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12.18: Ribosomas - Biología

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La síntesis de proteínas consume más energía celular que cualquier otro proceso metabólico. Cada aminoácido individual tiene un grupo amino (NH2) y un grupo carboxilo (COOH). Esta reacción es catalizada por ribosomas y genera una molécula de agua.

Maquinaria de síntesis de proteínas

Además de la plantilla de ARNm, muchas moléculas y macromoléculas contribuyen al proceso de traducción. La composición de cada componente puede variar entre especies; por ejemplo, los ribosomas pueden constar de diferentes números de ARNr y polipéptidos dependiendo del organismo. Sin embargo, las estructuras y funciones generales de la maquinaria de síntesis de proteínas son comparables de las bacterias a las células humanas. La traducción requiere la entrada de una plantilla de ARNm, ribosomas, ARNt y varios factores enzimáticos.

Polisomas

Incluso antes de que se traduzca un ARNm, una célula debe invertir energía para construir cada uno de sus ribosomas. En E. coli, hay entre 10,000 y 70,000 ribosomas presentes en cada célula en un momento dado. Un ribosoma es una macromolécula compleja compuesta de ARNr estructurales y catalíticos, y muchos polipéptidos distintos. En eucariotas, el nucleolo está completamente especializado para la síntesis y ensamblaje de ARNr.

Los ribosomas existen en el citoplasma de los procariotas y en el citoplasma y el retículo endoplásmico rugoso de los eucariotas. Las mitocondrias y los cloroplastos también tienen sus propios ribosomas en la matriz y el estroma, que se parecen más a los ribosomas procarióticos (y tienen sensibilidades similares a los fármacos) que los ribosomas que se encuentran justo fuera de sus membranas externas en el citoplasma. Los ribosomas se disocian en subunidades grandes y pequeñas cuando no están sintetizando proteínas y se reasocian durante el inicio de la traducción. coli, la subunidad pequeña se describe como 30S y la subunidad grande es 50S, para un total de 70S (recuerde que las unidades Svedberg no son aditivas). Los ribosomas de mamíferos tienen una pequeña subunidad 40S y una gran subunidad 60S, para un total de 80S. La subunidad pequeña es responsable de unir la plantilla de ARNm, mientras que la subunidad grande se une secuencialmente a los ARNt. Cada molécula de ARNm es traducida simultáneamente por muchos ribosomas, todos sintetizando proteínas en la misma dirección: leyendo el ARNm de 5 ′ a 3 ′ y sintetizando el polipéptido desde el terminal N al terminal C. La estructura completa de ARNm / polirribosoma se denomina polisoma.

ARNt

Los ARNt son moléculas de ARN estructural que se transcribieron a partir de genes mediante la ARN polimerasa III. Dependiendo de la especie, existen de 40 a 60 tipos de ARNt en el citoplasma. Sirviendo como adaptadores, los ARNt específicos se unen a secuencias en la plantilla de ARNm y agregan el aminoácido correspondiente a la cadena polipeptídica. Por lo tanto, los ARNt son las moléculas que realmente "traducen" el lenguaje del ARN al lenguaje de las proteínas.

De los 64 posibles codones de ARNm, o combinaciones de tripletes de A, U, G y C, tres especifican la terminación de la síntesis de proteínas y 61 especifican la adición de aminoácidos a la cadena polipeptídica. De estos 61, un codón (AUG) también codifica el inicio de la traducción. Cada anticodón de ARNt puede emparejarse con uno de los codones de ARNm y agregar un aminoácido o terminar la traducción, de acuerdo con el código genético. Por ejemplo, si la secuencia CUA ocurriera en una plantilla de ARNm en el marco de lectura adecuado, se uniría a un ARNt que expresa la secuencia complementaria, GAU, que se uniría al aminoácido leucina.

Como moléculas adaptadoras de la traducción, es sorprendente que los ARNt puedan encajar tanta especificidad en un paquete tan pequeño. Tenga en cuenta que los ARNt deben interactuar con tres factores:

  1. Deben ser reconocidos por la aminoacil sintetasa correcta.
  2. Deben ser reconocidos por los ribosomas.
  3. Deben unirse a la secuencia correcta en el ARNm.

Aminoacil tRNA sintetasas

El proceso de síntesis de pre-ARNt por la ARN polimerasa III solo crea la porción de ARN de la molécula adaptadora. El aminoácido correspondiente debe agregarse más tarde, una vez que el tRNA se procesa y exporta al citoplasma. A través del proceso de “carga” de tRNA, cada molécula de tRNA está ligada a su aminoácido correcto por un grupo de enzimas llamadas aminoacil tRNA sintetasas. Al menos un tipo de aminoacil tRNA sintetasa existe para cada uno de los 20 aminoácidos; el número exacto de aminoacil tRNA sintetasas varía según la especie. Estas enzimas primero se unen e hidrolizan el ATP para catalizar un enlace de alta energía entre un aminoácido y el monofosfato de adenosina (AMP); en esta reacción se expulsa una molécula de pirofosfato. Luego, el aminoácido activado se transfiere al ARNt y se libera AMP.


La persistencia de narnavirus ambigramáticos requiere la traducción del marco de lectura abierto inverso

Los narnavirus son virus de ARN detectados en diversos hongos, plantas, protistas, artrópodos y nematodos. Aunque inicialmente se describió como virus simples no segmentados de un solo gen que codifican la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp), un subconjunto de narnavirus denominados "ambigramáticos" alberga una configuración genómica única que consiste en marcos de lectura abiertos (ORF) superpuestos codificados en cadenas opuestas . El análisis filogenético apoya la selección para mantener esta organización inusual del genoma, pero faltan investigaciones funcionales. Aquí, establecemos el narnavirus 1 de Culex que infecta a los mosquitos (CxNV1) como un modelo para investigar el papel funcional de los ORF superpuestos en la replicación del narnavirus. En CxNV1, un ORF inverso sin homología con proteínas conocidas cubre casi todo el segmento de 3,2 kb que codifica RdRp. Además, se encuentran dos ORF novedosos opuestos y casi completamente superpuestos en el segundo segmento putativo de CxNV1, el ARN “Robin” de 0,8 kb. Desarrollamos un sistema para lanzar CxNV1 en una línea celular de mosquito sin experiencia, luego demostramos que se requiere RdRp funcional para la persistencia de ambos segmentos, y se requiere un ORF inverso intacto en el segmento RdRp para la persistencia. La espectrometría de masas de células infectadas con CxNV1 persistentemente proporcionó evidencia para la traducción de este ORF inverso. Finalmente, el perfil de los ribosomas produjo un patrón sorprendente de huellas para las cuatro cadenas de ARN de CxNV1 que era distinto de los ribosomas de traducción activa en el ARNm del hospedador o de los virus de ARN que infectaban conjuntamente. Tomados en conjunto, estos datos plantean la posibilidad de que el proceso de traducción en sí sea importante para la persistencia de narnavirus ambigramáticos, potencialmente protegiendo el ARN viral con ribosomas, lo que sugiere una táctica viral no descrita hasta ahora para la replicación y transmisión.

IMPORTANCIA Para nuestra comprensión de los virus de ARN es fundamental una descripción de qué hebras de ARN se transmiten como genoma viral, en relación con las que codifican las proteínas virales. Los narnavirus ambigramáticos rompen el molde. Estos virus, que se encuentran ampliamente en hongos, plantas e insectos, tienen la característica única de dos genes superpuestos codificados en hebras opuestas, que comprenden casi la longitud completa del genoma viral. Una superposición tan extensa no se ve en otros virus de ARN y tiene el costo de una menor flexibilidad evolutiva en la secuencia. El presente estudio está motivado por investigar los beneficios que equilibran ese costo. Mostramos por primera vez un requisito funcional para la configuración del genoma ambigramático en el narnavirus 1 de Culex, lo que sugiere un modelo de cómo la traducción de ambas cadenas podría beneficiar a este virus. Nuestro trabajo destaca un nuevo plan para la persistencia viral, distinto de las estrategias definidas por las definiciones canónicas de la cadena de codificación.


Enlaces de ubiquitina suavizados al transporte intraflagelar para regular la señalización del erizo

En ausencia de ligando hedgehog, patched-1 (Ptch1) se localiza en los cilios y previene la acumulación ciliar y la activación de suavizado (Smo). Tras la unión del ligando, Ptch1 se elimina de los cilios, Smo se desreprime y se acumula en los cilios donde activa la señalización. Los mecanismos que regulan estos movimientos dinámicos no se comprenden bien, pero los defectos en los componentes del transporte intraflagelar, incluidos Ift27 y el BB, algunos provocan la acumulación de Smo en los cilios sin activación de la vía. Encontramos que en ausencia de activación de la vía inducida por ligando, Smo se ubiquitina y se elimina de los cilios, y este proceso depende de Ift27 y componentes BBSome. La activación de la señalización de hedgehog disminuye la ubiquitinación de Smo y la eliminación ciliar, lo que resulta en su acumulación. El bloqueo de la ubiquitinación de Smo por un inhibidor de la ligasa E1 o la mutación de dos residuos de lisina en el bucle tres intracelular hace que Smo se acumule de forma aberrante en los cilios sin activación de la vía. Estos datos proporcionan un mecanismo para controlar el nivel ciliar de Smo durante la señalización de hedgehog regulando el estado de ubiquitinación del receptor.

Resumen La señalización del erizo implica el movimiento dinámico de receptores y efectores dentro y fuera de los cilios. Encontramos que la dinámica de Smo está regulada por la ubiquitinación, que regula su interacción con el sistema de transporte intraflagelar para controlar los niveles ciliares de este receptor.


12.18: Ribosomas - Biología

Para ti que no entiendes:
Lea las instrucciones, ¡allí está todo dicho!

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Fue bueno, pero demasiado fácil. Creo que debería mostrar instrucciones cuando el jugador hace clic en "jugar", ya sabe, muestra las instrucciones y un botón de jugar el juego a continuación.

Y no deberías dar puntos por comer moléculas con pac-man

¡Me encanta! ¡Manera de hacer que la educación sea divertida! ¿Fue esto para un proyecto o simplemente algo que hiciste por diversión? ¡Porque sería un proyecto de biología espectacular!

Tanto proyecto como por diversión en realidad. ¡También obtuve una buena nota!
¡Qué bueno que te haya gustado! ¡Gracias!

Pensé que estaba bien y no es tan complicado si lees todas las instrucciones.

Buen concepto, pero lo haces demasiado difícil con el límite de anticodones que puedes tener cuando, incluso cuando llenas la pantalla con ellos, no coinciden con el codón correcto que está a punto de matarte. Buena idea, solo necesita algunos arreglos.

Parece que me costó mucho trabajo, pero no pude entender cómo jugarlo. Parece que necesitas conocimientos prácticos de ARN para jugar a este juego.

¿Sabes siquiera qué es el ARN?
Lea las instrucciones por favor. Es un juego, lo juegas de acuerdo con las instrucciones.
Espero haberte cabreado :)


Parte 2: Vigilancia de ARNm por el ribosoma

00: 00: 07.22 Hola. Mi nombre es Rachel Green
00: 00: 09.14 y estoy en la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins
00: 00: 12.01 y en el Instituto Médico Howard Hughes.
00: 00: 14.12 Lo que voy a compartir contigo hoy
00: 00: 15.20 es una historia de mi propio laboratorio
00: 00: 17.06 centrándose en cómo el ribosoma,
00: 00: 18.21 en células eucariotas,
00: 00: 19.29 identifica ARN mensajeros defectuosos
00: 00: 21.24 para activar una serie de eventos en la celda
00: 00: 24.15 que conducen a la degradación del producto proteico incompleto,
00: 00: 27.15 a la desintegración del ARN mensajero,
00: 00: 29.01 y al reciclaje del complejo ribosómico.
00: 00: 33.02 Entonces, ¿qué ARN mensajero tiene defectos?
00: 00: 35.02 en la celda, ¿le gustaría monitorear?
00: 00: 36.28 ¿Cuál podría ser el problema?
00: 00: 39.00 con un ARN mensajero dado en una célula eucariota?
00: 00: 42.03 Como recordamos de aprender sobre el procesamiento de ARNm,
00: 00: 44.04 sabemos que los ARN mensajeros eucariotas
00: 00: 46.06 salen del núcleo con una tapa
00: 00: 48.01 en su extremo de 5 '
00: 00: 49.08 y con una cola poliA en el extremo de 3 ',
00: 00: 51.20 y estas son firmas clave en un ARN mensajero en células eucariotas
00: 00: 55.08 que le dice a un ribosoma
00: 00: 57.02 que este es un buen mensaje
00: 00: 58.13 y que este debería ser traducido.
00: 01: 00.12 Además, sabemos que los ARN mensajeros típicos
00: 01: 02.05 tienen un codón de inicio
00: 01: 03.18 que señala el comienzo de un marco de lectura abierto
00: 01: 05.21 y un codón de parada
00: 01: 07.24 que significa el final de un marco de lectura abierto,
00: 01: 09.26 y lo que le gustaría hacer al celular
00: 01: 11.13 es comenzar por el principio e ir al final
00: 01: 13.07 y hacer una proteína de cuerpo entero.
00: 01: 15.03 Entonces, ¿qué puede salir mal?
00: 01: 16.05 Bueno, puede haber muchos eventos que tienen lugar
00: 01: 18.24 en procesamiento de ARN o con mutaciones
00: 01: 21.01 que resultaría en un ARN mensajero
00: 01: 22.22 que en realidad podría no ser óptimo.
00: 01: 24.20 Un ejemplo del que muchos de ustedes pueden haber oído hablar
00: 01: 26.18 es, por ejemplo, si un ARN mensajero
00: 01: 28.22 contiene un codón de terminación prematura.
00: 01: 30.12 Es decir, en lugar de
00: 01: 32.10 con solo un codón de parada al final del marco de lectura abierto,
00: 01: 34.14 ellos, por mutación de algún otro proceso
00: 01: 36.22 - quizás un proceso de empalme incorrecto -
00: 01: 38.04 tienen un codón de terminación que aparece
00: 01: 40.28 temprano en el marco de lectura abierto.
00: 01: 42.06 Sorprendentemente, células eucariotas
00: 01: 43.21 tener un mecanismo en su lugar
00: 01: 45.19 para determinar si un codón de terminación
00: 01: 47.01 es el codón de terminación correcto o el codón de terminación incorrecto.
00: 01: 50.24 Y desencadenan esta secuencia de eventos
00: 01: 52.08 que finalmente conduce a la desintegración del ARN mensajero.
00: 01: 54.27 Otro ejemplo de un posible problema
00: 01: 57.12 con el ARN mensajero
00: 01: 58.20 sería un ARN mensajero escindido endonucleolíticamente.
00: 02: 00.12 Si el ARN mensajero recogió una escisión
00: 02: 02.14 en medio de,
00: 02: 03.26 el ribosoma nunca alcanzaría un codón de parada al final,
00: 02: 06.12 y el ribosoma se atascaría
00: 02: 07.29 en ausencia de un codón de parada
00: 02: 09.08 y la capacidad de promover el proceso normal de terminación.
00: 02: 11.27 Entonces, este es un ARN mensajero
00: 02: 13.08 que a la celda le gustaría deshacerse y no volver a usar.
00: 02: 15.15 También le gustaría deshacerse de ese producto polipeptídico incompleto.
00: 02: 19.25 Un último ejemplo que puedes imaginar podría suceder
00: 02: 22.27 es que el ARN mensajero podría no tener un codón de parada,
00: 02: 25.25 a través de algún evento de empalme incorrecto o alguna mutación,
00: 02: 28.02 y en ese caso el ribosoma
00: 02: 29.14 podría llegar hasta el final
00: 02: 32.16 la región 3 'no traducida de ese gen
00: 02: 35.06 y encuentro una cola poliA.
00: 02: 37.02 PolyA codifica lisina,
00: 02: 38.16 y lo que se cree que sucederá
00: 02: 40.04 es que el ribosoma siente que está produciendo lisina-lisina-lisina-lisina,
00: 02: 42.27 y desencadena un proceso de
00: 02: 47.22 decaimiento y rescate en la celda
00: 02: 49.08 a lo que nos referimos como decaimiento continuo.
00: 02: 50.21 Entonces, decadencia mediada por tonterías,
00: 02: 51.27 No-Go Decay,
00: 02: 53.00 y decadencia continua
00: 02: 54.14 son probablemente tres procesos relacionados
00: 02: 56.01 que están todos apuntados
00: 02: 57.26 para mantener bajo control en la celda u
00: 02: 59.12 ARN mensajeros productivos,
00: 03: 01.04 deshacerse de los ARN mensajeros,
00: 03: 02.19 degradando el producto proteico,
00: 03: 04.02 y rescatando los ribosomas
00: 03: 05.20 para eventos de traducción posteriores,
00: 03: 07.04 y eso es en lo que se centrará la conferencia de hoy.
00: 03: 10.06 Entonces, ¿cómo nos interesamos?
00: 03: 11.18 en estos procesos de descomposición,
00: 03: 13.20 de vigilancia de ARNm?
00: 03: 14.27 Nos interesamos
00: 03: 16.27 porque notamos en la literatura
00: 03: 18.16 una observación interesante.
00: 03: 19.28 Durante varios años,
00: 03: 21.11 habíamos estudiado el proceso de terminación
00: 03: 24.25 en sistemas eucariotas,
00: 03: 26.17 mediante el cual se reconoce un codón de parada
00: 03: 28.20 por factores de terminación en células eucariotas
00: 03: 31.02 para liberar la cadena polipeptídica en crecimiento.
00: 03: 32.27 Y habíamos estudiado estos factores
00: 03: 34.04 y cómo funcionan bioquímicamente
00: 03: 35.16 durante varios años.
00: 03: 37.20 Hubo una publicación que salió del laboratorio de Roy Parker, sin embargo,
00: 03: 40.06 donde el laboratorio de Roy puso un ARN mensajero en levadura
00: 03: 43.06 una estructura de bucle de tallo largo
00: 03: 44.26 - tenía 34 pares de bases de longitud, este vástago -
00: 03: 48.08 y de hecho era una estructura tan grande
00: 03: 49.28 que ningún ribosoma podría atravesarlo fácilmente.
00: 03: 53.10 Y lo que observó el laboratorio de Roy
00: 03: 55.08 era que este ARN mensajero
00: 03: 58.00 fue el objetivo de la descomposición en la célula eucariota
00: 03: 59.22 en un proceso que llamó No-Go-Decay,
00: 04: 01.12 porque el ribosoma no puede atravesarlo,
00: 04: 03.19 pero la observación clave en este estudio
00: 04: 06.06 fue que este proceso de desintegración del ARNm
00: 04: 07.21 dependía de dos proteínas,
00: 04: 09.05 Dom34 y Hbs1,
00: 04: 11.24 que resultaron ser homólogos
00: 04: 13.26 de los factores de terminación eucariotas
00: 04: 16.06 eRF1 y eRF3
00: 04: 17.24 que habíamos estado estudiando,
00: 04: 19.08 y los habíamos estado estudiando bioquímicamente.
00: 04: 21.08 Entonces, esto parecía una idea clave,
00: 04: 22.16 porque lo que sugirió
00: 04: 24.06 fue ese reconocimiento de un ARN mensajero malo
00: 04: 26.10 es de hecho impulsado por ribosomas, como puede sospechar,
00: 04: 28.09 porque el ribosoma debe ser la enzima,
00: 04: 31.15 o el catalizador, o la macromolécula,
00: 04: 34.10 que decide si un mensaje es bueno o no.
00: 04: 36.00 Parecía una idea muy lógica
00: 04: 37.12 que el ribosoma es lo que determina
00: 04: 39.08 si un ARN mensajero es bueno o malo.
00: 04: 40.22 ¿Debería traducirlo o no?
00: 04: 43.16 Y ahí es donde comenzó nuestro trabajo.
00: 04: 46.12 Sabíamos que Dom34 era un homólogo de eRF1
00: 04: 48.10 y eso está resaltado por esta vista estructural aquí.
00: 04: 50.18 Había estructuras conocidas de eRF1 y Dom34.
00: 04: 53.24 eRF1, al reconocer codones de parada,
00: 04: 55.16 tiene un motivo de reconocimiento de codones aquí abajo
00: 04: 57.21 llamado dominio NIKS,
00: 04: 59.21 y en la parte superior, interactuando con la subunidad grande del ribosoma,
00: 05: 02.17 es un motivo de tri-aminoácidos, un motivo GGQ,
00: 05: 06.01 que es responsable de la catálisis de la liberación de péptidos.
00: 05: 09.17 Vemos que Dom34 tiene dominios similares.
00: 05: 12.08 Este dominio está claramente relacionado con este dominio
00: 05: 14.16 - puedes ver eso en términos de las hojas beta
00: 05: 16.01 y las hélices alfa.
00: 05: 18.02 Sin embargo, falta este dominio con el motivo GGQ
00: 05: 20.18 que sería responsable de liberar la cadena polipeptídica en crecimiento.
00: 05: 24.06 Vemos que también hay
00: 05: 25.29 sin motivo de reconocimiento de codones,
00: 05: 27.10 pero la otra característica que tienen en común
00: 05: 29.10 si tienen este dominio, aquí,
00: 05: 30.29 que se sabe que interactúa con las GTPasas
00: 05: 33.05 que son esenciales para el paso de terminación.
00: 05: 35.08 Entonces, este fue nuestro punto de partida.
00: 05: 36.29 Teníamos una proteína que parecía
00: 05: 38.26 estaba relacionado con un factor de terminación,
00: 05: 40.08 y sospechamos que debemos activar el ribosoma,
00: 05: 42.08 y teníamos las herramientas bioquímicas
00: 05: 44.00 que queríamos usar para hacer preguntas
00: 05: 46.00 sobre lo que podría hacer Dom34
00: 05: 47.20 para provocar la desintegración del ARN mensajero
00: 05: 49.20 que había observado el laboratorio de Roy Parker.
00: 05: 52.20 Entonces, con estas ideas en mente,
00: 05: 53.28 lo que hicimos fue incorporar Dom34 y Hbs1,
00: 05: 57.20 estos homólogos de los factores de terminación,
00: 05: 59.19 en lo que estaba en su lugar en nuestro laboratorio,
00: 06: 02.08 que es un sistema de traducción reconstituido in vitro
00: 06: 05.07 de la levadura Saccharomyces cerevisiae.
00: 06: 09.15 En nuestro laboratorio, en el congelador,
00: 06: 11.00 teníamos componentes purificados del ribosoma,
00: 06: 12.24 las subunidades pequeñas y grandes del ribosoma.
00: 06: 14.17 Teníamos ARNt, ARN mensajero,
00: 06: 17.11 teníamos cinco factores clave de iniciación
00: 06: 19.04 que el laboratorio de John Lorisher había demostrado ser esencial
00: 06: 21.07 para iniciación in vitro
00: 06: 23.17 en un codón AUG
00: 06: 24.26 y obtener ese ARNt iniciador en el ribosoma,
00: 06: 27.17 teníamos factores de alargamiento,
00: 06: 28.20 teníamos factores de terminación,
00: 06: 29.28 ya esa lista agregamos Dom34 y Hbs1.
00: 06: 33.19 Lo que un sistema reconstituido nos permite hacer
00: 06: 35.28 es formar complejos de ribosomas
00: 06: 38.02 con varios ARN mensajeros
00: 06: 39.18 especificando varios péptidos
00: 06: 44.24 y otros pasos en el sistema de traducción.
00: 06: 46.12 Podemos colocar, por ejemplo,
00: 06: 47.21 un codón de parada en el sitio aminoacilo del ribosoma
00: 06: 49.15 para ser reconocido por un factor,
00: 06: 50.16 o podemos colocar un codón de sentido,
00: 06: 52.05 y podemos seguir la actividad de estos complejos.
00: 06: 55.07 Aquí se muestra una bola azul
00: 06: 56.28 para la cadena polipeptídica en crecimiento,
00: 06: 58.02 que significa que podemos etiquetar
00: 07: 00.08 los sustratos del ARNt,
00: 07: 01.14 podemos etiquetar los ARNt,
00: 07: 02.20 podemos etiquetar los aminoácidos,
00: 07: 04.03 podemos etiquetar los ARN mensajeros,
00: 07: 05.10 podemos etiquetar los ribosomas,
00: 07: 07.03 y podemos seguir el destino de varios componentes en el sistema
00: 07: 09.29 para preguntar sobre reacciones bioquímicas.
00: 07: 12.22 Y eso es lo que hicimos,
00: 07: 14.24 y les voy a mostrar un ejemplo
00: 07: 16.08 de una reacción bioquímica que realizamos
00: 07: 18.04 para aprender algo
00: 07: 19.26 sobre la función Dom34 y Hbs1,
00: 07: 22.06 comprender que estos factores
00: 07: 23.23 realmente acababa de estar implicado en la desintegración del ARNm
00: 07: 25.17 y, en realidad, no se sabía
00: 07: 27.15 qué podrían hacer con el ribosoma.
00: 07: 28.28 Entonces, lo que hicimos en este caso
00: 07: 30.16 si usamos nuestro sistema bioquímico
00: 07: 31.28 para reconstituir dos complejos de ribosomas diferentes.
00: 07: 34.08 Para el de la izquierda,
00: 07: 37.00 lo que hemos hecho es que hemos formado un complejo,
00: 07: 38.20 un dipeptidil-ARNt,
00: 07: 39.21 donde tenemos dos aminoácidos en un ARNt en el sitio P
00: 07: 42.06 - hemos llegado allí iniciando y alargando
00: 07: 44.28 para una ronda de síntesis de proteínas -
00: 07: 46.18 y en el sitio A hemos colocado un codón de parada,
00: 07: 48.03 pero al final no importa.
00: 07: 49.15 Y en este complejo
00: 07: 51.14 vemos que el aminoácido está etiquetado.
00: 07: 52.24 Entonces, en el metionil-tRNA,
00: 07: 54.02 la metionina lleva una etiqueta radiactiva.
00: 07: 56.17 Formamos un complejo similar en el otro lado, aquí,
00: 07: 59.05 pero en este caso el ARNt en sí
00: 08: 01.01 está etiquetado radiactivamente
00: 08: 02.08 y podemos seguir el tRNA
00: 08: 03.24 en lugar de los aminoácidos.
00: 08: 06.20 En este caso,
00: 08: 07.28 lo que hicimos fue tomar estos complejos,
00: 08: 09.06 estos grandes complejos marcados con ribosomas
00: 08: 10.22 con etiquetas en diferentes lugares,
00: 08: 12.24 y los aplicamos en un gel nativo.
00: 08: 14.16 Un gel nativo les permite correr
00: 08: 16.10 más o menos intacto
00: 08: 17.12 con todos sus componentes allí.
00: 08: 18.28 Y preguntamos dónde estaba la etiqueta.
00: 08: 21.02 Entonces, en la parte superior del gel,
00: 08: 22.12 el complejo ribosómico intacto corre
00: 08: 23.26 aquí en la posición 80S.
00: 08: 26.10 Y lo que vemos es que en ausencia de factores
00: 08: 28.19 funciona como un gran complejo de los 80.
00: 08: 30.27 Sin embargo, cuando agregamos eRF1 y eRF3
00: 08: 32.20 - los factores de terminación conocidos -
00: 08: 34.08 exactamente lo que esperaríamos que suceda,
00: 08: 36.13 que es, en el caso aquí
00: 08: 38.27 donde estamos siguiendo el péptido,
00: 08: 40.06 liberamos el péptido,
00: 08: 41.24 el dipéptido Met-Phe.
00: 08: 44.08 Mientras que aquí a la derecha,
00: 08: 45.15 donde tenemos un ARNt que ha sido etiquetado,
00: 08: 46.28 lo que pasa es que el tRNA se genera aquí
00: 08: 50.01 - este es un ARNt desacilado
00: 08: 51.12 sin los aminoácidos.
00: 08: 53.14 Entonces, este es el producto lanzado con factores de terminación.
00: 08: 56.04 Luego preguntamos qué pasó
00: 08: 57.23 cuando agregamos Dom34 y Hbs1,
00: 08: 59.04 estos factores que parecen jugar un papel
00: 09: 00.26 en la vigilancia de ARNm,
00: 09: 02.03 pero no sabemos qué hacen con el ribosoma,
00: 09: 03.19 y vimos la aparición de una banda diferente,
00: 09: 05.21 aquí - no una banda de péptidos -
00: 09: 07.23 y una banda diferente, aquí
00: 09: 09.10 - no es una banda de ARNt desacilado.
00: 09: 11.28 Y lo que razonamos en ese momento
00: 09: 14.16 cuando vimos una banda que era común
00: 09: 15.26 a estos dos complejos diferentes,
00: 09: 18.06 pero diferente del resultado
00: 09: 20.14 de la reacción con eRF1 y eRF3
00: 09: 22.28 razonamos que esto podría ser un peptidil-tRNA.
00: 09: 25.04 Eso de hecho lo que estaba pasando
00: 09: 26.26 fue que Dom34 y Hbs1,
00: 09: 28.05 al interactuar con estos complejos de ribosomas,
00: 09: 29.27 en realidad resultó en el lanzamiento
00: 09: 32.07 de todo el complejo peptidil-ARNt,
00: 09: 34.12 y pudimos confirmar que
00: 09: 36.04 agregando un reactivo diferente conocido como peptidil hidrolasa,
00: 09: 38.12 que libera, entonces, péptido libre
00: 09: 40.12 o ARNt libre.
00: 09: 41.22 Así que esta fue una reacción bioquímica clave
00: 09: 43.28 que usamos para identificar
00: 09: 46.10 una actividad novedosa para las proteínas Dom34 y Hbs1,
00: 09: 49.22 y esta actividad sugirió
00: 09: 52.22 que parte de lo que estaban haciendo estas proteínas
00: 09: 54.08 es que estaban reconociendo ribosomas
00: 09: 55.16 y estaban facilitando algún evento desestabilizador
00: 09: 58.24 que condujo al lanzamiento
00: 10: 00.12 de un peptidil-tRNA del ribosoma.
00: 10: 03.01 Entonces, este fue el comienzo de una historia bioquímica
00: 10: 05.05 y esta es una especie de resumen de esa historia.
00: 10: 07.21 Lo que encontramos con el tiempo
00: 10: 09.03 era que un complejo ribosómico,
00: 10: 11.04 cuando se presenta con Dom34 y Hbs1.
00: 10: 13.18 lo que, en realidad, hicieron Dom34 y Hbs1
00: 10: 16.10 se separó eficazmente las subunidades ribosómicas.
00: 10: 19.00 El peptidil-tRNA tendió a dividirse con la subunidad grande,
00: 10: 22.06 dependiendo de la longitud de la cadena polipeptídica.
00: 10: 25.06 Lo que encontramos fue que esta reacción de Dom34 y Hbs1
00: 10: 27.26 era codón independiente.
00: 10: 29.12 Eso fue consistente con la estructura
00: 10: 31.08 que les mostré hace varias diapositivas
00: 10: 33.04 donde no hay dominio de reconocimiento de codones en esta proteína, Dom34.
00: 10: 36.25 Vimos que el péptido no se liberaba del tRNA.
00: 10: 39.02 Eso es consistente con el hecho de que la proteína Dom34
00: 10: 42.12 carece del motivo GGQ que es responsable de esa actividad
00: 10: 45.24 en factores de terminación.
00: 10: 48.04 Y un poco al margen es que estas proteínas
00: 10: 50.10 prefieren dividir subunidades
00: 10: 52.18 cuando la plantilla de ARN mensajero, aquí, tiende a ser corta.
00: 10: 55.08 Entonces, si el ARN mensajero es corto
00: 10: 56.26 desde el extremo de 3 '
00: 10: 58.24 viniendo a la pared del ribosoma,
00: 11: 00.16 descubrimos que, de hecho, ese era un sustrato bioquímico preferido
00: 11: 03.02 para estas proteínas.
00: 11: 05.03 Entonces, ¿cómo tiene sentido todo esto?
00: 11: 06.19 dado lo que sabíamos sobre Dom34 y Hbs1
00: 11: 08.19 en el proceso del llamado No-Go-Decay?
00: 11: 11.08 Bueno, durante el mismo período de tiempo
00: 11: 13.06 que estábamos realizando reacciones bioquímicas
00: 11: 14.26 había varios laboratorios estudiando esto in vivo,
00: 11: 17.02 y se les ocurrió una serie de ideas importantes,
00: 11: 19.02 en particular, el laboratorio de Toshi Inada.
00:11: 20.27 Y encajaba con los modelos que había presentado,
00: 11: 22.16 cuál es la idea es que el ribosoma se atasque
00: 11: 24.22 en un lugar particular en un ARN mensajero,
00: 11: 27.08 tal vez, por ejemplo, una gran estructura de tallo-bucle.
00: 11: 30.18 Hay una división endonucleolítica que realmente ocurre
00: 11: 32.26 detrás del ribosoma,
00: 11: 34.06 y eso fue documentado en el laboratorio de Toshi,
00: 11: 36.14 que conduce a un ARN mensajero escindido endonucleolíticamente.
00: 11: 39.24 Y dado que hay muchos ribosomas
00: 11: 42.22 en cualquier ARN mensajero,
00: 11: 43.29 lo que eso significa son todos los ribosomas
00: 11: 45.16 que vienen detrás de ese sitio de escisión endonucleolítica
00:11: 48.02 encuentro ese extremo escindido endonucleolíticamente,
00: 11: 51.18 y que estos serían objetivos ideales para estas proteínas,
00: 11: 53.17 Dom34 y Hbs1.
00: 11: 55.02 En ausencia de estos factores,
00: 11: 56.25 el ribosoma está atascado en el mensaje
00: 11: 58.22 sin forma de bajar.
00: 12: 00.06 Y lo que estos factores podrían permitir
00: 12: 03.02 es para el reciclaje de estos complejos de ribosomas
00: 12: 04.24 en ARN mensajero defectuoso,
00: 12: 06.12 que conduce a la reacción de reciclaje
00: 12: 08.04 y la reutilización de estos ribosomas.
00: 12: 11.08 Entonces, nuestros datos bioquímicos encajan muy bien
00: 12: 14.07 con otros resultados en el campo
00: 12: 15.20 que estaban teniendo lugar en células intactas.
00: 12: 17.25 Y esos eran nuestros pensamientos,
00: 12: 19.19 y por eso queríamos hacer una pregunta más general a continuación.
00: 12: 22.02 Conociendo la actividad bioquímica de estas proteínas,
00: 12: 24.18 y conociendo un poco acerca de cómo estas proteínas
00: 12: 26.15 se comportó con los reporteros en varias celdas,
00: 12: 29.29 queríamos hacer preguntas sobre
00: 12: 32.04 el significado biológico general
00: 12: 33.21 de una respuesta de rescate.
00: 12: 35.04 ¿Qué ARN mensajeros se dirigen típicamente en una célula?
00: 12: 37.07 Es lo mismo en condiciones de tipo salvaje
00: 12: 39.20 o en condiciones de estrés?
00:12: 41.04 ¿Y cómo podemos pensar en eso?
00: 12: 43.08 Sabíamos desde el principio que Dom34
00: 12: 45.02 es un gen que no es esencial en la levadura,
00:12: 47.14 pero sabemos que es esencial en eucariotas superiores.
00: 12: 49.26 El gen se llama Pelota en eucariotas superiores
00:12: 52.01 y es un embrionario letal en ratones.
00:12: 55.14 Entonces, es un gen importante en eucariotas superiores.
00: 12: 58.08 Sin embargo, sabíamos que la deleción de Dom34 en la levadura
00: 13: 01.19 era sintético con una variedad de cosas diferentes
00: 13: 04.06 incluyendo, por ejemplo,
00: 13: 05.26 la deleción de un gen de proteína ribosomal.
00: 13: 07.12 Y se sabe que cuando eliminas un gen de la proteína ribosomal,
00: 13: 10.01 por ejemplo, una copia de un gen de proteína ribosomal,
00: 13: 12.24 que hay deficiencias de ribosomas en la célula,
00: 13: 15.22 porque la biogénesis no es realmente capaz de mantenerse al día
00: 13: 17.24 con lo que necesita hacer.
00: 13: 19.06 Y entonces la idea podría ser que
00: 13: 21.02 si elimina un factor de rescate para los ribosomas,
00: 13: 23.06 y juntarlo con un defecto de biogénesis de ribosoma,
00: 13: 26.27 que ahí es cuando las células realmente se enferman,
00:13: 28.17 y eso explicaría la letalidad sintética.
00: 13: 31.02 Y entonces la pregunta que realmente queríamos hacer a continuación
00: 13: 33.04 fue, "¿Qué podrían los objetivos celulares
00: 13: 35.23 para la función de Dom34 y el rescate de Dom34? "
00: 13: 38.10 Tuvimos suerte porque en ese momento
00: 13: 40.16 estábamos pensando en estas ideas
00: 13: 41.29 había un nuevo enfoque que acababa de entrar en línea
00: 13: 43.23 del laboratorio de Jonathan Weissman
00: 13: 45.07 y había sido desarrollado por Nick Ingolia,
00:13: 46.23 un postdoctorado en su laboratorio.
00:13: 48.05 Era un método conocido como perfilado de ribosomas.
00: 13: 49.22 que le permite a uno mirar sistemáticamente
00: 13: 52.03 en la ocupación de todos los ribosomas en una celda
00: 13: 54.19 en sus diversas plantillas de ARNm.
00: 13: 56.26 Y razonamos que
00: 13: 58.22 si Dom34 fuera una proteína que desempeñara una función,
00: 14: 01.04 en células de levadura, por ejemplo,
00: 14: 02.26 si tuviéramos una cepa de tipo salvaje y una cepa knockout,
00: 14: 04.29 podríamos preguntar
00: 14: 06.27 cuál es el papel de Dom34 en las células de levadura
00: 14: 08.12 preguntando dónde se acumulan los ribosomas
00: 14: 10.21 en cepas que carecen de esa proteína.
00:14: 13.11 Entonces, la idea básica detrás del perfil de ribosomas
00: 14: 15.19 si puedes tomar todos los ribosomas
00: 14: 17.13 que están en los ARN mensajeros en una célula,
00: 14: 18.28 y puedes aislar esos ARN mensajeros
00:14: 20.14 con ribosomas unidos a ellos.
00: 14: 21.29 Al usar una nucleasa,
00: 14: 23.19 puedes digerir todo el ARN mensajero libre,
00: 14: 25.22 dejando solo un poco de ARN mensajero
00: 14: 27.29 que está protegido por un ribosoma,
00: 14: 29.24 y ese bit de ARNm protegido
00: 14: 31.26 tiene unos 30 nucleótidos de longitud.
00: 14: 34.18 A continuación, puede aislar ese ARN mensajero largo de 30 nucleótidos aproximadamente
00: 14: 38.19 de todos los ribosomas en la célula,
00: 14: 40.10 puede enviarlo para una secuenciación completa.
00: 14: 43.20 Obtienes cientos de millones de lecturas
00: 14: 45.14 de huellas de ribosomas de la celda
00: 14: 47.01 y puedes preguntar cuál es la ocupación
00: 14: 48.22 - la ocupación global de los ribosomas en los mensajes -
00: 14: 51.08 está en una celda.
00: 14: 53.20 Por lo general, acopla este experimento
00: 14: 54.19 con un experimento de secuencia de ARNm,
00: 14: 56.08 donde fragmentas aleatoriamente todos los ARN mensajeros en una célula
00: 14: 59.08 solo para asegurarse de que puede tener en cuenta los sesgos de clonación
00: 15: 01.14 y otros posibles artefactos de una celda,
00: 15: 03.16 y luego también puedes preguntar
00: 15: 05.11 la eficiencia con la que un ribosoma ocupará un ARN mensajero dado
00: 15: 07.20 porque sabes cuánto de cada ARN mensajero está presente
00: 15: 10.12 y sabes cuántas huellas de ribosomas tienes.
00: 15: 13.24 Entonces, ese fue el experimento que imaginamos usando
00: 15: 16.10 para preguntar sobre el rol in vivo
00: 15: 18.12 para factores de rescate.
00: 15: 20.02 Empezamos como todos los demás,
00: 15: 21.18 enviando algunas muestras y preguntando qué tan bien funciona el sistema,
00: 15: 24.08 y esto me da una oportunidad
00: 15: 25.24 para mostrarte cómo es este tipo de datos.
00: 15: 27.26 Lo que hicimos fue ser sometido,
00: 15: 30.16 de levadura de tipo salvaje y de levadura mutante Dom34
00: 15: 32.19 - falta Dom34 -
00: 15: 34.06 huellas de ribosomas y datos de secuencia de ARNm.
00: 15: 36.26 Lo primero que puede hacer con esos datos
00: 15: 38.24 es que puede preguntar cómo se alinean con los marcos de lectura.
00: 15: 41.14 Y puedes ver, de manera muy simple,
00: 15: 42.29 en este panel en la parte superior,
00: 15: 45.07 que si toma las huellas de los ribosomas
00: 15: 46.29 se asignan predominantemente a un solo marco de lectura
00: 15: 50.05 dentro de todos los marcos de lectura abiertos,
00: 15: 52.22 sugiriendo que los ribosomas
00: 15: 54.11 están moviendo tres nucleótidos a la vez
00: 15: 56.22 por una plantilla de ARN mensajero,
00: 15: 58.08 y que esta metodología es capaz de capturar
00: 16: 00.22 ese movimiento de tres nucleótidos.
00: 16: 02.04 Hay una periodicidad en la firma de la huella.
00: 16: 05.20 Por el contrario, puede mirar los datos de la secuencia de ARNm
00: 16: 07.28 y ver que las lecturas se distribuyen a los tres marcos,
00: 16: 11.12 porque el ribosoma no impone ninguna periodicidad
00: 16: 13.02 en esos marcos
00: 16: 14.20 y así se distribuyen por igual en todos los marcos de lectura.
00: 16: 16.10 Eso sugirió que estábamos capturando
00: 16: 18.04 algo relevante para la traducción
00: 16: 20.14 y movimiento de tres nucleótidos a lo largo de una plantilla de ARN mensajero.
00: 16: 23.12 Puede ver que eso también es cierto a lo largo de los marcos de lectura abiertos
00: 16: 26.18 si alinea todos los codones de inicio,
00: 16: 28.22 aquí, al comienzo del gen,
00: 16: 31.16 y alineas todos los codones de parada
00:16: 33.04 y haces lo que llamamos un análisis de gen o metagen promedio.
00: 16: 36.14 en primer lugar, lo que puede ver es que la secuencia de ARNm dice:
00: 16: 39.04 en verde,
00: 16: 40.22 distribuir a lo largo del marco de lectura abierto,
00:16: 42.11 así como en las regiones no traducidas del gen, aquí afuera,
00: 16: 45.06 y en el extremo 3 'del gen.
00: 16: 47.04 Entonces, estas regiones distribuyen todo el mensaje.
00: 16: 49.07 Por el contrario, las huellas ribosómicas
00: 16: 51.05 distribuir solo a lo largo del marco de lectura abierto,
00: 16: 53.07 comenzando en 'inicio' y terminando en 'parada'.
00: 16: 56.03 Y de hecho en estos datos aquí,
00:16: 57.23 se puede ver que emergen tres periodicidades de nucleótidos.
00: 16: 59.23 Entonces, nos sentimos muy confiados
00: 17: 01.14 que este era un método que podría darnos alguna señal de actividad ribosómica
00: 17: 04.14 en la celda
00: 17: 06.01 que podría decirnos algo nuevo sobre la función
00: 17: 08.01 de estos factores de rescate.
00: 17: 10.04 Les voy a decir que agregamos otro pequeño toque
00: 17: 12.14 a estos estudios para ampliar el tipo de análisis
00: 17: 15.14 que las huellas de ribosomas de longitud completa
00: 17: 17.28 podría permitirnos pensar.
00:17: 19.23 Lo que razonamos es que,
00:17:21.25 si hubiera grandes impedimentos en la célula que impidieran los ribosomas
00: 17: 23.29 de pasar,
00: 17: 25.22 puede que no haya solo un ribosoma apilado en un ARN mensajero,
00: 17: 27.20 pero dos.
00:17: 29.02 Entonces, llamamos a estos disomes, y de hecho puedes.
00: 17: 30.26 después del tratamiento con ARNasa, vemos este rastro negro aquí.
00:17: 33.04 en realidad podemos ver un poco de pico residual de disome
00: 17: 35.00 y así aislamos ese pico desastroso también,
00:17: 36.24 razonando que los grandes puestos en la celda
00: 17: 40.04 que fueron un problema y podrían estar sujetos a rescate
00: 17: 42.02 podría enriquecerse en ese pico.
00:17:43 También fuimos generosos al cortar nuestros fragmentos de ARNm de un gel.
00:17: 47.21 porque sabíamos que podríamos hacerlo.
00: 17: 49.05 basado en la actividad bioquímica de Dom34 y Hbs1,
00:17: 52.08 razonamos que las huellas cortas de ARNm
00: 17: 55.17 en realidad también podría estar sesgado
00: 17: 58.28 en su preferencia por la enzima Dom34,
00: 18: 00.28 porque sabemos que a Dom34 le gustan las plantillas de ARN mensajero corto.
00: 18: 03.15 Entonces, también aislamos huellas más cortas y más largas,
00: 18: 06.02 así que fuimos generosos al cortar nuestros fragmentos de un gel.
00: 18: 08.27 Entonces, ¿cómo se ven esos datos?
00: 18: 11.08 Si tomamos, de una cepa de tipo salvaje
00: 18: 13.11 o una cepa delta Dom34.
00: 18: 14.19 si tomamos esas huellas,
00: 18: 16.12 los enviamos para secuenciación de alto rendimiento,
00: 18: 18.08 y pregunte cuál es la longitud promedio
00: 18: 20.25 de los fragmentos que obtienes, por ejemplo,
00: 18: 22.27 de un solo ribosoma, de un pico monosoma,
00:18:25 ¿Cómo se ven esos fragmentos?
00: 18: 27.11 Podemos ver la distribución, aquí,
00: 18: 28.25 donde miramos la longitud de lectura en el eje x
00: 18: 31.02 y observamos la fracción de lecturas que tienen esa longitud de lectura en el eje y,
00: 18: 36.07 lo que vemos es que la mayoría de nuestras lecturas
00: 18: 39.01 están en este rango de 28-30 nucleótidos de longitud.
00:18: 40.23 Esa fue la longitud del fragmento original estudiado por el laboratorio Weissman,
00: 18: 43.14 y eso es lo que creemos que es un ribosoma completo
00:18: 45.06 con un ARN mensajero de longitud completa unido a él.
00: 18: 48.04 De hecho, vemos un pequeño pico, aquí,
00: 18: 49.26 a 21 nucleótidos de longitud.
00: 18: 51.08 Este es un fragmento que se ha caracterizado
00: 18: 53.01 de Liana Lareau,
00: 18: 54.28 y lo que ella identificó como esto
00: 18: 56.20 probablemente representa un estado rotado o trinquete del ribosoma
00: 18: 59.08 en el proceso de translocación a lo largo de un ARN mensajero,
00: 19: 03.05 y ese no será el foco de ninguna discusión adicional aquí.
00: 19: 05.20 Finalmente, los fragmentos que más nos interesaron
00: 19: 08.08 son estos fragmentos truncados aquí abajo
00: 19: 10.20 ese pico alrededor de 16 nucleótidos de longitud,
00: 19: 12.12 y creemos,
00:19: 14.08 y te mostraré evidencia para respaldar eso,
00: 19: 15.28 que estos son fragmentos cortos de ARN mensajero
00: 19: 17.20 unido a ribosomas que han llegado al final de una plantilla de ARN mensajero,
00:19: 20.28 y, por lo tanto, solo hay 16 nucleótidos allí,
00: 19: 22.26 pero estos son los principales objetivos
00:19: 25.04 de la acción de Dom34 en la celda.
00:19: 27.24 Entonces, ¿cómo se ven los datos?
00: 19: 29.09 Obtienes 100 millones de lecturas de secuenciación
00: 19: 30.20 de una cepa de tipo salvaje y mutante
00:19: 32.08 y preguntas, ¿cómo se distribuyen en tu transcriptoma?
00:19: 34.13 ¿Cómo se distribuyen a lo largo de un ARN mensajero?
00:19: 36.02 Entonces, podemos mirar un gen abundante,
00: 19: 37.27 aquí, PGK1.
00:19: 39.04 Es solo un gen de una variedad de jardín.
00: 19: 40.29 Podemos ver que el ribosoma lee
00: 19: 43.09 distribuir a lo largo de su longitud,
00: 19: 44.27 desde el principio del marco de lectura abierto hasta el final,
00: 19: 47.14 y lo que vemos es que en una cepa de nocaut Dom34 (KO)
00:19: 51.02 el patrón es realmente muy equivalente.
00:19: 52.24 Así es como se ven los datos típicos de perfiles de ribosomas.
00:19: 55.02 Es hinchable.
00: 19: 56.18 Incluido en este rebote
00: 19: 58.08 es probablemente una pausa natural de los ribosomas,
00: 19: 59.18 así como sesgos de secuenciación,
00: 20: 01.06 y sesgos de clonación,
00: 20: 02.26 y sesgos de amplificación.
00: 20: 04.12 Pero lo que puedes ver es en términos de lo que nos interesaba saber
00: 20: 07.19 está en este gen en particular
00: 20: 09.15 no hubo una interrupción obvia.
00: 20: 10.29 no hubo pausas obvias en este gen,
00: 20: 12.29 o problemas, que llevaron a la acción de Dom34.
00: 20: 15.09 No había montones de ribosomas
00: 20: 16.26 en ausencia de Dom34 que acumuló.
00: 20: 19.24 Como vimos estos datos,
00: 20: 21.00 comenzamos a preocuparnos por si realmente teníamos las herramientas en su lugar, sin embargo,
00: 20: 23.20 para observar una pausa significativa,
00: 20: 25.29 y así hicimos un buen truco.
00: 20: 27.07 Ponemos un análogo de histidina en levadura
00: 20: 29.18 conocido como 3-AT - 3-aminotriazol -
00: 20: 31.05 que en realidad bloquea la biosíntesis de histidina
00: 20: 34.09 y te permite realmente.
00: 20: 36.18 tienes deficiencia de histidina en la célula
00: 20: 38.20 y así anticipamos que habría pausas,
00: 20: 40.06 ribosomas apilados en codones de histidina
00: 20: 42.26 en todo el genoma.
00:20: 44.16 Y de hecho eso es exactamente lo que vimos.
00: 20: 46.08 En un tipo salvaje o en una cepa knockout Dom34,
00: 20: 47.22 de repente ves montones de ribosomas
00: 20: 50.14 exactamente donde hay codones de histidina
00: 20: 52.04 en todos los genes del genoma.
00: 20: 54.12 Entonces, este fue un indicador muy bueno para nosotros
00: 20: 56.15 que entendimos algo sobre las funciones de los ribosomas
00: 20: 59.23 - los ribosomas deben detenerse en los codones de histidina en ausencia de histidina -
00: 21: 02.29 y realmente, sin embargo, como anticipamos,
00: 21: 05.00 Dom34 no responde a la inanición general de aminoácidos,
00: 21: 08.19 y no anticipamos que lo haría,
00: 21: 09.29 pero nos dio una idea del tipo de resultado
00: 21: 11.28 que estos datos podrían generar
00: 21: 13.28 - que podríamos entender algo sobre pausar
00: 21: 15.22 y podríamos descifrar algo
00: 21: 17.21 sobre la función Dom34.
00:21: 19.29 Entonces, con esas herramientas en la mano,
00: 21: 21.10 comenzamos a mirar más globalmente nuestro transcriptoma
00:21: 23.01 y pregunte, ¿había genes?
00: 21: 25.02 en el que hubo un mayor número de lecturas
00: 21: 26.24 en la cepa de deleción Dom34 en relación con una cepa de tipo salvaje.
00: 21: 30.01 La forma en que puedes hacer este experimento
00: 21: 31.22 es que puedes tomar todas las lecturas de un gen dado
00: 21: 33.23 y puedes trazarlo
00: 21: 36.00 - el número de lecturas por mRNA-seq
00: 21: 38.16 en el nocaut frente a la variedad salvaje,
00: 21: 40.14 y ponerlo en el eje x,
00: 21: 42.04 o la diferencia en el número de huellas de ribosomas
00:21: 44.04 en un gen dado en la cepa knockout versus la cepa de tipo salvaje -
00: 21: 48.01 y lo que puedes ver es un patrón muy poco interesante
00: 21: 50.02 desde la perspectiva de un experimento de alto rendimiento,
00:21: 51.19 donde casi todos nuestros genes
00:21: 53.21 no tienen diferencias de patrones interesantes.
00:21: 55.09 Todos salen alrededor de uno,
00: 21: 56.26 lo que significa en un tipo salvaje y una cepa knockout
00: 21: 59.11 tenemos aproximadamente el mismo número de lecturas.
00:22: 01.18 Eso es tanto por mRNA-seq,
00: 22: 03.07 así que Dom34 tal vez no sea un factor de deterioro,
00:22: 05.26 y también está en la ocupación de los ribosomas.
00: 22: 09.06 Hay una excepción,
00:22: 10.26 Voy a volver a eso.
00:22: 12.02 Es un gen conocido como Hac1.
00:22: 13.26 Es un factor de transcripción que es realmente muy interesante.
00: 22: 15.14 y terminó siendo nuestro gran positivo
00:22: 17.05 que nos dijo, pensamos,
00:22: 19.02 cómo funciona Dom34 en la celda.
00:22: 21.07 Sin embargo, les mostraré otra trama similar,
00:22: 24.01 que nos mostró algo nuevo y emocionante
00: 22: 25.25 sobre la función Dom34 en la celda,
00:22: 27.28 y tenía que ver con esas lecturas cortas.
00: 22: 30.13 Entonces, de hecho, en la diapositiva anterior
00:22: 32.01 en lo que me estaba enfocando eran en lecturas completas
00: 22: 33.27 que se generan en el mutante de deleción Dom34,
00:22: 35.18 el ribosoma estándar de 30 nucleótidos de longitud lee.
00:22: 40.18 Y de hecho eso es lo que se muestra aquí en el eje x,
00: 22: 42.21 que es, si miramos un tipo salvaje
00: 22: 44.18 o un nocaut Dom34 versus una cepa de tipo salvaje,
00: 22: 46.16 que lee el largo completo
00:22: 48.21 son prácticamente iguales en todos los genes del genoma.
00:22: 51.04 No hay diferencias en su distribución.
00: 22: 56.02 Sin embargo, si nos fijamos específicamente en las lecturas breves,
00: 22: 57.22 las lecturas de 15-18 nucleótidos
00: 22: 59.16 en la Dom34 versus la cepa de tipo salvaje,
00: 23: 01.28 esta distribución se sesga de manera bastante dramática,
00: 23: 03.24 sugiriendo que en una cepa de nocaut Dom34
00: 23: 06.18 ocupación de ribosomas en esos fragmentos cortos
00: 23: 10.06 se enriquece significativamente,
00: 23: 12.18 consistente con la idea de que Dom34
00: 23: 14.22 es específicamente responsable
00: 23: 16.18 para eliminar esos ribosomas en circunstancias normales,
00: 23: 18.14 y eso cuando falta Dom34
00: 23: 20.25 en realidad estás enriquecido con esas lecturas breves
00: 23: 22.26 en la cepa de nocaut Dom34.
00:23: 24.23 Entonces, esa fue una idea emocionante.
00:23: 26.08 y fue consistente con nuestra bioquímica.
00:23: 27.26 y las ideas que teníamos para este proyecto.
00: 23: 30.12 Así que, en realidad, vamos a seguir.
00: 23: 33.08 lo que quiero mostrarte a continuación
00: 23: 34.22 es lo que aprendimos sobre el gen HAC1
00: 23: 36.26 y nuestra mayor ocupación de ribosomas
00: 23: 38.14 en la cepa de nocaut Dom34,
00: 23: 40.02 porque termina siendo muy claro,
00: 23: 42.26 efecto positivo de Dom34 en levadura,
00:23: 44.18 y nos dice algo sobre la función Dom34.
00:23: 47.03 Pero primero, necesito contarte un poco sobre el gen HAC1.
00: 23: 50.08 El gen HAC1.
00:23: 54.16 codifica un factor de transcripción que está involucrado en la respuesta de la proteína desplegada.
00:23: 56.20 que ha sido ampliamente estudiado por el laboratorio de Peter Walter,
00:23: 59.17 y en la levadura resulta que es el gen único
00: 24: 02.19 que en las células de levadura se exporta desde el núcleo
00:24: 05.16 con un intrón intacto, no está empalmado por el espliceosoma en el núcleo.
00:24: 08.29 De hecho, está empalmado en el citoplasma.
00: 24: 11.25 por una endonucleasa, una vía no canónica,
00: 24: 15.03 que se conoce como IRE1,
00: 24: 16.23 específicamente cuando la endonucleasa IRE1
00: 24: 18.25 es activado por proteínas desplegadas
00: 24: 21.03 en el retículo endoplásmico.
00:24: 23.01 Entonces, lo que eso significa es que en el citoplasma de las células de levadura
00: 24: 25.24 se encuentra un gen sin empalme
00: 24: 27.26 que se ve así, el gen HAC1,
00: 24: 29.16 con un codón de inicio y un codón de parada.
00: 24: 31.01 Y está esperando una firma
00: 24: 32.24 para ser escindido por esta vía de empalme inusual.
00:24: 36.29 Pero lo que sabemos es, de hecho
00:24: 39.19 que hay algún empalme constitutivo
00: 24: 41.09 que ocurre en el sitio de empalme de 5 ',
00: 24: 42.22 y sabemos que es improductivo porque esto ha sido documentado,
00:24: 44.28 y sabemos que hay una cierta cantidad de este tipo de
00: 24: 47.15 ARN mensajero truncado sentado en la celda
00:24: 49.05 incluso en células normales.
00:24: 51.04 Y para nosotros esto parecía que podría ser un sustrato No-Go.
00: 24: 54.04 Es un marco de lectura abierto
00: 24: 55.22 que termina sin un codón de parada
00: 24: 57.08 y es posible que deba ser rescatado por Dom34.
00:24: 59.14 Y de hecho eso es cierto.
00: 25: 01.17 Podemos ver nuestros datos de perfiles de ribosomas
00: 25: 03.18 alineado específicamente a lo largo del gen HAC1,
00: 25: 05.22 y vemos en la parte inferior de cada conjunto de dos,
00: 25: 08.18 aquí, el tipo salvaje dice
00: 25: 10.20 y las huellas de ribosomas de tipo salvaje,
00: 25: 12.14 y por encima de ellos las huellas del nocaut de Dom34,
00: 25: 14.26 y lo que ves es que
00: 25: 17.05 ambos para las lecturas de disome
00:25: 18.18 - entonces esos picos que aislamos para dos ribosomas seguidos -
00: 25: 20.29 así como las lecturas cortas
00:25: 24.10 - las lecturas de 16 meros de un solo pico monosoma,
00: 25: 26.28 así que solo un ribosoma -
00: 25: 29.08 vemos que estamos significativamente enriquecidos con la cepa de deleción Dom34
00: 25: 32.12 en relación con la cepa de tipo salvaje,
00: 25: 34.20 consistente con la idea
00:25: 36.16 que los ribosomas de hecho
00: 25: 38.15 se apilan en esta unión escindida endonucleolíticamente,
00:25: 40.04 así que nos falta el intrón, ahora,
00:25: 41.21 porque se escinde endonucleolíticamente.
00:25: 43.09 Los ribosomas están atascados.
00: 25: 45.03 En circunstancias normales,
00: 25: 47.02 están aprobados por Dom34,
00: 25: 49.06 y en una cepa delta-Dom34
00:25: 51.19 acumula ribosomas en estas posiciones.
00:25: 53.22 Entonces, esta fue una hermosa firma
00:25: 55.26 de la función de esta proteína en la célula.
00:25: 57.28 Además, cuando miramos, en realidad,
00:25: 59.20 corriente arriba de ese conjunto de ribosomas en pausa,
00: 26: 01.02 vimos otra firma de la actividad de Dom34 en la celda
00: 26: 04.20 que se veía muy similar:
00: 26: 06.10 un conjunto de lecturas breves en el delta Dom34
00: 26: 09.05 y un conjunto de lecturas de pico disome en el delta Dom34,
00:26: 12.21 consistente con la idea de que, de hecho,
00: 26: 15.05 cuando el ribosoma se detiene en esta primera posición,
00: 26: 17.01 a través de una escisión endonucleolítica normal por IRE1,
00:26: 20.12 hay otro escote,
00: 26: 22.20 presumiblemente por la endonucleasa
00: 26: 24.14 que suele estar involucrado en este proceso llamado No-Go-Decay,
00:26: 27.02 es una segunda división endonucleolítica
00: 26: 30.04 que conduce a otro conjunto de ribosomas
00:26:32 16 amontonados que son aprobados por este sistema.
00:26: 35.16 Entonces, esto fue, para nosotros,
00: 26: 37.06 un hermoso ejemplo de lo que hace Dom34 en la celda
00:26: 39.13 en este único gen,
00: 26: 41.07 y en retrospectiva
00: 26: 43.10 creemos que esto podría ser consistente
00:26: 45.02 con la idea de que en las células normales
00:26: 46.27 hay muy pocos objetivos Dom34
00: 26: 48.19 que son crisis,
00: 26: 50.08 que son grandes, grandes objetivos sobre los que Dom34 necesita actuar.
00:26: 52.27 Pero proporcionó evidencia para el modelo,
00:26: 54.16 que es que cuando los ribosomas se detienen,
00: 26: 57.01 las escisiones endonucleolíticas ocurren,
00: 26: 59.00 y cuando ocurren esas escisiones endonucleolíticas
00: 27: 00.24 este sistema entra y rescata los ribosomas,
00: 27: 03.19 y en ausencia de este sistema
00:27: 05.05 acumula montones de ribosomas.
00:27: 07.01 Entonces, fue realmente un conjunto de datos muy consistente
00: 27: 09.08 para el modelo de No-Go-Decay,
00:27: 11.12 y por lo que hacen los ribosomas en una crisis.
00:27: 13.19 Simplemente no nos proporcionó muchos objetivos.
00:27: 16.28 Muy bien, les voy a contar otra historia, ahora,
00: 27: 18.28 eso está relacionado
00:27: 20.26 y tiene que ver con el papel de Dom34.
00:27: 22.11 Dom34 también había sido implicado.
00: 27: 24.10 en esta vía Non-Stop-Decay
00:27: 26.13 que describí en las dos primeras diapositivas.
00: 27: 28.29 Non-Stop-Decay, como mencioné,
00: 27: 30.26 es lo que sucede cuando el ribosoma se encuentra
00:27: 33.16 una cola de poliA y traduce poli-lisina.
00:27: 36.00 Y la idea es que la polilisina le habla al ribosoma,
00: 27: 38.19 a través del túnel de salida,
00:27: 40.07 y dice: "Esto es un problema.
00:27: 41.19 Tenemos que detenernos aquí y rescatar estos ribosomas,
00: 27: 43.18 degradar el mensaje,
00: 27: 45.06 y degradar el producto proteico,
00:27: 46.20 porque la polilisina no tiene sentido ".
00:27: 48.14 Y entonces el modelo es bastante similar,
00: 27: 49.28 que es en lugar de encontrarse con un vástago aquí,
00:27: 51.20 como en el estudio de Roy Parker,
00:27: 53.08 los ribosomas se encuentran con una cola poliA,
00: 27: 55.24 ocurre la escisión endonucleolítica,
00:27: 57.10 y eso ha sido documentado,
00: 27: 59.00 así que nuevamente se eliminarán los ribosomas finales
00: 28: 02.00 por estas proteínas Dom34 y Hbs1,
00:28: 04.11 y no estamos muy seguros de qué podría pasar con estos ribosomas.
00:28: 07.01 Pero lo que queríamos saber era:
00:28: 08.23 ¿Hubo alguna evidencia de este tipo de actividad?
00: 28: 11.00 en nuestras células de levadura
00:28: 12.09 que pudimos descifrar de los datos Dom34 que existían.
00: 28: 15.29 Lo que te diré primero es que
00:28: 18.03 De hecho, podemos tener una idea de lo que hacen las lisinas iteradas en la célula.
00:28: 22.08 a los ribosomas que los encuentran,
00:28: 24.02 y podemos hacerlo mirando todos los ribosomas en el genoma de la levadura,
00: 28: 27.08 o en el transcriptoma de levadura,
00:28: 28.22 y de hecho podemos hacer una especie de gen promediado
00: 28: 30.20 o análisis de metagen
00:28: 32.08 donde tomamos lisinas simples y las alineamos juntas,
00:28: 35.01 o genes que tienen dos lisinas seguidas
00: 28: 37.01 y alinearlos juntos,
00: 28: 39.02 o tres, o cinco, y así sucesivamente.
00: 28: 42.02 Y puedes ver inmediatamente
00:28: 44.02 lo que se ha descrito al nivel de un análisis del genoma,
00:28: 46.08 que es que múltiples lisinas seguidas
00: 28: 48.24 de hecho hace que el ribosoma tartamudee un poco
00:28: 51.10 - tienes picos más grandes aquí,
00:28: 52.24 los ribosomas están atascados -
00:28: 54.09 y ese tipo de propagación a lo largo
00:28: 56.18 del tracto de poli-lisina.
00:28: 58.05 Entonces, eso es usar datos de perfiles de ribosomas.
00: 29: 01.14 para hacer preguntas sobre la ocupación de ribosomas,
00: 29: 03.16 que son consistentes con la idea
00:29: 05.10 que la polilisina es un problema.
00: 29: 06.26 Debería decir, sin embargo,
00:29: 08.14 que estas polilisinas están en medio de genes
00:29: 09.28 - son lisinas codificantes normales.
00:29:12 20 Entonces, teníamos otra forma que pensamos que podríamos buscar.
00:29:16 ¿Qué sucede cuando los ribosomas se encuentran con polilisina?
00:29: 18.15 y eso fue manipulando las células de levadura
00: 29: 20.09 de una manera especial,
00:29: 22.17 y les voy a contar sobre eso en este experimento, aquí.
00: 29: 24.23 Entonces, lo que puede ver, por ejemplo,
00: 29: 26.13 es si tomamos un gen individual -
00: 29: 28.23 este gen se conoce como ENT5,
00: 29: 30.15 es solo un gen de levadura promedio -
00: 29: 31.28 y podemos ver en un tipo salvaje y una cepa de nocaut Dom34.
00: 29: 34.14 estas son lecturas de longitud promedio,
00:29:35 Estas son las lecturas de 30 mer que el laboratorio de Jonathan Weissman
00: 29: 37.26 originalmente caracterizado,
00:29: 39.08 y lo que vemos es lo que esperamos,
00: 29: 40.24 que es ribosoma lee en el marco de lectura abierto,
00: 29: 43.06 pero no en el 3'UTR
00: 29: 44.28 y no en la cola poliA,
00:29: 46.09 y eso tiene sentido porque este es un gen normal.
00: 29: 48.10 con un codón de parada normal
00:29: 49.27 y los ribosomas reconocen el codón de parada.
00:29: 51.18 Pero el experimento que hicimos
00:29: 53.01 ¿En realidad lo insertamos en una cepa de levadura?
00: 29: 55.03 un ARNt supresor,
00: 29: 56.22 y qué hacen los ARNt supresores
00:29: 58.12 es que reconocen mal los codones de parada
00: 30: 00.14 y leen los codones de parada,
00: 30: 02.24 permitiendo que se omitan los codones de parada
00: 30: 04.20 en algún nivel,
00: 30: 06.08 y por lo tanto traducción al 3'UTR
00: 30: 08.16 y, en genes que carecen de otro codón de parada en el 3'UTR,
00: 30: 10.29 en la cola de poliA.
00: 30: 13.18 Y entonces lo que vemos aquí.
00: 30: 15.02 estas son lecturas completas que estamos viendo ahora.
00: 30: 16.25 si ponemos un ARNt supresor
00: 30: 18.19 en una cepa de levadura y observe este mismo gen,
00: 30: 22.02 leemos a través del codón de parada, aquí,
00: 30: 24.15 acumulamos lecturas de ribosomas en el 3'UTR,
00: 30: 28.13 pero hemos mejorado las lecturas de ribosomas
00: 30: 30.21 en el mutante Dom34.
00: 30: 32.14 Entonces, esto es evidencia de que
00: 30: 34.10 cuando lee un codón de parada
00: 30: 35.28 y leer en el 3'UTR
00: 30: 37.16 y en la cola poliA,
00: 30: 39.02 estos ribosomas, en circunstancias normales.
00: 30: 40.29 esto está justo encima de la poliA.
00: 30: 42.18 sería autorizado por Dom34.
00: 30: 44.28 Y en su ausencia tenemos una gran pila,
00: 30: 47.13 así que esto es algo que Dom34 definitivamente hace en las celdas.
00: 30: 51.05 Sin embargo, estábamos aún más encantados,
00: 30: 52.28 cuando miramos el corto-mer
00: 30: 54.14 para ver signos de esta división endonucleolítica
00: 30: 56.10 que se había propuesto para leer en polilisina.
00: 30: 59.11 Vemos eso aquí cuando miramos, de nuevo,
00: 31: 01.10 en la misma cepa con el ARNt supresor de tonterías
00: 31: 03.18 y el ribosoma de longitud completa lee
00: 31: 05.20 sentado aquí en el cruce de la cola poliA.
00: 31: 09.11 Vemos, detrás de esa firma.
00: 31: 11.02 vemos lecturas amarillas
00: 31: 12.15 - estas son lecturas breves. Estos son ARN mensajeros que están truncados.
00: 31: 16.10 y el ribosoma ha llegado al final de ese ARN mensajero,
00: 31: 18.28 y siguen, de hecho,
00: 31: 20.21 este pico gris porque la escisión endonucleolítica,
00: 31: 23.19 creemos, y se ha mostrado,
00: 31: 24.27 sucede detrás del ribosoma que está en el frente.
00: 31: 27.06 Entonces, este ribosoma encuentra una cola de poliA,
00: 31: 30.00 lucha con eso de alguna manera,
00: 31: 31.18 el ribosoma lee eso como un problema,
00: 31: 33.08 La escisión endonucleolítica ocurre detrás de eso,
00: 31: 36.06 y obtienes una acumulación de lecturas.
00: 31: 38.12 Nuevamente, identificando un rol claro para Dom34
00: 31: 41.20 cuando lees en polyA tail.
00:31: 44.02 ¿Ocurre esto de alguna manera?
00:31: 46.16 ¿Qué pasa si miramos esto de una manera más global?
00: 31: 48.04 Bueno, podemos tomar este tipo de firma
00: 31: 50.01 y podemos hacerlo de una manera más global o de análisis metagénico,
00: 31: 54.00 donde nos alineamos, aquí, en 0,
00: 31: 55.25 la unión con la cola poliA.
00: 31: 58.08 Y ahí están,
00: 32: 00.02 ésas son las lecturas largas grises de 30 nucleótidos.
00: 32: 01.12 Hemos alineado todas las colas de poliA juntas
00: 32: 03.01 en todos los genes
00:32: 04.16 que tienen codones sin sentido que están suprimidos
00: 32: 06.04 por el ARNt supresor.
00:32: 07.18 Lo que vemos es la pila de lecturas grises aquí mismo.
00:32: 10.04 - estos son los ribosomas que se leen en la cola de poliA -
00:32: 12.22 y aquí está la pila de ribosomas
00: 32: 15.01 detrás de los ARN mensajeros truncados
00: 32: 17.00 que son el resultado del ribosoma
00:32: 19.19 leyendo esta cola de poliA.
00:32: 20.27 Es un retraso de 29 nucleótidos
00:32: 23.05 y eso es consistente con el espaciado
00:32: 24.24 que esperaríamos de un ribosoma pegado al frente
00:32: 26.22 y una endonucleasa detrás.
00:32: 28.20 Entonces, esta es una visión global de lo que
00: 32: 31.12 parece el llamado Non-Stop-Decay.
00:32: 33.14 Los ribosomas son una firma para nosotros.
00: 32: 35.24 identificando el decaimiento sin parar
00:32: 37.14 en esta cepa Dom34-delta.
00:32: 40.06 Entonces, podrías argumentar,
00:32: 41.19 que esto no es particularmente amplio
00: 32: 43.14 y de gran alcance
00:32:45.25 porque hemos puesto un ARNt supresor sin sentido
00:32: 47.19 en esta cepa de levadura,
00:32: 49.04 y quizás eso no sea un fenómeno general.
00:32: 50.19 Pero lo que voy a discutir
00:32: 52.03 es que, de hecho, la poliadenilación prematura
00:32: 55.02 es un evento abundante y regular en las células eucariotas,
00: 32: 58.26 y la firma de este evento
00: 33: 00.28 se borra en gran medida mediante una variedad de vías de control de calidad
00: 33: 04.18 que siempre están ocurriendo,
00: 33: 06.10 haciendo la firma de poliadenilación prematura
00:33: 08.22 invisible por experimentos normales.
00:33: 11.04 Y estos son dos ejemplos de eso.
00: 33: 12.22 El ARN14 es un gen en la levadura,
00: 33: 14.14 y YAP1,
00:33: 16.14 que se sabe que se poliadenilaron prematuramente.
00: 33: 18.20 Resultados anteriores de Pelechano et al en 2013,
00: 33: 22.14 de hecho usando métodos de secuenciación de ARN,
00: 33: 24.01 sitios identificados de poliadenilación prematura
00:33: 26.11 en estos dos genes.
00:33: 27.21 Y lo que vemos es,
00: 33: 29.12 usando nuestra cepa Dom34-delta
00: 33: 31.20 y buscando lecturas grises y amarillas
00: 33: 33.20 - las lecturas largas y las lecturas cortas -
00: 33: 36.21 vemos una firma clara
00:33: 38.22 que los ribosomas están atrapados en este gen
00: 33: 40.28 sobre ARN mensajeros escindidos endonucleolíticamente
00: 33: 43.08 ese debe ser el resultado
00:33:46.00 de la lectura del ribosoma en poli-lisina.
00:33: 47.26 Lo que puedo decirles es que si analizamos ampliamente la levadura,
00: 33: 50.14 en estas cepas - la cepa Dom34-delta -
00: 33: 53.06 y use la apariencia de tales lecturas
00: 33: 55.20 en medio de marcos de lectura abiertos
00: 33: 57.06 como firma de este proceso
00: 33: 59.23 de Non-Stop-Decay sucediendo,
00:34: 01.13 lo que puedo decirles es que es increíblemente amplio.
00:34: 03.17 Muchos, muchos, muchos genes que miramos,
00:34: 06.10 hasta el 50% de los genes que miramos,
00:34: 08.02 tienen montones de ribosomas en medio de ellos
00: 34: 10.22 si Dom34 es eliminado de la celda,
00:34: 12.26 sugiriendo que esto es de hecho
00: 34: 15.10 un evento muy regular que ocurre en las células de levadura
00:34: 17.26 y sospecho que sucederá en eucariotas superiores.
00:34: 20.10 Entonces, volveré a esta diapositiva,
00:34: 22.08 donde hablé sobre la distribución de tamaños de fragmentos,
00:34: 24.10 como una forma de terminar y decirte
00:34: 26.10 Cuán importante creemos que podría ser Dom34 en la celda.
00:34: 28.29 Entonces, les mostré al principio
00: 34: 31.00 que si simplemente, de una manera imparcial,
00:34: 32.22 cortar una gran rebanada del gel
00:34: 34.18 y pregunte cuántos ribosomas hay en lecturas completas de ribosomas
00: 34: 37.22 versus lecturas cortas,
00:34: 39.08 lo que puedes ver aquí es que hubo alrededor del 5% de las lecturas,
00:34: 42.23 tal vez, que estaban en esta área aquí abajo,
00:34: 44.13 si los sumamos en varias longitudes.
00:34: 46.16 Entonces, podría decirse, esos son los objetivos típicos de Dom34.
00:34: 48.24 Son lecturas cortas
00:34: 50.16 y podrían ser el objetivo del sistema Dom34.
00:34: 53.15 Y lo que puedo decirte es si noqueamos a Dom34.
00:34: 55.29 esta es en realidad una cepa de tipo salvaje
00:34: 57.18 que estamos viendo aquí.
00:34: 59.01 si noqueamos a Dom34, este tamaño máximo se duplica.
00: 35: 01.13 Entonces, al menos el 5% de las lecturas en ese caso,
00: 35: 04.02 podemos decir con confianza,
00: 35: 06.01 podría ser el resultado de la acción de Dom34 en la celda,
00:35: 08.26 sugiriendo que de hecho
00:35: 10.16 hay muchas lecturas breves en la celda
00:35: 12.16 y te puedes imaginar que hay menos gente
00: 35: 14.08 que resultan de los procesos intermedios
00: 35: 16.01 de la desintegración exosómica de los ARN mensajeros,
00:35: 19.20 por lo que argumentaríamos que esto nos ayuda a entender
00:35: 22.07 por qué este gen es esencial en eucariotas superiores,
00:35: 24.17 y sospecho que aprenderemos más sobre eso muy pronto,
00: 35: 27.09 y no esencial en levadura,
00:35: 29.02 pero que se vuelve esencial en el caso de que los ribosomas sean limitantes.
00:35: 31.29 Entonces, creo que nos ayuda a entender
00:35: 33.25 el papel in vivo de Dom34.
00:35: 35.14 Juega un papel importante,
00:35:37 por eso es embrionario letal en eucariotas superiores,
00:35: 38.26 y hemos descubierto ese papel
00:35: 40.16 trabajando en un sistema manipulable genéticamente
00:35: 42.08 donde podemos eliminar el gen
00:35: 44.06 y estudiar el proceso en tiempo real.
00:35: 47.05 Así que con eso voy a detenerme y concluir
00:35: 53.14 diciéndole que espero que haya llegado a entender
00:35: 55.11 algo sobre la vigilancia del ARNm en general,
00:35: 57.04 y creo que el mensaje para llevar a casa
00: 35: 59.16 es realmente eso en el centro
00: 36: 01.12 de cualquier proceso de vigilancia de ARNm
00:36: 03.02 es el ribosoma.
00:36: 04.17 El ribosoma lee los ARN mensajeros
00:36: 06.12 y sus propiedades del ribosoma
00: 36: 08.06 y la maquinaria ribosomal
00: 36: 09.23 que son responsables de reconocer y reclutar factores
00: 36: 12.07 para entender
00:36: 14.20 cuando los ARN mensajeros son defectuosos de alguna manera
00: 36: 16.01 y es necesario apuntar a la caries
00: 36: 19.14 por vías normales,
00: 36: 20.26 que el producto proteico incompleto debe ser objeto de degradación,
00:36: 23.27 y que los ribosomas mismos
00: 36: 25.20 necesitan ser rescatados por una vía independiente del proceso normal de terminación,
00:36: 29.08 para volver a ponerlo en la piscina para la homeostasis de los ribosomas.
00:36: 33.14 Y con eso mencionaré a los principales actores de mi laboratorio.
00:36: 35.26 quién hizo el trabajo.
00:36: 37.06 El primer trabajo bioquímico en el laboratorio.
00:36: 39.10 fue hecho por Chris Shoemaker,
00:36: 41.07 y todo el trabajo de perfilado de ribosomas
00:36: 42.20 realmente lo hizo Nick Guydosh,
00:36: 44.22 un postdoctorado reciente en el laboratorio.
00:36: 47.03 Y también me gustaría agradecer a mis fuentes de financiación.
00:36: 49.01 del NIH y del Instituto Médico Howard Hughes.
00:36: 51.13 Gracias.

  • Parte 1: Síntesis de proteínas: un evento molecular de alta fidelidad

El descubrimiento de la biología sintética un paso más hacia la nueva revolución industrial

Los científicos informan que han desarrollado un método que reduce el tiempo que lleva fabricar nuevas piezas para fábricas biológicas microscópicas.

El método reduce el tiempo de 2 días a solo 6 horas. Los científicos, del Imperial College de Londres, dicen que su investigación los acerca un paso más a un nuevo tipo de revolución industrial, donde las partes para estas fábricas biológicas podrían producirse en masa. Estas fábricas tienen una gran cantidad de aplicaciones que incluyen mejores tratamientos de administración de medicamentos para los pacientes, mejoras en la forma en que se extraen los minerales de las profundidades subterráneas y avances en la producción de biocombustibles.

Las bacterias inofensivas podrían rediseñarse en fábricas microscópicas que podrían mejorar la atención médica del paciente

El profesor Paul Freemont, codirector del Centro de Biología Sintética e Innovación del Imperial College de Londres y co-investigador principal del estudio, que se publica hoy en la revista Nucleic Acids Research, dice:

& ldquoAntes de la revolución industrial, la mayoría de los artículos se fabricaban a mano, lo que significaba que eran más lentos de fabricar, más caros de producir y limitados en número. Estamos en una coyuntura similar en biología sintética, teniendo que probar y construir cada parte desde cero, lo cual es un proceso largo y lento. Demostramos en nuestro estudio un nuevo método que podría ayudar a escalar rápidamente la producción y prueba de piezas biológicas. & Rdquo

Los científicos rediseñan las partes compuestas de ADN y las colocan en células para crear fábricas biológicas. Sin embargo, un cuello de botella importante en la biología sintética es la falta de piezas a partir de las cuales construir nuevos tipos de fábricas. Para construir piezas utilizando el método actual que consume mucho tiempo, los científicos tienen que rediseñar el ADN en una célula y observar cómo funciona.Si funciona de acuerdo con sus especificaciones, los científicos almacenan las especificaciones de la pieza en un catálogo.

Ahora, los científicos del Imperial College de Londres han ideado un método mucho más rápido que elimina la necesidad de rediseñar una celda cada vez que quieren hacer una pieza nueva. El equipo dice que su trabajo podría conducir a vastas bibliotecas nuevas de componentes listos para usar que podrían usarse para construir fábricas biológicas más sofisticadas.

James Chappell, coautor del estudio del Centro de Biología Sintética e Innovación del Imperial College de Londres, dice:

& ldquoUno de los principales objetivos de la biología sintética es encontrar una manera de industrializar nuestros procesos para que podamos producir en masa estas fábricas biológicas de la misma manera que industrias como los fabricantes de automóviles producen vehículos en masa en una línea de fábrica. Esto podría desbloquear el potencial de este campo de la ciencia y permitirnos desarrollar dispositivos mucho más sofisticados que podrían usarse para mejorar muchas facetas de la sociedad. Curiosamente, nuestra investigación nos acerca un paso más a esta realidad, proporcionando una forma rápida de desarrollar nuevas piezas. & Rdquo

Cuando se rediseña una célula, el ADN reprogramado en la célula codifica un mensaje que es transmitido por moléculas llamadas ácido ribonucleico mensajero (ARNm) a las fábricas de producción de células y rsquos llamadas ribosomas. Los ribosomas traducen la información genética en un comando que instruye a la célula para que realice funciones. Por ejemplo, los científicos ya pueden rediseñar una célula para convertirla en una fábrica de detectores de infecciones, que produce una proteína que detecta señales químicas de bacterias patógenas humanas y cambia de color para indicar su presencia.

En el estudio, los investigadores de Imperial demuestran por primera vez que se puede lograr el mismo método en un tubo de ensayo fuera de una célula. Esto implica extraer de las células la maquinaria que produce el ARNm y las proteínas y proporcionar la energía y los componentes básicos para ayudarlas a sobrevivir en los tubos de ensayo. Luego, el equipo agrega su ADN reprogramado a la solución y observa cómo funciona.

La ventaja de este método es que los científicos pueden desarrollar litros de este entorno similar a una célula para que se puedan probar varios ADN reprogramados simultáneamente, lo que acelera el proceso de producción de piezas.

La siguiente etapa de la investigación es ampliar los tipos de piezas y dispositivos que se pueden desarrollar con este método. También tienen como objetivo desarrollar un método que utilice robots para acelerar y automatizar todo el proceso.

El profesor Richard Kitney, codirector del Centro de Biología Sintética e Innovación del Imperial College de Londres dice: & ldquoEl gobierno británico considera que la biología sintética tiene el potencial de crear nuevas industrias y puestos de trabajo en beneficio de la economía del Reino Unido. Este trabajo es parte de un programa de investigación más amplio e importante dentro del Centro para desarrollar tecnología que se pueda utilizar en una variedad de aplicaciones industriales. & Rdquo


12.18: Ribosomas - Biología

¿Cómo impacta la variación genética en los rasgos fenotípicos, tanto a nivel de organismo como de célula (incluido un énfasis en la regulación de genes)? ¿Cuáles son las vías moleculares desde la variación genética hasta los fenotipos celulares y de organismos? ¿Por qué gran parte del genoma contribuye a la base genética de rasgos complejos?

Nuestro laboratorio incluye personas capacitadas en una variedad de campos diferentes que utilizan enfoques computacionales y experimentales para abordar estos problemas. A menudo trabajamos en problemas para los que no existen métodos estadísticos estándar. Por lo tanto, una parte importante de nuestro trabajo consiste en desarrollar enfoques estadísticos y computacionales apropiados que puedan producir nuevos conocimientos sobre los datos biológicos.

Enlaces útiles

Noticias de laboratorio

Y bienvenidos a nuestros nuevos estudiantes de doctorado Alyssa Fortier y Roshni Patel y nuevos postdoctorados: Sahin Naqvi, Jeff Spence, Hakhamanesh Mostafavi y Clemens Weiss!

Mayo: Los nuevos artículos incluyen nuestro último trabajo sobre la comprensión de la arquitectura genética de rasgos complejos (el artículo "Omnigenic 2") con Xuanyao Liu y Yang Li: [Enlace] y nuestro artículo con los laboratorios Criswell, Marson y Greenleaf sobre la estructura de la cromatina de las células inmunes (dirigido por Diego en nuestro laboratorio, con Michelle Nguyen y Anja Mezger): [Link] ¡Felicitaciones a Diego, Xuanyao, Yang y el resto de los equipos!

Enero: Bienvenido a Shaila Musharoff ¡quién se une a nosotros este mes!

Diciembre: Despedida a David y Emily! Ambos los extrañaremos mucho. David comenzará su propio laboratorio en el NY Genome Center y Emily llevará su experiencia en genómica al mundo de la consultoría.

9/18/2018. Resumen de noticias:

Idas y venidas:
Agosto: Bienvenidos a nuestros nuevos postdoctorados Jake Freimer y Yuval Simons!

Eilon aceptó un trabajo como uno de los primeros científicos en la nueva firma Insitro, fundada por Daphne Koller. ¡Buen viaje a Eilon!

Emily defendió su tesis! ¡Felicitaciones Emily! Ella permanecerá en el laboratorio hasta fin de año para terminar los trabajos.

enhorabuena a Natalie y Ben, ambos ex alumnos del laboratorio, en su hermosa boda.

Julio: Alumna de laboratorio Alexis batalla fue galardonado con la titularidad temprana en Ingeniería Biomédica en Johns Hopkins. ¡Noticias maravillosas!

Junio: Hannah M recibió el premio Robert Baynard Textor del Departamento de Antropología, por 'creatividad en antropología'. ¡Bien hecho y merecido, Hannah!

Mayo: Arbel se graduó y pasó a un puesto de posdoctorado en el laboratorio de Molly Przeworski en Columbia. ¡En agosto, él y su esposa Maya dieron la bienvenida a bebés gemelos! ¡Felicidades! Este es el tercer par de gemelos en el laboratorio en los últimos 7 años. ¿Es esto un enriquecimiento significativo?

JonathanLa charla plenaria de PEQG sobre el modelo omnigénico (con Evan, Yang y Xuanyao) está en línea aquí.

Marcha: Natalie se graduó y pasó a ocupar un puesto de científico de planta en Ancestry. ¡Felicidades Natalie! ¡Te extrañamos!

Enero: Kelley se mudó para iniciar su propio laboratorio en el Departamento de Ciencias del Genoma de la Universidad de Washington. ¡Estamos emocionados de seguir su progreso en Washington!

10/25/2017. Resumen de noticias:

Octubre: ASHG: Natalie dio una charla plenaria bien recibida a 7000 personas en su proyecto paralelo sobre la dinámica de género de la conferencia y Nasa, Yang, Emily y David también brindó presentaciones de plataforma muy agradables. ¡Bien hecho a todos!

Actualizar: Nasa ganó ASHG mejor charla estudiantil (para trabajar con Melina Claussnitzer). ¡¡Bien hecho!!

Tenemos varios artículos publicados o por publicar en revistas: Eilon sobre el uso de cfDNA para medir el rechazo de trasplantes Yang y David en LeafCutter (empalme) Diego sobre la estimación de tipos de células que impulsan rasgos complejos Arbel en NAGC en duplicados de genes Jessica sobre triclosán y microbiomas (en colaboración con el laboratorio de Ami).

enhorabuena a Ziyue en su boda!

Septiembre: Yang y Xun pasó a iniciar sus propios laboratorios. ¡¡Buen viaje!!

enhorabuena a Harold quien ha sido galardonado con una prestigiosa beca de posdoctorado de la facultad Hannah Gray del HHMI.

Junio: Bienvenido Nasa, Hannah y Margaret al laboratorio!

6/22/2017. Resumen de noticias de los últimos meses:

Junio: lanzamiento de nuestra pieza de perspectiva sobre el 'omnigénico'modelo de rasgos complejos, con autores principales Evan Boyle y Yang Li [Enlace PDF]. Nuestro artículo estimuló mucha discusión en las redes sociales y en otros lugares, incluido el artículo de Ed Yong en el Atlántico y en las noticias de Stanford.

Mayo: Felicitaciones a 3 de nuestros postdoctorados que han aceptado puestos de profesores asistentes para el próximo año académico: Kelley Harris (U Washington, Ciencias del Genoma), Yang Li (U Chicago, Medicina genética) y Xun Lan (Tsinghua U, Ciencias Médicas Básicas).

Y Kelley también recibió un prestigioso premio de transición de la facultad a través del programa CASI en Burroughs Wellcome Fund.

Natalie y Arbel recibió becas de posgrado de CEHG. ¡Bien hecho! Y Jonathan se convertirá en codirector de CEHG a partir de junio.

DiegoEl artículo de bioRxiv sobre la inferencia de los tipos de células que provocan enfermedades se publica.

Abril: Kelley tuvo un artículo muy bueno basado en los sorprendentes resultados de su trabajo de doctorado: Evolución rápida del espectro de mutaciones humanas, disponible este mes en eLife [Link].

Harold, Evan y David cada uno tiene nuevos artículos sobre su trabajo con otros laboratorios: Sleuth [Harold] y Cas9 Binding [Evan] y ASE para detectar GxE [David].

Marcha: Anand se ha trasladado a un puesto de científico de datos en Facebook. ¡Extrañaremos su increíble experiencia técnica y sus contribuciones informales a muchos proyectos en el laboratorio! ¡Buen viaje, Anand!

Diciembre de 2016. Arbel y AnandEl trabajo sobre cómo la mutación recurrente altera el espectro de frecuencia del sitio en muestras grandes ahora está disponible en PLOS Genetics: [Enlace]. ¡Felicidades!

Natalie Tenía un artículo divertido en el que aplicó métodos computacionales para estudiar la historia de la revista. Genética desde 1917 [Enlace]. [Gráfico de lapso de tiempo de las ubicaciones de los autores]

Noviembre. Yair, Evan, y NatalieDocumento sobre SDS y adaptación poligénica: Detección de la adaptación humana durante los últimos 2000 años ya está disponible en Science [Link]. ¡Felicidades!

9/20/2016. Bienvenido a Harold Pimentel que se unió al laboratorio el mes pasado!

También, Eilon tiene un artículo publicado en Nature Genetics que muestra Interacciones trans (es decir, trans-eQTL) entre los alelos de la proteína MHC y la expresión de genes receptores de células T. Con la ayuda de Leah Sibener y Chris García pudimos interpretarlos en términos de interacciones físicas en la estructura de la proteína [Enlace]

6/1/2016. Muchas noticias interesantes para informar de abril y mayo:

Anil's papel en utilizando datos de perfiles de ribosomas para detectar nuevos marcos de lectura abiertos ahora está en línea en eLife [Link].

De Xun papel en el evolución de genes duplicados fue publicado en Science [Link]. Esto recibió una buena atención, incluso en una publicación de blog de Francis Collins.

Yair, Evan y Natalie papel en adaptación poligénica muy reciente ahora está disponible en bioRxiv [Link]. Esto llamó mucho la atención, incluidas las noticias en Nature and Science.

Yair y Yang ambos dieron charlas en la Reunión de Biología de Genomas de Cold Spring. También fue genial ver las charlas de los alumnos del laboratorio. Alexis batalla, Joe Pickrell y Dan Gaffneyy para pasar el rato con muchos otros colegas, amigos y otros ex alumnos del laboratorio.

Aquí puedes ver un par de fantásticos bocetos de Yang y Yair, dibujados por Alex Cagan.

4/28/2016. Bien hecho Yang, cuyo papel El empalme de ARN es un vínculo principal entre la variación genética y la enfermedad sale hoy [Enlace]. Este documento utiliza datos de 7 años de proyectos conjuntos entre nuestro laboratorio y el laboratorio de Yoav para proporcionar una descripción detallada de los vínculos entre la variación genética, la variación en la regulación genética y la enfermedad.

3/29/2016. Felicidades a Evan (¡Predoc de NSF!). También a Yang y David K en su artículo de Leafcutter sobre la cuantificación del empalme de ARN, publicado ahora en bioRxiv.

1/4/2016. Despedida y mis mejores deseos para Bryce (postdoctorado, laboratorio Alkes Price, Harvard) y para Graham y Kyle, comenzando sus propios laboratorios en el Instituto Salk y UCSD, respectivamente.

11/20/2015. enhorabuena a Bryce por su magistral defensa de doctorado en Chicago. Fue una ocasión agridulce, que marcó el final de la era de U Chicago.

9/14/2015. El artículo WASP de Bryce y Graham (mapeo QTL con lecturas específicas de alelos) está disponible hoy en Nature Methods.

8/18/2015. Disfrutamos de una cena de despedida en el mostrador el viernes para Audrey y Towfique (comenzando sus propios laboratorios en la U de Idaho y Mt Sinai, respectivamente). ¡Buen viaje!

Una gran bienvenida a Kelley Harris y Ziyue Gao ¡que se unen a nosotros como nuevos postdoctorados de los laboratorios de Rasmus Nielsen y Molly Przeworski!

Bienvenidos al visitante a corto plazo Dan Lawson y también a Alexis Battle, quien regresará para visitarnos brevemente este mes.

¡Felicidades a Eilon y Michal por el nacimiento de su hijo Yuval!

En el departamento de subvenciones, ¡enhorabuena a Kelley (NRSA), David G (EMBO / LLHF), Yang (CEHG), Jessica (predoctorado de NSF)! Y Natalie y Evan obtuvieron un par de becas de investigación interna, una de Genética y otra de Biología de Sistemas. Prestigio.

5/22/2015. JKP casi termina de enseñar. Ponerse al día con las noticias: Enhorabuena a Graham quien esta tomando un trabajo de la facultad en el Instituto Salk!!

Y felicitaciones a Towfique quien esta tomando un trabajo de la facultad en Mt Sinai.

Y mas felicidades a Yang que ha sido galardonado con una beca de posdoctorado CEHG para el próximo año!

Y Papel de Xun sobre la evolución de las duplicaciones de genes está disponible en bioRxiv.

4/2/2015. enhorabuena a David G. que ha ganado una beca del premio Dan David!

3/31/2015. Felicitaciones a la ex miembro del laboratorio Melissa Hubisz, ahora en Cornell, por ganar un Predoc de NSF ¡otorgar! También felicitaciones a Jessica, Emily y Evan por sus menciones honoríficas.

12/18/2014. El artículo de Alexis, Zia y Sidney sobre la relación entre la variación genética y la variación fenotípica en el ARN, los ribosomas y las proteínas se publicó hoy. ¡Felicitaciones!

12/16/2014. enhorabuena a Cristina que completó su defensa de doctorado en CS ayer !!

12/04/2014. El artículo de Anil y Heejung sobre el uso de enfoques de múltiples escalas para modelar los datos de DNasa en los sitios de unión de TF está disponible en bioRxiv.

11/11/2014. Nuestro nuevo sitio web SciReader para recomendaciones científicas está disponible en versión beta. Puede consultarlo aquí: SciReader.org. ¡Bien hecho Priya, Natalie, Yonggan!

11/11/2014. El artículo y el software de Bryce y Graham sobre Mapeo de lectura imparcial específico de alelos y potente mapeo de QTL está disponible en bioRxiv y el software WASP correspondiente está en GitHub.

9/22/2014. Muchos recién llegados este mes: David, Yang, Anand y Emily. Académicos visitantes: Audrey, Towfique y Kyle. ¡Bienvenido!

8/07/2014. ¡Esta semana nos mudamos a nuestro espacio de laboratorio a largo plazo en el Centro Clark! Estamos muy felices de estar en el nuevo espacio. En otras noticias, Anand ha sido galardonado con una beca CEHG para el próximo año. ¡Bien hecho, Anand!

6/24/2014. Alexis comenzará su propio laboratorio el próximo mes en Johns Hopkins en los departamentos de CS y Biostats [Link]. ¡Le deseamos todo lo mejor en su nuevo puesto!

6/24/2014. Bien hecho a Eilon en ganar la prestigiosa beca EMBO! David Golan, que se unirá en septiembre, ha recibido las becas Rothschild y Fulbright. ¡Felicidades a ambos!

6/24/2014. El artículo de Xun y Nick sobre influencias genéticas en la metilación del ADN está en bioRxiv [Link].

4/29/2014. Anil's ESTRUCTURA rápida El artículo ya está disponible en Genetics: Link.

Alexis hablará la próxima semana en Biología de los genomas sobre su trabajo con Zia y Sydney para comprender los efectos de la variación genética en el ARNm, la traducción y las proteínas.

4/2/2014. El artículo de Darren Cusanovich sobre derribo de TF in LCLs (con el laboratorio de Yoav) ya está disponible en PLOS Genetics: Link. El artículo de Choongwon Jeong sobre introgresión adaptativa de las adaptaciones a gran altitud de los sherpas a los tibetanos (colaboración con el laboratorio de Anna Di Rienzo), ya está disponible en Nature Communications: Link.

4/1/2014. Buen viaje a Heejung Kim. Pasó el trimestre de invierno visitándonos desde el laboratorio de Matthew en Chicago.

3/1/2014. ¡Bienvenido a Yair, que ahora ha llegado de Chicago con su familia!

2/10/2014. Nuestro artículo sobre carga genética en poblaciones humanas, junto con el laboratorio de Guy Sella, ya está disponible en Nature Genetics. ¡Enhorabuena a Yuval Simons (en el laboratorio de Guy) y Michael Turchin (ahora en el laboratorio de Matthew Stephens)! Enlace.

2/10/2014. Bienvenido a nuestro nuevo postdoctorado Eilon Sharon, quien se mudó aquí desde el laboratorio de Eran Segal. Eilon colaborará con el laboratorio de Hunter Fraser. ¡Bienvenidos también a los estudiantes de rotación de este trimestre: Peyton Greenside, Natalie Telis, Diego Calderon, Arbel Harpak y Emily Glassberg!

12/6/2013. Joe Davis ha escrito una gran publicación de blog sobre el reciente artículo de Graham y Bryce sobre variación genética y modificación de histonas.

12/4/2013. ¡FastSTRUCTURE está disponible! Los enlaces al manuscrito de Anil y al software de lanzamiento beta están aquí.

12/4/2013. Gracias a Christine Vogel por su perspectiva sobre la evolución de Zia del papel de ARNm / proteína.

11/12/2013. ¡Bienvenidos a Yonggan y Priya que se unirán al laboratorio este mes!

11/12/2013. Felicitaciones a Jack / Athma / Roger, cuyo artículo sobre DNase QTLs fue elegido como uno de los mejores artículos de 2012 en Regulatory and Systems Genomics en la reunión RECOMB / ISCB.

11/1/2013. Hay una buena perspectiva en NRG de Hannah Storey en 4 artículos recientes, incluido uno de Graham y Bryce, que estudiaron los efectos de la variación genética en las modificaciones de histonas.

10/30/2013. Felicitaciones a Shyam por ganar el prestigioso premio Charles Epstein Trainee Research Award (división de posdoctorado) por su charla en ASHG sobre inferencia histórica para poblaciones africanas. Graham Coop es un ganador anterior de nuestro laboratorio (en 2007).

10/22/2013. Felicitaciones al alumno de laboratorio Joe Pickrell que acaba de aceptar un puesto como uno de los primeros profesores del Centro del Genoma de Nueva York. Además, Zia Khan ahora está en tránsito hacia su primer puesto en la facultad, en CS en la U. Maryland. ¡Buena suerte a los dos!

10/22/2013. El artículo de Darren sobre experimentos de derribo dirigidos a 59 TF está disponible en ArXiv.

10/17/2013. Zia y Graham / Bryce tienen un par de artículos publicados en Science hoy: evolución de la expresión de proteínas en primates y efectos de la variación genética en las modificaciones de histonas. ¡Felicidades a Zia, Graham y Bryce!

10/17/2013. El artículo de 2006 de Ben Voight sobre la selección se destacó en un bonito artículo de blog de Emma Ganley como parte de las celebraciones del décimo aniversario en PLOS Biology.

10/11/2013. ¡Bienvenidos a nuestros dos primeros estudiantes de rotación de Stanford: Ilana Arbisser del departamento de Biología y Michael Sikora de Genetics!

8/1/2013. Estamos encantados de mudarnos a la Universidad de Stanford. Este será un entorno académico fantástico y un gran lugar para vivir. Dicho esto, echaremos de menos a nuestros muchos amigos de la Universidad de Chicago, donde se basó el laboratorio durante 12 años.

8/1/2013. ¡Bienvenido a nuestro postdoctorado más reciente Alexis Battle! Es genial tenerla a bordo.

8/1/2013. Bienvenidos a Anil, Stoyan y Xun, que llegarán a Stanford este mes. El resto del laboratorio seguirá pronto o trabajará desde Chicago durante el período de transición.

Hola Mundo. El laboratorio se traslada a Stanford el 1/8/2013, después de 12 años en la Universidad de Chicago.


Cuantificación de cambios en la selección natural en el uso de codones entre regiones proteicas: un enfoque de genética de poblaciones

El sesgo de uso de codones (CUB), el uso no uniforme de codones sinónimos, se produce en todos los dominios de la vida. Se ha planteado la hipótesis de que el CUB adaptativo es el resultado de la selección para un movimiento eficiente del ribosoma y / o una traducción precisa. La evidencia empírica y computacional indica que los cambios en la tasa de error de sentido erróneo y la velocidad de traducción pueden afectar la capacidad de una proteína para alcanzar su estado nativo. Dado el vínculo crítico entre el plegamiento y la función, numerosos estudios han analizado la relación entre el uso de codones y la estructura de la proteína. Los resultados a menudo han sido contradictorios debido a los diversos métodos para cuantificar las diferencias en el uso de codones y no controlar adecuadamente los factores de confusión (por ejemplo, sesgos de aminoácidos). Para evitar estas deficiencias, adoptamos un enfoque genético de poblaciones explícito para cuantificar los cambios específicos de codones en la selección natural relacionados con la estructura de la proteína. Nuestros resultados revelan una relación débil entre el uso de codones y la estructura de la proteína, lo que indica que las diferencias en la selección entre estructuras son muy sutiles y / o ocurren de forma intermitente. Si bien la magnitud de las diferencias en la selección parece leve, nuestros resultados indican que la relación entre el uso de codones y la estructura de la proteína es más compleja de lo que se creía anteriormente.Nuestro trabajo demuestra el poder estadístico y los beneficios de estudiar los cambios selectivos en el uso de codones u otras características genómicas desde un enfoque explícitamente evolutivo.

Declaración de intereses en competencia

Los autores han declarado no tener intereses en competencia.


Resultados y discusión

Análisis de complejos inmunoprecipitados de circuito cerrado y 4E-BP

El modelo de circuito cerrado representa una explicación ampliamente comunicada para la selección de ARNm para el inicio de la traducción [12, 18, 19]. Hemos evaluado el perfil de unión de ARNm global de los componentes del complejo de circuito cerrado en S. cerevisiae (Figura 1A). Usamos cepas que llevaban etiquetas de purificación por afinidad en tándem (TAP) carboxi-terminales genómicamente integradas en cada uno de los genes endógenos que codifican los componentes del complejo de bucle cerrado, y las cultivamos en condiciones estándar de crecimiento exponencial en cultivo por lotes. Para proporcionar un análisis sistemático del proceso de selección de ARNm y los mecanismos reguladores que pueden estar involucrados, también investigamos el perfil de unión de ARNm para cada una de las proteínas de unión de eIF4E de levadura (4E-BP), Caf20p y Eap1p, que se consideran represores de la traducción. (Figura 1A) [40].

Al establecer el sistema experimental para la inmunopurificación (IP) de los ARNm asociados con cada uno de estos componentes, se prestó especial atención a una serie de factores. Primero, se evaluó el impacto del etiquetado TAP en los niveles de cada factor. Como resultado, observamos que en el CDC33-TAP cepa, la proteína eIF4E-TAP está sobreexpresada, por lo que reconstruimos esta cepa para eliminar el marcador seleccionable y restaurar los niveles de eIF4E al tipo salvaje (datos no mostrados). En segundo lugar, todas las cepas etiquetadas con TAP utilizadas en este estudio se evaluaron en términos de crecimiento (datos no mostrados) y traducción de ARNm global a través de perfiles de polisomas (archivo adicional 1A). Las cepas portan el alelo etiquetado con TAP como la única copia de estos genes del factor de iniciación de la traducción esencial, por lo tanto, el hecho de que los perfiles de crecimiento y polisoma no se puedan distinguir de la cepa original sugiere que las proteínas etiquetadas son completamente funcionales. En tercer lugar, desarrollamos un protocolo de perlas magnéticas para la IP rápida de proteínas de interés, de modo que nuestra IP se complete en 20 minutos para minimizar el impacto en los complejos de ribonucleoproteínas. También se tuvo especial cuidado para optimizar las purificaciones de modo que la mayoría de cada proteína etiquetada se purificara y, por lo tanto, se agotara del extracto (compare entradas, flujos y eluidos en la Figura 1B). De hecho, el único IP en el que se detectó alguna proteína etiquetada con TAP en el flujo continuo fue en la muestra de Pab1p. Como resultado, aunque Pab1p es una de las proteínas de unión de ARN más abundantes en la célula [38], todavía inmunopurificamos más del 80% de esta proteína a partir de extractos de células completas (Figura 1B).

Con el fin de asegurar que los IP contienen proteínas que son consistentes con la formación tanto del complejo de bucle cerrado como de los complejos de represión 4E-BP, las muestras inmunopurificadas se sondaron con varios anticuerpos en transferencias de Western (Figura 1C, D). En estas transferencias, la migración de cada proteína etiquetada con TAP se retarda en relación con la proteína no etiquetada (por ejemplo, Pab1p-TAP, eIF4E-TAP y Caf20p-TAP en la Figura 1C, D). Para eIF4G1-TAP y eIF4G2-TAP, la proteína A en el epítopo TAP es detectada por el anticuerpo secundario, por lo tanto, se observa una banda de proteína eIF4G2-TAP aunque se usó un anticuerpo primario específico de eIF4G1 (Figura 1C). Sin embargo, para resumir este análisis, todos los componentes relevantes del complejo de circuito cerrado, eIF4E, eIF4G1 y Pab1p, estaban presentes en los IP apropiados de eIF4E, eIF4G1, eIF4G2 y Pab1p (Figura 1C). Igualmente, en términos de los complejos de represión 4E-BP, los IP de Eap1p y Caf20p contienen eIF4E pero no eIF4G1 (Figura 1D), de acuerdo con el modelo competitivo generalmente aceptado para la represión mediada por 4E-BP representada en la Figura 1A [41]. Por último, se evaluó la capacidad de las proteínas etiquetadas con TAP para interactuar adecuadamente con la tapa de ARNm mediante cromatografía de afinidad Cap (archivo adicional 1B). Cada uno de los componentes etiquetados con TAP se aisló en la resina de manera similar a la proteína no etiquetada relevante, lo que sugiere que las etiquetas TAP en las cepas no influyen indebidamente en la capacidad de las proteínas etiquetadas para interactuar con ARN o proteínas unidas a ARN.

ARNm enriquecidos y el significado funcional de su asociación

Los ARNm que están asociados con las direcciones IP para eIF4E, eIF4G1, eIF4G2, Pab1p, Caf20p y Eap1p en tres réplicas biológicas se cuantificaron mediante RNA-seq (consulte Materiales y métodos para obtener más detalles y el archivo adicional 2 para obtener estadísticas de mapeo y recuentos). Los datos se procesaron para generar una proporción para cada especie de ARNm en relación con una muestra de ARN total de la misma cepa etiquetada con TAP. Las bibliotecas se secuenciaron a una profundidad promedio de 7.8 ± 5.8 millones de lecturas mapeadas únicas, y los datos se usaron para establecer listas de transcripciones enriquecidas estadísticamente (tasa de descubrimiento falso (FDR) & lt0.05) en la muestra inmunoprecipitada usando el modelo GLM emparejado de EdgeR (listas completas proporcionadas en el archivo adicional 2). En la Figura 2A se presenta un análisis de enriquecimiento funcional generado a partir de los datos de RIP-seq, a partir del cual son evidentes varias tendencias. Ambas proteínas de unión a eIF4E, Caf20p y Eap1p, tienen transcripciones enriquecidas con IP cuyos productos proteicos participan en una gran cantidad de funciones nucleares (por ejemplo, procesamiento y transcripción del ARN), lo que posiblemente revele una conexión entre la regulación de la traducción y la regulación de eventos ascendentes. en la vía de expresión génica. En un estudio anterior, evaluamos la importancia funcional de Caf20p y Eap1p mediante el uso de microarrays para medir cualquier cambio en la asociación de ARNm a través de gradientes polisoma en tipo salvaje versus caf20Δ y eap1Δ cepas mutantes [40]. Esto reveló que más de mil transcripciones estaban potencialmente reguladas a nivel de traducción por las 4E-BP de levadura. Aquí, podemos evaluar cómo los ARNm que se encuentran asociados con Caf20p y Eap1p a través del cambio de RIP-seq en términos de asociación polisomal en las cepas knockout. Las transcripciones que se asocian preferentemente con Caf20p y Eap1p se desplazan sutil, pero significativamente (utilizando un rango de límites de FDR), hacia las fracciones polisoma en el caf20Δ cepa relativa al tipo salvaje (archivo adicional 3). Para el eap1Δ cepa mutante en relación con el tipo salvaje se observaron tendencias similares en todo el país. eap1Δ parcelas, aunque la escala de efecto es significativamente menos pronunciada que para la caf20Δ datos (datos no mostrados), potencialmente debido a su abundancia reducida en la celda con respecto a Caf20p [38]. En general, esta comparación de los datos de RIP-seq con estudios de microarrays previos sobre mutantes es coherente con el papel descrito para las 4E-BP como represores del inicio de la traducción.

Propiedades de las transcripciones asociadas preferentemente con componentes de circuito cerrado y 4E-BP. (A) Términos de Ontología de genes que están significativamente sobrerrepresentados (rojo) o subrepresentados (verde) para cada uno de los conjuntos de transcripciones enriquecidos en el menú desplegable de afinidad de las seis proteínas que se muestran en la parte superior. (ANTES DE CRISTO) Diagramas de caja y bigotes que detallan la variación en la ocupación de ribosomas [42] y la longitud de la cola poli (A) [43] para las transcripciones enriquecidas con los componentes de circuito cerrado y 4E-BP. Una prueba estadística de rango de Wilcoxon entre conjuntos de transcripciones reveló una alta asociación para ambas características con las transcripciones enriquecidas con Pab1p. En estos gráficos, los cuadros de colores representan la extensión de los cuartiles superior e inferior con la muesca que representa la mediana. Las líneas verticales punteadas y rematadas representan los extremos superior e inferior, mientras que los círculos son valores periféricos.

Para evaluar otras correlaciones para las listas de genes individuales, se compararon con una serie de parámetros diferentes, incluida la longitud de la cola poli (A) [43] y la ocupación de ribosomas [42] (Figura 2B, C). Sorprendentemente, los ARNm asociados con Caf20p y Eap1p tienen ocupaciones de ribosomas que son tan altas como los ARNm asociados con eIF4G1 o eIF4G2. Podría haber varias razones para esto: la interacción con eIF4E podría no ser la única forma en que Caf20p y Eap1p pueden asociarse con ARNm, o las 4E-BP de levadura pueden simplemente amortiguar la traducción de ARNm altamente traducidos de manera que, en promedio , los ARNm asociados a 4E-BP todavía pueden tener una alta ocupación de ribosomas. Quizás el resultado más sorprendente de estas comparaciones es que las transcripciones enriquecidas con Pab1p están asociadas no solo con colas poli (A) más largas, como podría esperarse, sino también con los altos niveles de ocupación de ribosomas (Figura 2B, C). El alto nivel de correlación entre la longitud de la cola poli (A) y la asociación de ribosomas se ha observado antes [43], pero aquí mostramos que el nivel de ocupación de ribosomas para las transcripciones enriquecidas con Pab1p fue significativamente mayor que para las transcripciones asociadas con otros componentes de el complejo de circuito cerrado (Figura 2C). Estos resultados destacan a Pab1p como un actor importante para los ARNm donde la traducción es particularmente eficiente y robusta.

El perfil de unión del ARN de Pab1p es diferente al de los otros componentes de circuito cerrado

Con el fin de proporcionar una evaluación cuantitativa de la variación entre diferentes conjuntos de datos RIP-seq en pares, hemos utilizado un modelo de interacción derivado de la función Modelo lineal generalizado (GLM) dentro del paquete de software EdgeR (Bioconductor) [44,45] . Más específicamente, comparamos la proporción de niveles de ARNm en las muestras de IP en relación con el nivel en una muestra de ARN total (log2(IP / Total)) para cada gen en cada uno de los seis experimentos de inmunoprecipitación, y examinó las correlaciones por pares entre ellos (Figura 3A). Aquí se presenta el perfil completo de los valores de enriquecimiento de ARNm, en lugar de los definidos por un límite estadístico. Estos datos se presentan como diagramas de dispersión que comparan los conjuntos de datos, destacando en rojo las transcripciones que se encontraron significativamente diferentes entre los experimentos de acuerdo con el GLM. Sorprendentemente, estos gráficos enfatizan la alta correlación observada en los perfiles de unión de los tres miembros del complejo eIF4F (correlaciones de Pearson de 0,755, 0,753 y 0,812). Asimismo, los dos perfiles de unión 4E-BP, para Caf20p y Eap1p, también muestran una alta correlación similar entre sí. En particular, mientras que Pab1p muestra correlaciones positivas con componentes del complejo eIF4F, es el único factor evaluado que muestra una correlación negativa con los perfiles de los represores de traducción Caf20p y Eap1p.

Comparaciones directas por pares entre experimentos RIP-seq para cada uno de los componentes de circuito cerrado y 4E-BP. (A) Los diagramas de dispersión muestran cambios en el registro2 cambios de pliegue mediano (IP / Total) para cada una de las seis proteínas en comparación entre sí. Destacadas en rojo son aquellas transcripciones identificadas como significativamente diferentes entre los dos experimentos de acuerdo con el modelo GLM de interacción de edgeR en un FDR & lt0.05. (B) Tabla que muestra el número total de transcripciones que varían significativamente entre las comparaciones por pares en (A). Los números representan transcripciones que están sobrerrepresentadas en las direcciones IP de las proteínas enumeradas en las columnas en relación con las proteínas enumeradas en cada fila.

El número de transcripciones en desacuerdo con el modelo de interacción se muestra en la Figura 3B (detallada en el archivo adicional 4). Esto muestra el número de transcripciones enriquecidas diferencialmente o subrepresentadas para cada comparación por pares de acuerdo con el GLM (los puntos de datos rojos) y respalda las tendencias generales observadas en los diagramas de dispersión (Figura 3A). Por ejemplo, no se identificaron transcripciones como significativamente diferentes en su asociación con las dos isoformas eIF4G, eIF4G1 y eIF4G2. Esta observación es consistente con datos recientes que sugieren que estas dos isoformas probablemente sean funcionalmente redundantes [17]. Estos resultados, combinados con los datos anteriores, sugieren que el complejo eIF4F explica la gran mayoría de las interacciones de eIF4E, eIF4G1 y eIF4G2 con ARNm. Esto es particularmente intrigante dado que los represores de traducción Caf20p y Eap1p inhiben la traducción a través de la interacción con eIF4E, sin embargo, su perfil de unión exhibe una correlación mínima con el de eIF4E. Las posibles explicaciones para esto son que las 4E-BP pueden interactuar con los ARNm de formas que son independientes de eIF4E o que el complejo 4E-BP-eIF4E puede estar asociado de manera menos estable con el ARNm.

También es evidente que si Pab1p fuera estequiométrico con el complejo eIF4F en cada ARNm, entonces se esperaría que el perfil de unión del ARNm para Pab1p fuera similar al de eIF4E, eIF4G1 y eIF4G2. Como sea, este no es el caso. Cabe señalar que Pab1p se une al extremo 3 'del ARNm y los componentes eIF4F se asocian con el extremo 5'. Es posible que esta diferencia explique parte de la variación que es evidente entre estos conjuntos de datos RIP-seq. Alternativamente, estos datos podrían resaltar que el complejo de bucle cerrado solo es relevante para la traducción de un subconjunto de ARNm. Curiosamente, el perfil de Pab1p se correlaciona inversamente con los de los represores traduccionales Caf20p y Eap1p (de hecho, más que los perfiles eIF4G es, con mucho, la anti-correlación más fuerte con los perfiles 4E-BP), y las transcripciones enriquecidas con Pab1p también tienen un ribosoma más alto. ocupación (Figura 2B), enfatizando una fuerte correlación entre la asociación Pab1p y la traducción activa.

La agrupación de perfiles de enriquecimiento RIP-seq revela tendencias globales en el control de traslación a través del complejo de circuito cerrado y Pab1p

Si bien la comparación por pares de los conjuntos de datos RIP-seq ha proporcionado información significativa, la comparación de los perfiles de unión de ARN en todos los conjuntos de datos RIP-seq se puede visualizar simultáneamente mediante un método de agrupación jerárquica. Por lo tanto, los datos de RIP-seq se expresaron en forma de mapa de calor, mostrando las tres réplicas biológicas fuertemente correlacionadas para cada miembro de ciclo cerrado como columnas y las transcripciones individuales como filas (Figura 4). Con el fin de garantizar un número mínimo de falsos positivos, se utilizó un límite estadístico más conservador junto con un filtro basado en recuento para el análisis de agrupamiento. Más específicamente, el mapa de calor está restringido a aquellas transcripciones que muestran un enriquecimiento significativo (FDR & lt0.01) o una representación insuficiente según el modelo GLM de EdgeR en al menos una de las direcciones IP, así como a las transcripciones con más de 20 lecturas en cada una de las las muestras de extracto total pertinentes. En total, 3.173 de los genes anotados en el genoma de la levadura satisfacen estos criterios. Por lo tanto, una proporción sustancial del transcriptoma de levadura muestra un enriquecimiento o una representación insuficiente estadísticamente significativa y poco discernible con respecto al ARNm total, y el mapa de calor se centra en los que sí lo hacen.

Cuatro grupos principales son evidentes en los conjuntos de datos de RIP-seq. Mapa de calor derivado de la agrupación jerárquica de los perfiles de unión de ARNm (log2 veces cambios IP / Total) de las seis proteínas en el estudio, el rojo y el azul representan ARNm sobrerrepresentados y subrepresentados, respectivamente. El análisis se limitó a 3173 transcripciones que se identificaron como sobrerrepresentadas o subrepresentadas en cualquiera de los seis conjuntos de datos y la agrupación jerárquica se realizó como se describe en la sección Materiales y métodos. El mapa de calor presentado contiene 2767 transcripciones separadas en 7 grupos que se han agrupado en los grupos I a IV según la similitud de los patrones de asociación.

Utilizando la agrupación jerárquica estándar (consulte Materiales y métodos para obtener más detalles) de los perfiles de enriquecimiento de RIP-seq, se pueden definir cuatro grupos amplios (I a IV) que abarcan 2767 transcripciones (Figura 4 Archivo adicional 5). Estos cuatro grupos visualmente distintos exhiben patrones intrigantes de asociación con los componentes de circuito cerrado y los represores de traducción Caf20p y Eap1p, que se manifiestan en gran medida como bloques de enriquecimiento / representación insuficiente con respecto a eIF4E / 4G1 / 4G2 / Pab1p y Caf20p / Eap1p. El grupo I contiene ARNm que en su mayoría están subrepresentados en IP de todos los componentes probados con la excepción de Pab1p. El grupo II contiene ARNm enriquecidos en IP de los represores de traducción Caf20p y Eap1p. El grupo III consta de dos grupos que contienen ARNm que están enriquecidos en IP de componentes de circuito cerrado, pero están infrarrepresentados en las muestras de Caf20p y Eap1p: un perfil de asociación que podría esperarse de los ARNm en los que la traducción es muy activa y se inicia de forma robusta a través del circuito cerrado. complejo. Finalmente, el grupo IV es un grupo grande y amplio de ARNm que se enriquecen en los conjuntos de datos eIF4F y 4E-BP, con tres subgrupos determinados por el nivel de enriquecimiento con Pab1p o los componentes eIF4F; aquí puede haber una competencia compleja entre la interacción de componentes de bucle cerrado y los represores de traducción. Es particularmente intrigante que aproximadamente la mitad de los ARNm del grupo IV estén subenriquecidos en Pab1p, aunque estos mismos ARNm están enriquecidos con eIF4F. Parece plausible que, para estos ARNm, la cola de poli (A) podría interactuar con otras proteínas de unión a ARN como Nab2p o Sgn1p, que se ha sugerido anteriormente que compiten con Pab1p [46]. En general, estos grupos destacan la posibilidad de que el inicio de la traducción a través del complejo de bucle cerrado podría ser más importante para algunos ARNm que para otros. En particular, el grupo III define los ARNm que parecen interactuar preferentemente con el complejo de bucle cerrado y los ARNm del grupo II que interactúan preferentemente con las 4E-BP.

Antes de considerar estos grupos de traducción globales de ARNm con más detalle, es interesante observar que, como se encontró anteriormente, utilizando el modelo GLM y los diagramas de dispersión (Figura 3), existe una alta correspondencia entre los perfiles de IP eIF4E, eIF4G1 y eIF4G2 mientras que el patrón de Pab1p parece diferente (Figura 4). Además, si bien los perfiles para las levaduras 4E-BP, Caf20p y Eap1p, son muy similares, son diferentes a los patrones observados para las otras IP. Esto es particularmente evidente en el dendrograma de agrupamiento presentado sobre las columnas en la Figura 4. De hecho, los perfiles eIF4G1 y eIF4G2 son tan similares que no se pueden distinguir en el dendrograma. El hecho de que los componentes eIF4F eIF4E y eIF4G exhiban un perfil de interacción de ARNm similar, mientras que el de Pab1p parece diferente nuevamente apunta hacia un modelo en el que el complejo de bucle cerrado completo solo es relevante para la traducción de un subconjunto de ARNm. Además, dado que en el grupo II los 4E-BP pueden identificarse como interactuando preferentemente con transcripciones donde los factores de traducción no están enriquecidos, parece que el modelo sencillo de interacción eIF4E-4E-BP en ARNm para reprimir la traducción puede ser una simplificación excesiva. .

Con el fin de proporcionar una validación independiente para los grupos identificados en la Figura 4 y los conjuntos de datos de RIP-seq en su conjunto, se realizó una serie de análisis cuantitativos de PCR con transcriptasa inversa (qRT-PCR) en ARN preparado a partir de IP de los factores etiquetados con TAP y comparado con los niveles de ARN en las fracciones de entrada (Figura 5). Estos datos exhiben una excelente correlación con el análisis RIP-seq. Los ARNm del grupo III están enriquecidos con eIF4E, eIF4G1, eIF4G2 y Pab1p, pero no con 4E-BP. Los ARNm del grupo II están enriquecidos predominantemente con 4E-BP.Los ARNm del grupo IV están enriquecidos para la mayoría de los componentes marcados con TAP y los ARNm del grupo I están poco enriquecidos para todos los factores excepto Pab1p. Esta última observación es particularmente sorprendente y sugiere que Pab1p juega un papel clave en la traducción de estos ARNm de alta abundancia. Se ha sugerido que Pab1p mejora varias etapas en el proceso de traducción, incluida la unión de subunidades durante el inicio [22] y la terminación de la traducción / reciclaje de ribosomas [23]. Por lo tanto, una posibilidad es que Pab1p actúe para mejorar estos pasos independientemente de las proteínas que interactúan con la tapa. Alternativamente, Pab1p podría estar actuando de una manera no identificada hasta ahora.

Validación de grupos de transcripciones mediante RT-PCR cuantitativa. La Figura muestra cuatro gráficos, uno para cada uno de los grupos de transcripciones. Los ARNm indicados se cuantifican en las muestras de IP en relación con el ARN total para el control no etiquetado y los componentes reguladores de bucle cerrado / 4E-BP. Las barras de error son ± error estándar de tres experimentos repetidos.

Otro aspecto de los datos que se destaca por el análisis de qRT-PCR es que a pesar del subenriquecimiento de las transcripciones con varios componentes de circuito cerrado y 4EBP en relación con una muestra de ARN total, los ARNm todavía están presentes en los IP en comparación con el nivel de ARNm obtenido de una cepa no etiquetada (Figura 5 comparar BY4741 con las cepas etiquetadas con TAP). Esto también es evidente a partir de los datos de RIP-seq medidos por los valores de RPKM (lecturas por kilobase de transcripción por millón de lecturas asignadas) en los experimentos de IP (archivo adicional 2). Es decir, incluso aquellos ARNm que están poco enriquecidos con eIF4F, Pab1p o 4E-BP están claramente todavía unidos por estos componentes, aunque a un nivel significativamente reducido.

Análisis funcional de ARNm enriquecidos y agrupaciones de circuito cerrado

Para descifrar aún más el papel funcional de los componentes de ciclo cerrado en el inicio de la traducción en la levadura, examinamos los grupos de ARNm derivados del mapa de calor en busca de tendencias y patrones en términos de función génica. Inicialmente nos enfocamos en el grupo III, ya que este grupo exhibe el patrón más claro de asociación con componentes complejos de circuito cerrado. Encontramos que los ARNm del grupo III exhiben una alta ocupación de ribosomas y sus productos proteicos son, en promedio, muy abundantes (Figura 6B, C). Esto es coherente con el inicio de la traducción dependiente del complejo de bucle cerrado que actúa como una ruta eficaz para la producción de proteínas estables y muy abundantes. Un análisis funcional de los ARNm presentes dentro de este grupo da más peso a esta idea, ya que demuestra un enriquecimiento muy sustancial en los ARNm para proteínas ribosomales (Figura 6A) 115 de los 395 genes del grupo III codifican proteínas ribosomales. El hecho de que los ARNm de las proteínas ribosomales estén muy enriquecidos con la maquinaria de circuito cerrado proporciona un paralelo interesante con la situación en las células de mamíferos, donde muchos de los ARNm que codifican proteínas ribosómicas muestran patrones reguladores discretos en virtud de una oligopirimidina terminal 5 '(TOP) motivo [47]. No tal cisLas secuencias que actúan son obvias en los ARNm de la proteína ribosómica de levadura o en el conjunto de ARNm del grupo III (datos no mostrados), sin embargo, parece probable que tales elementos deban dictar el alto nivel de asociación que observamos con los componentes del complejo de bucle cerrado. Los paralelos entre las propiedades del ARNm del grupo III y las de los ARNm TOP de mamíferos son más profundos. Por ejemplo, los ARNm TOP son especialmente sensibles a la regulación de la diana de la rapamicina en mamíferos (mTOR), y la evidencia reciente sugiere que esto ocurre a través del represor de traducción 4E-BP1 [48]. La regulación específica de los ARNm TOP de esta manera sugiere que estos ARNm son muy sensibles al complejo cap y posiblemente a la inhibición del complejo en bucle cerrado [48]. Por lo tanto, el enriquecimiento específico de los ARNm de proteínas ribosomales con componentes del complejo de ciclo cerrado de levadura destaca la posibilidad de que exista un mecanismo paralelo en la levadura.

Análisis funcional de proteínas codificadas por los grupos de transcripciones. (A) Términos de Ontología genética (GO) que están significativamente sobrerrepresentados (rojo) o subrepresentados (azul) para las transcripciones que están presentes dentro de los cuatro grupos definidos en la Figura 4. Solo los términos GO que muestran diferencias significativas (mediante una prueba de Fisher que compara ese grupo con el resto del genoma FDR & lt0.01) para al menos un grupo y también tenía diferencias entre los grupos (prueba de Chi-cuadrado FDR & lt0.01). La escala de colores representa la significación estadística del enriquecimiento o subenriquecimiento del término GO medido por log10FDR. Para mayor comodidad, el registro de enriquecimiento de término de GO10Los valores de FDR se han multiplicado por -1. (ANTES DE CRISTO) Diagramas de caja y bigotes, como en la Figura 2, que detallan la variación en la ocupación de ribosomas [42] y la abundancia de proteínas de acuerdo con la base de datos PaxDb [49] para las transcripciones enriquecidas con los componentes de ciclo cerrado y 4E-BP. Una prueba de rango de Wilcoxon entre conjuntos de transcripciones por pares reveló una diferencia significativa (PAG & lt 1 × 10 -7) en todos los casos para ambas parcelas, la única excepción es entre el grupo I y el grupo III para la ocupación ribosómica, que fue significativa en PAG & lt 0.03.

Al igual que en el grupo III, los ARNm del grupo I tienen una alta ocupación de ribosomas y sus productos proteicos son muy abundantes (Figura 6B, C). Sin embargo, el patrón de asociación con los componentes de circuito cerrado es muy diferente para el grupo I en relación con el grupo III. Los ARNm del grupo I generalmente están subrepresentados para eIF4E, eIF4G1, eIF4G2, Caf20p y Eap1p. De hecho, los IP de Pab1p son los únicos en los que este grupo de ARNm no está subrepresentado en relación con el total (Figuras 4 y 5). Un análisis de las funciones de los productos proteicos de los ARNm dentro de este grupo destaca el metabolismo de aminoácidos y nucleótidos, el metabolismo de carbohidratos / generación de energía, la aminoacilación y traducción del ARNt (Figura 6A Archivo adicional 5). Sorprendentemente, este grupo incluye los ARNm que codifican los factores glucolíticos, como ENO2, TDH3 y PGK1y factores de traducción, como TEF1, TEF2, EFB1, TIF1 y TIF2, que se encuentran entre las proteínas más abundantes y expresadas en la célula. La infrarrepresentación de los ARNm en este grupo con componentes eIF4F combinados con la gran abundancia de los productos proteicos sugiere que el complejo de bucle cerrado es mucho menos relevante para el inicio de la traducción de alta eficiencia para este grupo de ARNm que para los ARNm del grupo III. Por lo tanto, es plausible que tales ARNm requieran una alternativa al mecanismo de circuito cerrado para su inicio de traducción altamente eficiente. Una posibilidad es que Pab1p esté involucrado de alguna manera en un mecanismo alternativo de alta eficiencia, especialmente considerando que los ARNm del grupo I están subrepresentados con todos los componentes proteicos de circuito cerrado excepto Pab1p. Curiosamente, con respecto a dicho modelo, los ARNm que están sobrerrepresentados estadísticamente en los IP de Pab1p exhiben, en promedio, colas de poli (A) más largas y una ocupación de ribosomas superior a la media (Figura 2B, C). Se ha sugerido previamente que Pab1p actúa en varios pasos del proceso de traducción: iniciación interna, unión de subunidades ribosómicas 60S y terminación de la traducción. Por lo tanto, es posible que una de estas actividades explique la observación de que los ARNm del grupo I parecen muy traducidos aunque interactúan menos bien con los componentes de eIF4F. Las observaciones para esta cohorte de ARNm combinadas con la correlación inversa entre Pab1p y 4E-BP en términos de sus perfiles de unión de ARNm se suman a una imagen en la que la interacción Pab1p representa un predictor clave de la eficiencia de la traducción.

Los ARNm del grupo II del mapa de calor incluyen ARNm que están preferentemente asociados con las 4E-BP y, por lo tanto, deben reprimirse traduccionalmente. Como se indicó anteriormente, aunque estas transcripciones parecen estar poco enriquecidas para eIF4E, los ARNm claramente todavía están presentes en los experimentos de IP pero están poco enriquecidos en relación con otras transcripciones muy unidas. Un análisis funcional de los ARNm del grupo II identifica un fuerte enriquecimiento de ciertas vías biosintéticas de aminoácidos, incluidas las de los aminoácidos hidrófobos y básicos (Figura 6A Archivo adicional 5), aunque debe tenerse en cuenta que también están presentes muchos genes biosintéticos de aminoácidos. en los grupos I y IV. Sin embargo, se han identificado conexiones intrigantes entre la vía de Gcn que controla la biosíntesis de aminoácidos y las 4E-BP de levadura [50]. En general, el hallazgo de que los ARNm específicos están enriquecidos con 4E-BP es consistente con la suposición de que dichos ARNm no son críticos en el crecimiento exponencial ilimitado, por lo tanto, la traducción se reprime en virtud de los represores 4EBP. Este análisis también es consistente con la hipótesis de que las 4E-BP de levadura no son reguladores globales de la iniciación de la traducción, sino que funcionan para regular de una manera específica del ARNm [40,51,52].

Finalmente, el gran grupo representado por el grupo IV se caracteriza por fuertes interacciones tanto con eIF4F como con las represivas 4E-BP. Las proteínas codificadas por este grupo de ARNm muestran una gama muy amplia de funciones, este grupo está enriquecido en funciones relacionadas con la transcripción, la fosforilación de proteínas y el ciclo celular, y está poco enriquecido para funciones relacionadas con la traducción y el ribosoma. Este grupo contiene 79 de los 127 ARNm que codifican proteína quinasa, mientras que ningún otro grupo contiene ARNm de proteína quinasa. Por lo tanto, parece que este grupo contiene ARNm para procesos que están estrechamente regulados en la célula, incluida la señalización y activación de vías y respuestas a estímulos. Nuestros datos sugieren que algo de esto se manifiesta a nivel de traducción. Sugerimos que estos procesos están bajo un control finito donde existe un delicado equilibrio en el nivel de un ARNm individual unido por el circuito cerrado en relación con las 4E-BP. También puede ser cierto que este grupo está preparado de tal manera que la desrepresión de la traducción a través del alivio de la represión 4E-BP representaría un medio para liberar un "freno de mano molecular".

Estimación de la estequiometría de interacciones de proteínas con eIF4E unido a ARNm

El hallazgo de que un gran grupo de ARNm están sobrerrepresentados en las inmunoprecipitaciones tanto de eIF4G como de 4E-BP (Figura 4, ARNm del grupo IV) destaca el potencial de interacciones competitivas con eIF4E en los ARNm entre las diversas proteínas de unión a eIF4E. Partiendo de la suposición de que la suma de las interacciones de las cuatro proteínas de unión de eIF4E debe aproximarse al perfil de unión de ARN para eIF4E como el guardián de la iniciación (y por lo tanto la traducción Figura 7A, B), podemos expresar esto matemáticamente a través de una combinación lineal simple de los cuatro perfiles (Figura 7C).

Un modelo estequiométrico para la encuadernación eIF4E destaca el CAF20 y EAP1 ARNm como valores atípicos significativos. (A) Diagrama que muestra la base teórica del modelo estequiométrico en el que las cuatro proteínas, eIF4G1, eIF4G2, Caf20p y Eap1p, se unen todas a la proteína de unión de la tapa eIF4E, que a su vez se une a los ARNm en un equilibrio complejo. Este modelo supone que el perfil de unión del ARNm de eIF4E se puede modelar mediante una combinación lineal de los otros perfiles de proteínas de circuito cerrado. (B) Mapas de calor de enriquecimiento de ARNm para cada una de las cuatro proteínas de unión de eIF4E, y un mapa de calor de enriquecimiento de ARNm predicho para eIF4E basado en un mejor ajuste del modelo a los datos de RIP-seq, que a su vez se puede comparar con el enriquecimiento de ARNm observado para eIF4E. Se observa una excelente correlación entre los perfiles de mapas de calor previstos y observados, con R 2 = 0,75. (C) Ecuación que detalla la afirmación de que el perfil de unión para eIF4E es igual a la suma de los perfiles observados para todas las proteínas de unión eIF4E, con los correspondientes coeficientes β que representan la contribución de cada perfil individual al modelo general (todos significativos PAG & lt 0,002). (D) Un gráfico que muestra los valores del modelo ajustado y los residuos correspondientes del modelo de regresión lineal. En particular, el CAF20 y EAP1 Los ARNm son valores atípicos significativos del modelo al trazar sus residuos de los valores de enriquecimiento de eIF4E predichos.

Aquí, los valores β son coeficientes que representan las contribuciones nominales de cada proteína de unión de eIF4E al perfil de unión de eIF4E, tomando el perfil de eIF4E como un proxy general para la iniciación dependiente de la tapa. Podemos estimar los valores de los coeficientes β en la ecuación anterior usando regresión lineal múltiple estándar para construir un modelo para el log2(cambios de pliegue (IP / Total)) para eIF4E construido a partir del registro2(cambios de veces (IP / Total)) de las otras cuatro proteínas. Esto produce un buen modelo con R 2 = 0,75. Los coeficientes β para los socios de unión de eIF4E equiparados al perfil de unión de ARNm de eIF4E de este modelo se muestran en la Figura 7C. Cada proteína hace una contribución muy significativa al modelo, con PAG-valores estimados por debajo de 0,002 en todos los casos. Los coeficientes β para eIF4G1 y eIF4G2 son grandes y positivos, mientras que el coeficiente de Caf20p es bajo y el de Eap1p es negativo. Estos reflejan ampliamente los valores de correlación GLM por pares entre eIF4E y las otras proteínas que se muestran en la Figura 3, y las similitudes en el mapa de calor en la Figura 4. Por ejemplo, los perfiles de unión de ARN de eIF4G1 y eIF4G2 están muy relacionados con los de eIF4E, mientras que los perfiles de unión de ARN de las 4EBP, Caf20p y Eap1p, están poco correlacionados con eIF4E. Queremos aclarar que los coeficientes β del modelo no se explican simplemente por la abundancia relativa de los componentes de circuito cerrado: tomando estimaciones de la abundancia relativa de proteínas del conjunto de datos proteómicos cuantitativos integrados de PaxDb [49], los niveles de las cuatro proteínas de levadura son: eIF4E = 1011 ppm, eIF4G1 = 444 ppm, eIF4G2 = 118 ppm, Caf20p = 306 ppm, Eap1p = 57 ppm. Un análisis como este se complica por el alto grado de colinealidad al comparar los perfiles de unión de ARNm de eIF4G1 con eIF4G2 o los de Caf20p con Eap1p. Esta colinealidad puede explicar el mayor coeficiente de eIF4G2 en relación con eIF4G1, aunque la abundancia de proteínas sugeriría que eIF4G1 debería desempeñar un papel más destacado. Sin embargo, tal colinealidad no puede explicar el coeficiente relativamente bajo de Caf20p y el coeficiente negativo de Eap1p. Es probable que los coeficientes bajos y negativos para Caf20p y Eap1p, respectivamente, sean indicativos de una red más compleja de interacciones con ARNm u otras proteínas de unión a ARN que no dependen de eIF4E y la estructura de la tapa del ARNm.

Con mucho, la observación más sorprendente del modelo se muestra en el gráfico de los residuos de la navaja contra los valores ajustados (Figura 7D). Esta es una gráfica de diagnóstico común en regresión lineal, donde los residuales estandarizados para transcripciones individuales deben centrarse en una media de 0 para un modelo bien descrito. Por lo tanto, como se puede ver en la Figura 7D, casi todos los datos se ajustan bien a este modelo. Sin embargo, los dos ARNm que se encuentran fuera de este modelo en mayor medida son los que codifican las 4E-BP, Caf20p y Eap1p. Esta observación sugiere fuertemente que dentro de los confines del complejo de bucle cerrado, el inicio de la traducción del CAF20 y EAP1 Los ARNm se encuentran fuera de este modelo y se regulan de manera diferente.

Caf20p interactúa preferentemente con su propia transcripción y la regula

La comparación estadística directa por pares entre los pull-downs de proteínas (Figura 3) también apunta a un comportamiento atípico de la CAF20 y EAP1 ARNm. Los perfiles de unión de ARNm de eIF4E y eIF4G1 están altamente correlacionados con solo un puñado de transcripciones enriquecidas preferentemente en la lista desplegable de eIF4E (Figura 3B). Sorprendentemente, sin embargo, entre las seis transcripciones enriquecidas estadísticamente se encuentran CAF20, EAP1 y TIF4632 ARNm, que codifican las 4E-BP Caf20p y Eap1p, y eIF4G2, respectivamente (Figura 8A). De manera similar, cuando se compararon los menús desplegables eIF4E y eIF4G2, observamos 24 transcripciones sobrerrepresentadas en el menú desplegable eIF4E en relación con el menú desplegable eIF4G2 (Figura 3B). Nuevamente ARNm para CAF20 y EAP1, y esta vez TIF4631, que codifican eIF4G1, se asociaron preferentemente con eIF4E (Figura 8A). Estos datos muestran que CAF20/EAP1 Los ARNm están enriquecidos con eIF4E pero no con eIF4G1.

Caf20p autorregula su propia transcripción. (A) Transcripciones sobrerrepresentadas en los menús desplegables de eIF4E en relación con eIF4G1 (azul claro) o eIF4G2 (rosa). Los datos se toman del modelo GLM presentado en la Figura 3B. (B) Una gráfica de superficie tridimensional de PAG-valores que detallan el nivel de significancia para el enriquecimiento de las transcripciones individuales de ciclo cerrado / eIF4E-BP en los seis experimentos de RIP-seq. (C) Una validación por RT-PCR semicuantitativa de la asociación de la proteína Caf20p con su propia transcripción utilizando cebadores diseñados para las regiones 1 a 6 que se muestran en la figura (detallada en el archivo adicional 6). El nivel de estas regiones del CAF20 La transcripción se determinó en muestras purificadas por afinidad TAP de la CAF20-TAP cepas relativas a las cepas de tipo salvaje (WT). (D) Un diagrama que muestra dos posibles modelos mediante los cuales Caf20p podría interactuar con su propia transcripción para regular la producción de proteínas. (MI) Purificación por afinidad de TAP y análisis de transferencia Western de cepas etiquetadas con eIF4E-TAP, investigando la asociación de eIF4E con proteína Caf20p endógena y Caf20p de tipo salvaje marcado con Flag o Caf20 m2 p marcado con Flag (que ha mutado la región de unión de eIF4E). (F) Validación de la especificidad de los cebadores de RT-PCR utilizando ARN total de las cepas representadas debajo del gráfico de barras para endógenos CAF20 transcripciones o etiquetados con bandera CAF20 transcripciones (archivo adicional 6). Las barras de error son ± error estándar de tres experimentos repetidos. (GRAMO) qRT-PCR para endógenos y etiquetados con Flag CAF20 transcripciones de una purificación por afinidad de eIF4E-TAP utilizando los cebadores validados anteriormente. los CAF20 o CAF20-fl las transcripciones se cuantifican en las muestras de IP en relación con el ARN total para las cepas enumeradas. Las barras de error son ± error estándar de tres experimentos repetidos. (H) Análisis de Western blot utilizando extractos de caf20 cepas de deleción transformadas con plásmidos centroméricos (copia baja) que llevan el tipo salvaje CAF20-fl gen o el mutante m2 de CAF20-fl. Se analizan tres transformantes individuales diferentes para cada cepa y se sondean las transferencias con anticuerpos anti-Flag para detectar Caf20-fl en relación con los anticuerpos anti-eIF4A de control.

Para explorar más a fondo la posibilidad de que los componentes proteicos del sistema de circuito cerrado estén involucrados en la regulación de los ARNm que codifican otros componentes del sistema, se realizó un análisis estadístico basado en la importancia de cualquier enriquecimiento para cada una de las transcripciones que codifican las seis proteínas inmunopurificadas en el RIP. Se llevaron a cabo experimentos -seq. Estos datos se presentan como un gráfico de superficie tridimensional en la Figura 8B, donde los picos (púrpura) denotan la importancia del enriquecimiento de la transcripción en IP específicos, mientras que los valles (azul) representan la importancia de cualquier representación insuficiente. Con mucho, las relaciones más llamativas en este gráfico están asociadas con la unión de Caf20p y eIF4E del CAF20 transcripción (Figura 8B). En efecto, CAF20 es, con mucho, la transcripción más sobrerrepresentada en la inmunoprecipitación de Caf20p con respecto al ARNm total del análisis EdgeR GLM, con un FDR & lt10 -30 corregido.

Sobre la base de los resultados anteriores, teorizamos que la interacción de Caf20p y eIF4E con el CAF20 la transcripción puede representar un mecanismo autorregulador (Figura 8D). Curiosamente, a este respecto, estudios previos han señalado una dificultad en la sobreexpresión genética de Caf20p: la expresión de todos los demás componentes del complejo de ciclo cerrado a partir de plásmidos de alta copia en levadura conduce a un aumento de dos a cinco veces en el nivel de proteína, mientras que los plásmidos de alta copia que llevan el CAF20 gene no genera tal sobreexpresión. Sin embargo, tal plásmido genera niveles de tipo salvaje de Caf20p en un caf20Δ cepa [52]. Para validar directamente la observación de que Caf20p interactúa con su propia transcripción, se realizaron purificaciones por afinidad de TAP en cepas de tipo salvaje y Caf20p-TAP y los ARN asociados se fragmentaron mediante tratamiento con ARNasa III. Se realizó un ensayo de RT-PCR semicuantitativo en estas muestras para evaluar la eficiencia del enriquecimiento de seis regiones diferentes del CAF20 transcripción (Figura 8C). Los productos de RT-PCR se identificaron en todo el CAF20 ARNm en las muestras inmunoprecipitadas, mientras que no se encontraron productos en muestras de cepas con CAF20. Se observó un enriquecimiento particular para los pares de cebadores que cubren el extremo 3 'del marco de lectura abierto (Figura 8C). Por lo tanto, mediante el uso de un ensayo independiente, estos datos confirman que Caf20p puede interactuar con el CAF20 ARNm.

Aunque los datos anteriores destacan la posibilidad de que Caf20p autorregula la traducción de su propia transcripción, también es posible que Caf20p naciente parcialmente traducido interaccione a través de su dominio de unión eIF4E amino-terminal con eIF4E unido al CAF20 Cap de ARNm 5 '(Figura 8D). Esto podría explicar el enriquecimiento de la CAF20 ARNm con eIF4E y Caf20p. Estas interacciones co-traduccionales de complejos proteína-proteína se han descrito previamente y pueden explicar el co-enriquecimiento de ARNm que codifican una subunidad específica con otras subunidades proteicas del mismo complejo [53].

Para explorar más esta posibilidad, probamos si el enriquecimiento de CAF20 El ARNm con eIF4E depende de la asociación de la proteína Caf20p con eIF4E. Usamos una estrategia en la que Caf20p etiquetado con bandera o Caf20 m2 p etiquetado con bandera (donde la región de Caf20p que interactúa con eIF4E se ha interrumpido a través de dos mutaciones sin sentido) se expresaron a partir de plásmidos en una cepa eIF4E-TAP que ya albergaba el tipo salvaje genómico endógeno CAF20 alelo. Esto coloca al ARNm marcado con Flag en competencia con el endógeno. CAF20 mRNA y permite analizar el impacto de la mutación de unión de eIF4E sobre esta competición. Como control para el sistema, la transferencia Western de eIF4E purificado por afinidad TAP capturó tanto el Caf20p endógeno como el Caf20p etiquetado con Flag (Figura 8E), mientras que cuando la proteína mutante Flag-Caf20 m2 p se puso en competencia con Caf20p endógeno, eIF4E solo interactuó con la proteína endógena (Figura 8E), lo que confirma que las mutaciones m2 interrumpen la unión de eIF4E [52].

qRT-PCR se utilizó para distinguir los endógenos CAF20 ARNm de la etiqueta Flag-tagged CAF20 ARNm. Las reacciones de qRT-PCR de control de muestras de ARN total demostraron especificidad de pares de cebadores (Figura 8F). En una cepa de tipo salvaje, solo las endógenas CAF20 Se detectó ARNm, mientras que solo se identificó la forma etiquetada del ARNm en una cepa que lleva solo la etiqueta etiquetada con Flag CAF20 gencaf20Δ Bandera-CAF20 Figura 8F). Finalmente, en las cepas que llevan tanto el endógeno CAF20 y etiquetado con bandera CAF20 genes, se detectaron ambos ARNm (Figura 8F). Por lo tanto, usamos este sistema para medir el nivel tanto de la etiqueta de bandera como de la endógena. CAF20 Se detectaron ARNm con eIF4E inmunoprecipitado y ambos ARNm en inmunoprecipitaciones de eIF4E. Críticamente, la bandera etiquetada CAF20 ARNm asociado con eIF4E independientemente de si el producto proteico de este ARNm podría interactuar con eIF4E (compare los resultados para las cepas que llevan pCAF20-Fl versus pCAF20 m2 -Florida Figura 8G). Por lo tanto, la interacción de eIF4E con el CAF20 El ARNm no depende de la capacidad de la proteína Caf20p para interactuar con eIF4E. A partir de estos datos, postulamos que es muy poco probable que la razón principal del enriquecimiento selectivo de CAF20 El ARNm con eIF4E o la proteína Caf20p es la "interacción cotraduccional" de Caf20p naciente a través de su dominio de unión eIF4E amino-terminal. En cambio, favorecemos el modelo en el que la proteína Caf20p madura enriquece selectivamente el CAF20 ARNm presumiblemente a través de interacciones Caf20p con otras proteínas de unión de ARN, así como su interacción con eIF4E (Figura 8D). De hecho, se ha demostrado previamente que Caf20p tiene interacciones con las proteínas de unión al ARN Puf4p y Puf5p [40].

Una predicción del modelo de autorregulación de Caf20p es que en las cepas donde el mutante de unión a eIF4E (Caf20 m2) es la única fuente de Caf20p, la autorregulación sufrirá un cortocircuito y Caf20p se acumulará a niveles más altos que en las cepas silvestres. -tipo Caf20p. De hecho, en la Figura 8H se encuentra que esta predicción es correcta: en caf20Δ mutantes que llevan la pCAF20 m2 -Florida plásmido, Caf20p se acumula a niveles 7,05 (± 1,25) veces más altos que en el mutante que lleva el plásmido de tipo salvaje. Tomados colectivamente, estos datos destacan un circuito autorregulador que controla la expresión de Caf20p en un bucle de retroalimentación negativa, donde se aplica un freno autolimitante para modular la expresión de un represor de traducción celular general.


12.3 Otros mecanismos de evolución

Las cuatro fuerzas evolutivas más importantes que cambiarán una población de organismos con el tiempo son la selección natural, la mutación, la deriva genética y la migración o el flujo de genes hacia o desde una población. La selección natural se describe en detalle en la sección anterior. Esta sección cubrirá el resto de los mecanismos de evolución.

12.3.1 Mutación: la fuente de toda nueva variación

La mutación es un cambio en una secuencia de ADN. Puede ser una pequeña alteración, como un cambio de un solo par de bases, a través de cambios más extensos como la adición o supresión de un par de bases, aunque grandes alteraciones a nivel cromosómico. Incluso los cambios pequeños pueden generar grandes diferencias en la proteína que codifica el ADN, como se vio anteriormente en el ejemplo de la anemia de células falciformes.

La mutación transforma un alelo en un alelo nuevo. Ese nuevo alelo tiene una frecuencia muy pequeña durante la primera generación. Durante varias generaciones, su frecuencia aumentará lentamente en una población si ninguna otra fuerza evolutiva actúa sobre el alelo. Si la selección natural actúa contra el alelo, será eliminado de la población. Ésta es una de las razones por las que las enfermedades genéticas permanecen en la población humana con una frecuencia muy baja. Si el alelo se ve favorecido por la selección, aumentará su frecuencia. Si la mutación es neutral & # 8211 ni aumenta ni disminuye la capacidad reproductiva & # 8211, su frecuencia permanecerá estática en una población durante generaciones.

12.3.2. Flujo / migración de genes

Si dos poblaciones de una especie tienen diferentes frecuencias alélicas, la migración de individuos de una población a otra provocará cambios de frecuencia en ambas poblaciones. La nueva población tendrá un aumento en ciertos alelos mientras que la población anterior experimentará una disminución en ciertos alelos (Figura 12.23).

Figura 12.23 En este ejemplo, un insecto marrón migra de una población a la siguiente. La frecuencia alélica para el color marrón aumentó en la población de la izquierda. Crédito: & # 8220 Archivo: Gene flow.jpg & # 8221 de Tsaneda tiene licencia CC BY 3.0

Después de migrar, los nuevos individuos se aparean con los individuos locales y los nuevos alelos pasan a formar parte del acervo genético de la población.

Si bien algunas poblaciones son bastante estables, otras experimentan más cambios. Algunos animales no viajan mucho durante su vida, mientras que algunas especies son altamente migratorias y el flujo de genes es muy común. Las especies de plantas pueden parecer muy fijas en su ubicación, pero también experimentan el flujo de genes. Muchas plantas pueden enviar sus semillas por todas partes por el viento o en las entrañas de los animales que las han comido y luego depositarlas en un lugar diferente cuando defecan. Estas semillas que viajan ampliamente pueden introducir alelos comunes en la población de origen a una nueva población en la que son raros.

12.3.3 Deriva genética

Otra forma en que pueden cambiar las frecuencias alélicas de una población es la deriva genética (figura 11.7), que es simplemente el efecto del azar. La deriva genética es más importante en poblaciones pequeñas. La deriva estaría completamente ausente en una población con infinitos individuos, pero, por supuesto, ninguna población es tan grande. La deriva genética se produce porque los alelos de una generación descendiente son una muestra aleatoria de los alelos de la generación parental. Los alelos pueden o no pasar a la próxima generación debido a eventos casuales que incluyen la mortalidad de un individuo, eventos que afectan la búsqueda de pareja e incluso los eventos que afectan qué gametos terminan en fertilizaciones. Si un individuo en una población de diez individuos muere antes de dejar descendencia a la siguiente generación, todos sus genes, una décima parte del acervo genético de la población, se perderán repentinamente. En una población de 100, ese individuo representa solo el 1 por ciento del acervo genético general, por lo tanto, tiene un impacto mucho menor en la estructura genética de la población y es poco probable que elimine todas las copias, incluso de un alelo relativamente raro.

Imagine una población de diez individuos, la mitad con el alelo A y la otra mitad con el alelo a (los individuos son haploides). En una población estable, la próxima generación también tendrá diez individuos. Elija esa generación al azar lanzando una moneda diez veces y deje que la cara sea A y la cruz sea a. Es poco probable que la próxima generación tenga exactamente la mitad de cada alelo. Puede haber seis de uno y cuatro del otro, o algún conjunto diferente de frecuencias. Por lo tanto, las frecuencias alélicas han cambiado y se ha producido una evolución. Una moneda ya no funcionará para elegir la próxima generación (porque las probabilidades ya no son la mitad para cada alelo). La frecuencia en cada generación se desplazará hacia arriba y hacia abajo en lo que se conoce como una caminata aleatoria hasta que en un punto se eligen todos los A o todos los a y ese alelo se fija a partir de ese punto. Esto podría llevar mucho tiempo para una gran población. Esta simplificación no es muy biológica, pero se puede demostrar que las poblaciones reales se comportan de esta forma. El efecto de la deriva en las frecuencias es mayor cuanto menor es la población. Su efecto también es mayor en un alelo con una frecuencia lejos de la mitad. La deriva influirá en todos los alelos, incluso en los que se seleccionan naturalmente.

La deriva genética también se puede magnificar por eventos naturales o causados ​​por el hombre, como un desastre que mata al azar a una gran parte de la población, lo que se conoce como el efecto de cuello de botella que da como resultado que una gran parte del genoma sea aniquilada repentinamente (Figura 11,8). De una sola vez, la estructura genética de los supervivientes se convierte en la estructura genética de toda la población, que puede ser muy diferente de la población anterior al desastre. El desastre debe ser uno que mata por razones no relacionadas con las características del organismo, como un huracán o un flujo de lava. Es probable que una matanza masiva causada por temperaturas inusualmente frías durante la noche afecte a los individuos de manera diferente dependiendo de los alelos que posean y que les confieren resistencia al frío.

Otro escenario en el que las poblaciones pueden experimentar una fuerte influencia de la deriva genética es si una parte de la población se va para comenzar una nueva población en una nueva ubicación, o si una población se divide por una barrera física de algún tipo. En esta situación, es poco probable que esos individuos sean representativos de toda la población, lo que da como resultado el efecto fundador. El efecto fundador ocurre cuando la estructura genética coincide con la de los padres y madres fundadores de la nueva población. Se cree que el efecto fundador fue un factor clave en la historia genética de la población afrikaner de colonos holandeses en Sudáfrica, como lo demuestran las mutaciones que son comunes en los afrikaners pero raras en la mayoría de las otras poblaciones. Es probable que esto se deba a que una proporción mayor de lo normal de los colonos fundadores, que eran una pequeña muestra de la población original, portaban estas mutaciones. Como resultado, la población expresa una incidencia inusualmente alta de enfermedad de Huntington (EH) y anemia de Fanconi (FA), un trastorno genético conocido por causar anomalías congénitas y de la médula ósea e incluso cáncer.


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