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9.1A: Descubrimiento y detección de virus - Biología

9.1A: Descubrimiento y detección de virus - Biología


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Los virus son partículas infecciosas aproximadamente 100 veces más pequeñas que las bacterias y solo pueden observarse mediante microscopía electrónica.

Objetivos de aprendizaje

  • Describir cómo se descubrieron los virus por primera vez y cómo se detectan.

Puntos clave

  • Los viriones, partículas de virus individuales, tienen un diámetro de 20 a 250 nanómetros.
  • En el pasado, los virus se clasificaban por el tipo de ácido nucleico que contenían, ADN o ARN, y si tenían ácido nucleico monocatenario o bicatenario.
  • El análisis molecular de los ciclos de replicación viral se utiliza ahora de forma más rutinaria para clasificar los virus.

Términos clave

  • virus: un organismo infeccioso submicroscópico, ahora entendido como una estructura no celular que consiste en un núcleo de ADN o ARN rodeado por una capa de proteína
  • virión: una sola partícula individual de un virus (el equivalente viral de una célula)

Descubrimiento y detección

Los virus se descubrieron por primera vez después del desarrollo de un filtro de porcelana, llamado filtro Chamberland-Pasteur, que podía eliminar todas las bacterias visibles en el microscopio de cualquier muestra líquida. En 1886, Adolph Meyer demostró que una enfermedad de las plantas de tabaco, la enfermedad del mosaico del tabaco, podía transferirse de una planta enferma a una sana a través de extractos líquidos de plantas. En 1892, Dmitri Ivanowski demostró que esta enfermedad podía transmitirse de esta forma incluso después de que el filtro Chamberland-Pasteur hubiera eliminado todas las bacterias viables del extracto. Aún así, pasaron muchos años antes de que se probara que estos agentes infecciosos "filtrables" no eran simplemente bacterias muy pequeñas, sino que eran un nuevo tipo de partícula diminuta que causaba enfermedades.

Los viriones, partículas de virus individuales, son muy pequeños, de unos 20 a 250 nanómetros de diámetro. Estas partículas de virus individuales son la forma infecciosa de un virus fuera de la célula huésped. A diferencia de las bacterias (que son unas 100 veces más grandes), no podemos ver los virus con un microscopio óptico, con la excepción de algunos viriones grandes de la familia de los poxvirus. No fue hasta el desarrollo del microscopio electrónico a fines de la década de 1930 que los científicos obtuvieron su primera buena visión de la estructura del virus del mosaico del tabaco (TMV) y otros virus. La estructura de la superficie de los viriones se puede observar mediante microscopía electrónica de transmisión y de barrido, mientras que las estructuras internas del virus solo se pueden observar en imágenes de un microscopio electrónico de transmisión. El uso de estas tecnologías ha permitido el descubrimiento de muchos virus de todo tipo de organismos vivos. Inicialmente se agruparon por morfología compartida. Posteriormente, los grupos de virus se clasificaron según el tipo de ácido nucleico que contenían, ADN o ARN, y si su ácido nucleico era monocatenario o bicatenario. Más recientemente, el análisis molecular de los ciclos de replicación viral ha perfeccionado aún más su clasificación.


Pestivirus: epidemiología, evolución, biología y características clínicas

Los pestivirus infectan predominantemente a los ungulados de dedos iguales, se distribuyen en todo el mundo y pueden afectar económicamente a la producción de ganado y porcino. Sus posibles diferencias en epidemiología e incluso en epidemiología molecular pueden actuar como marcadores locales e interferir con la eficacia de la vacuna y las estrategias de contramedidas. Además, la detección en hospedadores atípicos y vida silvestre puede influir en el estado sanitario de estas especies animales e incluso en la evolución del virus y la aparición de nuevas variantes. Además, el descubrimiento de nuevos miembros de este importante género viral aporta información importante sobre la evolución y el rango de hospedadores. La vigilancia continua actualiza los conocimientos en este campo, lo que lleva a una mejor comprensión de la patogénesis, la evolución y la variedad de hospedadores.

Este Tema de Investigación tiene como objetivo discutir las contribuciones en el campo de la investigación de los pestivirus y el conocimiento adquirido sobre su importancia económica y para la salud animal, las manifestaciones clínicas y la propagación que es amenazante por las siguientes razones:
- Pérdidas económicas debido a infecciones por pestivirus e introducción en áreas anteriores no endémicas
- Interferencia en la inmunidad y la eficacia de la vacuna debido a la aparición de nuevas especies, subespecies y variantes de virus.
- Huéspedes atípicos que pueden verse directamente afectados o actuar como reservorios para la producción animal.
- Falta de conocimiento sobre los mecanismos de interacción virus-hospedador
- Nuevos pestivirus y hosts atípicos que pueden agregar nueva información en la evolución del virus.
- Manifestaciones clínicas inusuales y cepas de virus más virulentas.

Los temas adecuados para las presentaciones incluyen, entre otros:
- Epidemiología, detección, diversidad genética y evolución de pestivirus
- Interacción virus-célula huésped
- Infección por pestivirus en animales salvajes
- Respuesta inmune y desarrollo de vacunas.
- Patogenia y manifestaciones clínicas

Palabras clave: BVDV, CSFV, BDV, virus similar a HoBi, APPV, pestivirus de Bungowannah

Nota IMPORTANTE: Todas las contribuciones a este tema de investigación deben estar dentro del alcance de la sección y la revista a la que se envían, según se define en sus declaraciones de misión. Frontiers se reserva el derecho de guiar un manuscrito fuera de alcance a una sección o revista más adecuada en cualquier etapa de la revisión por pares.

Los pestivirus infectan predominantemente a los ungulados de dedos iguales, se distribuyen en todo el mundo y pueden afectar económicamente la producción de ganado y porcino. Sus posibles diferencias en epidemiología e incluso en epidemiología molecular pueden actuar como marcadores locales e interferir con la eficacia de la vacuna y las estrategias de contramedidas. Además, la detección en hospedadores atípicos y vida silvestre puede influir en el estado sanitario de estas especies animales e incluso en la evolución del virus y la aparición de nuevas variantes. Además, el descubrimiento de nuevos miembros de este importante género viral aporta información importante sobre la evolución y el rango de hospedadores. La vigilancia continua actualiza los conocimientos en este campo, lo que lleva a una mejor comprensión de la patogénesis, la evolución y la variedad de hospedadores.

Este Tema de Investigación tiene como objetivo discutir las contribuciones en el campo de la investigación de pestivirus y el conocimiento adquirido sobre su importancia económica y para la salud animal, manifestaciones clínicas y propagación que es amenazante por las siguientes razones:
- Pérdidas económicas debido a infecciones por pestivirus e introducción en áreas anteriores no endémicas
- Interferencia en la inmunidad y la eficacia de la vacuna debido a la aparición de nuevas especies, subespecies y variantes de virus.
- Huéspedes atípicos que pueden verse directamente afectados o actuar como reservorios para la producción animal.
- Falta de conocimiento sobre los mecanismos de interacción virus-hospedador
- Nuevos pestivirus y hosts atípicos que pueden agregar nueva información en la evolución del virus.
- Manifestaciones clínicas inusuales y cepas de virus más virulentas.

Los temas adecuados para las presentaciones incluyen, entre otros:
- Epidemiología, detección, diversidad genética y evolución de pestivirus
- Interacción virus-célula huésped
- Infección por pestivirus en animales salvajes
- Respuesta inmune y desarrollo de vacunas.
- Patogenia y manifestaciones clínicas

Palabras clave: BVDV, CSFV, BDV, virus similar a HoBi, APPV, pestivirus de Bungowannah

Nota IMPORTANTE: Todas las contribuciones a este tema de investigación deben estar dentro del alcance de la sección y la revista a la que se envían, según se define en sus declaraciones de misión. Frontiers se reserva el derecho de guiar un manuscrito fuera de alcance a una sección o revista más adecuada en cualquier etapa de la revisión por pares.


Aplicaciones de la nanotecnología en los mecanismos de detección, seguimiento e infección de virus

Los virus se encuentran entre los patógenos más infecciosos, responsables del mayor número de muertes en todo el mundo. La falta de un fármaco clínico eficaz para la mayoría de los virus enfatiza el diagnóstico rápido y preciso en las primeras etapas de la infección para prevenir la rápida propagación de los patógenos. La nanotecnología es un campo emergente con aplicaciones en varios dominios, donde la ciencia nanobiomédica tiene muchas contribuciones significativas, como la entrega efectiva de fármacos / moléculas terapéuticas a órganos específicos, imágenes, detección sensible de virus y su seguimiento preciso en las células huésped. Los nanomateriales informados para la detección y seguimiento de virus incluyen principalmente NP magnéticas y de oro, ZnO / Pt-Pd, grafeno y puntos cuánticos (QD). Además, la tecnología de rastreo de virus único (SVT) permitió rastrear las etapas del ciclo de vida de un virus individual para comprender mejor su dinámica dentro de las células vivas. Los materiales fluorescentes inorgánicos y no metálicos comparten las ventajas de una alta estabilidad fotoquímica, una amplia gama de curvas de absorción de luz y emisión policromática. Por lo tanto, se consideran como posibles nano-sondas fluorescentes para TSV. Sin embargo, todavía existen algunos desafíos: (i) la tasa de falsos positivos clínicos de algunos métodos de detección sigue siendo alta (ii) en el proceso de seguimiento del virus, menor adaptabilidad de las QD debido al mayor tamaño, parpadeo y posible interferencia con la función del virus y ( iii) el seguimiento in vivo de un solo virus, en tiempo real, necesita un mayor perfeccionamiento. En el futuro, se necesitan nanomateriales más pequeños, no tóxicos y químicamente estables para mejorar la eficiencia y precisión de la detección y el seguimiento de las infecciones virales para frenar la mortalidad. Este artículo se clasifica en: Enfoques terapéuticos y descubrimiento de fármacos & gt Nanomedicina para nanomateriales inspirados en biología de enfermedades infecciosas & gt Proteínas y estructuras basadas en virus.

Palabras clave: detección de nanopartículas de virus de seguimiento de virus individuales.

© 2021 Wiley Periodicals LLC.

Declaracion de conflicto de interes

Los autores han declarado no tener ningún conflicto de intereses para este artículo.

Cifras

Selección in vitro de objetivos específicos ...

Selección in vitro de aptámeros específicos de la diana basada en la separación magnética por SELEX (Xi ...

El inmunoabsorbente ligado a enzimas de fluorescencia mejorada ...

El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de fluorescencia mejorada para la detección de alfafetoproteína y ...

Un modelo para detectar el ADN / ARN artificial específico del virus con alta sensibilidad contra ...

Un mecanismo de "cambio de controlador" de ...

Un mecanismo de "conmutación de impulsores" del transporte del virus de la influenza de los microfilamentos a los microtúbulos (L.‐J. ...

Un protocolo específico del sitio para enterovirus ...

Un protocolo específico del sitio para la cápside de enterovirus y las AuNP monodispersas (Marjomäki et al., 2014).…

Estrategia de "integración de síntesis-modificación" de un solo paso para ...

Estrategia de "integración de síntesis-modificación" de un solo paso para la fabricación de puntos C funcionalizados con ácido borónico (Shen & amp ...


Descubrimiento de virus mediante secuenciación profunda y ensamblaje de pequeños ARN silenciadores derivados de virus

En respuesta a la infección, los invertebrados procesan la replicación de los genomas del ARN viral en ARNip de tamaños discretos para guiar la eliminación del virus mediante la interferencia del ARN. Aquí, mostramos que los ARNip virales secuenciados a partir de células de mosca de la fruta, mosquitos y nematodos se superpusieron en secuencia, lo que sugiere la posibilidad de usar ARNip para el ensamblaje del genoma viral y el descubrimiento de virus. Para probar esta idea, examinamos contigs ensamblados a partir de pequeñas bibliotecas de ARN publicadas y descubrimos cinco virus no descritos previamente de células de Drosophila cultivadas y mosquitos adultos, incluidos tres con un genoma de ARN de cadena positiva y dos con un genoma de ARNdc. En particular, cuatro de los virus identificados exhibieron solo similitudes de secuencia bajas con virus conocidos, de modo que ninguno pudo asignarse a un género de virus existente. También informamos la detección de ARN que interactúan con PIWI derivados de virus (piRNA) en Drosophila melanogaster que no se han descrito previamente en ninguna otra especie huésped y demuestran el ensamblaje del genoma viral a partir de piRNA virales en ausencia de siRNA virales. Por lo tanto, este estudio proporciona un poderoso enfoque independiente del cultivo para el descubrimiento de virus en invertebrados mediante el ensamblaje de genomas virales directamente a partir de productos de respuesta inmune del huésped sin enriquecimiento o amplificación previa del virus. Proponemos que los virus de invertebrados descubiertos por este enfoque pueden incluir patógenos virales humanos y vertebrados no descritos previamente que son transmitidos por vectores artrópodos.

Declaracion de conflicto de interes

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Cifras

Posición y distribución de FHV…

Posición y distribución de los contigs de ARNip de FHV y SINV ensamblados a partir de ARN pequeños ...

Descubrimiento de virus dsRNA DTV…

Descubrimiento de virus dsRNA DTV ( A ) y DBV ( B )…

Las células S2-GMR contenían cuatro infecciosos ...

Las células S2-GMR contenían cuatro virus ARN infecciosos. ( A ) DTV, DBV, DXV,…

Distribución de tamaño ( A )…

Distribución de tamaño ( A ) y composición de nucleótidos agregados ( B ) de…


Abstracto

El desarrollo de métodos para anticipar la aparición o reemergencia de enfermedades infecciosas es importante y oportuno; sin embargo, los enfoques tradicionales basados ​​en modelos se ven obstaculizados por la incertidumbre que rodea a los factores subyacentes. Aquí, demostramos un algoritmo de detección operacional, independiente del mecanismo, para la (res) emergencia de enfermedades, basado en señales de alerta temprana (EWS) derivadas de la teoría de la desaceleración crítica. Específicamente, usamos simulaciones por computadora para entrenar un algoritmo de aprendizaje supervisado para detectar las huellas dinámicas de (res) emergencia presentes en los datos epidemiológicos. Luego, nuestro algoritmo fue desafiado para pronosticar la reaparición espacialmente replicada y de manifestación lenta de las paperas en Inglaterra a mediados de la década de 2000 y la tos ferina posterior a 1980 en los Estados Unidos. Nuestro método anticipó con éxito la reaparición de las paperas con 4 años de anticipación, tiempo durante el cual se podrían haber implementado esfuerzos de mitigación. Desde 1980 en adelante, nuestro modelo identificó estados resurgentes con una precisión creciente, lo que llevó a una clasificación confiable a partir de 1992. Además, aplicamos con éxito el algoritmo de detección a 2 estudios de casos transmitidos por vectores, a saber, brotes de serotipos de dengue en Puerto Rico y un desarrollo rápido brote de peste en 2017 en Madagascar. En conjunto, estos hallazgos ilustran el poder de las técnicas de aprendizaje automático informadas teóricamente para desarrollar sistemas de alerta temprana para la (res) aparición de enfermedades infecciosas.

Citación: Brett TS, Rohani P (2020) Las huellas dinámicas permiten la detección de la aparición de enfermedades. PLoS Biol 18 (5): e3000697. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000697

Editor académico: Christophe Fraser, Universidad de Oxford, REINO UNIDO

Recibió: 2 de octubre de 2019 Aceptado: 23 de abril de 2020 Publicado: 20 de mayo de 2020

Derechos de autor: © 2020 Brett, Rohani. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la Licencia de Atribución Creative Commons, que permite el uso, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se acredite el autor y la fuente originales.

Disponibilidad de datos: Todos los archivos de datos están disponibles en el repositorio de Zenodo (URL: https://doi.org/10.5281/zenodo.3713381).

Fondos: La investigación fue financiada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud (premio no. U01GM110744 https://www.nigms.nih.gov). Los patrocinadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia.

Abreviaturas: AUC, área bajo la curva característica receptor-operador DENV, virus del dengue EWS, señal de alerta temprana LA, autoridad local MRSA, resistente a meticilina Staphylococcus aureus ROC, receptor-operador característico SARS-CoV, síndrome respiratorio agudo severo coronavirus XDR TB, tuberculosis extensamente resistente a los medicamentos


Materiales y métodos

Resumen de métodos

En este estudio, seguimos métodos y usamos código derivado de Allen, et al [19]. Recopilamos y codificamos geográficamente los primeros informes en la literatura revisada por pares de infección humana para cada virus de ARN en nuestra base de datos durante un período de 118 años desde 1901 hasta 2018. Un modelo de árbol de regresión impulsado por Poisson (BRT), un método que maneja datos bien: se ajustó a los datos del virus de ARN humano con un conjunto de variables que se cree que pueden ser factores explicativos potenciales. Al hacer coincidir el recuento de descubrimiento de virus y todos los factores explicativos en cada celda de la cuadrícula de 1 ° de resolución (aproximadamente 110 km en el ecuador) por década, clasificamos la contribución de cada factor explicativo a las predicciones. Luego, usamos las estimaciones de los parámetros del modelo BRT que mejor se ajusta para predecir la probabilidad de descubrimiento de virus para todas las celdas de la cuadrícula en todo el mundo en 2010-2019 utilizando los valores de todos los factores explicativos en 2015. También realizamos análisis estratificados (distinguiendo virus transmisibles en humanos o estrictamente zoonóticos, y transmitidos por vectores o no transmitidos por vectores) para encontrar los factores explicativos para el descubrimiento de categorías específicas de virus.

Fuente de datos de virus ARN humanos y actualización.

Los datos sobre virus de ARN humanos se derivaron de una versión actualizada de nuestra base de datos publicada anteriormente (https://datashare.is.ed.ac.uk/handle/10283/2970), que contiene 214 virus, con fechas de descubrimiento entre 1901 y 2017. En nuestro artículo anterior se proporcionaron términos de búsqueda, búsquedas en bases de datos y criterios de inclusión o exclusión para la recopilación de datos [1]. La versión actualizada a 2018 incluye nueve especies de virus humanos adicionales recientemente reconocidas por ICTV o recién agregadas a la base de datos: Orthonairovirus de la enfermedad de las ovejas de Nairobi, Virus Achimota 2, Menangle rubulavirus, Virus Madariaga, Pegivirus H, Virus espumoso simio del chimpancé central, Virus espumoso simio de Guenon, Enterovirus H y Orthohepevirus C (Tabla S1). Los metadatos proporcionan información sobre la fecha de descubrimiento, la transmisibilidad, la ruta de transmisión y el rango de host [1].

Definimos "descubrimiento" como el primer informe de una especie de virus de ARN reconocida por ICTV de humanos en la literatura revisada por pares, y la ubicación de la exposición / infección humana inicial con el virus se tomó como la ubicación del descubrimiento. Cuando la ubicación no se proporcionó en el artículo original, se utilizó el sitio del laboratorio de investigación como ubicación del descubrimiento (n = 3). Si ni el lugar de exposición / infección humana ni el sitio del laboratorio de investigación estaban disponibles, se utilizó la dirección del primer autor como el lugar del descubrimiento (n = 19). En nuestra base de datos, las ubicaciones de exposición / infección humana inicial se utilizaron para 201 (90%) virus (Tabla S1) y ninguno de estos fue contratado durante el viaje. Las ubicaciones se georreferenciaron con la mayor precisión posible de acuerdo con la literatura original, que van desde coordenadas precisas de puntos hasta datos a nivel de polígono (por ejemplo, ciudad, condado, distrito, estado o país) (ver Texto S1 para detalles). Para ubicaciones no especificadas que cubren más de una celda de la cuadrícula (Tabla S2), el muestreo se utilizó en nuestro marco de arranque como se describe a continuación.

Factores explicativos espaciales

Se recopiló un conjunto de 33 variables que podrían afectar la distribución espacial del descubrimiento de virus de ARN y se utilizaron como factores explicativos. Los detalles completos de las fuentes, las resoluciones originales y las definiciones se proporcionan en Tabla S3. Las variables se asignaron a cuatro grupos: climático, socioeconómico, uso del suelo y biodiversidad. Esperamos que el PIB, el crecimiento del PIB y el recuento de universidades, etc. estén correlacionados con el esfuerzo de descubrimiento, ya que implican más recursos que podrían invertirse en la investigación de virus [25, 26]. Es más probable que otros grupos de variables, incluidos el uso de la tierra, el clima y la biodiversidad, estén relacionados con el rango geográfico natural del virus [27], es decir, estas variables afectarán el descubrimiento a través del paso intermedio de emergencia.

Todos los factores explicativos y las ubicaciones de los virus se emparejaron mediante una celda de cuadrícula espacial de 1 °, habiendo reescalado o transformado los datos cuando fue necesario (los detalles de la transformación de datos se proporcionan en Texto S2). Nuestro modelo comparó el recuento de descubrimiento de virus de ARN en cada celda de la cuadrícula con las variables climáticas históricas decenales, la población, el PIB y los datos de uso de la tierra (que se describen a continuación), por lo que extrapolamos los datos para estas variables hasta 1901 (ver Texto S2 para detalles).

Enfoque de modelado BRT

Al ajustar un modelo BRT de Poisson, estimamos el riesgo relativo de descubrimiento de virus de ARN para cada 1 ° de resolución de la celda de la cuadrícula en todo el mundo como una función de los 33 factores explicativos. BRT es un método de aprendizaje automático basado en árboles que comienza a ser ampliamente utilizado en estudios ecológicos [28, 29]. Aplica la técnica de impulso para combinar muchos modelos de árboles más simples de forma adaptativa y ofrece un rendimiento predictivo mejorado [30,31]. Los métodos de aprendizaje basados ​​en árboles son herramientas útiles para modelar relaciones no lineales e interacciones de orden superior entre variables. Además, BRT maneja bien los datos espacialmente dependientes, ya que puede capturar estructuras complejas dentro de los datos que muchos otros métodos de modelado no pueden [32]. Calculamos el I de Moran (un índice de dependencia espacial) para estimar la capacidad del modelo BRT para dar cuenta de la dependencia espacial en los datos del virus, utilizando el paquete spdep en R v. 3.5.1 (se generaron pesos de distancia fijos basados ​​en la distancia esférica, con valores de corte que oscilan entre una vez y treinta veces la distancia de la celda de cuadrícula de resolución de 1 ° en el ecuador, es decir, 110 km a 3300 km) [33]. A diferencia de los enfoques tradicionales basados ​​en la significancia, BRT evalúa el efecto individual de cada variable estimando la importancia relativa de cada variable para las predicciones.

El enfoque de remuestreo bootstrap se aplicó para tener en cuenta la incertidumbre espacial en la ubicación de los descubrimientos de virus y generó cuantiles del 95%. Para los virus con ubicaciones de descubrimiento imprecisas, se seleccionó al azar una celda de la cuadrícula cada vez. Para cada celda de la cuadrícula con descubrimiento de virus, se seleccionaron al azar dos celdas de cuadrícula sin descubrimiento de todas las celdas en todo el mundo que estaban "libres de descubrimiento de virus" en todos los puntos de tiempo. Entonces, en cada modelo, se incluyeron 223 celdas de cuadrícula con descubrimiento de virus y 446 sin descubrimiento de virus. Comparamos los datos del virus con todos los factores explicativos (utilizando la misma década para los factores explicativos que varían en el tiempo, por ejemplo, los valores de 2010 de las variables se compararon con los virus descubiertos en 2005-2014). Asumimos que el recuento de virus en cualquier celda de la cuadrícula en cada década sigue una distribución de Poisson, y usamos el recuento de descubrimiento de virus en cada celda de la cuadrícula por década como variable de respuesta.

Utilizando el remuestreo bootstrap, ajustamos 1000 modelos BRT replicados y generamos gráficos de contribución relativa y gráficos de dependencia parcial con cuantiles del 95%. La contribución relativa, o la influencia / peso, de cada variable es un indicador de la importancia de esa variable para predecir el número de descubrimientos de virus. Las contribuciones relativas de todas las variables de un modelo BRT suman el 100%, y los números más altos indican una mayor influencia en la respuesta. Definimos los factores explicativos más influyentes como aquellos cuyas contribuciones relativas fueron mayores que el nivel medio (es decir, 100 / (el total de factores explicativos cuenta * 100) en este estudio: 100 / (33 * 100) = 3,03%) [28]. Las gráficas de dependencia parcial son un método para visualizar las relaciones entre las variables predictivas de un BRT y su resultado después de tener en cuenta los efectos promedio de todas las demás variables. Las medias de las predicciones de los 1000 modelos se utilizaron para predecir la probabilidad de descubrimiento de virus en todo el mundo en 2010-2019, utilizando valores de 2015 de los 33 factores explicativos. Usando la ecuación de distribución de probabilidad de Poisson, convertimos el mapa de predicción continua en un mapa de probabilidad. Usamos los paquetes dismo y gbm en R v. 3.5.1 para adaptarse a los modelos BRT. Los parámetros que incluyen la complejidad del árbol (que refleja el número de nodos en un árbol), la tasa de aprendizaje (reduciendo la contribución de cada árbol agregado) y la fracción de bolsa (que especifica la proporción de datos que se seleccionarán en cada paso) se establecieron siguiendo Elith et al. [31] para asegurarse de que cada modelo de remuestreo contenga al menos 1000 árboles. Los parámetros finales del modelo óptimo tenían los siguientes valores: complejidad del árbol = 5, tasa de aprendizaje = 0,003, fracción de bolsa = 0,5. Se utilizó una función de validación cruzada por etapas para identificar el número óptimo de árboles en cada modelo [31]. Con estos parámetros, los 1000 modelos de BRT replicados se ajustaron a una media de 1214 árboles.

El rendimiento predictivo del modelo se evaluó calculando la desviación del modelo bootstrap, así como realizando 50 rondas de validación cruzada de diez veces. Los detalles de la validación del modelo se proporcionan en Texto S3 y Tabla S4.

También realizamos análisis de sensibilidad mediante i) utilizando datos de 1980 a 2000 únicamente (ya que las variables explicativas están disponibles sin extrapolación solo para este período), y ii) eliminando los 22 informes de descubrimiento que no eran ubicaciones de humanos infectados (ya que son menos precisos ). Los parámetros del modelo se proporcionan en Tabla S5.

Análisis estratificado

Se realizaron dos análisis estratificados para encontrar factores explicativos específicos de los descubrimientos de diferentes categorías de virus. El primer análisis estratificado distinguió 131 virus que son estrictamente zoonóticos (todas las infecciones humanas se adquieren a partir de una infección en un reservorio no humano) y los 92 virus que pueden propagarse dentro de poblaciones humanas (es decir, son transmisibles, directa o indirectamente, entre humanos) (Tabla S1), sobre la base de datos publicados anteriormente [34]. Se realizó un segundo análisis estratificado por separado para 93 virus transmitidos por vectores y 130 virus no transmitidos por vectores (Tabla S1). Usamos el mismo enfoque de modelado BRT para análisis estratificados como describimos antes, y se dibujaron gráficos de contribución relativa y gráficos de dependencia parcial con cuantiles del 95% para cada categoría de virus. Los parámetros del modelo se proporcionan en Tabla S5. Con base en modelos BRT estratificados, las predicciones de la probabilidad de descubrimiento para cada categoría de virus en 2010-2019 también se realizaron utilizando valores de 2015 de los 33 factores explicativos.

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software R, versión 3.5.1 (R Foundation for Statistical Computing, Viena, Austria), y todos los mapas se visualizaron utilizando ArcGIS Desktop 10.5.1 (Environmental Systems Research Institute). El archivo de forma mundial utilizado en el estudio se obtuvo de Data and Maps for ArcGIS (anteriormente Esri Data & amp Maps, https://www.arcgis.com/home/group.html?id=24838c2d95e14dd18c25e9bad55a7f82#overview) bajo una licencia CC-BY (Texto S4). Los datos brutos y las secuencias de comandos R de apoyo que se utilizan para generar cifras para el modelo completo se presentan en Secuencia de comandos S1 R.


1. Introducción

Tras el descubrimiento del virus del mosaico del tabaco en 1892 y del virus de la fiebre aftosa en 1898, el primer & # x02018agente filtrable & # x02019 que se descubrió en humanos fue el virus de la fiebre amarilla en 1901 [1]. Todavía se están identificando nuevas especies de virus humanos, a una tasa de tres o cuatro por año (ver más abajo), y los virus constituyen más de dos tercios de todos los nuevos patógenos humanos [2], una sobrerrepresentación muy significativa dado que la mayoría Las especies patógenas humanas son bacterias, hongos o helmintos. Estos nuevos virus difieren enormemente en su importancia, que van desde la enfermedad rara y leve debida al virus Menangle hasta el devastador impacto del VIH-1 en la salud pública.

En este artículo, adoptamos un enfoque ecológico para estudiar la diversidad de virus humanos (definidos como virus para los que existe evidencia de infección natural en humanos). Primero, describimos y analizamos patrones temporales, geográficos y taxonómicos en el descubrimiento de virus humanos (& # x000a72). Luego consideramos los procesos mediante los cuales surgen nuevos virus humanos (& # x000a73). Hay una serie de definiciones de & # x02018emergence & # x02019 [3] aquí, estamos interesados ​​en todas las etapas del proceso por el cual un virus pasa de no infectar a los humanos en absoluto a convertirse en un patógeno humano importante. Como muestran las experiencias con el VIH-1 y las nuevas variantes de la influenza A (y también con nuevos patógenos animales como el parvovirus canino [4]), este cambio puede ocurrir rápidamente, en escalas de tiempo de décadas, años o incluso meses.

Por supuesto, no todas las especies de virus humanos recientemente identificadas son & # x02018nuevas & # x02019 en el sentido de que solo recientemente han comenzado a infectar a los humanos, muchas de ellas han estado presentes en los humanos durante un tiempo considerable, pero solo recientemente se han reconocido (ver [2 ] para una discusión más detallada). Además, reconocemos que & # x02018species & # x02019 en sí es una designación imprecisa, especialmente para virus como la influenza A, donde diferentes serotipos pueden tener epidemiologías e impactos en la salud muy diferentes. De hecho, la demarcación entre género, complejo de especies, especie y serotipo (u otras designaciones de variación subespecífica) puede ser algo arbitraria. No obstante, un estudio de & # x02018species & # x02019 actualmente reconocidas es un punto de partida natural para los intentos de caracterizar e interpretar patrones de diversidad de virus.


4. TRANSMISIÓN Y PATOGÉNESIS

4.1. Modo de entrada a la celda

Está bien documentado que el SARS-CoV y el HCoV-NL63 utilizan el mismo receptor, la enzima convertidora de angiotensina (ECA) -2, para entrar en la célula huésped [41, 42]. Sin embargo, las consecuencias después de la entrada son muy diferentes. El SARS-CoV causa dificultad respiratoria severa, mientras que el HCoV-NL63 puede provocar una infección respiratoria leve. Esto se atribuyó a la capacidad de cada proteína de unión al receptor de virus, pico o proteína S, para unirse a ACE-2 en la superficie celular. Se encontró que la proteína HCoV-NL63 S tiene una interacción más débil con ACE-2 que la proteína SARS-CoV S. Esta interacción de menor afinidad con ACE-2 podría explicar en parte las diferentes consecuencias patológicas de la infección por SARS-CoV y HCoV-NL63 [43].

No obstante, se espera que evolucione una alta patogenicidad con los coronavirus. En cuanto a HCoV-NL63, la posibilidad de que se desarrolle una variante de virus recombinante es alta debido a su alta prevalencia y la posibilidad de un evento de recombinación por coinfección [24]. Además, el virus puede sobrevivir hasta siete días en una solución acuosa y secreciones respiratorias y permanece infeccioso a temperatura ambiente. En regiones densamente pobladas, la transmisión directa de persona a persona se considera la ruta principal de propagación del VHC-NL63 [42, 44].

4.2. Incidencia estacional

Se ha demostrado que el virus tiene una distribución mundial y se observó principalmente en la temporada de invierno en climas templados. Por otro lado, los países con condiciones climáticas extremas, como Canadá, también han mostrado actividad del virus entre enero y marzo, aunque se notificaron síntomas más leves [45]. Curiosamente, se han informado variaciones estacionales en China, donde la infección por HCoV-NL63 apareció principalmente en primavera y verano [26]. Además, un estudio reciente de coronavirus en Tailandia no mostró ninguna predilección estacional [46], mientras que Wu et al. (2007) informaron que el virus se detecta durante la temporada de otoño en Taiwán [47]. Es evidente que el virus no tiene predilección por una estación en particular y no se ve afectado por las variaciones de temperatura ya que las infecciones pueden ocurrir durante todo el año (Tabla & # x200B 1 1 ).

Tabla 1

Características epidemiológicas, demográficas, clínicas y virológicas de las infecciones por HCoV-HCOV-NL63

PaísTipo de muestraMétodo de detecciónPrevalencia estacionalTipo de estudioNúmero de pacientes involucrados en el estudio (tamaño de la muestra)La edadIncidencia de HCoV-NL63Co-infecciónSíntomasRefs.
AustraliaHisopo de garganta y narizRT-PCRInviernoBasado en la comunidad234& # x0003e 5 años3.3%DAKOTA DEL NORTELeve Sin crup, sin bronquiolitis[54]
BélgicaNRRT-PCRInvierno (enero-febrero)Pacientes hospitalizadosNRVariable (6 casos menores de 2 años)2.3%AusenteFiebre, tos, sibilancias, dificultad respiratoria, diarrea[28, 88]
CanadáFrotis de garganta, frotis nasofaríngeo, autopsia de pulmónRT-PCRInvierno (enero-marzo)pacientes con IRA5251 mes-100 años3,6% (13 hombres y 6 mujeres)AusenteFiebre, rinitis, tos, dolor de garganta, bronquiolitis[45]
FranciaNRRT-PCRInvierno (febrero)Pacientes hospitalizados por IRA300Variable (18 casos menores de 2 años)9.3%AusenteFiebre, rinitis bronquiolitis, problemas digestivos, otitis, faringitis y conjuntivitis[29]
AlemaniaSecreciones nasofaríngeasRT-PCR en tiempo realInviernoBasado en la población (pacientes hospitalizados + pacientes ambulatorios)949& # x0003c 3 años5.2%RegaloBronquitis de crup Bronquiolitis[52, 53]
China, Hong KongAspirado nasofaríngeoRT-PCRPrimavera y veranoPacientes hospitalizados por IRA5876-57 meses2.6%RegaloCrup Fiebre Erupción Dolor de garganta Tos Rinitis Dificultad para respirar Ronquera Exacerbaciones del asma Convulsiones[26]
ItaliaAspirado nasofaríngeoRT-PCRInvierno (diciembre-febrero)Lactantes hospitalizados por IRA150& # x0003c2 años1.86%RegaloBronquiolitis Neumonía Broncoespasmo Rinitis sibilante Bronquiolitis Laringitis[51]
JapónNRRT-PCREnero marzoNR419NR5 casosDAKOTA DEL NORTEDAKOTA DEL NORTE[49]
CoreaAspirado nasofaríngeoRT-PCRAbril MayoNiños con infección del tracto respiratorio inferior515 1.6%25%Fiebre, estertores, sibilancias, neumonía, crup, exacerbación del asma[71]
TaiwánAspirado nasofaríngeoRT-PCR cuantitativaPico en octubrePacientes hospitalizados por IRA539< 3 years1.3%RegaloFever, cough , croup, and straidor[47]
TailandiaNasopharyngeal aspirateRT-PCROtoñoHospitalized patients with pneumonia+ out patients with flu like illnesses18901month-65 years7/734 (first year) 1/1156 (second yearRegaloCough, fever, straidor, croup[46]
SudáfricaNasal swabRT-PCRNRND238Median age= 12.4 months8.3%RegaloWheezing[89]
SuizaNasopharyngeal swabRT-PCRCold monthsoutpatients82Neonates (less than 1 year)7%NDCough, wheeze, fever, rhinitis , otitis, tonsillitis[60]
SueciaNasopharyngeal aspirateRT-PCRNROupatients (Children attending to pediatric department)212ND6%NDND[90]
Estados UnidosRespiratory specimensRT-PCRMostly January-FebruaryBoth ambulatory and hospitalized patients for ARI895< 5 years8.8%RegaloCough, rhinnorhoea, tachpnea, fever, abnormal breath sounds, hypoxia[91]

4.3. Prevalence

The human coronaviruses account for a significant number of hospitalization for children under 18 years of age, the elderly and immunocompromised individuals. In fact, a one-year study of children hospitalized in Hong Kong (China) has shown that respiratory tract infection with coronaviruses accounts for 4.4% of all admissions for acute respiratory infections. Of these, HCoV-NL63 was the most common coronavirus identified with an incidence of 2.6% [48]. Moreover, a study in Japan has shown that out of 419 specimens that tested negative for common respiratory viruses, five (1.2%) were positive for human coronavirus HCoV-NL63 [49]. Another Japanese report has indicated that out of 118 nasopharyngeal swab samples obtained from hospitalized children younger than two years of age, three (2.5%) were positive for HCoV-NL63 [50].

In Europe, high prevalence was also noted. In Italy, a study conducted on 322 infants suffering from acute respiratory disease has shown that 8.7% of the cases examined were caused by coronaviruses, with HCoV-NL63 accounting for 21.4% of the latter [51]. In France, 300 respiratory specimens were checked for HCoV-NL63 presence of the 300 samples, 28 (9.3%) were positive [29]. Likewise, seven cases were reported in a one-year study in Belgium [28]. Interestingly, the Dutch group that first described the virus has obtained 949 samples from a German group who conducted a population-based study on lower respiratory tract infection in children under three years of age [52] the group re-analyzed the samples and detected a 5.2% incidence of HCoV-NL63 [53]. In Australia, the virus was detected in Melbourne, where a study conducted on 543 patients with respiratory symptoms has shown 18 cases (3.3%) of human coronavirus HCoV-NL63 infection [54]. Moreover, in the USA and Canada, the virus was reported in 79 (8.8%) out of 895 and 19 (3.6%) out of 525 patients, respectively.

Currently, the accuracy of the percentage of detection is hampered by two main problems: firstly, the suitability of the samples examined: a recent study has shown that there are differences between respiratory samples collected by nose/throat swabs and by nasopharyngeal aspirates, specifically regarding their potential to detect and identify respiratory pathogens [55]. The second problem is that diagnostic tests for HCoVs are not frequently used in the routine testing for viruses, which probably results in the percentage of HCoVs infections being greatly underestimated [56]. Moreover, throughout the years several methods of variable sensitivity were used to determine the incidence of the virus [57-59].

4.4. Co-Infection

Many groups have reported that the occurrence of co-infections with HCoV-NL63 and other respiratory viruses, including other human coronaviruses, influenza A virus, respiratory syncytial virus (RSV), parainfluenza virus and human metapneumovirus (hMPV), are common [26, 30, 46, 47, 51, 53, 54, 60, 61]. Also, co-infected patients are more likely to be hospitalized, indicating the severity of this kind of superinfection. In a study from Germany, RSV-A and HCoV-NL63 was the most common co-infection indentified in children less than three years of age. This is probably due to the high incidence of RSV-A in winter and the overlap in seasonality of the viruses [53]. Also, in Italy, HCoV-NL63 circulates as a mixture of variant strains and is often associated with other viral infections [30]. In South Africa, co-infection of patients with HCoV-NL63 and bocavirus in hospitalized children is reported. Nasopharyngeal and bronchoalveolar lavage samples from 341 patients were screened for common respiratory viruses, and the co-presence of HCoV-NL63 and bocavirus in at least one sample was reported [62].

Interestingly, the viral load of HCoV-NL63 is lower in co-infected patients than in patients infected with HCOV-NL63 only. There are various possible explanations for this phenomenon [53]:

HCoV-NL63 might be the initial infection that weakens the immune system enough for a second infection to gain a foothold. By the time this second infection shows symptoms, the HCoV-NL63 infection might have already have been brought under control by the host immune system,

the two viruses may be in competition for the same receptor or target cell in the respiratory organs,

the elevated activation of the innate immune response triggered by the second respiratory virus may cause inhibition of HCoV-NL63 or,

prolonged persistence of HCoV-NL63 at low levels.

The high prevalence of co-infections of HCoV-NL63 and other respiratory viruses increases the chances of genetic recombination with these human or zoonotically transmitted viruses. In fact, Pryc et al. (2006) states HCoV-NL63 resulted from a recombination event between PEDV and an ancestral HCoV-NL63 strain. Theoretically, these types of recombination events could enable highly pathogenic virus variants to arise [24].

4.5. Características clínicas

Recent scientific and clinical evidence has indicated that the virus is found during upper and lower respiratory tract infections, causing symptoms and signs that do not differ greatly from the symptoms described for the 'old' viruses HCoV-229E and HCoV-OC43. Other systems involvement is still controversial [63].

Mesa ​ 1 1 shows that patients diagnosed with the virus have presented with mild symptoms, indicating upper respiratory tract infection such as fever, cough and rhinorrhoea. On the other hand, the disease is also known to cause significant more alarming lower respiratory tract infection. One of the most alarming symptoms is bronchiolitis, an inflammation of the membranes lining the bronchioles. This symptom was reported by several research groups [25, 50, 64], and although a population-based study in China did not report an association of HCoV-NL63 with bronchiolitis [26], it is still believed to be one of the presenting symptoms. Several research groups have linked HCoV-NL63 to croup [26, 53]. Croup children present with pharangitis, sore throat and hoarseness of voice, and are considered for hospitalization. Of the rare findings, a group has reported the association between HCoV-NL63 and Kawasaki disease, a form of childhood vasculitis that is presented as fever, polymorphic exanthema, oropharyngeal erythema and bilateral conjuctivitis [65]. However, others fail to report on this association [66, 67].

It is noteworthy to say that the report of symptoms in young children, who represent the majority of patients, is based mainly on parental observations, where other possible subjective signs and symptoms fail to be recognized by the parents. Moreover, most of the studies were conducted on patients reporting to hospitals suffering from acute respiratory tract infection. To date, there are only few population-based studies and the question arises whether larger numbers of such studies might reveal the involvement of other body systems.


Applications of molecular techniques

NEW APPROACHES TO THE DISCOVERY OF VIRUSES AND DISEASE AETIOLOGIES

Molecular techniques have been instrumental in the recent discoveries of viruses associated with hepatitis. 4 The most important of these came in 1989 with the partial characterisation of the infectious agent associated with most cases of non-A non-B hepatitis. 5, 6 This condition usually presented as post-transfusion jaundice and was long suspected to have a viral aetiology. Nucleic acid from infectious chimpanzee blood was used to produce sufficient quantities of virus encoded proteins for the development of a diagnostic antibody assay. This molecular approach was successful in developing a laboratory diagnostic assay before the virus had been isolated and characterised in the conventional sense now named hepatitis C virus, it has been characterised extensively using molecular techniques. Another virus has been similarly discovered and characterised, 7 and although termed hepatitis G virus, a role for this virus or group of viruses in human disease remains unclear. 8

A powerful PCR based technique known as representational difference analysis has been used to discover a virus associated with cancer in HIV infected individuals. 9 Apart from epidemiological data suggesting an infectious cause of Kaposi's sarcoma, there had been no characterisation of the newly discovered member of the herpesvirus group. Human herpesvirus 8, or KS virus, has been detected in tissue from HIV infected individuals, including those with Kaposi's sarcoma lesions, 10, 11 and also from sarcoid. 12

DIAGNOSTIC PROBLEMS

Traditionally, laboratory diagnostic techniques in virology have relied on an ability to propagate infectious virus from clinical material in cell culture, or on the detection of a specific antibody. Where virus propagation is not successful, laboratory diagnosis has remained a problem because direct detection methods for viral antigen, nucleic acid, or morphology by microscopy in clinical material have low sensitivity. These difficulties, together with the time interval required to detect a specific immune response and the interpretation of antibody values for viruses that cause latent infections, has caused continuing diagnostic dilemmas for the clinical virologist. A reliable diagnosis of HIV and HCV infection is usually achieved by the detection of antibody however, these viruses can be transmitted vertically and passive acquisition of maternal antibody confuses confirmation of infection in the neonate. The serological diagnosis of HIV and HCV infection is also impossible in the “window period” before seroconversion, and this poses a concern for the safety of blood products: an estimated risk of HCV transmission in western Germany is 1/20 000 for first time donors and 1/200 000 for repeat donors. 13

Molecular assays in some circumstances might be no more sensitive or specific than traditional techniques, although they may be more suited to large scale screening programmes. The detection of C trachomatis infection, an “atypical” organism that has traditionally been the interest of the virologist, has evolved from isolation in cell lines, which is technically difficult but has good specificity, to antigen detection by enzyme immunoassay or fluorescence antibody test, and now to molecular amplification of pathogen DNA. The commercial molecular assays that have been developed are more sensitive than antigen detection, 14 and much better suited to routine use than cell culture isolation. The use of molecular detection has led to a growing awareness of the extent of chlamydial infection and the potential value of a comprehensive screening programme.

CENTRAL NERVOUS SYSTEM INFECTION

Central nervous system (CNS) viral infections, although recognised clinically, are a diagnostic difficulty because of the generally low sensitivity of virus isolation methods from cerebrospinal fluid (CSF). Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is rarely recoverable from the CSF of patients with herpes simplex virus (HSV) encephalitis, probably because relatively few viable virus particles are released into the CSF. For a while, techniques based on the detection of virus in brain biopsy were attempted to provide a reliable, prompt diagnosis in this illness, but the advent of effective antivirals of low toxicity has made invasive techniques difficult to justify. In cases of enterovirus meningitis, virus might be recovered from CSF, although not all serotypes grow in laboratory cell lines, and growth is generally too slow to aid differentiating between viral and bacterial meningitis. Hitherto, patients with viral CNS infection have often received only a presumptive diagnosis based on clinical presentation: without supportive laboratory evidence an understanding of the aetiology and epidemiology of viral CNS disease has been limited.

Molecular amplification techniques have been able to overcome many of these problems through the ability to detect just a few copies of viral nucleic acid directly in CSF. The use of the PCR technique for the diagnosis of HSV encephalitis was one of its first applications in the clinical virology laboratory, and when it was demonstrated that PCR could potentially provide sensitive and specific diagnosis, 15 the test was evaluated extensively in several prospective studies. 16– 18 Assays for the other herpesviruses and enteroviruses have also been developed and found to contribute to laboratory diagnosis and patient management. 19– 22 The molecular amplification approach to the diagnosis of HSV encephalitis is now recognised as the method of choice for this disease, 17, 23 and also for viral CNS infection in general. 24 PCR analysis of CSF has demonstrated that symptoms of meningitis might be caused by the reactivation of varicella zoster virus (VZV), 25, 26 or herpes simplex virus type 2 (HSV-2) 26, 27 infection without concurrent skin lesions. HSV-2 infection has been shown to be the cause of Mollaret's meningitis 28 and an important cause of apparent sporadic aseptic meningitis in one study, this virus was the most common aetiology found in women with this clinical diagnosis. 29 Where traditional diagnostic methods are insensitive, our understanding of the natural history of viral disease continues to be improved through the use of molecular techniques, and in CNS infection our knowledge of the range of viral aetiologies has improved alongside the potential for early therapeutic intervention.

DIAGNOSIS IN IMMUNOSUPPRESSED PATIENTS

The development of antiviral drugs has highlighted the potential value to treatment of a rapid diagnosis of virus reactivation in immunosuppressed patients. Cytomegalovirus (CMV) is a major cause of post-transplant morbidity and, because it replicates only slowly in conventional cell culture, methods such as immunostaining for CMV early antigen expression have been used to speed the detection of virus replication in inoculated cell monolayers in the laboratory. Methods for detecting directly either virus specific antigen 30 or nucleic acid 31 in clinical material have removed the need for virus cell culture. An early concern that the high sensitivity of molecular amplification techniques would result in the detection of latent herpesvirus genome, so lowering the clinical specificity of virus nucleic acid detection, have been unfounded: the detection of viraemia has been found to correlate well with active CMV disease 32, 33 and CMV PCR is now often incorporated into routine post-transplant microbiological surveillance of susceptible patients.

VIRAL GENOTYPING

The problem of drug resistant virus phenotypes is becoming more recognised with an increase in the number of immunosuppressed patients receiving long term antiviral treatment. The use of prophylactic antiviral treatment for reactive herpesvirus infection, and the use of combinations of drugs to suppress viral replication in HIV infection, has selected for mutations conferring drug resistance. Under selective pressure, a drug resistant strain can quickly become the dominant phenotype, but molecular based assays have improved the clinical management of these patients by facilitating the detection of mutations conferring resistance. For the HIV genome, a commercial assay is available based on molecular amplification of the viral genome followed by hybridisation with mutation specific DNA probes. At present, these methods are used for the detection of resistance to the reverse transcriptase inhibitor class of antiviral compounds, but as a rapid and inexpensive approach it is likely to be used for other phenotypic determinants. A similar technique has been used for genotyping HCV infection for epidemiological study and for predicting the response to treatment. 34, 35

VIRAL LOAD

Molecular assays have had an important role in the study of the natural history of HIV infection, and subsequently in the development of effective treatment strategies. Quantitative molecular assays have shown that HIV-1 infection is characterised by high rates of virus production and clearance of both infected cells and cell free virions. 36 This discovery led to the development of highly active antiretroviral treatment, the aim of which is the durable maximum suppression of virus replication. 37 This advance in HIV treatment has been facilitated by the recent commercial development of viral load assays. The assessment of viraemia is now used as a prognostic indicator in HIV, 38 HCV, 39 and hepatitis B virus 40 infections, and is also used in monitoring the efficacy of antiviral treatment in systemic viral infections of immunosuppressed patients. 33


John Lednicky

Title: Research Professor
Universidad: Public Health and Health Professions
Department: Environmental and Global Health
Curriculum vitae: PDF
Research Interests: Detection, isolation, and genetic analysis of arboviruses and respiratory viruses (especially animal and human influenza viruses and coronaviruses) Discovery and genetic analyses of viruses associated with fatal infections in farmed cervids Aerovirology specializing in the collection of airborne viruses Stability, spread and decontamination of respiratory viruses on environmental surfaces Polyomavirus regulatory region structure and function Molecular and classical diagnostic virology (human and animal) Paramyxovirus detection, isolation, and genetic analysis Development of human and animal virus detection, isolation, and identification methodologies Determination of whole genomic sequences of DNA and RNA viruses Diagnostic (clinical) microbiology (bacteriology, mycology, parasitology, and virology) Reverse genetics of RNA viruses: expression of viral genes and virus production.
Hobbies: Cooking and dining, soccer, wildlife viewing, and attending cultural events

Dr. John Lednicky has broad training and experience in microbiology and molecular biology, and performs both basic and applied research. He has worked with various bacteria, fungi, and viruses, some of which are select agents, in a variety of settings that include A/BSL3 laboratories. At the University of Florida, he engages in many multi-disciplinary projects that cover a range in topics, including aerobioogy, virus discovery, and research on the outcomes of inhaled nanoparticles on subsequent respiratory virus infections.

At his previous job at MRIGlobal, first as Principal Scientist, then as Senior Advisor, he managed and provided technical oversight and guidance for programs involving molecular biology, virology, and microbiology served as a corporate expert in the area of virology and molecular biology developed and directed research programs wrote and reviewed research proposals, technical reports, and presentations and managed technical aspects, schedules, and budgets of programs. While there, he established a ferret model for intranasal and aerosol studies with H5N1 and other influenza viruses.

His recent work includes detection and/or isolation of metapneumoviruses, unusual reassortant influenza A viruses, neurotropic Canine morbillivirus, an arenavirus, human and murine coronaviruses, the genetic characterization of a unique rhinovirus C and of a unique strain of human polyomavirus. The Lednicky laboratory also engineers cells that express specific virus receptors these cells facilitate the isolation and propagation of the viruses that bind the receptors. Finally, the laboratory also evaluates antivirals (synthetic and natural) in-vitro and has the experience to do so in animal models.


CRISPR discovery from Wuerzburg paves the way for novel COVID testing method

Most conventional molecular diagnostics usually detect only a single disease-related biomarker. Great examples are the PCR tests currently used to diagnose COVID-19 by detecting a specific sequence from SARS-CoV-2. Such so-called singleplex methods provide reliable results because they are "calibrated" to a single biomarker. However, determining whether a patient is infected with a new SARS-CoV-2 variant or a completely different pathogen requires probing for many different biomarkers at one time.

Scientists from the Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI) and the Julius Maximilians University (JMU) in Würzburg have now paved the way for a completely new diagnostic platform with LEOPARD. It is a CRISPR-based method that is highly multiplexable, with the potential to detect a variety of disease-related biomarkers in just one test.

How LEOPARD works

LEOPARD, which stands for "Leveraging Engineered tracrRNAs and On-target DNAs for PArallel RNA Detection," is based on the finding that DNA cutting by Cas9 could be linked to the presence of a specific ribonucleic acid (RNA). This link allows LEOPARD to detect many RNAs at once, opening opportunities for the simultaneous detection of RNAs from viruses and other pathogens in a patient sample.

The study published today in "Science" was initiated by Chase Beisel, professor at JMU and research group leader at HIRI, and Professor Cynthia Sharma from JMU's Institute of Molecular Infection Biology (IMIB). "With LEOPARD, we succeeded in detecting RNA fragments from nine different viruses,' says Beisel. "We were also able to differentiate SARS-CoV-2 and one of its variants in a patient sample while confirming that each sample was correctly collected from the patient."

CRISPR-Cas9 is principally known as a biomolecular tool for genome editing. Here, CRISPR-Cas9 function as molecular scissors that cut specific DNA sequences. These same scissors are naturally used by bacteria to cut DNA associated with invading viruses. Whether editing genomes or eliminating viruses, Cas9 cutting is directed by guide RNAs. The guide RNAs found in bacteria must pair with a separate RNA called the tracrRNA. The RNA couple then can work with Cas9 to direct DNA cutting.

Un descubrimiento inesperado

The tracrRNA was thought to only pair with guide RNAs coming from the antiviral system. However, the Würzburg scientists discovered that the tracrRNA was pairing with other RNAs, turning them into guide RNAs. Cynthia Sharma, Chair of Molecular Infection Biology II at the IMIB and spokesperson of the Research Center for Infection Diseases (ZINF) at JMU was astounded by this discovery: "When we searched for RNAs binding to Cas9 in our model organism Campylobacter, we surprisingly found that we detected not only guide RNAs, but also other RNA fragments in the cell that looked like guide RNAs. The tracrRNA was pairing with these RNAs, resulting in "non-canonical" guide RNAs that could direct DNA cutting by Cas9."

The LEOPARD diagnostic platform builds on this discovery. "We figured out how to reprogram the tracrRNAs to decide which RNAs become guide RNAs," says Beisel. "By monitoring a set of matching DNAs, we can determine which RNAs were present in a sample based on which DNAs get cut. As part of the ongoing pandemic, LEOPARD could allow a doctor to figure out whether the patient is infected with SARS-CoV-2, if it's a unique variant, and whether the sample was correctly taken or needs to be repeated--all in one test."

In the future, LEOPARD's performance could dwarf even multiplexed PCR tests and other methods. "The technology has the potential to revolutionize medical diagnostics not only for infectious diseases and antibiotic resistances, but also for cancer and rare genetic diseases," says Oliver Kurzai, director of JMU's Institute of Hygiene and Microbiology, which provided patient samples for the study.

"The work highlights the excellent collaborative and interdisciplinary research taking place here in Würzburg," says Jörg Vogel, director of IMIB and HIRI, a joint facility of JMU with the Helmholtz Center for Infection Research in Braunschweig. "LEOPARD impressively demonstrates that we can cover the full spectrum of complementary cutting-edge research in Würzburg, from the fundamentals of RNA research to clinical applications."

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