidad de las secuencias que intervienen en las repeticiones directas entre diferentes cepas de M. tuberculosis [16] y usé esta propiedad para diseñar un método de escritura que se denominó spoligotipado, que todavía está en uso hoy. [17] [18]

Francisco Mojica de la Universidad de Alicante en España estudió las repeticiones observadas en los organismos arqueales de Haloferax y Haloarcula especies y su función. El supervisor de Mojica supuso en ese momento que las repeticiones agrupadas tenían un papel en la segregación correcta del ADN replicado en las células hijas durante la división celular porque los plásmidos y cromosomas con matrices de repeticiones idénticas no podían coexistir en Haloferax volcanii. La transcripción de las repeticiones interrumpidas también se observó por primera vez, esta fue la primera caracterización completa de CRISPR. [18] [19] Para el año 2000, Mojica realizó un estudio de la literatura científica y uno de sus estudiantes realizó una búsqueda en genomas publicados con un programa diseñado por él mismo. Identificaron repeticiones interrumpidas en 20 especies de microbios como pertenecientes a la misma familia. [20] En 2001, Mojica y Ruud Jansen, que buscaban repeticiones interrumpidas adicionales, propusieron el acrónimo CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) para aliviar la confusión derivada de los numerosos acrónimos utilizados para describir las secuencias en la literatura científica. [19] [21] En 2002, Tang, et al. mostró evidencia de que CRISPR repite regiones del genoma de Archaeoglobus fulgidus se transcribieron en moléculas de ARN largas que posteriormente se procesaron en ARN pequeños de longitud unitaria, además de algunas formas más largas de 2, 3 o más unidades espaciadoras-repetidas. [22] [23]

En 2005, el investigador del yogur Rodolphe Barrangou, descubrió que Streptococcus thermophilus, después de desafíos iterativos de fagos, desarrolla una mayor resistencia a los fagos, y esta mayor resistencia se debe a la incorporación de secuencias espaciadoras CRISPR adicionales. [24] La empresa de alimentos danesa Danisco, para la que en ese momento trabajaba Barrangou, desarrolló una resistencia a los fagos S. thermophilus cepas para su uso en la producción de yogur. Más tarde, Danisco fue comprada por DuPont, que "posee alrededor del 50 por ciento del mercado mundial de cultivos lácteos" y la tecnología se generalizó. [25]

Sistemas asociados a CRISPR Editar

Una importante adición a la comprensión de CRISPR vino con la observación de Jansen de que el grupo de repeticiones de procariotas estaba acompañado por un conjunto de genes homólogos que componen los sistemas asociados a CRISPR o cas genes. Cuatro cas genescas 1-4) fueron reconocidos inicialmente. Las proteínas Cas mostraron motivos de helicasa y nucleasa, lo que sugiere un papel en la estructura dinámica de los loci CRISPR. [26] En esta publicación se utilizó el acrónimo CRISPR como el nombre universal de este patrón. Sin embargo, la función CRISPR siguió siendo enigmática.

En 2005, tres grupos de investigación independientes demostraron que algunos espaciadores CRISPR se derivan del ADN del fago y del ADN extracromosómico, como los plásmidos. [30] [31] [32] En efecto, los espaciadores son fragmentos de ADN recolectados de virus que previamente intentaron atacar la célula. La fuente de los espaciadores fue una señal de que el CRISPR /cas El sistema podría tener un papel en la inmunidad adaptativa de las bacterias. [27] [33] Los tres estudios que proponen esta idea fueron inicialmente rechazados por revistas de alto perfil, pero finalmente aparecieron en otras revistas. [34]

La primera publicación [31] que propone un papel de CRISPR-Cas en la inmunidad microbiana, de Mojica y colaboradores de la Universidad de Alicante, predijo un papel para la transcripción de ARN de espaciadores en el reconocimiento de blancos en un mecanismo que podría ser análogo a la interferencia del ARN. sistema utilizado por las células eucariotas. Koonin y sus colegas ampliaron esta hipótesis de interferencia de ARN al proponer mecanismos de acción para los diferentes subtipos CRISPR-Cas de acuerdo con la función predicha de sus proteínas. [35]

El trabajo experimental de varios grupos reveló los mecanismos básicos de la inmunidad CRISPR-Cas. En 2007, se publicó la primera evidencia experimental de que CRISPR era un sistema inmunológico adaptativo. [11] [4] Una región CRISPR en Streptococcus thermophilus espaciadores adquiridos del ADN de un bacteriófago infectante. Los investigadores manipularon la resistencia de S. thermophilus a diferentes tipos de fagos agregando y eliminando espaciadores cuya secuencia coincidía con las encontradas en los fagos probados. [36] [37] En 2008, Brouns y Van der Oost identificaron un complejo de proteínas Cas (llamado Cascade) que en E. coli cortar el precursor de ARN CRISPR dentro de las repeticiones en moléculas de ARN maduras que contienen espaciador llamadas ARN CRISPR (ARNcr), que permaneció unido al complejo proteico. [38] Además, se descubrió que se requería Cascade, crRNA y una helicasa / nucleasa (Cas3) para proporcionar a un huésped bacteriano inmunidad contra la infección por un virus de ADN. Al diseñar un CRISPR antivirus, demostraron que dos orientaciones del crRNA (sentido / antisentido) proporcionaban inmunidad, lo que indica que las guías del crRNA estaban dirigidas al dsDNA. Ese año Marraffini y Sontheimer confirmaron que una secuencia CRISPR de S. epidermidis ADN dirigido y no ARN para prevenir la conjugación. Este hallazgo estaba en desacuerdo con el mecanismo propuesto similar a la interferencia de ARN de la inmunidad CRISPR-Cas, aunque más tarde se encontró un sistema CRISPR-Cas que se dirige al ARN extraño en Pyrococcus furiosus. [11] [36] Un estudio de 2010 mostró que CRISPR-Cas corta ambas hebras de ADN de fago y plásmido en S. thermophilus. [39]

Cas9 Editar

Los investigadores estudiaron un sistema CRISPR más simple de Streptococcus pyogenes que se basa en la proteína Cas9. La endonucleasa Cas9 es un sistema de cuatro componentes que incluye dos moléculas pequeñas: crRNA y CRISPR RNA trans-activador (tracrRNA). [40] [41] Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier rediseñaron la endonucleasa Cas9 en un sistema de dos componentes más manejable fusionando las dos moléculas de ARN en un "ARN de guía única" que, cuando se combinaba con Cas9, podía encontrar y cortar el ADN diana especificado por el ARN guía. Esta contribución fue tan significativa que fue reconocida por el Premio Nobel de Química en 2020. Al manipular la secuencia de nucleótidos del ARN guía, el sistema artificial Cas9 podría programarse para apuntar a cualquier secuencia de ADN para la escisión. [42] Otro grupo de colaboradores que comprende Virginijus Šikšnys junto con Gasiūnas, Barrangou y Horvath mostró que Cas9 de la S. thermophilus El sistema CRISPR también se puede reprogramar para apuntar a un sitio de su elección cambiando la secuencia de su crRNA. Estos avances impulsaron los esfuerzos para editar genomas con el sistema CRISPR-Cas9 modificado. [18]

Los grupos dirigidos por Feng Zhang y George Church publicaron simultáneamente descripciones de la edición del genoma en cultivos de células humanas utilizando CRISPR-Cas9 por primera vez. [11] [43] [44] Desde entonces se ha utilizado en una amplia gama de organismos, incluida la levadura de panadería (Saccharomyces cerevisiae), [45] [46] [47] el patógeno oportunista Candida albicans, [48] [49] pez cebra (Danio rerio), [50] moscas de la fruta (Drosophila melanogaster), [51] [52] hormigas (Harpegnathos saltator [53] y Ooceraea biroi [54]), mosquitos (Aedes aegypti [55]), nematodos (Caenorhabditis elegans), [56] plantas, [57] ratones, [58] [59] monos [60] y embriones humanos. [61]

CRISPR se ha modificado para producir factores de transcripción programables que permiten a los científicos apuntar y activar o silenciar genes específicos. [62]

El sistema CRISPR-Cas9 ha demostrado realizar ediciones genéticas efectivas en cigotos tripronucleares humanos descritos por primera vez en un artículo de 2015 de los científicos chinos P. Liang e Y. Xu. El sistema realizó una escisión exitosa de la beta-hemoglobina mutante (HBB) en 28 de 54 embriones. 4 de los 28 embriones se recombinaron con éxito utilizando una plantilla de donante proporcionada por los científicos. Los científicos demostraron que durante la recombinación del ADN de la hebra escindida, la secuencia endógena homóloga HBD compite con la plantilla del donante exógeno. La reparación del ADN en embriones humanos es mucho más complicada y particular que en las células madre derivadas. [63]

Cas12a (anteriormente Cpf1) Editar

En 2015, la nucleasa Cas12a (antes conocida como Cpf1 [64]) se caracterizó en el sistema CRISPR / Cpf1 de la bacteria. Francisella novicida. [65] [66] Su nombre original, de una definición de familia de proteínas TIGRFAM construida en 2012, refleja la prevalencia de su subtipo CRISPR-Cas en el Prevotella y Francisella linajes. Cas12a mostró varias diferencias clave de Cas9, que incluyen: causar un corte 'escalonado' en el ADN de doble hebra en lugar del corte 'contundente' producido por Cas9, confiando en un PAM 'T rico' (que proporciona sitios de orientación alternativos a Cas9) y requiriendo solo un CRISPR RNA (crRNA) para una focalización exitosa. Por el contrario, Cas9 requiere tanto crRNA como un crRNA transactivante (tracrRNA).

Estas diferencias pueden dar a Cas12a algunas ventajas sobre Cas9. Por ejemplo, los crRNA pequeños de Cas12a son ideales para la edición del genoma multiplexado, ya que se pueden empaquetar más en un vector que los sgRNA de Cas9. Además, los salientes pegajosos 5 'que deja Cas12a se pueden usar para el ensamblaje de ADN que es mucho más específico de la diana que la clonación tradicional de enzimas de restricción. [67] Por último, Cas12a escinde el ADN de 18 a 23 pares de bases aguas abajo del sitio PAM. Esto significa que no hay interrupción de la secuencia de reconocimiento después de la reparación, por lo que Cas12a permite múltiples rondas de escisión del ADN. Por el contrario, dado que Cas9 corta solo 3 pares de bases corriente arriba del sitio PAM, la vía NHEJ da como resultado mutaciones indel que destruyen la secuencia de reconocimiento, evitando así más rondas de corte. En teoría, las rondas repetidas de escisión del ADN deberían aumentar la oportunidad de que se produzca la edición genómica deseada. [68] Una característica distintiva de Cas12a, en comparación con Cas9, es que después de cortar su objetivo, Cas12a permanece unido al objetivo y luego escinde otras moléculas de ssDNA de forma no discriminatoria. [69] Esta propiedad se denomina actividad de "escisión colateral" o "trans-escisión" y se ha aprovechado para el desarrollo de diversas tecnologías de diagnóstico. [70] [71]

Cas13 (anteriormente C2c2) Editar

En 2016, la nucleasa Cas13a (antes conocida como C2c2) de la bacteria Leptotrichia shahii Fue caracterizado. Cas13 es una endonucleasa de ARN guiada por ARN, lo que significa que no escinde el ADN, sino solo el ARN monocatenario. Cas13 es guiado por su crRNA a un objetivo de ssRNA y se une y escinde el objetivo. De manera similar a Cas12a, el Cas13 permanece unido al objetivo y luego escinde otras moléculas de ssRNA de forma no discriminatoria. [72] Esta propiedad de escisión colateral se ha aprovechado para el desarrollo de diversas tecnologías de diagnóstico. [73] [74] [75]

Repeticiones y espaciadores Editar

La matriz CRISPR se compone de una secuencia líder rica en AT seguida de repeticiones cortas que están separadas por espaciadores únicos. [76] Las repeticiones CRISPR suelen tener un tamaño de 28 a 37 pares de bases (bps), aunque puede haber tan solo 23 pb y hasta 55 pb. [77] Algunos muestran simetría de díadas, lo que implica la formación de una estructura secundaria como un tallo-bucle ('horquilla') en el ARN, mientras que otros están diseñados para no estar estructurados. El tamaño de los espaciadores en diferentes matrices CRISPR es típicamente de 32 a 38 pb (rango de 21 a 72 pb). [77] Pueden aparecer rápidamente nuevos espaciadores como parte de la respuesta inmunitaria a la infección por fagos. [78] Por lo general, hay menos de 50 unidades de la secuencia espaciadora repetida en una matriz CRISPR. [77]

Estructuras de ARN CRISPR Editar

Genes cas y subtipos de CRISPR Editar

Pequeños racimos de cas los genes se encuentran a menudo junto a las matrices de espaciadores repetidos CRISPR. Colectivamente los 93 cas los genes se agrupan en 35 familias basándose en la similitud de secuencia de las proteínas codificadas. 11 de las 35 familias forman el cas core, que incluye las familias de proteínas Cas1 a Cas9. Un locus CRISPR-Cas completo tiene al menos un gen que pertenece al cas centro. [79]

Los sistemas CRISPR-Cas se dividen en dos clases. Los sistemas de clase 1 utilizan un complejo de múltiples proteínas Cas para degradar los ácidos nucleicos extraños. Los sistemas de clase 2 utilizan una única proteína Cas grande para el mismo propósito. La clase 1 se divide en los tipos I, III y IV, la clase 2 se divide en los tipos II, V y VI. [80] Los 6 tipos de sistemas se dividen en 19 subtipos. [81] Cada tipo y la mayoría de los subtipos se caracterizan por un "gen característico" que se encuentra casi exclusivamente en la categoría. La clasificación también se basa en el complemento de cas genes que están presentes. La mayoría de los sistemas CRISPR-Cas tienen una proteína Cas1. La filogenia de las proteínas Cas1 generalmente concuerda con el sistema de clasificación. [79] Muchos organismos contienen múltiples sistemas CRISPR-Cas, lo que sugiere que son compatibles y pueden compartir componentes. [82] [83] La distribución esporádica de los subtipos CRISPR / Cas sugiere que el sistema CRISPR / Cas está sujeto a la transferencia horizontal de genes durante la evolución microbiana.

La inmunidad CRISPR-Cas es un proceso natural de bacterias y arqueas. [98] CRISPR-Cas previene la infección por bacteriófagos, la conjugación y la transformación natural al degradar los ácidos nucleicos extraños que ingresan a la célula. [36]

Adquisición de espaciadores Editar

Cuando un bacteriófago invade un microbio, la primera etapa de la respuesta inmune es capturar el ADN del fago e insertarlo en un locus CRISPR en forma de espaciador. Cas1 y Cas2 se encuentran en ambos tipos de sistemas inmunológicos CRISPR-Cas, lo que indica que están involucrados en la adquisición del espaciador. Los estudios de mutación confirmaron esta hipótesis, mostrando que la eliminación de cas1 o cas2 detuvo la adquisición del espaciador, sin afectar la respuesta inmune CRISPR. [99] [100] [101] [102] [103]

Se han caracterizado múltiples proteínas Cas1 y se han resuelto sus estructuras. [104] [105] [106] Las proteínas Cas1 tienen diversas secuencias de aminoácidos. Sin embargo, sus estructuras cristalinas son similares y todas las proteínas Cas1 purificadas son nucleasas / integrasas dependientes de metales que se unen al ADN de manera independiente de la secuencia. [82] Se han caracterizado proteínas Cas2 representativas y poseen actividad endoribonucleasa específica (monocatenario) ssRNA- [107] o (bicatenario) dsDNA- [108] [109].

En el sistema I-E de E. coli Cas1 y Cas2 forman un complejo donde un dímero Cas2 une dos dímeros Cas1. [110] En este complejo, Cas2 desempeña un papel de andamiaje no enzimático, [110] uniendo fragmentos bicatenarios de ADN invasor, mientras que Cas1 une los flancos monocatenarios del ADN y cataliza su integración en matrices CRISPR. [111] [112] [113] Por lo general, se agregan nuevos espaciadores al comienzo del CRISPR junto a la secuencia líder, lo que crea un registro cronológico de las infecciones virales. [114] En E. coli una proteína similar a una histona llamada factor de integración del huésped (IHF), que se une a la secuencia líder, es responsable de la precisión de esta integración. [115] IHF también mejora la eficiencia de integración en el sistema de tipo I-F de Pectobacterium atrosepticum. [116] pero en otros sistemas pueden ser necesarios diferentes factores de hospedaje [117]

Motivos adyacentes al protospacer Editar

El análisis bioinformático de regiones de genomas de fagos que se escindieron como espaciadores (denominados protoespaciadores) reveló que no se seleccionaron al azar, sino que se encontraron adyacentes a secuencias de ADN cortas (3-5 pb) denominadas motivos adyacentes protoespaciadores (PAM). El análisis de los sistemas CRISPR-Cas mostró que los PAM son importantes para los sistemas de tipo I y II, pero no los de tipo III durante la adquisición. [32] [118] [119] [120] [121] [122] En los sistemas tipo I y tipo II, los protoespaciadores se extirpan en posiciones adyacentes a una secuencia PAM, con el otro extremo del espaciador cortado utilizando un mecanismo de regla, manteniendo así la regularidad del tamaño del espaciador en la matriz CRISPR. [123] [124] La conservación de la secuencia PAM difiere entre los sistemas CRISPR-Cas y parece estar vinculada evolutivamente a Cas1 y la secuencia líder. [122] [125]

Los nuevos espaciadores se agregan a una matriz CRISPR de manera direccional, [30] ocurriendo preferentemente, [78] [118] [119] [126] [127] pero no exclusivamente, adyacentes [121] [124] a la secuencia líder. Análisis del sistema tipo I-E de E. coli demostró que se copia la primera repetición directa adyacente a la secuencia líder, con el espaciador recién adquirido insertado entre la primera y la segunda repeticiones directas. [102] [123]

La secuencia de PAM parece ser importante durante la inserción del espaciador en sistemas de tipo I-E. Esa secuencia contiene un nucleótido final fuertemente conservado (nt) adyacente al primer nt del protoespaciador. Este nt se convierte en la base final en la primera repetición directa. [103] [128] [129] Esto sugiere que la maquinaria de adquisición del espaciador genera voladizos monocatenarios en la penúltima posición de la repetición directa y en el PAM durante la inserción del espaciador. Sin embargo, no todos los sistemas CRISPR-Cas parecen compartir este mecanismo ya que las PAM en otros organismos no muestran el mismo nivel de conservación en la posición final. [125] Es probable que en esos sistemas, se genere un extremo romo al final de la repetición directa y el protoespaciador durante la adquisición.

Variantes de inserción Editar

Análisis de Sulfolobus solfataricus Los CRISPR revelaron más complejidades en el modelo canónico de inserción de espaciadores, ya que uno de sus seis loci CRISPR insertó nuevos espaciadores al azar en toda su matriz CRISPR, en lugar de insertarlos más cerca de la secuencia líder. [124]

Varios CRISPR contienen muchos espaciadores para el mismo fago. El mecanismo que causa este fenómeno fue descubierto en el sistema de tipo I-E de E. coli. Se detectó una mejora significativa en la adquisición del espaciador donde los espaciadores ya apuntan al fago, incluso los desajustes con el protoespaciador. Este "cebado" requiere que las proteínas Cas involucradas tanto en la adquisición como en la interferencia interactúen entre sí. Los espaciadores recién adquiridos que resultan del mecanismo de cebado siempre se encuentran en la misma hebra que el espaciador de cebado. [103] [128] [129] Esta observación llevó a la hipótesis de que la maquinaria de adquisición se desliza a lo largo del ADN extraño después de cebar para encontrar un nuevo protoespaciador. [129]

Biogénesis editar

CRISPR-RNA (crRNA), que luego guía la nucleasa Cas hacia el objetivo durante el paso de interferencia, debe generarse a partir de la secuencia CRISPR. El crRNA se transcribe inicialmente como parte de una única transcripción larga que abarca gran parte de la matriz CRISPR. [28] Esta transcripción es luego escindida por proteínas Cas para formar crRNAs. El mecanismo para producir crRNAs difiere entre los sistemas CRISPR / Cas. En los sistemas tipo I-E y tipo I-F, las proteínas Cas6e y Cas6f, respectivamente, reconocen los bucles de tallo [130] [131] [132] creados por el emparejamiento de repeticiones idénticas que flanquean el crRNA. [133] Estas proteínas Cas escinden la transcripción más larga en el borde de la región pareada, dejando un solo crRNA junto con un pequeño remanente de la región de repetición pareada.

Los sistemas de tipo III también usan Cas6, sin embargo, sus repeticiones no producen bucles de vástago. Cleavage instead occurs by the longer transcript wrapping around the Cas6 to allow cleavage just upstream of the repeat sequence. [134] [135] [136]

Type II systems lack the Cas6 gene and instead utilize RNaseIII for cleavage. Functional type II systems encode an extra small RNA that is complementary to the repeat sequence, known as a trans-activating crRNA (tracrRNA). [40] Transcription of the tracrRNA and the primary CRISPR transcript results in base pairing and the formation of dsRNA at the repeat sequence, which is subsequently targeted by RNaseIII to produce crRNAs. Unlike the other two systems the crRNA does not contain the full spacer, which is instead truncated at one end. [91]

CrRNAs associate with Cas proteins to form ribonucleotide complexes that recognize foreign nucleic acids. CrRNAs show no preference between the coding and non-coding strands, which is indicative of an RNA-guided DNA-targeting system. [5] [39] [99] [103] [137] [138] [139] The type I-E complex (commonly referred to as Cascade) requires five Cas proteins bound to a single crRNA. [140] [141]

Interference Edit

During the interference stage in type I systems the PAM sequence is recognized on the crRNA-complementary strand and is required along with crRNA annealing. In type I systems correct base pairing between the crRNA and the protospacer signals a conformational change in Cascade that recruits Cas3 for DNA degradation.

Type II systems rely on a single multifunctional protein, Cas9, for the interference step. [91] Cas9 requires both the crRNA and the tracrRNA to function and cleaves DNA using its dual HNH and RuvC/RNaseH-like endonuclease domains. Basepairing between the PAM and the phage genome is required in type II systems. However, the PAM is recognized on the same strand as the crRNA (the opposite strand to type I systems).

Type III systems, like type I require six or seven Cas proteins binding to crRNAs. [142] [143] The type III systems analysed from S. solfataricus y P. furiosus both target the mRNA of phages rather than phage DNA genome, [83] [143] which may make these systems uniquely capable of targeting RNA-based phage genomes. [82] Type III systems were also found to target DNA in addition to RNA using a different Cas protein in the complex, Cas10. [144] The DNA cleavage was shown to be transcription dependent. [145]

The mechanism for distinguishing self from foreign DNA during interference is built into the crRNAs and is therefore likely common to all three systems. Throughout the distinctive maturation process of each major type, all crRNAs contain a spacer sequence and some portion of the repeat at one or both ends. It is the partial repeat sequence that prevents the CRISPR-Cas system from targeting the chromosome as base pairing beyond the spacer sequence signals self and prevents DNA cleavage. [146] RNA-guided CRISPR enzymes are classified as type V restriction enzymes.

The cas genes in the adaptor and effector modules of the CRISPR-Cas system are believed to have evolved from two different ancestral modules. A transposon-like element called casposon encoding the Cas1-like integrase and potentially other components of the adaptation module was inserted next to the ancestral effector module, which likely functioned as an independent innate immune system. [147] The highly conserved cas1 and cas2 genes of the adaptor module evolved from the ancestral module while a variety of class 1 effector cas genes evolved from the ancestral effector module. [148] The evolution of these various class 1 effector module cas genes was guided by various mechanisms, such as duplication events. [149] On the other hand, each type of class 2 effector module arose from subsequent independent insertions of mobile genetic elements. [150] These mobile genetic elements took the place of the multiple gene effector modules to create single gene effector modules that produce large proteins which perform all the necessary tasks of the effector module. [150] The spacer regions of CRISPR-Cas systems are taken directly from foreign mobile genetic elements and thus their long term evolution is hard to trace. [151] The non-random evolution of these spacer regions has been found to be highly dependent on the environment and the particular foreign mobile genetic elements it contains. [152]

CRISPR/Cas can immunize bacteria against certain phages and thus halt transmission. For this reason, Koonin described CRISPR/Cas as a Lamarckian inheritance mechanism. [153] However, this was disputed by a critic who noted, "We should remember [Lamarck] for the good he contributed to science, not for things that resemble his theory only superficially. Indeed, thinking of CRISPR and other phenomena as Lamarckian only obscures the simple and elegant way evolution really works". [154] But as more recent studies have been conducted, it has become apparent that the acquired spacer regions of CRISPR-Cas systems are indeed a form of Lamarckian evolution because they are genetic mutations that are acquired and then passed on. [155] On the other hand, the evolution of the Cas gene machinery that facilitates the system evolves through classic Darwinian evolution. [155]

Coevolution Edit

Analysis of CRISPR sequences revealed coevolution of host and viral genomes. [156] Cas9 proteins are highly enriched in pathogenic and commensal bacteria. CRISPR/Cas-mediated gene regulation may contribute to the regulation of endogenous bacterial genes, particularly during interaction with eukaryotic hosts. Por ejemplo, Francisella novicida uses a unique, small, CRISPR/Cas-associated RNA (scaRNA) to repress an endogenous transcript encoding a bacterial lipoprotein that is critical for F. novicida to dampen host response and promote virulence. [157]

The basic model of CRISPR evolution is newly incorporated spacers driving phages to mutate their genomes to avoid the bacterial immune response, creating diversity in both the phage and host populations. To resist a phage infection, the sequence of the CRISPR spacer must correspond perfectly to the sequence of the target phage gene. Phages can continue to infect their hosts given point mutations in the spacer. [146] Similar stringency is required in PAM or the bacterial strain remains phage sensitive. [119] [146]

Rates Edit

A study of 124 S. thermophilus strains showed that 26% of all spacers were unique and that different CRISPR loci showed different rates of spacer acquisition. [118] Some CRISPR loci evolve more rapidly than others, which allowed the strains' phylogenetic relationships to be determined. A comparative genomic analysis showed that E. coli y S. enterica evolve much more slowly than S. thermophilus. The latter's strains that diverged 250 thousand years ago still contained the same spacer complement. [158]

Metagenomic analysis of two acid-mine-drainage biofilms showed that one of the analyzed CRISPRs contained extensive deletions and spacer additions versus the other biofilm, suggesting a higher phage activity/prevalence in one community than the other. [78] In the oral cavity, a temporal study determined that 7–22% of spacers were shared over 17 months within an individual while less than 2% were shared across individuals. [127]

From the same environment a single strain was tracked using PCR primers specific to its CRISPR system. Broad-level results of spacer presence/absence showed significant diversity. However, this CRISPR added 3 spacers over 17 months, [127] suggesting that even in an environment with significant CRISPR diversity some loci evolve slowly.

CRISPRs were analysed from the metagenomes produced for the human microbiome project. [159] Although most were body-site specific, some within a body site are widely shared among individuals. One of these loci originated from streptococcal species and contained ≈15,000 spacers, 50% of which were unique. Similar to the targeted studies of the oral cavity, some showed little evolution over time. [159]

CRISPR evolution was studied in chemostats using S. thermophilus to directly examine spacer acquisition rates. In one week, S. thermophilus strains acquired up to three spacers when challenged with a single phage. [160] During the same interval the phage developed single nucleotide polymorphisms that became fixed in the population, suggesting that targeting had prevented phage replication absent these mutations. [160]

Otro S. thermophilus experiment showed that phages can infect and replicate in hosts that have only one targeting spacer. Yet another showed that sensitive hosts can exist in environments with high phage titres. [161] The chemostat and observational studies suggest many nuances to CRISPR and phage (co)evolution.

CRISPRs are widely distributed among bacteria and archaea [87] and show some sequence similarities. [133] Their most notable characteristic is their repeating spacers and direct repeats. This characteristic makes CRISPRs easily identifiable in long sequences of DNA, since the number of repeats decreases the likelihood of a false positive match. [162]

Analysis of CRISPRs in metagenomic data is more challenging, as CRISPR loci do not typically assemble, due to their repetitive nature or through strain variation, which confuses assembly algorithms. Where many reference genomes are available, polymerase chain reaction (PCR) can be used to amplify CRISPR arrays and analyse spacer content. [118] [127] [163] [164] [165] [166] However, this approach yields information only for specifically targeted CRISPRs and for organisms with sufficient representation in public databases to design reliable polymerase chain reaction (PCR) primers. Degenerate repeat-specific primers can be used to amplify CRISPR spacers directly from environmental samples amplicons containing two or three spacers can be then computationally assembled to reconstruct long CRISPR arrays. [166]

The alternative is to extract and reconstruct CRISPR arrays from shotgun metagenomic data. This is computationally more difficult, particularly with second generation sequencing technologies (e.g. 454, Illumina), as the short read lengths prevent more than two or three repeat units appearing in a single read. CRISPR identification in raw reads has been achieved using purely de novo identification [167] or by using direct repeat sequences in partially assembled CRISPR arrays from contigs (overlapping DNA segments that together represent a consensus region of DNA) [159] and direct repeat sequences from published genomes [168] as a hook for identifying direct repeats in individual reads.

Another way for bacteria to defend against phage infection is by having chromosomal islands. A subtype of chromosomal islands called phage-inducible chromosomal island (PICI) is excised from a bacterial chromosome upon phage infection and can inhibit phage replication. [169] PICIs are induced, excised, replicated and finally packaged into small capsids by certain staphylococcal temperate phages. PICIs use several mechanisms to block phage reproduction. In first mechanism PICI-encoded Ppi differentially blocks phage maturation by binding or interacting specifically with phage TerS, hence blocks phage TerS/TerL complex formation responsible for phage DNA packaging. In second mechanism PICI CpmAB redirect the phage capsid morphogenetic protein to make 95% of SaPI-sized capsid and phage DNA can package only 1/3rd of their genome in these small capsid and hence become nonviable phage. [170] The third mechanism involves two proteins, PtiA and PtiB, that target the LtrC, which is responsible for the production of virion and lysis proteins. This interference mechanism is modulated by a modulatory protein, PtiM, binds to one of the interference-mediating proteins, PtiA, and hence achieving the required level of interference. [171]

One study showed that lytic ICP1 phage, which specifically targets Vibrio cholerae serogroup O1, has acquired a CRISPR/Cas system that targets a V. cholera PICI-like element. The system has 2 CRISPR loci and 9 Cas genes. It seems to be homologous to the I-F system found in Yersinia pestis. Moreover, like the bacterial CRISPR/Cas system, ICP1 CRISPR/Cas can acquire new sequences, which allows phage and host to co-evolve. [172]

Certain archaeal viruses were shown to carry mini-CRISPR arrays containing one or two spacers. It has been shown that spacers within the virus-borne CRISPR arrays target other viruses and plasmids, suggesting that mini-CRISPR arrays represent a mechanism of heterotypic superinfection exclusion and participate in interviral conflicts. [166]

CRISPR gene editing Edit

CRISPR technology has been applied in the food and farming industries to engineer probiotic cultures and to immunize industrial cultures (for yogurt, for instance) against infections. It is also being used in crops to enhance yield, drought tolerance and nutritional value. [173]

By the end of 2014 some 1000 research papers had been published that mentioned CRISPR. [174] [175] The technology had been used to functionally inactivate genes in human cell lines and cells, to study Candida albicans, to modify yeasts used to make biofuels and to genetically modify crop strains. [175] Hsu and his colleagues state that the ability to manipulate the genetic sequences allows for reverse engineering that can positively affect biofuel production [176] CRISPR can also be used to change mosquitos so they cannot transmit diseases such as malaria. [177] CRISPR-based approaches utilizing Cas12a have recently been utilized in the successful modification of a broad number of plant species. [178]

In July 2019, CRISPR was used to experimentally treat a patient with a genetic disorder. The patient was a 34-year-old woman with sickle cell disease. [179]

In February 2020, progress was made on HIV treatments with 60-80% of the DNA removed in mice and some being completely free from the virus after edits involving both LASER ART, a new anti-retroviral therapy, and CRISPR. [180]

In March 2020, CRISPR-modified virus was injected into a patient's eye in an attempt to treat Leber congenital amaurosis. [181]

In the future, CRISPR gene editing could potentially be used to create new species or revive extinct species from closely related ones. [182]

CRISPR-based re-evaluations of claims for gene-disease relationships have led to the discovery of potentially important anomalies. [183]

CRISPR as diagnostic tool Edit

CRISPR associated nucleases have shown to be useful as a tool for molecular testing due to their ability to specifically target nucleic acid sequences in a high background of non-target sequences. In 2016, the Cas9 nuclease was used to deplete unwanted nucleotide sequences in next-generation sequencing libraries while requiring only 250 picograms of initial RNA input. [184] Beginning in 2017, CRISPR associated nucleases were also used for direct diagnostic testing of nucleic acids, down to single molecule sensitivity. [185] [186]

By coupling CRISPR-based diagnostics to additional enzymatic processes, the detection of molecules beyond nucleic acids is possible. One example of a coupled technology is SHERLOCK-based Profiling of IN vitro Transcription (SPRINT). SPRINT can be used to detect a variety of substances, such as metabolites in patient samples or contaminants in environmental samples, with high throughput or with portable point-of-care devices. [187] CRISPR/Cas platforms are also being explored for detection [188] [189] [190] [191] [192] and inactivation of SARS-CoV-2, the virus that causes COVID-19. [193]


Información del autor

Present address: Department of Cell and Tissue Biology, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA

Afiliaciones

Innovative Genomics Institute, University of California, Berkeley, Berkeley, CA, USA

Chris D. Richardson, Katelynn R. Kazane, Sharon J. Feng, Elena Zelin, Nicholas L. Bray & Jacob E. Corn

Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley, Berkeley, CA, USA

Chris D. Richardson, Katelynn R. Kazane, Sharon J. Feng, Elena Zelin, Nicholas L. Bray, Axel J. Schäfer, Stephen N. Floor & Jacob E. Corn

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

Contribuciones

C.D.R. and J.E.C. designed the experiments. C.D.R., A.J.S. and S.N.F. performed the pooled screens. C.D.R., K.R.K. and S.J.F. performed the follow-up experiments. C.D.R., N.L.B. and J.E.C. analyzed the data. E.Z. and K.R.K. generated the knockout clones. C.D.R. and J.E.C. wrote the manuscript.

Autor correspondiente


Conclusiones y perspectivas

The continuous identification and characterization of highly useful new CRISPR proteins reveal the enormous potential behind CRISPR/Cas. While CRISPR/Cas9 initially allowed the guidance of one specific enzymatic activity to one or, by the use of multiple sgRNAs, to various target sites, it is now possible to realize multidimensional approaches that enable the parallel employment of a number of activities [98] . This was recently demonstrated through the simultaneous application of different Cas9 orthologues either for imaging or GT experiments [23, 61] . The establishment of aptamer-based sgRNAs that can recruit a variety of potential RBPs allows considerable flexibility for employment of different enzymatic activities simultaneously (e.g. [99] ). The constantly increasing set of applicable CRISPR proteins expands the possible number and flexibility of parallel genomic manipulations even further. In particular, the availability of Cas12a opens up new target sites and Cas13 now enables the manipulation of RNA on several levels. New CRISPR based methods enabling often unexpected new applications are continuously being developed, as recently evidenced by SHERLOCK and DETECTR using CRISPR for highly sensitive nucleic acid detection (Fig. 3E) [83, 100] . Through the combination of DNA and RNA editing systems, the cellular transcriptome can now be manipulated on the transcriptional and posttranscriptional level simultaneously, allowing delicate and also reversible fine-tuning of gene expression. Previous experiments only indicated the possibilities to edit genomes or influence cell metabolism, and current applications merely give us a hint of the amount of further discoveries that await to change molecular biology.


1. INTRODUCCIÓN

Genome editing is a type of genetic engineering where DNA is manipulated at the single-base level. It is revolutionizing the biomedical research field and holds promise to treat or prevent many human genetic disorders. The perfect genome-editing tool has to be able to alter a genomic sequence efficiently, showing high DNA sequence specificity, and minimal off-target effects. 1 Genome-editing strategies were first developed in yeast 2, 3 and then in mammalian cells, 4, 5 in which small portions of the genome were substituted with exogenous donor DNA sequences via the endogenous homologous recombination repair pathway. In the late 80s, this same natural homologous recombination-based approach was used in mouse embryonic stem cells to generate mice with a specific genotype. 6 Since then, this technique has enabled the study of human diseases in mouse and other animal models and contributed considerably in the process of drug discovery and development.

Nevertheless, this approach has several limitations, such as its low editing efficiency and unwanted genome-editing events where the donor DNA template is more frequently inserted into the genome randomly than at the desired location. 7 To overcome these limitations, several groups have developed tools that allowed the introduction of site-specific double-stranded breaks (DSBs) into a genomic locus of interest using ‘meganucleases’. This refers to endonucleases with an extremely rare recognition site that recognizes and cleaves specific DNA sequences in order to stimulate homology-directed repair (HDR) mechanism. 8-11 This approach requires that a DNA donor template with ends homologous to the break site is delivered and used by the polymerase to copy information along the break site. 9, 10 However, besides HDR, non-homologous end joining (NHEJ) also occurs at the sites of DSBs. 11 NHEJ is able to unify the two ends of the break by introducing a random nucleotide insertion or deletion (indels). While NHEJ repair mechanism is exceptionally successful in obtaining functional gene knockouts, the generation of indels emerges as an undesired side effect. 12 Therefore, the generation of site-specific DSBs that specifically trigger HDR and simultaneously blunt NHEJ activity is still a current challenge in the field.

Alternatively, site-directed zinc finger nucleases (ZFs) 13-15 and transcription-activator-like effector nucleases (TALENs) 16, 17 are two approaches that use the principles of DNA-protein recognition. Both ZFs and TALENs are fusion proteins made up of an engineered DNA binding domain fused to a non-specific nuclease domain from the FokI restriction enzyme. Unlike DNA-binding proteins, ZF and TALEN amino acid sequences can be designed to cleave virtually any target sequence in the genome with high specificity. 17-22 However, the routine use of these editing tools in the laboratory has been impaired by difficulties in protein design, synthesis and validation. 23

The development of the CRISPR/Cas9 system has proven to be a major scientific breakthrough and made gene editing more accessible. Distinct from the protein-guided DNA cleavage used by TALENs and ZFs, CRISPR/Cas9 depends on a small RNA to introduce a site-specific DSB. 24-26 The requirements of the endonuclease Cas9 to match a DNA target sequence are elegant and simple: It only requires a 20-nucleotide ‘guideRNA’ (sgRNA) that base pairs with the target DNA and the presence of a DNA ‘protospacer-adjacent motif’ (PAM), a short DNA sequence adjacent to the complementary region that varies according to the bacterial species of the Cas9 protein being used. 23-29 This two-pronged system in which the sgRNA guides the Cas9 nuclease to target any DNA sequence of interest has replaced the laborious protein design procedure associated with ZFs and TALENs. 1, 24-26

The simplicity of CRISPR/Cas9 technology coupled with a unique DNA cleaving mechanism, the ability to target multiple regions, and the existence of different type II CRISPR-Cas system variants, has enabled notable progresses using this cost-effective and user-friendly technology to precise and efficiently modify the genomic DNA of a wide collection of cells and organisms. 23 Although the CRISPR/Cas9 system has been widely adopted as the preferred genetic editing tool for most researches worldwide, the use of this technology in pre-clinical and clinical setting is now bursting with new and exciting studies. In this review, we summarize some of the recent disease-focused studies that have applied the CRISPR/Cas9 system and explore the advantages of this technology as well as discuss the major obstacles involved in translating it to the clinic.


Abstracto

Several plant pathogens severely affect crop yield and quality, thereby threatening global food security. In order to cope with this challenge, genetic improvement of plant disease resistance is required for sustainable agricultural production, for which conventional breeding is unlikely to do enough. Luckily, genome editing systems that particularly clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) has revolutionized crop improvement by enabling robust and precise targeted genome modifications. It paves the way towards new methods for genetic improvement of plant disease resistance and accelerates resistance breeding. In this review, the challenges, limitations and prospects for conventional breeding and the applications of CRISPR/Cas9 system for the development of transgene-free disease-resistant crops are discussed.


Referencias

  1. 1. Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S, et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science (80-). 2007315: 1709–1712. pmid:17379808
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  2. 2. Wiedenheft B, Sternberg SH, Doudna JA. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Naturaleza. 2012482: 331–338. pmid:22337052
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  3. 3. Makarova KS, Haft DH, Barrangou R, Brouns SJJ, Charpentier E, Horvath P, et al. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol. Nature Publishing Group 20119: 467–477. pmid:21552286
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  4. 4. Deltcheva E, Chylinski K, Sharma CM, Gonzales K, Chao Y, Pirzada ZA, et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Naturaleza. 2011471: 602–607. pmid:21455174
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  5. 5. Sternberg SH, Haurwitz RE, Doudna JA, Sternberg SH, Haurwitz RE, Doudna JA. Mechanism of substrate selection by a highly specific CRISPR endoribonuclease Mechanism of substrate selection by a highly specific CRISPR endoribonuclease. RNA. 201218: 661–672. pmid:22345129
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  6. 6. Westra ER, van Erp PBG, Künne T, Wong SP, Staals RHJ, Seegers CLC, et al. CRISPR Immunity Relies on the Consecutive Binding and Degradation of Negatively Supercoiled Invader DNA by Cascade and Cas3. Mol Cell. 201246: 595–605. pmid:22521689
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  7. 7. Deltcheva E, Chylinski K, Sharma CM, Gonzales K. CRISPR RNA maturation by trans -encoded small RNA and host factor RNase III. Naturaleza. 2011471: 602–607. pmid:21455174
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  8. 8. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A Programmable Dual-RNA–Guided. Science (80-). 2012337: 816–822. pmid:22745249
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  9. 9. Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Hsu PD, et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/VCas Systems. Science (80-). 2013339: 819–823. pmid:23287718
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  10. 10. Ran FA, Hsu PDP, Wright J, Agarwala V, Scott D a, Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 20138: 2281–2308. pmid:24157548
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  11. 11. Sander JD, Joung JK. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. Nature Publishing Group 201432: 347–350. pmid:24584096
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  12. 12. Konermann S, Brigham MD, Trevino AE, Joung J, Abudayyeh OO, Barcena C, et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Naturaleza. Nature Publishing Group 2015517: 583–588. pmid:25494202
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  13. 13. Hilton IB, D’Ippolito AM, Vockley CM, Thakore PI, Crawford GE, Reddy TE, et al. Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. Nat Biotechnol. 201533: 510–517. pmid:25849900
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  14. 14. Gilbert LA, Larson MH, Morsut L, Liu Z, Brar GA, Torres SE, et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Celda. 2013 pmid:23849981
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  15. 15. Wang H, Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/cas-mediated genome engineering. Celda. Elsevier Inc. 2013153: 910–918. pmid:23643243
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  16. 16. Hendel A, Bak RO, Clark JT, Kennedy AB, Ryan DE, Roy S, et al. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. 201533. pmid:26121415
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  17. 17. Sakuma T, Nishikawa A, Kume S, Chayama K, Yamamoto T. Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system. Sci Rep. 20144: 4–9. pmid:24954249
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  18. 18. Kabadi AM, Ousterout DG, Hilton IB, Gersbach CA. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Ácidos nucleicos Res. 201442. pmid:25122746
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  19. 19. Hampf M, Gossen M. Promoter Crosstalk Effects on Gene Expression. J Mol Biol. 2007365: 911–920. pmid:17097679
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  20. 20. Nie L, Thakur M Das, Wang Y, Su Q, Zhao Y, Feng Y. Regulation of U6 Promoter Activity by Transcriptional Interference in Viral Vector-Based RNAi. Genomics, Proteomics Bioinforma. Genomics, Proteomics & Bioinformatics 20108: 170–179. pmid:20970745
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  21. 21. Wang S, Shi Z, Liu W, Jules J, Feng X. Development and validation of vectors containing multiple siRNA expression cassettes for maximizing the efficiency of gene silencing. BMC Biotechnol. 20066: 1–7.
    • View Article
    • Google Académico
  22. 22. Moriarity BS, Rahrmann EP, Keng VW, Manlove LS, Beckmann DA, Wolf NK, et al. Modular assembly of transposon integratable multigene vectors using RecWay assembly. Ácidos nucleicos Res. 201341: 1–12.
    • View Article
    • Google Académico
  23. 23. Yahata K, Maeshima K, Sone T, Ando T, Okabe M, Imamoto N, et al. cHS4 Insulator-mediated Alleviation of Promoter Interference during Cell-based Expression of Tandemly Associated Transgenes. J Mol Biol. 2007374: 580–590. pmid:17945255
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  24. 24. Engler C, Gruetzner R, Kandzia R, Marillonnet S. Golden gate shuffling: A one-pot DNA shuffling method based on type ils restriction enzymes. Más uno. 20094. pmid:19436741
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  25. 25. Rathe SK, Moriarity BS, Stoltenberg CB, Kurata M, Aumann NK, Rahrmann EP, et al. Using RNA-seq and targeted nucleases to identify mechanisms of drug resistance in acute myeloid leukemia. Sci Rep. 20144: 1–9. pmid:25116387
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  26. 26. Till BJ, Burtner C, Comai L, Henikoff S. Mismatch cleavage by single-strand specific nucleases. Ácidos nucleicos Res. 200432: 2632–2641. pmid:15141034
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  27. 27. Haurwitz RE, Sternberg SH, Doudna JA. Csy4 relies on an unusual catalytic dyad to position and cleave CRISPR RNA. EMBO J. Nature Publishing Group 201231: 2824–32. pmid:22522703
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  28. 28. Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Ácidos nucleicos Res. 200129: 45e–45.
    • View Article
    • Google Académico
  29. 29. Holkers M, Maggio I, Liu J, Janssen JM, Miselli F, Mussolino C, et al. Differential integrity of TALE nuclease genes following adenoviral and lentiviral vector gene transfer into human cells. Ácidos nucleicos Res. 201341. pmid:23275534
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  30. 30. Nissim L, Perli SD, Fridkin A, Perez-Pinera P, Lu TK. Multiplexed and Programmable Regulation of Gene Networks with an Integrated RNA and CRISPR/Cas Toolkit in Human Cells. Mol Cell. Elsevier Inc. 201454: 698–710. pmid:24837679
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  31. 31. Tsai SQ, Wyvekens N, Khayter C, Foden JA, Thapar V, Reyon D, et al. Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing. Nat Biotechnol. 201432: 569–576. pmid:24770325
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  32. 32. Jusiak B, Cleto S, Perez-Piñera P, Lu TK. Engineering Synthetic Gene Circuits in Living Cells with CRISPR Technology. Trends Biotechnol. Elsevier Ltd 201634: 535–547. pmid:26809780
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  33. 33. Chen B, Gilbert LA, Cimini BA, Schnitzbauer J, Zhang W, Li GW, et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Celda. Elsevier 2013155: 1479–1491. pmid:24360272
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  34. 34. Fonfara I, Richter H, BratoviÄ M, Le Rhun A, Charpentier E. The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA. Naturaleza. 2016532: 517–521. pmid:27096362
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  35. 35. June CH, Blazar BR, Riley JL. Engineering lymphocyte subsets: Tools, trials and tribulations. Nat Rev Immunol. Nature Publishing Group 20099: 704–716. pmid:19859065
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  36. 36. Sather BD, Ibarra GSR, Sommer K, Curinga G, Hale M, Khan IF, et al. Efficient modification of CCR5 in primary human hematopoietic cells using a megaTAL nuclease and AAV donor template. Sci Transl Med. 20157. pmid:26424571
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico
  37. 37. Wang J, Exline CM, Declercq JJ, Llewellyn GN, Hayward SB, Li PWL, et al. Homology-driven genome editing in hematopoietic stem and progenitor cells using ZFN mRNA and AAV6 donors. Nat Biotechnol. Nature Publishing Group 201533: 1256–1263. pmid:26551060
    • View Article
    • PubMed/NCBI
    • Google Académico

Subject Areas

For more information about PLOS Subject Areas, click here.

We want your feedback. Do these Subject Areas make sense for this article? Click the target next to the incorrect Subject Area and let us know. Thanks for your help!

Is the Subject Area "Guide RNA" applicable to this article? Yes No

Is the Subject Area "Plasmid construction" applicable to this article? Yes No

Is the Subject Area "Transfection" applicable to this article? Yes No

Is the Subject Area "CRISPR" applicable to this article? Yes No

Is the Subject Area "Nucleases" applicable to this article? Yes No

Is the Subject Area "Oligonucleotides" applicable to this article? Yes No

Is the Subject Area "Polyadenylation" applicable to this article? Yes No

Is the Subject Area "Genome engineering" applicable to this article? Yes No


Ver el vídeo: How CRISPR lets us edit our DNA. Jennifer Doudna (Mayo 2022).