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¿Son necesarios el bFGF y / o EGF en el medio de expansión NSC?

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Tengo entendido que no es necesario, ya que parece que la idea detrás de una capa alimentadora es que las células madre producen su propio bFGF y EGF junto con otros factores de crecimiento. Sin embargo, todavía he visto algunos artículos (por ejemplo, este que estoy tratando de reproducir), utilícelo en medios utilizados para el mantenimiento de NSC (su cultivo progenitor neuronal contiene ambos). Este documento parece sugerir que una capa de alimentación para NSC es innecesaria, lo que tendría sentido, pero quería saber cuál es la práctica común y el método más sólido y cómo se relaciona con estos hallazgos. Por eso me gustaría escuchar de mi experiencia personal, pero las referencias también son obviamente útiles.


Un nuevo papel de Gab2 en la supervivencia celular mediada por bFGF durante la diferenciación neuronal inducida por ácido retinoico y # x02013

Las proteínas Gab amplifican e integran señales estimuladas por muchos factores de crecimiento. En cultivos y animales, el ácido retinoico (RA) induce la diferenciación neuronal. Mostramos que la expresión de Gab2 se detecta en neuronas en tres modelos de diferenciación neuronal: células madre de carcinoma embrionario (CE), células madre embrionarias y células madre neurales primarias (NSC). El tratamiento de la AR induce la apoptosis, contrarrestada por FGF básico (bFGF). En las células EC, el silenciamiento de Gab2 da como resultado hipersensibilidad a la apoptosis inducida por RA y anula la protección por bFGF. La supresión de Gab2 reduce la activación dependiente de bFGF de AKT pero no ERK, y AKT constitutivamente activa, pero no MEK1 constitutivamente activa, revierte la hipersensibilización. Por tanto, la activación de AKT mediada por Gab2 es necesaria para la protección de bFGF. Además, el silenciamiento de Gab2 altera la diferenciación de las células EC en neuronas. De manera similar, en las NSC, la supresión de Gab2 reduce la proliferación dependiente de bFGF así como la supervivencia y producción neuronal tras la diferenciación. Nuestros hallazgos proporcionan la primera evidencia de que Gab2 es un actor importante en la diferenciación neuronal, en parte al actuar aguas abajo de bFGF para mediar la supervivencia a través de la fosfoinositido 3 quinasa & # x02013AKT.


Introducción

Las células madre neurales (NSC) tienen la capacidad de autorrenovación y pueden diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Desempeñan un papel importante en el desarrollo del sistema nervioso central embrionario y continúan funcionando durante la edad adulta 1, 2, 3. La proliferación y diferenciación de las NSC dependen de señales de nicho microambiental 4, 5, que incluyen una serie de factores de crecimiento como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) 6.

El VEGF se identificó originalmente como un mediador principal de la angiogénesis 7, 8. Desempeña un papel importante en la mediación de la permeabilidad vascular y la regeneración tisular 9, 10. En la mayoría de ocasiones, el VEGF ejerce su acción a través de su receptor, Flk-1, en células endoteliales, células madre / progenitoras hematopoyéticas y algunas células tumorales 11, 12, 13, 14. En el sistema nervioso central (SNC), por ejemplo el hipocampo, el VEGF estimula la expansión de las NSC y la neurogénesis en varios modelos animales, lo que mejora la capacidad de aprendizaje 15, 16, 17, 18. En los adultos, las NSC se encuentran muy próximas a los vasos sanguíneos y rodeadas por células gliales en el hipocampo y la zona subventricular. Estudios anteriores de otros sugirieron que tanto las células vasculares como las células gliales pueden servir como un nicho para las NSC 19, 20. Dado que ambos tipos de células expresan VEGF y bFGF 21, planteamos la hipótesis de que estos dos factores de crecimiento pueden servir como señales de nicho para las NSC.

Hay una serie de observaciones que sugieren que el bFGF también puede modular la neurogénesis, tanto en vivo y in vitro. En primer lugar, el bFGF y su principal receptor, FGFR-1, están presentes en el SNC del ratón durante la corticogénesis 22. En segundo lugar, el bFGF es secretado por las células del cerebro a través de un proceso de exocitosis dependiente de la energía 23. En tercer lugar, durante la fase inicial del desarrollo, las células progenitoras neurales proliferan en respuesta al bFGF durante la fase neurogénica 24, 25. Se ha informado que la desactivación del bFGF durante los períodos críticos del desarrollo cerebral condujo a una reducción general de la proliferación de progenitores y la posterior diferenciación neuronal 26, 27.

Para evaluar las funciones de VEGF y bFGF en la regulación de NSC, utilizamos una población casi homogénea de NSC derivadas de células madre embrionarias de ratón (ES) para probar la hipótesis de que bFGF y VEGF regulan coordinadamente la proliferación de NSC.


Métodos

Cultivo de células

Agregados de células pancreáticas empobrecidas en islotes de donantes humanos (10 en total 39 años y # x000b119 años peso corporal 72 y # x000b113 kg) fueron amablemente proporcionados por el Dr. Garth Warnock y el Dr. Ziliang Ao en el Laboratorio de Trasplante de Islotes Humanos de Ike Barber (Vancouver, BC). , Canadá). Los pancreata se obtuvieron con el consentimiento informado por escrito de los miembros de la familia bajo la aprobación de la Junta de Ética de Investigación Clínica de la Universidad de Columbia Británica. Los grupos de células recibidos el día 0 se lavaron dos veces en medio CMRL con 10 & # x00025 suero fetal bovino, 100 unidades / ml de penicilina y 100 & # x000b5g / ml de estreptomicina (todos de Invitrogen, Carlsbad, CA), denominada CMRL & # x0002b10 & # x00025 Medio FBS. Luego, los racimos se dispersaron o sembraron durante la noche en medio CMRL & # x0002b10 & # x00025 FBS a 1 & # x000b5L de volumen de células empaquetadas (PCV) / cm 2 (tubos PCV, Techno Plastic Product, Trasadingen, Suiza) en matraces tratados con cultivo de tejidos (Sarstedt, N & # x000fcmbrecht, Alemania) antes de la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) el día 1. Se sembraron células sin clasificar o clasificadas a 1,25 & # x000d710 5 células / cm 2 en 0,32 ml / cm 2 CMRL & # x0002b10 & # x00025 medio FBS en placas que contiene 0,32 ml / cm 2 de medio preincubado y cultivado a 37 & # x000b0C, 5 & # x00025 CO2 y 90 & # x00025 humedad. Las células vivas se enumeraron mediante exclusión con azul tripán usando un contador de células Cedex (Roche Innovatis, Bielefeld, Alemania). Los cultivos sin clasificar y clasificados por MACS se mantuvieron en medio CMRL & # x0002b10 & # x00025 FBS durante 8 días, con intercambios de medio los días 2, 5 y 7. Para el desarrollo y selección del ensayo sin suero, los cultivos se acortaron a 6 días con medio intercambios en los días 2 y 5. El medio basal libre de suero CMRL-0.1X ITS consistió en CMRL con 0.5 mg / L de insulina & # x0002b0.5 mg / L de transferrina & # x0002b0.5 & # x000b5g / L de selenito (es decir, 0.1 veces I -1884 de Sigma), nicotinamida 10 mM y BSA 0,2 & # x00025 (STEMCELL, BC, Canadá). Las soluciones de prueba contenían 0.1 & # x00025, 1 & # x00025 o 10 & # x00025 FBS (Invitrogen), o 50 & # x00025 medio acondicionado con fibroblastos pancreáticos diluido en CMRL-0.1X ITS. Los siguientes factores de crecimiento humanos recombinantes también se probaron a 20 ng / ml a menos que se indique lo contrario: factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF, STEMCELL), factor de crecimiento epidérmico (EGF, STEMCELL), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF, Sigma), factor de crecimiento de queratinocitos ( KGF, Sigma), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, Sigma). Una hora después del último intercambio de medio, se añadió 10 & # x000b5M de 5-Bromo-2 & # x02032-desoxi-uridina (BrdU, Labeling and Detection Kit II, Roche, Basilea, Suiza) y se incubó durante 20 h antes de la fijación. tinción y análisis Cellomics.

Medio acondicionado

Células pancreáticas enriquecidas en CD90 pasadas (P3 a P8) cultivadas en medio CMRL & # x0002b10 & # x00025 FBS hasta alcanzar una confluencia de 90 & # x00025 (& # x0223c6 & # x000d710 4 células / cm 2) se trataron con 10 & # x000b5g / mL de mitomicina c ( Sigma) durante 1 h, se lavó 3 veces y se incubó durante 24 h en CMRL-0.1X ITS, luego se esterilizó por filtración y se almacenó a & # x0221280 & # x000b0C.

Dispersión celular

Los grupos de células se lavaron dos veces con medio de dispersión (EDTA 1 mM de Invitrogen, HEPES 10 mM de Sigma y albúmina de suero bovino 0,5 & # x00025 de STEMCELL preparada en Ca 2 & # x0002b y HBSS libre de Mg 2 & # x0002b de Invitrogen), luego se re -suspendió a 0,05 ml de PCV / ml en medio de dispersión y se mantuvo a 37 ° C durante 7 min con agitación de 75 rpm. Los racimos se digirieron durante 10 min a 37 ° C mediante la adición de 25 ° C de tripsina y 4 ° C de 5 g / ml de DNasa (Sigma). Después de añadir medio FBS CMRL & # x0002b10 & # x00025, las células se trituraron y se filtraron a través de un tamiz de nailon de 40 & # x000b5m (BD Biosciences). El rendimiento celular total basado en PCV fue 43 & # x000b17 & # x00025, proporcionando 168 & # x000b139 millones de células vivas dispersas / ml de grupos de tejido iniciales de PCV.

Clasificación de células activadas magnéticamente

Las células adherentes de los grupos no dispersos se lavaron con tampón MACS que consistía en Ca 2 & # x0002b y solución salina tamponada con fosfato (PBS) libre de Mg 2 & # x0002b con 1 & # x00025 FBS, EDTA 2 mM, 100 unidades / ml de penicilina y 100 & # x000b5g / mL de estreptomicina. Las células se tripsinizaron, trituraron después de añadir medio CMRL & # x0002b10 & # x00025 FBS y luego se filtraron a través de un filtro de células 40 & # x000b5m (BD Biosciences), produciendo 0,17 & # x000b10,05 & # x000d710 6 células / cm 2 el día 1. Las células luego se lavaron dos veces con tampón MACS y se resuspendieron a & # x022642 & # x000d710 7 células / ml en & # x0226550 & # x000b5L tampón MACS. Se añadió un volumen igual de anticuerpo primario para obtener 1 & # x02236100 anti-Ca19-9 de ratón (# NCL-L-CA19-9, Leica Microsystems, Alemania) o 1 & # x02236500 anti-CD90 de ratón (# 555593, BD Pharmingen, CA ). Después de incubar durante 25 min en hielo a 75 rpm de agitación, las células se lavaron dos veces con tampón MACS. El marcaje magnético se realizó usando anticuerpo IgG1 de cabra o rata anti-ratón marcado con microperlas (nº 130-048-402 o nº 130-047-102, Miltenyi Biotec, Alemania). Las células se resuspendieron a 4 & # x000d710 6 células / ml y se separaron usando el programa & # x0201cpossel & # x0201d (para Ca19-9) o & # x0201cdepletes & # x0201d (para CD90) de un separador de células Automacs & # x000ae (Miltenyi). El rendimiento total de células vivas de MACS fue 60 & # x000b13 & # x00025.

Citometría de flujo

Las células adherentes se lavaron con PBS, se tripsinizaron, se trituraron después de añadir tampón FACS (PBS & # x0002b10 & # x00025 FBS) y se filtraron a través de un filtro de 40 & # x000b5m. Las células mantenidas en hielo se lavaron luego dos veces con tampón FACS, se distribuyeron para obtener 2,5 & # x000d710 5 células / muestra, se centrifugaron y se resuspendieron en 50 & # x000b5L. Luego, se añadieron 50 & # x000b5L de anticuerpo primario diluido en tampón FACS (mismas concentraciones que para MACS), seguido de incubación de 25 min a 75 rpm. Las células se lavaron dos veces, se resuspendieron en 50 & # x000b5L y se añadieron 50 & # x000b5L de IgG anti-ratón de cabra marcada con Alexa 647 (A21450, Invitrogen) para obtener una dilución 1 & # x02236200. Después de 15 min de incubación en la oscuridad a 75 rpm, se añadieron 10 & # x000b5L de yoduro de propidio a 100 & # x000b5g / mL (Sigma, en PBS). Las células se lavaron dos veces, se resuspendieron en 500 & # x000b5L de tampón FACS y se analizaron en un citómetro de flujo BD FACSCalibur. El análisis de datos, incluida la compensación, se realizó con el software Flowjo 7.2.5 (Tree Star, Ashland, OR).

Inmunocitoquímica y Celómica

La fijación y tinción celular con BrdU se realizó de acuerdo con las instrucciones del kit BrdU (Roche), excepto para diluir los anticuerpos primarios y secundarios 1 & # x0223620. Para las muestras que no requirieron marcaje con BrdU, las células se fijaron con fijador de Bouin durante 15 min y se almacenaron en etanol 70 & # x00025. La recuperación del antígeno CK19 o Ki67 se realizó calentando en microondas 6 veces durante 5 sa 1000 W en citrato 10 mM (Sigma) a pH 6,0 y las células se permeabilizaron mediante una incubación de 10 min en 0,25 & # x00025 Triton X 100 (Sigma) disuelto en PBS. A menos que se indique lo contrario, todas las incubaciones posteriores se realizaron a temperatura ambiente y con agitación de 100 rpm. A continuación, todas las muestras se lavaron con PBS, se incubaron en solución de bloqueo (Dakocyotmation, Glostrup, Dinamarca) durante 15 minutos y luego se tiñeron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios en diluyente de anticuerpos (Dako). Los anticuerpos primarios fueron 1 & # x02236200 anti-insulina humana de cobaya (Dako A0564), 1 & # x022361000 anti-amilasa humana de conejo (Sigma A8273), 1 & # x02236200 de ratón anti-CK19 humana (Dako M0888), 1 & # x02236200 de ratón anti-humano vimentina (Dako M0725), 1 & # x0223650 Ki67 antihumano de conejo (Santa Cruz Biotech sc-15402, Santa Cruz, CA) y / o 1 & # x02236200 Ki67 antihumano de ratón (BD Biosciences 556003). Al día siguiente, las células se lavaron con PBS y se tiñeron durante 1 h en la oscuridad con anticuerpos secundarios (Alexa 488 de cabra anti-IgG de cobaya, Alexa 488 o 568 de cabra anti-IgG de conejo y / o Alexa 568 de cabra anti-IgG de ratón, todas de Invitrogen) a 1 & # x02236200 en diluyente de anticuerpos. Después, las muestras se lavaron, se tiñeron con 1 & # x000b5 g / ml de DAPI durante 15 min y se lavaron de nuevo. Se obtuvieron imágenes de las placas en un Cellomics ArrayScan VTI. Los portaobjetos se montaron con medio Vectashield (Vector Labs, Burlingame, CA) y se obtuvieron imágenes en un microscopio Zeiss Axioplan 2 (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania), utilizando el software de análisis ImageJ (NIH).

Diseño de experimentos y análisis estadístico

Los resultados representan los valores promedio obtenidos de 3 a 5 páncreas & # x000b1 error estándar de la media. Las comparaciones bidireccionales se basaron en las pruebas t de Student con valores p & # x0003c0.05 considerados significativos, con una prueba t pareada utilizada en el caso de la comparación entre el número de células CK19 & # x0002b y las lecturas de incorporación de BrdU. Para la comparación entre una respuesta basal y las respuestas normalizadas a la respuesta basal, se utilizaron intervalos de confianza con niveles de & # x003b1 de 0,05. Los efectos principales y de interacción de bFGF, EGF, HGF, KGF y VEGF se cuantificaron mediante un diseño factorial completo de dos niveles (nivel bajo 0 ng / mL nivel alto 20 ng / mL) con 8 puntos centrales (10 ng / mL de todos cinco factores). Para cada páncreas, estas 40 condiciones se repitieron en tres placas de 96 pocillos con diferente aleatorización en cada placa. Los resultados se analizaron con el software estadístico JMP 7.0 u 8.0 (SAS, Cary, NC). Las concentraciones del factor de crecimiento CI se transformaron en variables escaladas . El modelo fue el siguiente: hasta el efecto de interacción de quinto orden , dónde & # x003b2I Los valores representan los parámetros ajustados del modelo. Los subíndices F, E, H, K, V representan el & # x0201cI& # x0201d factores bFGF, EGF, HGF, KGF y VEGF. Luego, el modelo se redujo para excluir factores con valores p & # x0003e0.1.


Efecto de EGF y FGF sobre las propiedades de expansión de las células mesenquimales del cordón umbilical humano

Las células madre mesenquimales se han introducido cada vez más para tener un gran potencial en la medicina regenerativa, la inmunoterapia y la terapia génica debido a sus propiedades únicas de autorrenovación y diferenciación en múltiples linajes celulares. Los estudios han demostrado que estas propiedades pueden verse limitadas y cambiadas por la detención del crecimiento asociada a la senescencia en diferentes condiciones de cultivo. Este estudio tuvo como objetivo presentar la capacidad de algunos factores de crecimiento sobre la expansión de las células mesenquimales del cordón umbilical humano (hUCM) y la actividad de la telomerasa. Para optimizar el crecimiento de las células hUCM, se utilizaron el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) en los medios de cultivo, y se investigó la capacidad de estos factores de crecimiento en la expresión del gen de la transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT) y las fases del ciclo celular. . La expresión de ARNm de TERT aumentó en las células hUCM tratadas con EGF y FGF. Por tanto, las células hUCM no tratadas expresaron 30,49 ± 7,15% de TERT, mientras que las células tratadas con EGF expresaron 51,82 ± 12,96% y las células tratadas con FGF expresaron 33,77 ± 11,55% de TERT. La exposición de células hUCM a EGF o FGF también promovió la progresión de las células desde la fase G1 a la fase S del ciclo celular y las indujo a disminuir el número de células que entraban en la fase G2 / M. Nuestro estudio mostró que el EGF y, en menor medida, el FGF amplifican la proliferación y expansión de las células hUCM.

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Tratamiento con factor de crecimiento epidérmico (EGF) en células estromales multipotenciales (MSC). Posible mejora del potencial terapéutico de MSC

Las células estromales multipotenciales (MSC) de la médula ósea adulta son muy prometedoras en la medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos. Sin embargo, debido a su bajo número al momento de la recolección, las MSC deben expandirse in vitro sin sesgar la diferenciación futura para una utilidad óptima. En este documento conceptual, nos centramos en el uso potencial del factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento prototípico para mejorar la recolección y / o diferenciación de MSC. Se demostró que el EGF soluble aumenta la proliferación de MSC al tiempo que conserva los progenitores tempranos dentro de la población de MSC y, por lo tanto, no induce la diferenciación. Sin embargo, se demostró que la forma atada de EGF promueve la diferenciación osteogénica. También se demostró que el EGF soluble aumenta las secreciones paracrinas, incluidos VEGF y HGF de MSC. Por tanto, el EGF soluble puede usarse no solo para expandir MSC in vitro, sino también para mejorar la secreción paracrina a través de armazones encapsulados en MSC liberadores de fármaco in vivo. El EGF anclado también se puede utilizar para dirigir las MSC hacia el linaje osteogénico tanto in vitro como in vivo.

1. Células estromales multipotenciales / células madre mesenquimales (MSC)

1.1. Descripción general de MSC

Las células estromales multipotenciales de la médula ósea adultas / células madre mesenquimales (MSC) son células multipotentes con fuertes actividades paracrinas de varios factores de crecimiento [1-7]. Estas células se aislaron originalmente como células fibroblásticas adherentes formadoras de colonias o células fibroblásticas unitarias formadoras de colonias (UFC-F) a partir de una suspensión de médula ósea [8], pero posteriormente se descubrió que estas células tienen multipotencia capaz de diferenciarse en múltiples linajes celulares que incluyen osteoblastos, condrocitos, adipocitos, células de músculo liso, miocitos esqueléticos y cardíacos, células endoteliales y neuronas [3-6, 9, 10].

Inicialmente, la diferenciación de MSC y la incorporación directa en tejidos locales sometidos a cicatrización de heridas y regeneraciones tisulares se consideraban un mecanismo primario de acción de MSC, sin embargo, la contribución de la diferenciación de MSC y la incorporación directa en tejidos en regeneración sigue siendo debatida [11]. Por ejemplo, algunos grupos demostraron que las CMM se diferenciaron e incorporaron como miocardiocitos o células vasculares (células endoteliales y células de músculo liso vascular) en vasos recién formados en modelos de cardioplastia basados ​​en CMM en ratas (trasplante de CMM isogénico y alogénico) y porcino (trasplante alogénico). ) [11-14]. Las CMM humanas de la médula ósea adulta se injertaron y diferenciaron en cardiomiocitos dentro del miocardio de ratones SCID [15].Por el contrario, otro grupo mostró que las células derivadas de la médula ósea no se incorporaron en los vasos sanguíneos recién formados en la isquemia de las patas traseras en el modelo alogénico de trasplante de médula ósea en ratones [16]. La incorporación directa y la diferenciación de las MSC trasplantadas en queratinocitos y células vasculares también se demostró en el modelo de cicatrización de heridas dérmicas de ratones (trasplante alogénico de MSC) [17-19], mientras que otros mostraron que la diferenciación de MSC de las MSC trasplantadas en queratinocitos y células vasculares no se observó en modelo de curación de heridas dérmicas en ratones (trasplante alogénico de MSC) y modelos de isquemia de extremidades en ratones (trasplante isogénico de MSC) [20, 21]. Además, incluso cuando se observa una incorporación temprana en el tejido en regeneración, estas células desaparecen en gran parte en un mes [15]. La eficacia del injerto de MSC trasplantada fue variada, lo que sugiere la presencia de otros mecanismos de promoción de la regeneración tisular mediada por MSC [7, 11].

Uno de esos mecanismos es la secreción paracrina de factores de crecimiento y citocinas. Se sabe que las CMM tienen una fuerte capacidad paracrina de varios factores de crecimiento y citocinas como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), que promueven la angiogénesis y la cicatrización de heridas [7, 22-24]. De hecho, también se demostró que el medio condicionado de las CMM promueve la angiogénesis o la cicatrización de heridas en modelos animales, lo que sugiere el papel crucial de la acción paracrina de las CMM en la promoción de la angiogénesis y la cicatrización de heridas [21, 23, 25].

1.2. In vitro Expansión de MSC

Un impulso importante es el uso farmacológico de las CMM. Incluso si la participación fisiológica de las CMM es discutible, los estudios han demostrado que las CMM inyectadas en el hogar de los tejidos heridos [1, 2, 4, 5]. Sin embargo, la disponibilidad de un número suficiente de MSC que conserven su multipotencia y actividad paracrina es un requisito previo para el éxito de la terapéutica basada en MSC y la ingeniería de tejidos. Las CMM están presentes solo en baja frecuencia en la médula ósea (una en

células mononucleares de la médula ósea, menor frecuencia en hospedadores de edad avanzada) [5, 26], por lo tanto, las MSC recolectadas de la médula ósea para usos farmacológicos deben expandirse in vitro. Estas celdas son expandibles in vitro [3, 27] y esa es una de las características deseables de las MSC.

Actual in vitro Las estrategias de expansión generalmente se basan en el uso de suero fetal bovino, pero esta práctica no solo conlleva riesgos de enfermedad inherentes [28], sino que también dificulta la estandarización que es fundamental para establecer una adopción clínica amplia. Otro problema sobre la expansión actual de las MSC es la pérdida de los potenciales de diferenciación, proliferativos y terapéuticos de las MSC a través de in vitro proceso de expansión [29, 30]. Por lo tanto, existe una fuerte motivación para identificar factores que podrían usarse en formulaciones sin suero para expandir MSC in vitro sin perder la capacidad de diferenciación y para preservar la autorrenovación y los potenciales terapéuticos de las CMM indiferenciadas [31].

Un informe reciente encontró que una combinación de factores de crecimiento transformadoresβ (TGF-β), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), y los factores de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF) podrían reemplazar el componente del suero en el medio de cultivo celular para expandir las CMM humanas ex vivo sin comprometer el potencial de diferenciacións, al menos hasta 5 pasajes [32]. Posteriormente, se comercializaron medios de cultivo de MSC sin suero ni componentes animales (STEMPRO MSC SFM, de Invitrogen, Carlsbad, CA) (Kit de cultivo MesenCult-ACF, de STEMCELL Technologies, Vancouver, Canadá). Los fabricantes afirman que los medios de cultivo ejercen un potencial superior de proliferación de MSC mientras mantienen el potencial de diferenciación y el potencial de formación de colonias, como lo respalda al menos un estudio [33]. Esos medios definidos químicamente deberían ser más seguros y, por lo tanto, mejores para los entornos clínicos, aunque la composición patentada de estos medios de cultivo puede dificultar la aceptación en el uso preclínico y clínico.

1.3. Poblaciones heterogéneas dentro de las preparaciones de MSC

Aunque las CMM poseen un gran potencial proliferativo, tienen la capacidad de autorrenovación y dan lugar a progenies diferenciadas, se demostró que todas las poblaciones de CMM analizadas mediante ensayos clonales son heterogéneo, con células individuales capaces de varios potenciales de diferenciación y capacidad de expansión [34]. Por lo tanto, la Sociedad Internacional de Terapia Celular propuso que las MSC se nombraran como células estromales mesenquimales multipotenciales, que también pueden abreviarse como MSC [35]. Poblaciones de MSC in vitro se sabe que incluyen progenitores tempranos o células de autorrenovación rápida (RS), así como grandes células maduras / senescentes de replicación lenta. Son los progenitores tempranos o las células RS las que conservan una fuerte multipotencialidad para la diferenciación. Por el contrario, las células maduras / senescentes sólo tienen potenciales de diferenciación limitados, y estas células predominan en las MSC de múltiples pases [27, 29, 36].

Una de las características destacadas de las CMM es su capacidad para producir colonias después de ser sembradas a baja densidad [8]. La generación de una colonia derivada de una sola célula se basa en la presencia de progenitores tempranos o células RS en las preparaciones de MSC. En otras palabras, la evaluación de la unidad de formación de colonias (UFC) se puede utilizar para medir la proporción de progenitores tempranos que forman colonias en la población de MSC [29, 37, 38]

Se demostró que el número de CMM dentro de las células mononucleares de la médula ósea disminuye con la edad [26]. Además, se demostró que tanto las CMM de donantes antiguos como las CMM con muchos pases tenían una actividad paracrina disminuida y efectos protectores de órganos reducidos tras el trasplante [30, 39]. Estos informes sugieren claramente la importancia de preservar los progenitores tempranos o las células RS en la preparación de MSC para mantener los potenciales terapéuticos de las MSC.

1.4. Potenciales de expansión y diferenciación de MSC

Para preservar los progenitores tempranos dentro de las poblaciones de MSC, la autorrenovación de estas células debe mantenerse o incluso mejorarse mediante in vitro Proceso de expansión de MSC. De lo contrario, los progenitores tempranos se perderán durante in vitro expansión. La división celular es un paso central de la autorrenovación y expansión de estas células. Existen varios factores de crecimiento y citocinas que se sabe que funcionan como mitógenos, pero los factores de crecimiento ideales para in vitro La expansión de MSC debe suprimir reversiblemente o al menos no alterar el proceso de diferenciación posterior. En otras palabras, estos factores no deberían disminuir los potenciales de diferenciación de las CMM. Los factores de crecimiento o citocinas que promueven la diferenciación de las CMM en ciertos linajes no se pueden utilizar para in vitro La expansión de las MSC, ya que el proceso de diferenciación en sí mismo está antagonizando la autorrenovación de las MSC indiferenciadas, incluidos los progenitores tempranos, y la diferenciación comprometería la utilización de estas células.

Entre esos factores de crecimiento, nos hemos centrado en el factor de crecimiento epidérmico (EGF) como candidato para utilizar in vitro La expansión de las CMM como EGF estimula la proliferación de las CMM sin alterar el proceso de diferenciación y los potenciales [3].

2. EGF para mejorar la autorrenovación y la expansión de las MSC In vitro

2.1. Receptor EGF y EGF

El EGF se aisló originalmente del extracto de glándulas salivales de ratón como un factor que acelera la cicatrización de la herida corneal [40], pero pronto se reconoció que de hecho es un factor de crecimiento general que ejerce diversas acciones, incluida la migración y proliferación celular en una amplia variedad de células [41]. –43].

El receptor de EGF (EGFR / ErbB-1 o receptor 1 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER1)) es el receptor del factor de crecimiento prototípico con actividad intrínseca de tirosina quinasa. Se expresa ampliamente en muchos tipos de células, incluidos los linajes epiteliales y mesenquimales [42]. Tras la unión de al menos cinco ligandos genéticamente distintos (incluido EGF, factor de crecimiento transformante-

(TGF-) y EGF de unión a heparina (HB-EGF)), la tirosina quinasa intrínseca dentro de EGFR / ErbB-1 se activa y fosforila el propio receptor (autofosforilación) y numerosas moléculas diana aguas abajo. Las vías de señalización intracelular aguas abajo de EGFR / ErbB-1 incluyen la fosholipasa C

(PLC) y sus cascadas mediadas por calcio y proteína quinasa C (PKC), activación de ras que conduce a varias proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK), otras pequeñas GTPasas como rho y rac, transductor de señales múltiples y activador de la transcripción (STAT ) isoformas y proteínas G heterotriméricas, fosfatidilinositol

-OH quinasa (PI3K) y fosfolipasa D (PLD) [3, 42, 43].

Tras la unión y activación del ligando, EGFR / ErbB-1 sufre internalización desde la superficie celular a través del sistema endocítico recubierto de clatrina. Dentro del compartimento endosómico tardío ácido, tanto EGF como EGFR / ErbB-1 unido a EGF sufren degradación ya que EGF es un ligando no disociativo para EGF, mientras que EGFR / ErbB-1 unido a TGF se recicla de nuevo a la superficie celular después de la disociación de TGF- de EGFR / ErbB-1 [42]. Existe una evidencia creciente que sugiere que la activación preferencial y prolongada de EGFR / ErbB-1 de la superficie celular ejerce una actividad distinta de EGFR / ErbB-1 internalizado, ya que el EGF unido a la superficie promueve la propagación celular y la supervivencia de las MSC, mientras que el EGF soluble no lo hace. (Véase la discusión a continuación) [44].

2.2. EGF mejora la proliferación de MSC

EGF es un mitógeno prototípico para varios tipos de células. Las CMM humanas expresan EGFR / ErbB-1, y nosotros y otros demostramos el efecto mitógeno de EGF y HB-EGF en las CMM [3, 45]. La proliferación celular es una parte integral de la autorrenovación y expansión de las células y, por lo tanto, estos datos respaldan nuestra hipótesis de que el EGF se puede utilizar para in vitro Expansión de MSC, al menos en el entorno de cultivo a corto plazo, sin embargo, los efectos aditivos del tratamiento con EGF sobre la proliferación de MSC humana se vuelven menos claros en el cultivo a largo plazo (Figura 1), presumiblemente debido a la regulación a la baja de EGFR / ErbB1, como se analiza a continuación .


(a)
(B)
(a)
(B) Efecto de EGF sobre la proliferación de MSC humana primaria (a) y la duplicación acumulativa de la población (PD) (b). (a) El número de células de MSC humanas primarias aumenta aproximadamente 5,5 veces en el diluyente (Ctrl) en medio de cultivo suplementado con FBS al 17% en un período de tiempo de 120 horas (5 días). La adición de EGF (10 nM) proporciona un aumento adicional de los recuentos de células a 8,5 veces. Se sembró un total de 10000 células por cada pocillo en una placa de 12 pocillos y se midió el recuento de células de cada pocillo mediante Coulter Cell Counter Z2 (Beckman Coulter, Inc. Fullerton, CA). Mostrados son malos

s.e.m. de tres experimentos cada uno realizado por triplicado. Las diferencias en la proliferación se compararon entre el factor de crecimiento y el diluyente (Ctrl) expuestos (*

). (b) PD acumulada de MSC humanas primarias en el día 5 y 19 en la condición de cultivo igual que (a). Después del recuento de células en el día 5, se sembró el mismo número de células (un total de 1000) por cada pocillo en una placa de 6 pocillos y el recuento de células de cada pocillo se midió el día 19 mediante Coulter Cell Counter Z2 (Beckman Coulter, Inc. Fullerton , CA). Tenga en cuenta que la EP es mayor en el grupo tratado con EGF (2,54 en Ctrl, 3,07 en EGF) durante los primeros 5 días (*

El segundo aspecto de la expansión es mantener las unidades formadoras de colonias. En este aspecto, el tratamiento con EGF también tiene éxito. EGF conduce a un aumento estadísticamente significativo del 25% en las colonias que se pueden teñir (Figura 2), lo que sugiere que el tratamiento con EGF ayuda a preservar los progenitores tempranos dentro de las poblaciones de MSC humanas.


(a)
(B)
(a)
(B) Efectos del tratamiento con EGF (10 nM) sobre la formación de colonias de MSC humanas primarias. Se sembraron quinientas células en placa de 10 cm dentro de medio de cultivo suplementado con FBS al 17% y el número de colonias formadas (diámetro

1,5 mm) se contó manualmente el día 14. (a) Imagen representativa de colonias de MSC teñidas con violeta cristal. (b) Recuento de colonias de MSC. El número de colonia se da por 1000 células sembradas inicialmente (*

2.3. Potenciales de diferenciación EGF y MSC

El potencial de diferenciación múltiple es una característica clave de las CMM, que atrae tanta atención en el campo de la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa [4, 5]. El potencial de diferenciación en sí mismo debe preservarse a través de la in vitro Sin embargo, la expansión de las MSC, el proceso de diferenciación en curso en sí debe ser suprimido o no inducido al menos ya que antagoniza la autorrenovación y la expansión de las MSC indiferenciadas y limita el uso posterior de estas células.

Kratchmarova y sus colegas demostraron que la estimulación con EGF mejora la diferenciación osteogénica de las CMM humanas en presencia de señales químicas, mientras que el PDGF no [46]. A través del enfoque de proteómica basado en espectrometría de masas, identificaron PI3K como un interruptor molecular para apagar la señal pro-osteogénica de PDGFR.

Este informe contradice los informes de nuestro grupo y de otros. Nuestros datos muestran que el EGF por sí solo no induce la diferenciación en ausencia de señales químicas o de otro tipo, y no altera los procesos de diferenciación de las MSC humanas en linajes osteogénicos, adipogénicos y condrogénicos mediante señales químicas. in vitro [3]. Este hallazgo discrepante podría atribuirse a una señalización intracelular diferente, ya que la vía de la proteína quinasa B / akt de PI3K se activa en el sentido descendente de EGFR / ErbB-1 en nuestro informe [3], mientras que esta vía no está activada en su informe [46 ]. La razón aparente de esta discrepancia no está clara, pero una diferencia destacada es la concentración de EGF en nuestro informe se utilizó EGF 10 nM [3], mientras que Kratchmarova y sus colegas utilizaron 83 nM de EGF en su informe [46]. Esta especulación está respaldada por un informe reciente que muestra que el EGF 80 pM inhibe la diferenciación osteogénica de las CMM humanas [47]. Krampera y su colega también demostraron que HB-EGF (2,3 nM) inhibe la diferenciación osteogénica de MSC inducida por señales químicas [45]. Las MSC humanas no expresan ErbB-4, otro receptor para HB-EGF, tanto EGF como HB-EGF se unen solo a EGFR / ErbB-1 en MSC, y la cascada de señalización descendente es similar [3, 45].

¿Los agonistas de EGFR / ErbB1 ejercen efectos tanto positivos como negativos sobre la diferenciación osteogénica de MSC de una manera dependiente de la concentración? Y si es así, ¿cuál es el mecanismo subyacente? Esta pregunta aún no se ha resuelto, pero nosotros y nuestros colaboradores estamos utilizando una superficie de EGF inmovilizada y atada de una manera que proporciona algunas pistas importantes [44, 47]. El EGF unido bloquea la internalización endocítica de EGFR / ErbB1 y mejora la diferenciación osteogénica al proporcionar una activación sostenida de la señalización descendente a través de EGFR / ErbB1, mientras que 80 pM de EGF soluble interfiere con la diferenciación osteogénica al inducir la internalización del receptor y la degradación posterior [47], de acuerdo con los datos de Krampera. [45]. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la señalización débil y temporal de baja concentración de EGF soluble ejerce efectos anti-osteogénicos, mientras que la señalización sostenida fuerte de EGF unido ejerce señalización pro-osteogénica en MSC (Figura 3). Informes anteriores han demostrado que la activación de la vía ERK / MAPK, una de las principales vías de señalización en la cadena descendente de EGFR / ErbB-1 [3, 42], promueve la diferenciación osteogénica de MSC [48-50]. De acuerdo con estos informes, se ha observado una activación fuerte y sostenida de la vía ERK / MAPK en las CMM cultivadas en la superficie de EGF atada [44, 47] y, por lo tanto, la vía ERK / MAPK podría ser una de las principales vías de señalización pro-osteogénicas en aguas abajo de EGFR / ErbB-1.


Modelo simplificado para los efectos de la señalización EGFR / ErbB1 en la diferenciación osteogénica de MSC. La estimulación débil y temporal de EGFR / ErbB1 ejerce efectos anti-osteogénicos, mientras que la estimulación fuerte y sostenida de EGFR / ErbB1 ejerce efectos pro-osteogénicos sobre MSC.

Otras posibles razones de la discrepancia general sobre los efectos de EGF en la diferenciación de MSC incluyen la heterogeneidad de las preparaciones de MSC humanas, incluidas las primarias o inmortalizadas. Kratchmarova y sus colegas utilizaron CMM humanas inmortalizadas por la transcriptasa inversa de telomerasa humana (hTERT) [46], mientras que Krampera y su colega utilizaron CMM humanas primarias [45]. Nosotros y el grupo de Griffith también usamos clon AOC (adipogénico, osteogénico, condrogénico) de MSC humanas inmortalizadas por hTERT [3, 47, 51]. Como las CMM inmortalizadas se derivaron de un solo clon, es posible que los resultados discrepantes entre el grupo de Kratchmarova y nuestro grupo se deban al sesgo de selección del clon. La heterogeneidad también existe incluso dentro de la preparación primaria. Los niveles de expresión de EGFR / ErbB-1 son muy variables en cada clon de preparación de MSC humana, con una diferencia de hasta 77 veces entre los clones [52]. En este informe, no se observó una correlación significativa entre los niveles de EGFR / ErbB-1 y la capacidad de diferenciación osteogénica, aunque los niveles de EGFR / ErbB-1 en promedio fueron más altos en las colonias no formadoras de hueso que en las colonias formadoras de hueso. Los patrones de fosforilación de proteínas tirosina aguas abajo de EGFR / ErbB-1 también parecían heterogéneos entre las colonias. Por lo tanto, es probable que exista heterogeneidad no solo en los niveles de expresión de EGFR / ErbB-1, sino también en las vías de señalización aguas abajo de EGFR / ErbB-1 incluso dentro de la misma preparación de MSC, lo que también debería contribuir a la discrepancia general sobre la efectos de EGF en la diferenciación de MSC.

Como vemos anteriormente, los informes sobre agonistas de EGFR y sus efectos sobre la diferenciación de MSC en curso todavía proporcionan directivas discrepantes debido principalmente a diferentes condiciones de EGF y estímulos externos. Aún así, debemos enfatizar que tanto nuestro informe como el informe de Krampera están de acuerdo en que el tratamiento con EGF o HB-EGF no disminuye los potenciales de diferenciación de MSC [3, 45]. No hay informes que muestren que el EGF solo en ausencia de señales químicas osteogénicas promueva la diferenciación osteogénica de las MSC. In vitro La diferenciación de MSC en linajes adipogénicos y condrogénicos no fue alterada por EGF soluble [3]. Por lo tanto, el EGF soluble todavía se puede usar para expandir las MSC in vitro sin inducir la diferenciación o sacrificar los potenciales de diferenciación.

3. Tratamiento con EGF para mejorar el potencial terapéutico de la MSC

3.1. EGF mejora la motilidad de MSC

Numerosas actividades celulares, hormonales, matriciales y enzimáticas están involucradas en los procesos de reparación de heridas y regeneración de tejidos. El EGF es uno de los factores de crecimiento fundamentales presentes en el lecho de la herida, que acelera la reparación de la herida junto con otros factores de crecimiento como el PDGF. Se demostró que la aplicación tópica de EGF recombinante acelera la epitelización del proceso de cicatrización de heridas, incluida la úlcera del pie diabético [53, 54].

El EGF es secretado por las plaquetas y los macrófagos en los tejidos heridos [55]. HB-EGF es abundante en ECM [56]. Tanto EGF como HB-EGF estimulan la proliferación y migración de fibroblastos y queratinocitos. De manera similar, las MSC trasplantadas en los tejidos heridos deben proliferar y repoblarse para promover los procesos de curación de heridas y regeneración de tejidos en las terapias basadas en MSC. Nosotros y otros demostramos que tanto EGF como HB-EGF provocan una respuesta mitogénica y motogénica de las MSC in vitro [3, 45, 52]. Por tanto, se especula que las respuestas mitógenas y motogénicas de las MSC inducidas por EGF desempeñan un papel en la regulación de la proliferación y repoblación de las MSC en los tejidos heridos.

Los ligandos EGFR / ErbB1 existen no solo en forma soluble, sino también dentro de múltiples repeticiones similares a EGF de moléculas de matriz extracelular como tenascina y laminina. en vivo [57]. Anteriormente hemos demostrado que estas repeticiones similares a EGF dentro de la tenascina C se unen a EGFR / ErbB1 y producen señalización intracelular que promueve la motilidad celular y la adhesión, similar al EGF unido [58, 59]. La tenacina C es producida por queratinocitos y fibroblastos durante el proceso de cicatrización de heridas, por lo que podría servir como ligandos endógenos similares a EGF anclados y producir pistas promigratorias para fibroblastos o CMM implantadas dentro de los bordes de cicatrización de heridas [57, 60].

Aunque la motilidad permite a las MSC reposicionarse en los tejidos heridos, podría hacer un control preciso de en vivo Difícil distribución celular. Un posible enfoque es crear gradientes de concentración o patrones de EGF anclado dentro de andamios embebidos en MSC.La actividad motogénica del EGF se conserva en la forma atada, ya que se informó que los queratinocitos humanos en gradientes de EGF atados migran en la dirección de una mayor concentración de EGF unido [61]. La forma atada de EGF permite un control más preciso de la concentración y el patrón de EGF dentro de los microambientes tisulares y uno que dura más tiempo. Esta conexión de ligando motogénico a la matriz formadora de espacio debería ser una herramienta poderosa en el campo de la ingeniería de tejidos.

3.2. EGF mejora las actividades paracrinas de MSC

La terapéutica basada en MSC se basa en gran medida en la fuerte capacidad de secretar diversos factores de crecimiento y citocinas para promover la angiogénesis, la reparación de heridas y la regeneración de tejidos [7, 21-25]. Se requiere que las CMM se trasplanten a los tejidos heridos, que de otra manera no sanarán. En vivo Los microambientes de estas heridas que no cicatrizan se caracterizan por la falta de oxígeno y nutrientes debido al flujo sanguíneo comprometido y por mediadores proinflamatorios exuberantes [62-64]. Las MSC son necesarias para producir moléculas bioactivas incluso en esos entornos hostiles para ejercer efectos de regeneración de tejidos. De hecho, se demostró que el mediador proinflamatorio factor de necrosis tumoral alfa (TNF-) o lipopolisacárido (LPS) mejora las funciones paracrinas y autocrinas de las CMM [65]. Además, se demostró que TGF-, otro ligando de EGFR / ErbB1, aumentaba aún más la secreción de VEGF de las MSC ya reguladas positivamente por la estimulación de TNF- de una manera dependiente de p42 / 44 MAPK [66, 67].

Nuestro in vitro Los datos mostraron que el tratamiento con EGF de las CMM promueve aún más la secreción de VEGF y HGF, pero no de bFGF (Figura 4), de acuerdo con un estudio anterior [65]. Tanto el VEGF como el HGF desempeñan un papel fundamental en la cicatrización acelerada de heridas mediada por MSC al inducir la angiogénesis y mejorar el suministro de oxígeno a los tejidos isquémicos [7, 21, 68-70].


(a)
(B)
(C)
(a)
(B)
(C) Efectos del tratamiento con EGF (10 nM) sobre las actividades paracrinas de las CMM primarias humanas. Las MSC se cultivaron en medio de cultivo sin suero con y sin EGF (10 nM) durante 24 horas. Las concentraciones de VEGF (a), HGF (b) y bFGF (c) dentro de los medios acondicionados se midieron mediante ELISA y se estandarizaron a la cantidad total de contenido de proteína celular (*

Por lo tanto, es probable que los ligandos solubles de EGFR / ErbB1 (TGF-, EGF y HB-EGF) mejoren las funciones paracrinas y autocrinas de las MSC no solo in vitro, pero también en vivo, incluso en los microambientes inflamatorios dentro de los tejidos heridos que no cicatrizan. También es probable que el EGF anclado mejore las funciones paracrinas y autocrinas de las CMM. in vitro al igual que en vivo a través de la activación fuerte y sostenida de la vía p42 / 44 MAPK en la parte inferior de EGFR / ErbB1 [44]. Se especula que los ligandos EGFR / ErbB1 solubles y anclados promueven la cicatrización de heridas y el proceso de regeneración tisular mediante la estimulación de la secreción de factores de crecimiento angiogénicos de las MSC trasplantadas. en vivo. Se necesitan más estudios para dilucidar el papel de los ligandos solubles de EGFR / ErbB1 y el EGF anclado en los efectos paracrinos y autocrinos de las MSC. in vitro al igual que en vivo.

3.3. ¿El EGF mejora los potenciales terapéuticos de la MSC?

EGF estimula la proliferación celular y mejora la autorrenovación de las MSC, especialmente los progenitores tempranos indiferenciados dentro de las preparaciones de MSC in vitro. La presencia de progenitores tempranos es fundamental para las terapias basadas en MSC, ya que las MSC de donantes antiguos y las MSC con muchos pases han disminuido la actividad paracrina y los efectos protectores de los órganos durante el trasplante, presumiblemente a través de la pérdida de los progenitores tempranos [27, 29, 30, 36, 39 ]. El tratamiento con EGF también mejora la motilidad celular, que es necesaria para la repoblación de MSC dentro del lecho de la herida. El tratamiento con EGF aumenta aún más la secreción paracrina de VEGF y HGF, los cuales mejoran la angiogénesis y promueven la cicatrización de heridas y la regeneración de tejidos, siendo también estimulantes para las células adherentes residentes dentro del lecho de la herida. En conjunto, es razonable suponer que in vitro El tratamiento de MSC con ligandos EGFR / ErbB1 mejora el potencial terapéutico de las MSC. Esto podría ser probado por en vivo estudio.

También es razonable plantear la hipótesis de que la estimulación EGFR / ErbB1 en MSC mejora los potenciales terapéuticos de las MSC en vivo, presumiblemente mediante el aumento de la actividad paracrina y el ejercicio de actividades mitógenas y motogénicas de las CMM. Los andamios biodegradables son un enfoque prometedor para apoyar la liberación celular, guiar la proliferación y diferenciación de las células [71]. También se encuentran disponibles andamios de administración de fármacos o andamios de liberación de factores de crecimiento, lo que permite la liberación controlada del factor de crecimiento [72]. La disponibilidad de EGF es menos predecible en vivo Sin embargo, en el entorno, los andamios de liberación lenta de EGF permiten una mejor predicción de la concentración de EGF dentro de los microambientes. en vivo, por lo tanto, in vitro Los hallazgos deberían traducirse mejor al en vivo Los entornos y el papel del EGF en las terapias basadas en MSC podrían evaluarse mejor.

Además de los ligandos solubles de EGFR / ErbB1, el EGF unido podría otorgar un potencial terapéutico aún mayor a las CMM. En primer lugar, el EGF unido ejerce efectos proliferativos y citoprotectores sobre las CMM [44, 73]. Los efectos terapéuticos de las MSC dependen en gran medida del número de MSC inyectadas [19], sin embargo, la baja viabilidad de las MSC posimplantes limita la eficacia general de las terapias basadas en MSC debido a los microambientes hostiles [15, 74]. Por tanto, la mejora de la supervivencia de las CMM posimplante debería aumentar la eficacia de los tratamientos basados ​​en las CMM. En segundo lugar, el EGF anclado proporciona señales pro-osteogénicas para las CMM, por lo que podría utilizarse tanto en in vitro y en vivo diferenciación osteogénica de las CMM. Este mecanismo podría jugar un papel importante en vivo, ya que se demostró que la laminina 5, que contiene repeticiones similares a EGF, estimula la diferenciación osteogénica de las CMM humanas mediante la activación de ERK en el tejido óseo [75]. Por lo tanto, el andamio incrustado en MSC con EGF anclado podría ser potencialmente aplicable a estudios en humanos actuales, como el imperfecta osteogénico [76-78].

El desafío de trasladar los hallazgos teóricos a la cabecera de las camas siempre reside en pasar de in vitro para en vivo estudios y luego en personas. Si bien no podemos prever todos los obstáculos, el principal desafío en esta traducción tiene que ver con la situación inflamatoria y los problemas inmunológicos. En el caso de este último, esto es discutible si las MSC son autólogas, pero las MSC alogénicas también son útiles, especialmente para pacientes de edad avanzada, como recolección de MSC y posteriores ex vivo la expansión podría ser limitada para esas poblaciones [26, 39]. La naturaleza inmunosupresora de las CMM hace factible el trasplante alogénico [26]. La inflamación inespecífica por cualquier cuerpo extraño es algo inevitable. En realidad, proponemos que el EGF anclado confiera resistencia a las señales de muerte en las CMM [44]. Aún así, la compleja mezcla de citocinas inflamatorias y quimiocinas puede alterar la respuesta a los ligandos EGFR / ErbB1 de formas impredecibles. Por último, si la respuesta inflamatoria se dirige hacia la fibrosis, las CMM corren el riesgo de quedar aisladas del sitio de la lesión. Otro desafío potencial de la traducción a las personas son las enfermedades subyacentes, ya que el suministro de nutrientes, el suministro de oxígeno y la eliminación de metabolitos tóxicos a menudo se ven gravemente comprometidos en estas poblaciones [62-64] en la diabetes la hiperglucemia también afecta las vías de señalización del EGFR [79, 80 ]. Estos microambientes agresivos, con un pH extracelular alterado, afectarán el comportamiento de las MSC de una manera impredecible. Es por eso que nos estamos moviendo rápidamente para probar estos modelos en modelos animales cada vez más desafiados.

4. Epílogo

Estudios previos sugieren que EGF facilita la expansión de progenitores tempranos formadores de colonias en la población de MSC sin inducir la diferenciación o comprometer los potenciales de diferenciación. El tratamiento con EGF también promueve la actividad paracrina de MSC, al menos la producción de VEGF y HGF, los cuales son fundamentales para la cicatrización de heridas y la regeneración de tejidos. El EGF se puede utilizar para promover la expansión y las actividades paracrinas de las MSC. in vitro, al menos con tratamiento a corto plazo con EGF. Para en vivo En los entornos, EGF se puede incorporar en andamios de liberación de factor de crecimiento que encapsulan las MSC para aumentar la proliferación de las MSC y la acción paracrina. La forma atada de EGF también se puede incorporar en el andamio para controlar la diferenciación osteogénica de MSC o distribuciones de MSC en vivo. Las funciones de los ligandos EGFR / ErbB1 y la señalización descendente de EGFR / ErbB1 en la fisiología de MSC se resumen en las Figuras 5 y 6. En general, debería ser razonable utilizar EGF para la expansión de MSC in vitro, mejora de los potenciales terapéuticos de MSC en vivoy regulación de la diferenciación de MSC tanto in vitro y en vivo.


Diagrama simplificado de las vías de señalización EGFR / ErbB1 en fisiología de MSC. Los ligandos EGFR / ErbB1 activan PLCγ vía, vía p42 / 44 MAPK y vías PI3K / Akt en las CMM [3]. SOCIEDAD ANÓNIMAγ La vía juega un papel fundamental en la actividad motogénica, mientras que la vía p42 / 44 MAPK juega un papel clave en la actividad mitogénica y las actividades paracrinas de ciertos factores como el VEGF [42, 43, 66, 67]. La activación sostenida y fuerte de la vía p42 / 44 MAPK ejerce efectos citoprotectores y pro-osteogénicos [44, 47], mientras que la vía PI3K / Akt podría ejercer efectos anti-osteogénicos [46].


Las funciones de los ligandos EGFR / ErbB1 solubles y anclados en la fisiología de las MSC. Ligandos solubles EGFR / ErbB1 (EGF, HB-EGF, TGF-

Expresiones de gratitud

La preparación de este artículo fue financiada por subvenciones de la AHA Beginner-Grant-in-aid (09BGIA2050227) y un fondo de puesta en marcha del Departamento de Patología, OSU (K.T.) y de NIH (R01GM063569 y R01GM069668) (A.W.). Nos gustaría agradecer al Dr. J. Van Brooklyn (OSU, Columbus, OH) por su generoso apoyo instrumental.

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Derechos de autor

Copyright & # x00A9 2010 Kenichi Tamama et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo la licencia de atribución de Creative Commons, que permite el uso, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que el trabajo original se cite correctamente.


Generación de neuronas motoras espinales a partir de células madre neurales derivadas del cerebro fetal humano: papel del factor básico de crecimiento de fibroblastos

Las células madre neurales (NSC) tienen algunas propiedades específicas, pero generalmente no están comprometidas y, por lo tanto, pueden cambiar su destino después de la exposición a señales ambientales. No está claro hasta qué punto esta plasticidad NSC puede ser modulada por señales extrínsecas y cuáles son los mecanismos moleculares subyacentes a la determinación del destino neuronal. El factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) es un mitógeno bien conocido para las NSC en proliferación. Sin embargo, su papel en la orientación de las células madre para la especificación de subtipos neuronales no está definido. Aquí informamos que las NSC derivadas del prosencéfalo fetal humano expandidas in vitro pueden generar neuronas colinérgicas con propiedades de neurona motora espinal cuando se tratan con bFGF dentro de una ventana de tiempo específica. El bFGF induce a las NSC a expresar el marcador de la neurona motora Hb9, que está bloqueado por inhibidores específicos del receptor de FGF y anticuerpos neutralizantes de bFGF. Este desarrollo de las propiedades de las neuronas motoras espinales es independiente de la proliferación selectiva o la supervivencia y no requiere altos niveles de activación de MAPK. Por lo tanto, nuestro estudio indica que el bFGF puede desempeñar un papel importante en la modulación de la plasticidad y el destino neuronal de las NSC humanas y presumiblemente tiene implicaciones para explorar todo el potencial de las NSC cerebrales para aplicaciones clínicas, particularmente en la regeneración de neuronas motoras espinales. © 2008 Wiley-Liss, Inc.


EXPRESIONES DE GRATITUD

Este estudio fue apoyado en parte por una subvención de investigación del National Natural Science Funding of China (81722028, 81802235, 81972150, 81572227, 81572237), Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (LY17H060009, LR18H50001), Zhejiang Experimental Animal Science and Technology Project of China (2018C37112) y el proyecto del plan de investigación en ciencias básicas de Wenzhou (Y20180033). Este estudio también fue apoyado en parte por el Consejo Australiano de Investigación Médica y de Salud (NHMRC, No 1107828, 1027932 a Jiake Xu). Concedido por el Proyecto de Apertura de la disciplina principal de medicina clínica de la provincia de Zhejiang (No LKFJ017), Samuel Xu brindó apoyo editorial. Los autores agradecen a Jennifer Tickner y Nathan Pavlos por sus comentarios sobre este manuscrito.


Métodos

Aislamiento celular MIAMI

La médula ósea completa se obtuvo de la cresta ilíaca de un donante masculino vivo de 20 años (Lonza Walkersville, Maryland MIAMI # 3515), y se manipuló y procesó siguiendo las pautas para el consentimiento informado establecidas por el Comité de la Facultad de Medicina de la Universidad de Miami sobre la Uso de sujetos humanos en investigación. Como se describió anteriormente [3], se sembraron células aisladas de médula ósea a una densidad constante de 1 x 105 células / cm 2 en medio DMEM con bajo contenido de glucosa, que contenía suero bovino fetal al 3% (FBS, Hyclone Waltham, MA, lote # 30039), ácido ascórbico 20 mM (Fluka / Sigma St. Louis, MO, # 49752), una mezcla de ácidos grasos esenciales (Sigma St. Louis, MO 12,9 nM de ácido araquidónico, (# A9673), 1,12 μM de colesterol (# C3045) , 290 nM DL-alfa tocoferol-acetato (# T3376), 85,9 nM ácido mirístico (# M3128), 69,4 nM ácido oleico (# 01383), 76,5 nM ácido palmítico (# P5585), 77,1 nM ácido palmitoleico (P9417) y 68,9 nM ácido esteárico nM (# S4751) (modificado de [21]) y antibióticos (100 U / mL de penicilina, 0.1 mg / mL de estreptomicina) (Gibco Carlsbad, CA, # 15140) en 10 ng / ml de fibronectina (Sigma St. Louis, MO, # F2518) (Nunclone Rochester, NY). Se incubaron células enteras de médula ósea, que contenían células adherentes y no adherentes, a 37 ° C en condiciones hipóxicas (3% O2, 5% CO2 y 92% N2). Siete días después, se reemplazó la mitad del medio de cultivo. Catorce días después de la siembra inicial, se eliminaron las células no adherentes. Las colonias agrupadas de células adherentes se aclararon con PBS y se sembraron en placas a baja densidad para la expansión (100 células / cm 2) en matraces revestidos con fibronectina de 75 cm 2.

Condiciones de cultivo celular de MIAMI

Las células MIAMI se cultivaron en un medio de expansión que consistía en DMEM con bajo contenido de glucosa (como se describió anteriormente) en condiciones de bajo oxígeno (3% de O2, 5% CO2 y 92% N2).El medio se cambió cada 2-3 días y las células se separaron y sedimentaron usando tripsina (Gibco Carlsbad, CA, # 25300) al alcanzar

Confluencia del 60%. Las células peletizadas se resuspendieron en medio y se sembraron en matraces recubiertos con fibronectina de 10 ng / ml (Sigma St Louis, MO, nº F2518) (Nunclon, Rochester, NY) a 100 células / cm2. Antes del aislamiento del ARN, las células adherentes se enjuagaron 2 veces con PBS. Las células MIAMI expandidas durante 3 pases se caracterizaron mediante citometría de flujo y fueron positivas para MHC1, CD29, CD81, CD90 y 50% positivas para CD63, y negativas para MHC2, HLA-DR, CD49, CD109, CD54, CD56, CD36 (datos no mostrado).

Condiciones de cultivo celular RS-1

Se obtuvieron células estromales de médula humana (hMSC, donante nº 7081, varón de 22 años) del laboratorio del Dr. Darwin Prockop, director del Instituto de Medicina Regenerativa del Centro de Ciencias de la Salud de Texas A & ampM. Se aislaron células de médula ósea (BM) de donantes humanos de acuerdo con las pautas sobre el uso de sujetos humanos en la investigación, como describen todos los proveedores comerciales. Las hMSC se cultivaron en medio Alfa-Mínimo Esencial (αMEM) con L-glutamina, pero sin ribonucleósidos ni desoxirribonucleósidos (Invitrogen / Gibco Carlsbad, CA, n.o 12561-056), complementado con FBS al 16,5% (Hyclone Waltham, MA, n.o 31752), GlutaMAX 2 mM (nº 35050) y antibióticos (Gibco Carlsbad, CA, nº 15140). Para enriquecer las células RS-1, se sembraron hMSC (P1) a 37 ° C en condiciones normóxicas (21% de O2, 5% CO2 y 74% N2) en matraces recubiertos con fibronectina 10 ng / ml (Sigma St. Louis, MO, # F2518) (Nunclon Rochester, NY) durante la noche. Las células se separaron usando tripsina (Gibco Carlsbad, CA # 25300) y se sembraron a 50 células / cm 2. Las hMSC enriquecidas con RS-1 se separaron al 30-40% de confluencia y se volvieron a colocar en placas a baja densidad (50 células / cm2) [7]. Las células RS-1 se recolectaron para el aislamiento de ARN en cada pase. Las células RS-1 derivadas de MSC, pase 2, fueron positivas para CD29, CD90, CD105 y CD73 según lo determinado por el Centro de Terapia Génica de la Universidad de Tulane (hMSC # 7801). Las células RS-1 derivadas en nuestras instalaciones, paso 3, fueron positivas para MHC1, CD81, CD90, CD29 (20%), CD63 (45%) y negativas para MHC2, HLA-DR, CD49, CD109, CD54, CD56, CD36 , según se determina usando análisis de citometría de flujo (datos no mostrados).

Condiciones de cultivo celular MSC

Las células madre mesenquimales humanas (MSC) derivadas de la cresta ilíaca se adquirieron de Lonza (Walkersville, Maryland (PT-2501: mujer de 21 años)). Se aislaron células de médula ósea (BM) de donantes humanos de acuerdo con las directrices sobre el uso de sujetos humanos en la investigación, como describen todos los proveedores comerciales. Las MSC se sembraron a 6.000 células / cm 2 en medio DMEM con alto contenido de glucosa (Gibco Carlsbad, CA, # 31053) suplementado con 15% de FBS (Hyclone Waltham, MA, # 30039), ácido ascórbico, antibióticos y ácidos grasos esenciales (como descrito anteriormente), y se expandió al 21% de O2, 5% CO2 y 92% N2. El medio de cultivo completo se cambió cada 3-4 días y las células se separaron y se volvieron a sembrar cada 7 días [16]. Las MSC compradas a Lonza fueron positivas para CD105, CD166, CD29, CD44 y negativas para CD14, CD34 y CD45, según lo determinado por citometría de flujo (Lonza Wlkersville, Maryland (documento nº TS-PT-212-8 06/09).

Pretratamiento neuronal

El tratamiento con factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) de células MIAMI se realizó usando 20 ng / ml de EGF (# AF-100-15) y bFGF (Peprotech Rocky Hill, NJ, # AF-100- 18B) solos o en combinación. Las células pretratadas se separaron usando tripsina y se volvieron a sembrar después del día 5, seguido de un segundo período de pretratamiento de 5 días. Las células pretratadas se cultivaron en medios de expansión en condiciones de expansión (3% O2, 5% CO2 y 92% N2). El medio se cambió cada 2-3 días y las células se dividieron usando tripsina (Gibco Carlsbad, CA, # 25300) al alcanzar

Diferenciación endotelial

Para la diferenciación endotelial, se sembraron células MIAMI a 20.000 células / cm 2 en placas de 6 pocillos (Nunclone Rochester, NY) en medio DMEM con bajo contenido de glucosa, que contenía ácido ascórbico 100 μM, antibióticos, ácidos grasos esenciales, cóctel de factor de crecimiento angiogénico [Sigma St . Louis, MO: 10 ng / ml de bFGF, 10 ng / ml de EGF, 10 ng / ml de IGF R & ampD Systems, Inc. Minneapolis, MN: 100 ng / ml de VEGF], 100 nM de hidrocortisona, en una atmósfera de 21% de O2, 5% CO2 y se incubó a 37 ° C durante 21 días, con cambios de medio cada 5 días. Las células se recolectaron los días 10 y 21 y se evaluaron mediante RT-qPCR para el marcador endotelial CD 31.

Preparación de muestras de ARN total y síntesis de ADNc

Las células MIAMI se separaron (tripsina) y se centrifugaron para formar un sedimento celular. El ARN se aisló usando el kit RNAqueous® -4PCR (Ambion Austin, TX, # AM1914) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN total se cuantificó en el espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 (Nanodrop Wilmington, DE). La transcripción inversa de 2 µg de ARN total a ADNc se realizó con cebadores hexámeros aleatorios utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems Foster City, CA, nº 4368814). El cDNA se diluyó 1:20 (Nuclease-Free Water: Gibco # 10977-015) hasta una concentración final de cDNA de 5 ng / μl, se dividió en alícuotas y se almacenó a -20 ° C hasta el próximo uso. Para el análisis de PCR solo se usó ARN con una relación 260/280 entre 1.9-2.0.

RT-PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR)

La PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) se realizó usando 10 μl de ADNc diluido 1:20 (50 ng) en el sistema de PCR cuantitativa multiplex Mx3005P (Stratagene # 401513) usando reactivos RT-qPCR SYBR GREEN (Brilliant® II SYBR® Green QPCR Master Mix, Agilent Technologies) con colorante de referencia ROX. Los pares de cebadores directos e inversos se reconstituyeron en agua libre de nucleasas (Gibco nº 10977-015). Se mezcló una solución madre de 2 µM que contenía pares de cebadores tanto directos como inversos y se almacenó a -20ºC. Se usó una concentración final de pares de cebadores directo e inverso 160 nM para cada reacción de RT-qPCR. Las condiciones de los ciclos fueron las siguientes: 95 ° C inicial durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 30 segundos, 58 ° C durante 30 segundos, 72 ° C durante 15 segundos. Se utilizó el software MxPro-Mx3005P v4.10 para determinar el CP para cada reacción de amplificación. Los resultados se exportaron a Microsoft Excel para su análisis.

Análisis de datos RT-qPCR

Todos los datos correspondientes de RT-qPCR se analizaron utilizando el método ΔΔCP [13] y se normalizaron frente a un control negativo y dos genes de referencia (genes de mantenimiento).

El punto de cruce (CP) se define como el punto en el que la fluorescencia se eleva apreciablemente por encima de la fluorescencia de fondo. El software Mx3005P utilizó el "Método del punto de ajuste" para determinar el CP para cada reacción. La muestra de control se estableció en un valor de "1" en todos los casos y las barras de error en las cifras respectivas se muestran como desviación estándar. El número de experimentos independientes se designa como "N" con 2-3 puntos de datos individuales recopilados por experimento.

Genes de normalización

Se probaron ocho genes para la normalización de la β-actina (ACTB, NM_001101), beta-2-microglobulina (B2M, NM_004048), factor de elongación traslacional eucariota 1 alfa (EF1α, NM_001402), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH, NM_002046), hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 (HPRT1, NM_000194), proteína ribosómica L13a (RPL13a, NM_01242), proteína de activación de tirosina 3-monooxigenasa / triptófano 5-monooxigenasa, variante 1 y 2 del polipéptido zeta (YWHAZ, NM_003406 & amp NM_145690) y ubiquitina C (UBC, NM_021009)]. En la Tabla # 1 se incluye una lista de las secuencias de pares de cebadores utilizadas.

Determinación de la eficiencia del par de cebadores

La determinación de la eficiencia del par de cebadores de cada genes (E) para RT-qPCR se calculó utilizando esta ecuación: E = 10 ^ (- 1 / m) [22]. La pendiente (m) se calculó representando el punto de cruce del número de ciclo (CP) calculado durante la fase exponencial del gráfico de amplificación (software PxPro-Mx3005P v4.10) frente a la concentración total de ADNc. Las concentraciones de ADNc oscilaron entre 50 y 1 ng por reacción. También se calculó el porcentaje de eficiencia (% E):% E = (E-1) * 100. N = 4 (2-3 puntos de datos por experimento) (archivo adicional n. ° 1).

Construcción de pares de cebadores específicos de especies

Para crear pares de cebadores específicos de especie que detecten solo secuencias de ARNm humano o solo secuencias de ARNm de rata dentro de una biblioteca de ADNc humano-rata, las correspondientes secuencias de ARNm humano y de rata deben tener una región única de al menos 60 pb o más. Usando las secuencias de ARNm de FASTA de rata humana y correspondiente para EF1α, RPL13a y YWHAZ, utilizamos Blast-n http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi para comparar las secuencias. EF1α tenía una cobertura de secuencia del 99% (100% de identidad) entre las secuencias de ARNm humano y de rata. RPL13a tenía una cobertura de secuencia del 57% (87% de identidad) y YWHAZ las variantes de transcripción 1 y 2 tenían 92% - 63% de cobertura de secuencia (100% de identidad). Por lo tanto, RPL13a y YWHAZ Ambos eran genes candidatos de normalización específicos de la especie humana, mientras que EF1α no tenía una región que contenga una secuencia única (≥60 pb) para crear pares de cebadores. Se construyeron pares de cebadores específicos de la especie humana para los 2 genes de normalización. RPL13a y YWHAZ y para 3 genes diana stanniocalcin-1 (STC-1), factor de necrosis tumoral, proteína 6 inducida por alfa (TSG6), y la proteína de unión al factor de crecimiento transformante latente 2 (LTBP2). Se utilizó NCBI Primer-BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ para la construcción de secuencias de pares de cebadores [23] utilizando las secuencias de ARNm de especies únicas (formato FASTA). Se utilizó PCR en gradiente para determinar la temperatura de hibridación óptima. Todos los pares de cebadores específicos de rata y humanos se validaron con RT-qPCR utilizando ADNc de células MIAMI humanas H3515 (3) o cultivos organotípicos de hipocampo de rata, ya sea por separado o en combinación. Todos los pares de cebadores produjeron 1 amplicón específico de especie, con una amplificación mínima fuera del objetivo. Esto se determinó mediante la curva de fusión de cada reacción de amplificación (archivo adicional n. ° 2) y la electroforesis en gel de agarosa (datos no mostrados). Se probaron aproximadamente 3-5 pares de cebadores por normalización específica de especie humana o de rata o gen diana. Todos los resultados de RT-qPCR se normalizaron frente a un control negativo y los 2 genes de normalización hRPL13a y hYWHAZ (humano), o rRPL13a (rata). Usando este mismo método, también se construyeron pares de cebadores específicos de rata para RPL13a, IGF1, IGFBP3, y IGFBP5.

Modelo de isquemia cerebral global ex vivo para análisis de RT-qPCR de especies cruzadas

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas aprobadas establecidas por la Universidad de Miami IACUC. La preparación de cortes organotípicos del hipocampo de rata se ha descrito en detalle [19, 24]. Brevemente, se obtuvieron cortes de cerebro de 400 μm de crías de rata de cualquier sexo entre los días 9 y 10 postnatales. solución salina, 5,5 mg / ml de D-glucosa y 1 mmol / L de glutamina. Para la isquemia utilizamos un modelo establecido que consiste en la privación combinada de oxígeno y glucosa ([19, 24]) durante 40 minutos. Para OGD, el oxígeno se reemplaza con nitrógeno y la glucosa con sacarosa. Las células MIAMI se pretrataron con bFGF y EGF (7 días: 50 ng / ml) antes de la inyección en la región CA1 del hipocampo (7500 células / µl por inyección (3 inyecciones)). Una hora después de la inducción de OGD y 24 horas después de que se aisló el ARN total de OGD de cultivos de cortes organotípicos de hipocampo de rata (descritos en [25]) con o sin MIAMI inyectado. Como se describió anteriormente, se utilizaron 2 μg de ARN total para la síntesis de ADNc. El análisis de RT-qPCR se realizó utilizando 5 µl de ADNc sin diluir. Los pares de cebadores específicos de rata y humanos se designan con (h) y (r) respectivamente (Tabla nº 2: los pares de cebadores específicos de humanos se designan con (*)).


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