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¿Cómo se diluyen los cebadores directos e inversos para una mezcla maestra?

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Pido disculpas por la pregunta tan ingenua, pero recién estoy comenzando en un laboratorio de biología de la escuela secundaria y estoy muy confundido. Si tengo existencias de 100 μM para cebadores directos e inversos por separado, puedo diluirlos a 10 μM muy fácilmente. Pero, ¿y si quiero hacer una mezcla maestra? Tengo 1000 μL de 10 μM para cada cebador, hacia adelante y hacia atrás (no mezclado). ¿Agregaría simplemente 500 μL de mi imprimación directa y 500 μL de mi imprimación inversa para una mezcla de 1000 μL en la que ambas concentraciones siguen siendo 10 μM?


¿Agregaría simplemente 500 μL de mi imprimación directa y 500 μL de mi imprimación inversa para una mezcla de 1000 μL en la que ambas concentraciones siguen siendo 10 μM?

No. Diluir su solución de 10 μM a la mitad reducirá la concentración a la mitad. Mezclar partes iguales de imprimación de 10 μM hará una mezcla maestra donde cada imprimación es de 5 μM

Pero en general, los cebadores se agregan a estas reacciones en gran exceso, por lo que 5 μM de cebador podrían estar bien.


Preparación de una mezcla maestra de PCR

Hoy, tuve que averiguar las concentraciones correctas para una mezcla maestra de PCR.

Usaremos dos juegos de imprimaciones, haciendo así 2 mezclas maestras, que irán en 10 tubos.

Tenemos tres muestras de ADN diferentes: BW (control), 9916Bxx y 9916Bx. En el tercero, realizaremos tres pruebas de 1x DNA, 1 / 10x DNA y 1 / 100x. Para ello, el ADN debe estar diluido.

El primer paso para hacer una mezcla maestra es diluir los cebadores. Vienen en concentrado stock de 100 μM, y debemos diluirlo a 10 μM, por lo que debe poner 10 μL del frente y 10 μL del reverso en 80 μL de H2O. Luego, toma 1μL de la imprimación recién diluida y la coloca en su mezcla maestra. Tendrá 1 μL / 50 μL, por lo que al final serán 0,2 μM de imprimación. También debe poner 25 μL de la mezcla Taq, 1 μL de la plantilla de ADN y 23 μL de H2O, para hacer una mezcla maestra total de 50 μL. También haremos esto para la otra cartilla. SIN EMBARGO, cuando haces la mezcla maestra, todavía no puedes introducir el ADN.

Haremos las dos mezclas maestras hasta que tengan un volumen de 49μL y no tengan ADN molde. Luego, colocaremos 49μL en cada tubo, 10 tubos en total. En los primeros 3 de cada conjunto de 5 tubos, el ADN se agregará a 1x. Esto significa que simplemente agrega 1 μl de ADN. Para 1 / 10x, toma 10μL del ADN 1x, agrégalo a 90μL de agua para hacer 1 / 10x. Toma 10 μl de eso y lo pone en 90 μl de agua por 1 / 100x.

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Nuestros 10 consejos principales para una qPCR consistente

qPCR requiere una cierta cantidad de delicadeza técnica para garantizar datos consistentes en todos los experimentos. Los principales desafíos que se encuentran al comenzar con esta técnica son problemas de contaminación o inconsistencia entre réplicas. El costo de ejecutar qPCR es mucho más alto que el de la PCR de punto final, por lo que hacer bien todos los experimentos también puede ser fundamental para el presupuesto de su laboratorio.

¡A continuación se muestran nuestros 10 consejos principales para ayudarlo a obtener datos de qPCR consistentes en todo momento!

1. Mezcle siempre bien los reactivos antes de usarlos

Los reactivos de qPCR incluyen colorantes, nucleótidos y enzimas que pueden asentarse mientras están en el congelador o refrigerador. Asegúrese de mezclar bien sus reactivos individuales antes de preparar su mezcla maestra. De manera similar, pipetee su mezcla maestra a fondo antes de dividirla en alícuotas en su placa o tubos para evitar una distribución desigual de los reactivos entre las reacciones.

2. Almacene los cebadores en un búfer para proteger su estabilidad.

Cuando lleguen sus cebadores, evite resuspender el stock maestro en agua. El pH del agua puede ser bajo (especialmente si está tratada con DEPC), lo que lleva a la degradación de la imprimación con el tiempo. En su lugar, use una solución tamponada a pH neutro para proteger sus cebadores de la hidrólisis ácida. Tris-EDTA (TE) es una opción común. El EDTA (1 mM) inhibirá la actividad potencial de la DNAsa, y cuando diluya los cebadores para las reservas de trabajo, el EDTA debe estar suficientemente diluido para no interferir con Taq actividad polimerasa.

3. Alícuotas de los cebadores

Una vez que tenga un stock maestro (generalmente de 100 a 200 mM), debe hacer un stock de trabajo para evitar múltiples ciclos de congelación / descongelación de su solución de imprimación original. Prepare estas existencias de trabajo (10-20 mM) en tampón TE en volúmenes que se adapten a sus necesidades. Limítese a tres ciclos de congelación / descongelación de estas existencias de trabajo. La congelación / descongelación repetida puede provocar la degradación de la imprimación, lo que puede afectar negativamente los resultados de la qPCR, p. reducción de la eficiencia de qPCR y reducción de la sensibilidad.

La preparación de alícuotas también le ayudará en caso de contaminación de la imprimación. Si contamina accidentalmente un vial de imprimación, puede tirarlo y tomar uno nuevo sin preocuparse por contaminar el vial maestro.

4. Utilice pipetas calibradas para volúmenes bajos

Si necesita una precisión absoluta en la cuantificación, utilice pipetas calibradas para pipeteo de bajo volumen (como P2 o P10) para preparar sus curvas estándar y reacciones de qPCR.

El uso de las pipetas adecuadas garantiza la reproducibilidad entre réplicas. Esto es importante cuando se mide la eficiencia de qPCR basándose en curvas estándar, ya que debe asegurarse de que realmente se mide la eficiencia de qPCR y no sus habilidades de pipeteo. Además, asegúrese de que sus pipetas sean precisas antes de comenzar.

5. Realice una curva estándar para cada nuevo par de imprimaciones.

No asuma que todos los juegos de imprimaciones que solicite funcionarán tan bien como el último. La eficacia de la qPCR puede verse influida por varios factores. La mejor práctica es ejecutar una curva estándar de 5 puntos con diluciones de 10 veces para cada nuevo par de cebadores y asegurarse de que puede obtener al menos un 90% de eficiencia de qPCR con ADN de control.

6. Siga la regla de las tres habitaciones

Una de las mayores fuentes de contaminación es el uso de las mismas pipetas para todas las partes del flujo de trabajo de qPCR, es decir, extracción de ADN, PCR y manipulación de productos de PCR después de la ejecución. Esto no es recomendable incluso si usa puntas resistentes a los aerosoles en todo momento. Para qPCR, utilice siempre un conjunto de pipetas dedicadas exclusivamente a la configuración de la reacción de qPCR.

Además de utilizar estas pipetas específicas, debe mantenerlas alejadas de la habitación utilizada para la extracción de ADN / ARN. La configuración ideal es tener tres salas, una para la extracción de ácidos nucleicos, otra para la configuración de la reacción (con una campana que contiene una lámpara UV para pretratar las pipetas y los plásticos entre los usuarios) y otra para el ciclador qPCR.

Ésta es la forma más segura de minimizar el riesgo de contaminación en sus controles negativos.

7. Verifique las condiciones del ciclo

Esto es importante si está utilizando un instrumento compartido. Incluso si tiene su propio archivo de plantilla configurado, verifique su ciclo de ejecución antes de presionar el botón de inicio. Es posible que alguien haya realizado pequeños cambios en su plantilla de ciclismo (por ejemplo, temperatura de recocido, tiempo de activación del arranque en caliente) sin su conocimiento.

8. Diluya la plantilla (menos puede ser más)

Dependiendo de los genes de interés, es posible que en realidad esté comenzando con demasiada plantilla. qPCR es tan sensible que menos plantilla a menudo proporciona una medición más precisa.

Idealmente, desea que sus muestras crucen el umbral del ciclo entre los ciclos 20-30. Las muestras que cruzan el umbral antes del ciclo 15 caerán en la configuración de línea base predeterminada en la mayoría de los instrumentos, y esto dará lugar a una sustracción de la señal de fluorescencia de otras muestras en la ejecución. Puede remediar esto ajustando la configuración de la línea de base, pero si no está familiarizado con su instrumento, es posible que deba llamar al servicio técnico para obtener ayuda.

Además, si había inhibidores en la muestra del paso de purificación (por ejemplo, sales de guanidina o etanol), diluir la muestra minimizará su impacto en los resultados, aumentando sus posibilidades de cuantificar con precisión su objetivo.

El mejor enfoque para una nueva muestra es realizar una curva estándar & # 8211 incluso solo una serie de dilución de 3 puntos & # 8211 para determinar la concentración de la plantilla que da como resultado una Cq dentro del rango de su curva estándar de eficiencia qPCR.

9.Hacer diluciones frescas

Los ácidos nucleicos se adhieren al plástico, por lo que si desea almacenar una serie de diluciones para futuras ejecuciones, deberá evitar que los ácidos nucleicos se absorban en las paredes del tubo y, por lo tanto, se diluyan con el tiempo.

Puede lograrlo utilizando un ácido nucleico portador, como ARNt, o utilizando material de plástico especialmente tratado que no se una a los ácidos nucleicos. Varios fabricantes ofrecen tubos de baja retención o tubos tratados con silicona para evitar este problema.

Si almacena diluciones en tubos no tratados, es posible que desee volver a verificar las diluciones más concentradas en un Nanodrop antes de usarlo para asegurarse de que coincidan con la concentración esperada.

10. Asegúrese de que sus datos sean dignos de publicación & # 8211 ¡Conozca las pautas de MIQE!

No tiene mucho sentido gastar tiempo, dinero y energía configurando qPCR si no puede publicar sus datos. En 2009, un grupo de investigadores del Reino Unido compiló una lista de verificación de la información mínima requerida para publicar datos de qPCR. Su objetivo era optimizar los enfoques de qPCR para lograr la confiabilidad de los resultados, la integridad de la literatura científica, la coherencia entre los laboratorios y aumentar la transparencia experimental (1).

Esta lista se llama las pautas de MIQE y debe complementar su envío inicial de manuscrito a una revista. Es necesaria la divulgación completa de todos los reactivos, secuencias y métodos de análisis utilizados para que otros investigadores puedan reproducir los resultados. También se estipula que los detalles de MIQE se publiquen en forma abreviada o como material complementario en línea.


Ask TaqMan Episodio 13 - Cómo funciona TaqMan

Los ensayos de genotipado TaqMan (TaqMan® SNP Genotyping Assays y TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays) consisten en pares de cebadores de PCR optimizados previamente y dos sondas para discriminación alélica.

  • Un par de cebadores sin etiquetar
  • Dos sondas TaqMan (una con una etiqueta de colorante FAM y otra con una etiqueta de colorante VIC) en el extremo de 5 'y aglutinantes de surcos menores (MGB) y extintores no fluorescentes (NFQ) en el extremo de 3'.

Los ensayos de genotipado TaqMan se utilizan para amplificar y detectar alelos específicos en el ADN genómico (ADNg). La siguiente figura muestra el proceso del ensayo de genotipado TaqMan SNP.

  1. El ADN genómico se introduce en una mezcla de reacción que consta de TaqMan® Genotyping Master Mix, cebadores directos e inversos y dos sondas TaqMan® MGB.
  2. Cada sonda TaqMan MGB se hibrida específicamente con una secuencia complementaria, si está presente, entre los sitios del cebador directo e inverso. Cuando la sonda está intacta, la proximidad del tinte extintor al tinte indicador suprime la fluorescencia del indicador.
  3. La actividad exonucleasa de AmpliTaq Gold® DNA Polymerase escinde solo las sondas hibridadas con la diana. La escisión separa el tinte indicador del tinte apagador, aumentando la fluorescencia del indicador. El aumento de la fluorescencia se produce solo si la secuencia diana amplificada es complementaria a la sonda. Por tanto, la señal de fluorescencia generada por amplificación por PCR indica qué alelos están en la muestra.

Los ensayos de número de copias TaqMan® se ejecutan junto con un ensayo de referencia de números de copias TaqMan® en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) dúplex en tiempo real. El ensayo de número de copias detecta el gen diana o la secuencia genómica de interés y el ensayo de referencia detecta una secuencia que se sabe que está presente en dos copias en un genoma diploide.

una. Un ensayo de número de copias TaqMan®, un ensayo de referencia de números de copias TaqMan®, la mezcla maestra de genotipado TaqMan® y una muestra de ADNg se mezclan en un solo pocillo o tubo.

B. La plantilla de ADNg se desnaturaliza y cada conjunto de cebadores de ensayo se hibrida con sus secuencias diana específicas. Cada sonda TaqMan® se hibrida específicamente con su secuencia complementaria entre los sitios de unión del cebador directo e inverso. Cuando cada sonda de oligonucleótidos está intacta, la proximidad del tinte desactivador al tinte indicador hace que se apague la señal del tinte indicador.

C. Durante cada ronda de PCR, la ADN polimerasa AmpliTaq® Gold amplifica simultáneamente las secuencias objetivo y de referencia. Esta enzima tiene una actividad nucleasa 5 'que escinde las sondas que se hibridan con cada secuencia de amplicón. Cuando una sonda de oligonucleótidos es escindida por la actividad nucleasa 5 'de la ADN polimerasa AmpliTaq Gold, el inhibidor se separa del colorante indicador aumentando la fluorescencia del indicador. La acumulación de productos de PCR se puede detectar en tiempo real controlando el aumento de fluorescencia de cada colorante indicador en cada ciclo de PCR.

Este método de cuantificación relativa se utiliza para determinar el número de copias relativo de la diana de interés en una muestra de ADNg, normalizado al número de copias conocido de la secuencia de referencia.


Mutagénesis dirigida al sitio

La mutagénesis dirigida al sitio (SDM) es un método para crear cambios específicos y dirigidos en el ADN plasmídico bicatenario. Hay muchas razones para realizar alteraciones específicas del ADN (inserciones, deleciones y sustituciones), que incluyen:

  • Estudiar los cambios en la actividad de las proteínas que se producen como resultado de la manipulación del ADN.
  • Para seleccionar o cribar mutaciones (a nivel de ADN, ARN o proteína) que tengan una propiedad deseada.
  • Para introducir o eliminar sitios o etiquetas de endonucleasas de restricción


Resumen del método:

SDM es un in vitro procedimiento que utiliza cebadores de oligonucleótidos diseñados a medida para conferir una mutación deseada en un plásmido de ADN de doble hebra. Anteriormente, un método iniciado por Kunkel (Kunkel, 1985) que aprovecha una cepa deficiente en dUTPasa y uracildesglicosilasa para que el receptor E. coli degrada el ADN de tipo salvaje que contiene uracilo fue ampliamente utilizado. Actualmente, hay una serie de kits disponibles comercialmente que también requieren una modificación específica y / o E. coli cepas (por ejemplo, la mutagénesis dirigida al sitio Phusion & reg de Thermo y el sistema GeneArt & reg de Life). Los métodos más utilizados no requieren modificaciones ni cepas únicas e incorporan mutaciones en el plásmido mediante PCR inversa con cebadores estándar. Para estos métodos, los cebadores se pueden diseñar en una superposición (QuikChange & reg, Agilent) o en una orientación adosada (Q5 & reg Site-Directed Mutagénesis Kit) (Figura 1). El diseño del cebador superpuesto da como resultado un producto que se volverá a circularizar para formar un plásmido con doble muesca. A pesar de la presencia de estas mellas, este producto circular se puede transformar directamente en E. coli, aunque con una eficacia menor que los plásmidos sin mellas. Los métodos de diseño de cebadores consecutivos no solo tienen la ventaja de transformar plásmidos sin mellas, sino que también permiten la amplificación exponencial para generar una cantidad significativamente mayor del producto deseado (Figura 2). Además, debido a que los cebadores no se superponen entre sí, los tamaños de las deleciones solo están limitados por el plásmido y las inserciones solo están limitadas por las limitaciones de la síntesis de cebadores moderna. Actualmente, al dividir la inserción entre los dos cebadores, se pueden crear inserciones de hasta 100 pb de forma rutinaria en un solo paso utilizando este método.

Antes de diseñar los cebadores, es importante determinar qué flujo de trabajo de mutagénesis se utilizará. Aquí presentamos una comparación de tres kits disponibles comercialmente (Figura 3) y una breve descripción de características importantes.

Antes de planificar su próximo experimento de SDM, asegúrese de leer nuestra lista de consideraciones experimentales importantes.

Kunkel, T.A. (1985) Proc Natl Acad Sci EE. UU. 82 (2): 488-492. PMID: 3881765

Figura 1: La mutagénesis específica del sitio se desarrolla en menos de 2 horas.

El uso de una mezcla maestra, una mezcla única de enzimas KLD de múltiples enzimas y una polimerasa rápida asegura que, para la mayoría de los plásmidos, la reacción de mutagénesis se complete en menos de dos horas.

Figura 2: Descripción general del kit de mutagénesis dirigida al sitio Q5.

Este kit está diseñado para la incorporación rápida y eficiente de inserciones, deleciones y sustituciones en ADN plasmídico bicatenario. El primer paso es una amplificación exponencial utilizando cebadores estándar y una mezcla maestra de la ADN polimerasa de alta fidelidad Q5 Hot Start. El segundo paso implica la incubación con una mezcla de enzimas única que contiene una quinasa, una ligasa y DpnI. Juntas, estas enzimas permiten una rápida circularización del producto de PCR y la eliminación del ADN molde. El último paso es una transformación de alta eficiencia en células químicamente competentes (proporcionado).

Figura 3: Diseño del cebador para el kit de mutagénesis dirigida al sitio Q5

Las sustituciones, deleciones e inserciones se incorporan en el ADN plasmídico mediante el uso de cebadores directos (negros) e inversos (rojos) diseñados específicamente. A diferencia de los kits que se basan en la amplificación lineal, los cebadores diseñados para el kit de mutagénesis dirigida al sitio Q5 no deben superponerse para garantizar que se obtengan los beneficios de la amplificación exponencial. A) Las sustituciones se crean incorporando los cambios de nucleótidos deseados (indicados por *) en el centro del cebador directo, incluyendo al menos 10 nucleótidos complementarios en el lado 3 & acuteside de la mutación o mutaciones. La imprimación inversa está diseñada de modo que los extremos 5 y agudos de las dos imprimaciones se templan espalda con espalda. B) Las deleciones se manipulan mediante el diseño de cebadores directos e inversos estándar no mutagénicos que flanquean la región que se va a eliminar. C) Se incorporan inserciones menores o iguales a 6 nucleótidos en el extremo 5 & agudo del cebador directo mientras que el cebador inverso se hibrida espalda con espalda con el extremo 5 & agudo de la región complementaria del cebador directo. D) Se pueden crear inserciones más grandes incorporando la mitad de la inserción deseada en los extremos 5 y agudos de ambos cebadores. El tamaño máximo de la inserción depende en gran medida de las limitaciones de la síntesis de oligonucleótidos.

Elija el tipo:

Este producto está protegido por una o más patentes, marcas comerciales y / o derechos de autor propiedad o controlados por New England Biolabs, Inc (NEB).

Si bien NEB desarrolla y valida sus productos para diversas aplicaciones, el uso de este producto puede requerir que el comprador obtenga derechos de propiedad intelectual adicionales de terceros para ciertas aplicaciones.

Para obtener más información sobre los derechos comerciales, comuníquese con el equipo de Desarrollo comercial global de NEB en [email protected]

Este producto está destinado únicamente a fines de investigación. Este producto no está destinado a ser utilizado con fines terapéuticos o de diagnóstico en humanos o animales.


  • Puntas de pipeta con filtro estériles
  • Tubos de microcentrífuga con tapa de rosca estériles de 1,5 ml (CLS430909)
    • Tubos y placas de PCR, seleccione uno para que coincida con el formato deseado:
    • Tubos de PCR individuales de pared delgada de 200 μL (Z374873 o P3114)
    • Platos
      - Placas de 96 pocillos (Z374903)
      - Placas de 384 pocillos (Z374911)
    • Sellos de placa
      - Películas de sellado ThermalSeal RTS ™ (Z734438)
      - Película ThermalSeal RT2RR ™ (Z722553)

    En el ejemplo que se muestra a continuación, las concentraciones del cebador se pueden ajustar de acuerdo con los resultados de los procedimientos de optimización (Optimización de la concentración del cebador, Optimización del cebador mediante gradiente de temperatura y Optimización y validación del ensayo).


    Protocolo de enriquecimiento de ARNm, excluyendo ARNm de Globina, de ARN total de sangre total

    Este protocolo describe el enriquecimiento de ARNm de poli (A) seguido de ARNm de globina y agotamiento de ARNr amp (Sección 1 y 2). El ARN enriquecido contiene solo ARNm (excluida la globina) y no ARN no codificante. El ARN enriquecido se utiliza luego como entrada para la preparación de la biblioteca de ARN direccional para secuenciar en un instrumento Illumina (Sección 3).

    Este protocolo requiere los siguientes productos NEBNext:

    • Módulo de aislamiento magnético de ARNm poli (A) NEBNext (NEB # E7490)
    • NEBNext Kit de reducción de globina y ARNr (humano / ratón / rata) con perlas de purificación de muestras de ARN (NEB # E7755)
    • Preparación de biblioteca de ARN direccional NEBNext Ultra II para Illumina con perlas de purificación de muestras (NEB # E7765)

    Requisitos de las muestras de ARN

    Integridad del ARN:
    Evalúe el tamaño y la calidad del ARN de entrada ejecutando la muestra de ARN en un microprocesador Agilent Bioanalyzer RNA 6000 Nano / Pico para determinar el número de integridad del ARN (RIN). Para el enriquecimiento de ARNm de poli (A), se requiere ARN de alta calidad con RIN Score & gt7.

    Muestra de ARN:
    La muestra de ARN debe estar libre de sales (p. Ej., Mg 2+ o sales de guanidinio) u orgánicos (p. Ej., Fenol y etanol). El ARN debe estar libre de ADN. El ADNg es un contaminante común en las preparaciones de ARN. Puede ser transferido de la interfase de extracciones orgánicas o cuando la matriz de sílice de los métodos de purificación de ARN en fase sólida está sobrecargada. Si la muestra de ARN total puede contener contaminación de ADNg, trate la muestra con DNasa I (no incluida en este kit) para eliminar todos los rastros de ADN. Después del tratamiento, la DNasa I debe eliminarse de la muestra. Cualquier ADNasa I residual puede degradar los oligos necesarios para el enriquecimiento.

    Cantidad de entrada:

    Este protocolo ha sido probado con 100 ng de ARN total de sangre humana (libre de ADN) en un máximo de 50 & microlitros de agua libre de nucleasas, cuantificado mediante un método fluorimétrico asistido por colorante específico de ARN (Qubit & reg) y calidad verificada por Bioanalyzer .

    Mantenga todos los tampones en hielo, a menos que se indique lo contrario.

    1.0. Enriquecimiento de ARNm de poli (A) mediante el módulo de aislamiento magnético de ARNm de poli (A) NEBNext (NEB # E7490)

    1.1. Diluir el ARN total con agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 50 µl en un tubo de PCR de 0,2 ml sin nucleasas y mantener en hielo.

    1.2. Para lavar las perlas de Oligo (dT), agregue los componentes de la tabla siguiente a un tubo sin nucleasas de 1,5 ml. Si prepara múltiples bibliotecas, se pueden agregar perlas para hasta 10 muestras a un solo tubo de 1,5 ml para lavados posteriores (use el imán NEB # S1506 para tubos de 1,5 ml). El propósito de este paso es llevar las perlas del tampón de almacenamiento al tampón de unión. No es necesario diluir el tampón de unión 2X para este paso.

    NEBNext RNA Binding Buffer (2X)

    Volumen total

    1.3. Lave las perlas pipeteando hacia arriba y hacia abajo seis veces.

    1.4. Coloque el tubo sobre el imán e incube a temperatura ambiente hasta que la solución sea transparente (

    1.5. Retire y deseche todo el sobrenadante del tubo. Tenga cuidado de no alterar las cuentas.

    1.6. Retire el tubo de la rejilla magnética.

    1.7. Agregue 100 & mul RNA Binding Buffer (2X) a las perlas y lávelas pipeteando hacia arriba y hacia abajo seis veces. Si prepara múltiples bibliotecas, agregue 100 & microlitros de tampón de unión de ARN (2X) por muestra. El Binding Buffer no tiene que diluirse.

    1.8. Coloque los tubos en el imán e incube a temperatura ambiente hasta que la solución sea transparente (

    1.9. Retire y deseche el sobrenadante del tubo. Tenga cuidado de no alterar las cuentas.

    1.10. Agregue 50 & mul RNA Binding Buffer (2X) a las perlas y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo hasta que las perlas sean homogéneas. Si prepara múltiples bibliotecas, agregue 50 & mul RNA Binding Buffer (2X) por muestra.

    1,11. Agregue 50 & mul perlas a cada muestra de ARN del paso 1.1. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo seis veces. Este paso de unión elimina la mayor parte del ARN no objetivo.

    1.12. Coloque el tubo en un termociclador y cierre la tapa. Calentar la muestra a 65 ° C durante 5 minutos y enfriar a 4 ° C con la tapa térmica ajustada a & ge 75 & degC. Este paso desnaturalizará el ARN y facilitará la unión del ARNm a las perlas.

    1,13. Retire el tubo del termociclador cuando la temperatura alcance los 4 ° C.

    1,14. Mezcle bien pipeteando arriba y abajo seis veces. Coloque el tubo en la mesa e incube a temperatura ambiente durante 5 minutos para permitir que el ARNm se una a las perlas.

    1,15. Coloque el tubo en la rejilla magnética a temperatura ambiente hasta que la solución sea transparente (

    1,16. Retire y deseche todo el sobrenadante. Tenga cuidado de no alterar las cuentas.

    1,17. Retire el tubo de la rejilla magnética.

    1,18. Para eliminar el ARN no unido, agregue 200 µl de tampón de lavado al tubo. Pipetee suavemente todo el volumen hacia arriba y hacia abajo 6 veces para mezclar bien.

    1.19 Gire el tubo hacia abajo brevemente para recoger el líquido de la pared y la tapa del tubo.

    Nota: Es importante girar el tubo hacia abajo para evitar el arrastre del tampón de lavado en los pasos siguientes.

    1.20. Coloque el tubo en la rejilla magnética a temperatura ambiente hasta que la solución sea transparente (

    1,21. Retire y deseche todo el sobrenadante del tubo. Tenga cuidado de no alterar las perlas que contienen el ARNm.

    1,22. Retire el tubo de la rejilla magnética.

    1,24. Agregue 11 & mul de agua libre de nucleasas a cada tubo. Pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo 6 veces para mezclar bien.

    1,25. Coloque el tubo en el termociclador. Cierre la tapa y caliente las muestras a 80 ° C durante 2 minutos, luego enfriar a 25 ° C con la tapa calentada fijada a & ge 90 & degC para eluir el ARNm de las perlas.

    1,26. Retire el tubo del termociclador cuando la temperatura alcance los 25 ° C.

    1.27 Coloque inmediatamente el tubo sobre el imán a temperatura ambiente hasta que la solución sea transparente (

    1,28. Recoger el ARNm purificado transfiriendo 10 & mul del sobrenadante a un tubo de PCR limpio libre de nucleasas.

    1,29. Coloque el ARN en hielo y proceda a la Depleción de Globina y ARNr en la Sección 2.

    2.0. Agotamiento de globina y rRNA con el kit de agotamiento de rRNA y globina NEBNext (NEB # E7750 / E7755)

    2.1 Hibridación de sonda a ARN

    2.1.2. Reúna la siguiente reacción de hibridación de ARN / sonda en hielo:

    REACCIÓN DE HIBRIDACIÓN DE ARN / SONDA

    (blanco) ARNm en agua sin nucleasas (Paso 1.29)

    (blanco) NEBNext Solución de agotamiento de globina y ARNr

    (blanco) NEBNext Probe Hybridization Buffer

    Volumen total

    2.1.3. Mezcle bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces. Nota: Es crucial mezclar bien en este paso.

    2.1.4. Gire brevemente hacia abajo el tubo en una microcentrífuga para recoger el líquido del costado del tubo.

    2.1.5. Coloque el tubo en un termociclador precalentado y ejecute el siguiente programa con la tapa calentada a 105 ° C. Este programa tardará aproximadamente entre 15 y 20 minutos en completarse:

    2.1.6. Gire brevemente hacia abajo el tubo en una microcentrífuga y colóquelo en hielo. Proceder inmediatamente a la digestión con RNasa H.

    2.2. Digestión de RNasa H

    2.2.1. Reúna la siguiente reacción de digestión de RNasa H en hielo:

    (blanco) NEBNext Thermostable RNase H

    (blanco) Tampón de reacción de ARNasa H

    Volumen total

    2.2.2. Mezcle bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces.

    2.2.3. Gire brevemente hacia abajo el tubo en una microcentrífuga.

    2.2.4. Incube el tubo en un termociclador precalentado durante 30 minutos a 50 ° C con la tapa puesta a 55 ° C.

    2.2.5. Gire brevemente hacia abajo el tubo en una microcentrífuga y colóquelo en hielo. Proceder inmediatamente a la digestión de DNasa I.

    2.3. Digestión de DNasa I

    2.3.1. Reúna la siguiente reacción de digestión de DNasa I en hielo:

    REACCIÓN DE DIGESTIÓN DNASE I

    ARN tratado con RNasa H (paso 1.2.5)

    (blanco) Tampón de reacción de DNasa I

    (blanco) NEB Next DNase I

    Volumen total

    2.3.2. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces.

    2.3.3. Gire brevemente hacia abajo el tubo en una microcentrífuga.

    2.3.4. Incube el tubo en un termociclador precalentado durante 30 minutos a 37 ° C con la tapa puesta a 40 ° C o apagada.

    2.3.5. Gire brevemente hacia abajo el tubo en una microcentrífuga y colóquelo en hielo. Proceda inmediatamente al paso de purificación de ARN.

    2.4. Purificación de ARN con microesferas Agencourt RNAClean XP o microesferas de purificación de muestras de ARN NEBNext

    2.4.1. Agite en el vórtex las microesferas Agencourt RNAClean XP o las microesferas de purificación de muestras de ARN NEBNext para resuspender.

    2.4.2. Agregue cuentas de 90 & mul (1.8X) a la muestra de ARN del paso 2.3.5 y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces.

    2.4.3. Incube el tubo durante 15 minutos en hielo para unir el ARN a las perlas.

    2.4.4. Coloque el tubo en una rejilla magnética para separar las perlas del sobrenadante.

    2.4.5. Una vez que la solución esté clara, retire con cuidado y deseche el sobrenadante. Tenga cuidado de no alterar las perlas que contienen el ARN.

    2.4.6. Agregue 200 microlitros de etanol al 80% recién preparado al tubo mientras está en la rejilla magnética. Incubar a temperatura ambiente durante 30 segundos y luego retirar con cuidado y desechar el sobrenadante. Tenga cuidado de no alterar las perlas, que contienen el ARN.

    2.4.7. Repita el paso 2.4.6 una vez para un total de dos lavados.

    2.4.8. Retire completamente el etanol residual y seque al aire las perlas durante un máximo de 5 minutos mientras el tubo está en la rejilla magnética con la tapa abierta.

    Precaución: No seque demasiado las perlas. Esto puede resultar en una menor recuperación del ARN objetivo. Eluir las muestras cuando las perlas todavía sean de color marrón oscuro y de aspecto brillante, pero cuando todo el líquido visible se haya evaporado. Cuando las perlas se vuelven de color marrón más claro y comienzan a agrietarse, están demasiado secas.

    2.4.9. Retire el tubo de la rejilla magnética. Eluir el ARN de las perlas agregando 7 & mul de agua libre de nucleasas. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces y haga girar brevemente el tubo.

    2.4.10. Incube el tubo durante 2 minutos a temperatura ambiente.

    2.4.11. Coloque el tubo en la rejilla magnética hasta que la solución sea transparente (

    2.4.12. Retire 5 & microlitros del sobrenadante que contiene ARN y transfiéralo a un tubo libre de nucleasas.

    2.4.13. Coloque el tubo en hielo y proceda con la construcción de la biblioteca RNA-Seq (protocolo a continuación) u otra aplicación posterior. Alternativamente, la muestra se puede almacenar a -80 ° C.

    Nota: El siguiente paso proporciona un tiempo de incubación de fragmentación que da como resultado un inserto de ARN de

    200nt. Consulte el Apéndice (Sección 4 del Manual de preparación de bibliotecas de ARN direccional NEBNext Ultra II para Illumina) para conocer las condiciones de fragmentación si está preparando bibliotecas con inserciones grandes (& gt200 bp).

    3.1.3. Incube la muestra durante 15 minutos a 94& gradosC en un termociclador con la tapa calentada a 105 ° C.

    3.1.4. Transfiera inmediatamente el tubo a hielo durante 1 minuto.

    3.1.5 Realice un giro rápido para recoger todo el líquido de los lados del tubo y continúe con la síntesis de ADNc de la primera hebra.

    3.2. Síntesis de ADNc de la primera hebra

    3.2.1. Ensamble la reacción de síntesis de la primera hebra en hielo agregando los siguientes componentes al fragmentado
    y ARN cebado del Paso 3.1.5:

    REACCIÓN DE SÍNTESIS DE LA PRIMERA HILA

    ARN fragmentado y cebado (paso 3.1.5)

    (marrón) NEBNext Strand Especificidad Reactivo

    (lila) NEBNext First Strand Synthesis Enzyme Mix

    Volumen total

    3.2.2. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces.

    3.2.3. Incube la muestra en un termociclador precalentado con la tapa calentada ajustada a & ge 80 & degC de la siguiente manera:

    Nota: Si sigue las recomendaciones de la Sección 4 del Manual de preparación de bibliotecas de ARN direccional NEBNext Ultra II para Illumina para bibliotecas con insertos más largos (bases & gt200), aumente la incubación a 42 & ° C de 15 minutos a 50 minutos en el Paso 2 a continuación.

    3.2.4. Proceda directamente a la síntesis de ADNc de la segunda hebra.

    3.3. Síntesis de ADNc de segunda hebra

    3.3.1. Ensamble la reacción de síntesis de la segunda cadena de ADNc en hielo agregando los siguientes componentes en el producto de síntesis de la primera cadena del paso 3.2.4.

    REACCIÓN DE SÍNTESIS DE SEGUNDA HILA

    Producto de síntesis de la primera hebra (paso 3.2.4)

    (naranja) NEBSiguiente búfer de reacción de síntesis de segunda hebra
    con dUTP Mix (10X)

    (naranja) NEBNext Second Strand Synthesis Enzyme Mix

    Volumen total

    3.3.2. Manteniendo el tubo en hielo, mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces.

    3.3.3. Incubar en un termociclador por 1 hora a 16 ° C con la tapa térmica ajustada a & le 40 & degC (o apagada).

    3.4. Purificación de ADNc bicatenario mediante perlas SPRIselect o perlas de purificación de muestras NEBNext

    3.4.1. Vortex SPRIselect Beads o NEBNext Sample Purification Beads para resuspender.

    3.4.2. Agregue 144 & mul (1.8X) de perlas resuspendidas a la reacción de síntesis de la segunda cadena (

    80 y mul). Mezcle bien en un mezclador vórtex o pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces.

    3.4.3. Incubar para 5 minutos a temperatura ambiente.

    3.4.4. Gire brevemente el tubo en una microcentrífuga para recolectar cualquier muestra en los lados del tubo. Coloque el tubo en una rejilla magnética para separar las perlas del sobrenadante. Una vez que la solución esté clara, retire con cuidado y deseche el sobrenadante. Tenga cuidado de no alterar las perlas, que contienen ADN. Precaución: no deseche las perlas.

    3.4.5. Agregue 200 & mul de etanol al 80% recién preparado al tubo mientras está en la rejilla magnética. Incubar a temperatura ambiente durante 30 segundos y luego retirar con cuidado y desechar el sobrenadante.

    3.4.6. Repita el paso 3.4.5 una vez para un total de 2 pasos de lavado.

    3.4.7. Seque las perlas al aire durante un máximo de 5 minutos mientras el tubo está en la rejilla magnética con la tapa abierta.

    Precaución: No seque demasiado las perlas. Esto puede resultar en una menor recuperación del ADN diana. Eluir las muestras cuando las perlas todavía sean de color marrón oscuro y de aspecto brillante, pero cuando todo el líquido visible se haya evaporado. Cuando las perlas se vuelven de color marrón más claro y comienzan a agrietarse, están demasiado secas.

    3.4.8. Retire el tubo de la rejilla magnética. Eluir el ADN de las perlas agregando 53 & mul 0.1X TE Buffer (incluido) a las perlas. Mezcle bien en un mezclador vórtex o pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces. Gire rápidamente el tubo e incube durante 2 minutos a temperatura ambiente. Coloque el tubo en la rejilla magnética hasta que la solución sea transparente.

    3.4.9. Retire 50 μl del sobrenadante y transfiéralo a un tubo de PCR limpio sin nucleasas.

    Note: If you need to stop at this point in the protocol samples can be stored at &ndash20°C.

    3.5. End Prep of cDNA Library

    3.5.1. Assemble the End Prep reaction on ice by adding the following components to the second strand synthesis product from
    Step 3.4.9.

    Second Strand cDNA Synthesis Product (Step 3.4.9)

    (green) NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer

    (green) NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix

    Total Volume

    If a master mix is made, add 10 µl of master mix to 50 µl of cDNA for the End Prep reaction.

    3.5.2. Set a 100 &mul or 200 &mul pipette to 50 &mul and then pipette the entire volume up and down at least 10 times to mix thoroughly. Perform a quick spin to collect all liquid from the sides of the tube.

    Note: It is important to mix well. The presence of a small amount of bubbles will not interfere with performance.

    3.5.3. Incubate the sample in a thermocycler with the heated lid set at &ge 75°C as follows.

    3.5.4. Proceed immediately to Adaptor Ligation.

    3.6. Adaptor Ligation

    Note: If you are selecting for libraries with larger insert size (>200 nt) follow the size selection recommendations in Appendix, Section 4 of the NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep for Illumina Manual.

    3.7.1. Add 87 &mul (0.9X) resuspended SPRIselect Beads or NEBNext Sample Purification Beads and mix well on a vortex mixer or by pipetting up and down at least 10 times.

    3.7.2. Incubar para 10 minutes at room temperature.

    3.7.3. Quickly spin the tube in a microcentrifuge and place the tube on a magnetic rack to separate beads from the supernatant. After the solution is clear (

    5 minutes), discard the supernatant that contains unwanted fragments. Caution: do not discard beads.

    3.7.4. Add 200 &mul of freshly prepared 80% ethanol to the tube while in the magnetic rack. Incubate at room temperature for 30 seconds, and then carefully remove and discard the supernatant.

    3.7.5. Repeat Step 3.7.4 once for a total of 2 washing steps.

    3.7.6. Briefly spin the tube and put the tube back in the magnetic rack.

    3.7.7. Completely remove the residual ethanol, and air-dry beads until the beads are dry for up to 5 minutes while the tube is on the magnetic rack with the lid open.

    Caution: Do not over-dry the beads. This may result in lower recovery of DNA target. Elute the samples when the beads are still dark brown and glossy looking, but when all visible liquid has evaporated. When the beads turn lighter brown and start to crack they are too dry.

    3.7.8. Remove the tube from the magnetic rack. Elute DNA target from the beads by adding 17 &mul 0.1X TE (provided) to the beads. Mix well on a vortex or by pipetting up and down. Quickly spin the tube and incubate for 2 minutes at room temperature. Place the tube in the magnet until the solution is clear.

    3.7.9. Without disturbing the bead pellet, transfer 15 &mul of the supernatant to a clean PCR tube and proceed to PCR enrichment.

    Note: If you need to stop at this point in the protocol, samples can be stored at &ndash20°C.

    3.8. PCR Enrichment of Adaptor Ligated DNA

    Check and verify that the concentration of your oligos is 10 &muM on the label.

    Use Option A for any NEBNext Oligos kit where index primers are supplied in tubes. These kits have the forward and reverse primers supplied in separate tubes.

    Use Option B for any NEBNext Oligos kit where index primers are supplied in a 96-well plate format. These kits have the forward and reverse primers (i7 and i5) combined.

    3.8.1. Set up the PCR reaction as described below based on the type of oligos (PCR primers) used.

    3.8.1A. Forward and Reverse Primers Separate

    Adaptor Ligated DNA (Step 2.11.9)

    (blue) NEBNext Ultra II Q5 ® Master Mix

    Universal PCR Primer/i5 Primer*,**

    Total Volume

    * NEBNext Oligos must be purchased separately from the library prep kit. Refer to the corresponding NEBNext Oligo kit manual
    for determining valid barcode combinations.

    ** Use only one i7 primer/ index primer per sample. Use only one i5 primer (or the universal primer for single index kits) per sample.

    3.8.1B. Forward and Reverse Primers Combined

    Adaptor Ligated DNA (Step 2.11.9)

    (blue) NEBNext Ultra II Q5 Master Mix

    Index (X) Primer/i7 Primer Mix*

    Total Volume

    * NEBNext Oligos must be purchased separately from the library prep kit. Refer to the corresponding NEBNext Oligo kit manual
    for determining valid barcode combinations.

    ** Use only one i7 primer/ index primer per sample. Use only one i5 primer (or the universal primer for single index kits) per sample

    3.8.2. Mix well by gently pipetting up and down 10 times. Quickly spin the tube in a microcentrifuge.

    3.8.3. Place the tube on a thermocycler with the heated lid set to 105°C and perform PCR amplification using the following PCR cycling conditions (refer to Table 3.8.3A and Table 3.8.3B):

    * The number of PCR cycles should be adjusted based on RNA input.

    ** It is important to limit the number of PCR cycles to avoid overamplification.
    If overamplification occurs, a second peak

    1,000 bp will appear on the Bioanalyzer trace (See Figure 5.2 of the NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep for Illumina Manual).

    Table 3.8.3B: Recommended PCR cycles based on total RNA input amount:

    * The PCR cycles are recommended based on high quality human whole blood total RNA. To prevent over-amplification, the number of cycles may require optimization based on the sample quality and the fraction of globin mRNA. For RNA where globin mRNA is > than 50% of the transcripts (once rRNA is removed), follow the higher cycle recommendation for that input.

    3.9. Purification of the PCR Reaction using SPRIselect Beads or NEBNext Sample Purification Beads

    3.9.1. Vortex SPRIselect Beads or NEBNext Sample Purification Beads to resuspend.

    3.9.2. Add 45 &mul (0.9X) of resuspended beads to the PCR reaction (

    50 &mul). Mix well on a vortex mixer or by pipetting up and down at least 10 times.

    3.9.3. Incubar para 5 minutes at room temperature.

    3.9.4. Quickly spin the tube in a microcentrifuge and place the tube on a magnetic rack to separate beads from the supernatant. After the solution is clear (about 5 minutes), carefully remove and discard the supernatant. Be careful not to disturb the beads that contain DNA targets. Caution: do not discard beads.

    3.9.5. Add 200 &mul of freshly prepared 80% ethanol to the tube while in the magnetic rack. Incubate at room temperature for 30 seconds, and then carefully remove and discard the supernatant.

    3.9.6. Repeat Step 3.9.5 once for a total of 2 washing steps.

    3.9.7. Air dry the beads for up to 5 minutes while the tube is on the magnetic rack with the lid open.

    Caution: Do not over-dry the beads. This may result in lower recovery of DNA target. Elute the samples when the beads are still dark brown and glossy looking, but when all visible liquid has evaporated. When the beads turn lighter brown and start to crack they are too dry.

    3.9.8. Remove the tube from the magnetic rack. Elute the DNA target from the beads by adding 23 &mul 0.1X TE (provided) to the beads. Mix well on a vortex mixer or by pipetting up and down ten times. Quickly spin the tube in a microcentrifuge and incubate for 2 minutes at room temperature. Place the tube in the magnetic rack until the solution is clear.

    3.9.9. Transfer 20 &mul of the supernatant to a clean PCR tube and store at &ndash20°C.

    3.10. Library Quantification

    3.10.1. Use a Bioanalyzer or TapeStation to determine the size distribution and concentration of the libraries.

    3.10.2. Check that the electropherogram shows a narrow distribution with a peak size approximately 300 bp.

    80 bp (primers) or 128 bp (adaptor-dimer) is visible in the bioanalyzer traces, bring up the sample volume (from Step 3.9.9) to 50 &mul with 0.1X TE buffer and repeat the SPRIselect Bead or NEBNext Sample Purification Bead Cleanup Step (Section 3.9).

    Figure 3.9.1 Example of RNA library size distribution on a Bioanalyzer.


    Colony PCR or PCR with Growing culture in Broth - Trying to detect the cloned fragment in living cells (Jan/18/2007 )

    Hey Guys
    Another Question for you.
    What is the best technique to do PCR on living cells, cells from colony or can I directly take cell from overnight cultures which I use for plasmid extraction. I tried it once while taking 1 microliter from the broth culture in a total volume of 25 microliter. It worked and I got the amplification but I am not sure, will it work in every case.
    Any Suggestions are highly appreciated.
    And if any body has a nice protocol for this, I will request to post it here too.
    Gracias por adelantado.

    if the cells are oldish (growing for >16hrs) I would avoid using them for PCR. This is true for both colonies and cultures.. cells growing more then 16hrs greatly increase their production of liposaccarides (slime!) which intefers with the PCR reaction.

    Otherwise (provide sufficient dilution) and the cells are 'fresh-young' there is no difference between the two methods. Personally I prefer doing my PCR on colonies.. i use colony PCR for screening purposes and doing the screen on colonies saves me a day.

    Use a 96 well plate to hold my colony dilutions.

    Fill 96 well plate with 50ul sterile distilled water
    Pick 1 isolated colony with pipette tip and place said colony into a well.
    Repeat as many times as desired.

    PCR mix per reaction (but this is usually made a single master mix)
    4.22 ul sterile distilled water
    1ul 2mM dNTP
    1ul 10X taq buffer
    0.5ul primer forward
    0.5ul primer reverse
    0.08ul Taq
    0.2ul 50mM MgCl2

    Add PCR mix into 96 Well PCR plate. Then add

    1 = 95 Celsius (4min)
    2 = 94 Celsius (30 sec) melting
    3 = Tm (30 sec) anealing
    4 = 72 Celsius (1min) extention

    Of course the above conditions can be changed. the time for each step is a little too long, but I don't bother to optimise it for each individual screen.

    EDIT: The primer concentration is 10mM, made by diluting a master stock (100mM) with sterile distilled water.

    if the cells are oldish (growing for >16hrs) I would avoid using them for PCR. This is true for both colonies and cultures.. cells growing more then 16hrs greatly increase their production of liposaccarides (slime!) which intefers with the PCR reaction.

    Otherwise (provide sufficient dilution) and the cells are 'fresh-young' there is no difference between the two methods. Personally I prefer doing my PCR on colonies.. i use colony PCR for screening purposes and doing the screen on colonies saves me a day.

    Use a 96 well plate to hold my colony dilutions.

    Fill 96 well plate with 50ul sterile distilled water
    Pick 1 isolated colony with pipette tip and place said colony into a well.
    Repeat as many times as desired.

    PCR mix per reaction (but this is usually made a single master mix)
    4.22 ul sterile distilled water
    1ul 2mM dNTP
    1ul 10X taq buffer
    0.5ul primer forward
    0.5ul primer reverse
    0.08ul Taq
    0.2ul 50mM MgCl2

    Add PCR mix into 96 Well PCR plate. Then add

    1 = 95 Celsius (4min)
    2 = 94 Celsius (30 sec) melting
    3 = Tm (30 sec) anealing
    4 = 72 Celsius (1min) extention

    Of course the above conditions can be changed. the time for each step is a little too long, but I don't bother to optimise it for each individual screen.

    if the cells are oldish (growing for >16hrs) I would avoid using them for PCR. This is true for both colonies and cultures.. cells growing more then 16hrs greatly increase their production of liposaccarides (slime!) which intefers with the PCR reaction.

    Otherwise (provide sufficient dilution) and the cells are 'fresh-young' there is no difference between the two methods. Personally I prefer doing my PCR on colonies.. i use colony PCR for screening purposes and doing the screen on colonies saves me a day.

    Hi, I've been getting negative results all this time for my colony pcr screen! White colonies with negative results really depressing
    My colonies have been on the plate for 2 days (unfortunately) cause they were really too small to be picked.
    Would it also matter if I had resuspended the colonies in LB (5ul) instead of sterile water? Had realised you used 50ul!!
    Maybe i should try out your dilution method as well.

    yes, I certainly agree. Do dilute your colony solution. If the colony solution is too concentrated, the PCR reaction will either fail or become very smeary.

    If only a small amount of LB entered the PCR mix, 2ul or so, there should not be any effect. But personally I use sterile distilled water. Should I decide to keep the colonies in the 96 well plate for an extended time (>2 days), I later add LB to the wells.

    Hi perneseblue,
    I just added another 50ul of distilled water as u suggested.
    But unfortunately, still nothing turned up
    Have tried on 36 samples !

    Did u do any serial dilutions, or change the volumes of Colony dilutons for your PCR screen?
    Anyway, I'll be repeating the TA cloning step once more since my plate is about 4days old now

    Is there any other factors other than colony dilutions? I've browsed through the forum and it seems that there are also other members facing similar problems: picking up white colonies but not finding the inserts

    I'd like to foresee any upcoming problems and be mentally prepared

    Hi perneseblue,
    I just added another 50ul of distilled water as u suggested.
    But unfortunately, still nothing turned up
    Have tried on 36 samples !

    Did u do any serial dilutions, or change the volumes of Colony dilutons for your PCR screen?
    Anyway, I'll be repeating the TA cloning step once more since my plate is about 4days old now

    Is there any other factors other than colony dilutions? I've browsed through the forum and it seems that there are also other members facing similar problems: picking up white colonies but not finding the inserts

    I'd like to foresee any upcoming problems and be mentally prepared

    1. Add 100 uL water to desired number of wells in a PCR plate or tubes.
    2. Toothpick colony into each well or add 10 uL of overnight culture
    3. Heat in thermal cycler to 95C for 5 or 10 minutes. Heat blocks are not recommended, as the protocol does not work as well if the temperature is 93C rather than 95C.
    4. Spin down the plate or tubes so that any cell debris is pelleted at the bottom of the tube/well. This removes the inhibitory components from the supernatant.
    5. Carefully transfer 25 uL of supernatant to the PCR reaction, being careful not to disturb the bottom of the tube/well, even if you can't see any pellet.
    6. PCR with forward and reverse to check for single/double inserts. Use vector only for a control.

    hi makosad05 and tfitzwater,

    Thanks for your replies!
    I use the same primers as my inserts, 40cycles
    my PCR reaction is 10ul

    Hi perneseblue,
    I just added another 50ul of distilled water as u suggested.
    But unfortunately, still nothing turned up
    Have tried on 36 samples !

    Did u do any serial dilutions, or change the volumes of Colony dilutons for your PCR screen?
    Anyway, I'll be repeating the TA cloning step once more since my plate is about 4days old now

    Is there any other factors other than colony dilutions? I've browsed through the forum and it seems that there are also other members facing similar problems: picking up white colonies but not finding the inserts

    I'd like to foresee any upcoming problems and be mentally prepared

    The PCR product size. I find that under colony PCR conditions, Taq polymerase is reliably only for amplification of 900bp products and below. Anything larger, and the reaction's success becomes uncertain. If your product is on the large side, I would try reducing the extention temperature (to around 70 Celsius - 68 Celsius) compensating by increased extention time. (50% longer)

    tm- what is the tm of your primers? Like any PCR reaction, all rules concerning primers design apply. There shouldn't be too large a difference between primers melting temperature.

    The rule of the tumb for annealing tempearture is (tm - 5 Celsius). You can reduce the annealing temperature, a little further.

    I would also consider testing more colonies, up to 72.

    Lastly, there is there is the possibility that there the colony PCR isn't working because there aren't any colonies which are positive.


    Principles of Molecular Techniques

    Faramarz Naeim , . Wayne W. Grody , in Atlas of Hematopathology , 2013

    Related Amplification Techniques

    A large number of innovations to the basic PCR technique have been developed over the years to address particular applications or to circumvent certain pitfalls. Included are such techniques as nested PCR, whole-genome amplification, inverse PCR, hot-start PCR, allele-specific PCR, cold PCR, and many others. For the most part they are beyond the scope of this chapter, but will be mentioned in the context of particular disease applications where relevant elsewhere in the book. In addition, a number of non-PCR amplification techniques have been developed over the years, such as Q-β replicase, ligation chain reaction, etc., but for the most part they have fallen by the wayside in favor of PCR, at least for applications relevant to hematopathology (some are used in molecular microbiology and genetics testing).


    Ver el vídeo: Mezclar en MONO. El gran secreto de las mezclas Profesionales? (Mayo 2022).