Información

Una pregunta sobre el adn triplex

Una pregunta sobre el adn triplex


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Se han identificado cadenas triples de ADN cortas en varios órganos. Pero, ¿la inyección de una sola hebra de ADN o ARN (con sus bases complementarias a las bases del ADN que se encuentran en el surco principal de un determinado gen) provocaría que se formara una triple hélice de ADN en ese gen?


Posiblemente sí, pero hay complicaciones.

Existen otras condiciones que ayudan a crear las condiciones energéticamente favorables para que las bases se unan de manera que formen un tríplex, incluida la acidez y la presencia de iones de magnesio.

La región de ADN donde se encuentra su gen de interés (o sus regiones reguladoras, dependiendo de lo que esté tratando de hacer) también debería descomprimirse. El ADN generalmente se empaqueta en cromatina. Los complejos de histonas, que envuelven el ADN, proporcionan cierta protección al surco principal. Para hacer un triplex, necesitaría condiciones bioquímicas que desenvuelvan las histonas y apoyen la formación de triplex, en general.

El uso de ARN, específicamente, podría ser complicado si se procesa o podría procesarse en un elemento corto o microARN, que podría consumirse para regular a la baja la población de moléculas de ARNm (que, a su vez, en última instancia, regula la expresión génica). No es útil si se agota antes de unirse a su triplex de interés.

Existe cierto interés farmacéutico en los TFO (oligonucleótidos formadores de triplex) como mecanismo de administración de fármacos.

Si algún gen está roto e implicado en una enfermedad genética, digamos, y su ADN o las regiones reguladoras cercanas pueden hacerse accesibles, tal vez se pueda administrar un TFO que ayude a aumentar o disminuir la expresión del producto proteico de ese gen.

Los artículos sobre las OFT probablemente podrían indicarle otros problemas de ingeniería que los investigadores han encontrado y deberían superar para crear una medicina eficaz.


Nanosensores ensamblados de ADN triplex y cuádruplex para correlacionar el K + y el pH en los lisosomas

Sigue siendo una pregunta sin respuesta si el flujo de K + y H + en los lisosomas está correlacionado debido a las dificultades para obtener imágenes simultáneas de estos dos iones. Esta pregunta es de gran valor para comprender la acidificación lisosomal. En este documento, diseñamos nanosensores luminiscentes basados ​​en ADN cuádruple y triplex que pueden, respectivamente, monitorear el K + y el pH en la luz lisosomal. Cada sensor contenía un luminóforo de nanopartículas de conversión ascendente y un extintor de nanopartículas de oro, que producían señales de luminiscencia verde y azul para K + y H +, respectivamente. Los sensores se probaron en tampones que mostraban rangos dinámicos de K + de 5 a 200 mM y pH de 5,0 a 8,2. La co-imagen usando estos dos sensores en las células indicó que la entrada de H + fue acompañada con la salida de K +, resolviendo esta cuestión de larga data de la bioquímica lisosomal.

Como servicio a nuestros autores y lectores, esta revista proporciona información de apoyo proporcionada por los autores. Dichos materiales son revisados ​​por pares y se pueden reorganizar para su entrega en línea, pero no se editan ni se componen. Los problemas de soporte técnico que surjan de la información de respaldo (que no sean archivos faltantes) deben dirigirse a los autores.

Nombre del archivo Descripción
anie202013302-sup-0001-misc_information.pdf 3,5 MB Suplementario

Tenga en cuenta: El editor no es responsable del contenido o la funcionalidad de la información de apoyo proporcionada por los autores. Cualquier consulta (que no sea contenido faltante) debe dirigirse al autor correspondiente del artículo.


Nanosensores ensamblados de ADN triplex y cuádruplex para correlacionar el K + y el pH en los lisosomas

Los nanosensores cuádruplex y triplex de ADN están diseñados para monitorear simultáneamente el K + y el pH mediante el ensamblaje de luminóforos de nanopartículas de conversión ascendente y extintores de nanopartículas de oro. La entrega conjunta de los dos sensores con estimulación de ATP indica que la acidificación lisosomal está acompañada de la salida de K +.

Abstracto

Sigue siendo una pregunta sin respuesta si el flujo de K + y H + en los lisosomas está correlacionado debido a las dificultades para obtener imágenes simultáneas de estos dos iones. Esta pregunta es de gran valor para comprender la acidificación lisosomal. En este documento, diseñamos nanosensores luminiscentes basados ​​en ADN cuádruple y triplex que pueden, respectivamente, monitorear el K + y el pH en la luz lisosomal. Cada sensor contenía un luminóforo de nanopartículas de conversión ascendente y un extintor de nanopartículas de oro, que producían señales de luminiscencia verde y azul para K + y H +, respectivamente. Los sensores se probaron en tampones que mostraban rangos dinámicos de K + de 5 a 200 mM y pH de 5,0 a 8,2. La co-imagen usando estos dos sensores en las células indicó que la entrada de H + fue acompañada con la salida de K +, resolviendo esta cuestión de larga data de la bioquímica lisosomal.


Aunque nuestro ADN es similar, los humanos se ven muy diferentes entre sí. Pero los rasgos que usamos para adivinar la raza de alguien no siempre funcionan bien. Piense en el color de la piel. No hay solo unos pocos colores: hay más tonos de los que puedas contar. Los rasgos que usamos también son independientes entre sí. Por ejemplo, ser alto no significa que también tendrás el pelo oscuro. Independientemente de los rasgos que usemos, no existe una buena manera de agrupar a los humanos mediante la apariencia o el ADN.

En cambio, todos agrupan a las personas en razas según los rasgos que creen que son más importantes. La forma en que clasificamos a las personas en razas también cambia con el tiempo. Piense en las personas que conoce que son irlandesas o italianas. Hoy podríamos clasificarlos como blancos, como mucha gente de Europa. Pero hace 100 años, no se los consideraba de la misma raza que los estadounidenses de origen europeo. A los humanos les encanta organizar las cosas en grupos. Pero cuando se trata de raza, estos grupos nos dicen más sobre nuestra cultura que sobre nuestra biología.


MATERIALES Y MÉTODOS

Simulaciones de dinámica molecular (MD)

Se simuló un dúplex de ADN de 30 meros solo y en complejo con una tercera hebra de ADN de 10 meros en solución acuosa con y sin restricción de torsión helicoidal. Para imponer una restricción de torsión helicoidal, el dúplex de ADN se ha tratado como un polímero continuo. Lo que significa que la hélice de ADN se extiende desde un extremo del volumen de simulación hasta el extremo opuesto, donde continúa a través de la conectividad de enlace normal (25). Etiquetamos el sistema con restricción de giro helicoidal, continuo hélice, y la de fuera, aislado hélice.

Todas las simulaciones de MD se realizaron utilizando el conjunto de programas GROMACS (versión 4.5) (26, 27). Se empleó el campo de fuerza CHARMM27 (28, 29) para describir las estructuras del ADN y los iones de sodio. Los sistemas de ADN se colocaron en una caja cúbica de 12 nm. Se utilizó una caja rectangular de 9 nm de altura para continuo Sistemas de ADN. Posteriormente, las cajas se llenaron con moléculas de agua TIP3P (30). Para neutralizar el sistema, se colocaron iones de sodio al azar en la caja de simulación.

Se empleó el método de Ewald de malla de partículas (31) para tratar las interacciones de Coulomb utilizando una distancia de conmutación de 1,0 nm y una cuadrícula de 0,12 nm. Las interacciones de Lennard-Jones se desactivaron entre 1.0 y 1.2 nm. Presión constante pag y temperatura T se mantuvieron acoplando débilmente el sistema a un baño externo a 1 bar y 300 K, utilizando el barostato Berendsen (32) y el termostato de reajuste de velocidad (33), respectivamente. El sistema se acopló al baño de temperatura con un tiempo de acoplamiento de 0,1 ps. El tiempo de acoplamiento de la presión fue de 1,0 ps y la compresibilidad isotérmica de 4,5 · 10 −5 bar −1. Se aplicó un acoplamiento de presión semi-isotrópico en el caso del continuo Sistema de ADN (que es isotrópico en el X y y direcciones, pero no en el z dirección).

Las distancias de enlace y los ángulos del agua se restringieron mediante el algoritmo SETTLE (34). Otras distancias de enlace se restringieron mediante el algoritmo LINCS (35). Se utilizó un integrador de salto de rana con un paso de tiempo de integración de 2 fs.

Las estructuras de partida de ADN de 5′AACTGCTAAA-GAGGGAGGGA-CTTGATGTAT 3 ′ y 5′AGGGAGGAG 3 ′ de 30 mer se generaron en la forma B como una hebra doble y una hebra sencilla, respectivamente, utilizando el paquete de software 3DNA (23) . Para generar la estructura inicial de la triplex de ADN, se realizaron simulaciones MD de 10 ns utilizando restricciones de distancia entre los átomos donantes y aceptores del enlace de hidrógeno del lado Watson-Crick de la purina 30-mer y el lado Hoogsteen inverso de la tercera hebra. Después de un equilibrio de 10 ns, se realizaron 50 ns de simulación MD para cada sistema.

Análisis estructural

Para evitar una posible clasificación errónea de las conformaciones de ADN como se menciona en la introducción, analizamos los pasos de doble hélice de ADN en nuestras trayectorias MD utilizando el software 3DNA (23, 36) y su conjunto de rubí scripts llamados x3dna_ensemble. Los gráficos y el análisis estadístico se produjeron utilizando escrituras caseras escritas en R ( 37).

Los parámetros del par de bases para los pasos de Watson-Crick y los pasos de Hoogsteen se determinaron para cada par de bases y se promediaron en el tiempo. Por conveniencia, la hélice de ADN se dividió en tres regiones: primer dúplex, homopurina y segundo dúplex. Los parámetros de paso promedio para cada región se obtuvieron promediando los valores promediados en el tiempo del par de bases. El error estándar de la media se calculó utilizando el promedio de bloques (38).

Para una interpretación rápida y detallada del espacio conformacional de los pasos del par de bases, exploramos los parámetros helicoidales locales Inclinación versus X-desplazamiento, los parámetros del paso base Roll versus Slide (39) y el eje local entre cadenas de fósforo a proyecciones de vector de fósforo | $ z $ | pag(h) versus | $ z $ | pag para cada paso en los ADN simulados. Diapositiva (Dx) puede discriminar entre las conformaciones de ADN B y ADN A ya que sus valores medios están muy espaciados, mientras que Roll (ρ) puede discriminar el ADN A y el ADN B aparte del ADN TA pero no entre ellos (40). Se ha demostrado que la proyección del vector fósforo a fósforo en el | $ z $ | -eje del marco de referencia del eje helicoidal local | $ z $ | pag(h), discrimina eficazmente entre las conformaciones de ADN B y ADN TA (41), y que la proyección correspondiente en el marco de referencia del paso intermedio | $ z $ | pag diferencia entre las conformaciones de ADN A y ADN B (42).

Para analizar las características globales, los anchos de surcos mayores y menores se calculan como distancias entre fósforo y fósforo entre cadenas (43). Estos valores pueden correlacionarse con las características locales descritas por los parámetros de paso del par de bases. Además, presentamos superposiciones de pasos de pares de bases endocíclicas y exocíclicas que se correlacionan con geometrías e interacciones de apilamiento de bases de ADN (23, 39).

Para cuantificar el efecto de la tercera hebra sobre la estructura helicoidal, se calculan los ángulos entre los centros de masa de los pares de bases de Watson-Crick. En particular, hemos calculado los ángulos entre el par de bases intermedias (posición 15 en el ADN de 30 meros) y los pares de bases vecinos equidistantes.

Para comparar las fluctuaciones conformacionales de la estructura helicoidal en presencia y ausencia de TFO, hemos realizado un análisis de componentes principales (PCA) (44-46) de las trayectorias fusionadas de ADN de doble hebra. Se consideran todos los átomos. Antes de realizar el análisis, cada conjunto de coordenadas en la trayectoria se traslada y gira para dar el mejor ajuste al marco helicoidal central (entre los pares de bases 11 y 20) de la estructura de referencia dúplex. Los primeros cuatro (de 5715 en total) autovectores describen el 86% de las fluctuaciones totales.

Potencial de fuerza media (PMF)

Para modelar el cambio de base, el PMF se calculó utilizando un muestreo general con un sesgo de potencial armónico | $ w $ | I = k(XXI) 2/2 a lo largo de una coordenada de reacción X, definido como un ángulo pseudo-diedro entre el centro de masa de la base de volteo, del azúcar correspondiente, del primer azúcar vecino y del primer par de bases vecinas. Esta coordenada de reacción se ha utilizado ampliamente para estudiar el cambio de bases en el ADN y el ARN (47–49) (para una definición detallada, consulte (47)). Los cálculos de PMF se realizaron utilizando el conjunto de programas GROMACS (versión 4.5) utilizando restricciones diedras, que funcionan en el centro de masa a través de sitios de interacción virtual.

Los PMF de cambio de base se obtuvieron realizando 72 ventanas de simulación independientes variando el ángulo pseudo-diedro de referencia XI, de -180 ° a 180 ° en intervalos de 5 °. Las conformaciones iniciales para cada ventana se generaron ejecutando 5 ps cada una a lo largo de la coordenada de reacción con k = 20000 kcal / (mol rad 2). En la fase de producción, cada ventana se ejecutó durante 5 ns (de los cuales los últimos 4 ns se utilizaron para el análisis) con k = 2000 kcal / (mol rad 2). Se utilizó la restricción diedro, que trabaja en el centro de masa a través de sitios de interacción virtual. Los valores del ángulo pseudo-diedro se registraron en cada paso. Las curvas de PMF se generaron a partir de las distribuciones de distancia resultantes utilizando el Método de análisis de histograma ponderado (50, 51) con una tolerancia de 10-6, 720 bins y aplicando la periodicidad de la coordenada de reacción. Las barras de error se obtuvieron dividiendo la recopilación de datos en cada ventana en cuatro partes y calculando su desviación estándar.

Los cambios de energía libre en la apertura del par de bases se calcularon mediante la integración de la función de distribución de probabilidad (obtenida de la curva PMF) sobre los estados cerrado y abierto para A y T volteando. Para definir los estados abierto y cerrado para el par de bases, calculamos el área superficial accesible al solvente del átomo de H3 en pirimidina y N1 en purina. El área superficial accesible al solvente atómico se calculó numéricamente (52) estableciendo la sonda de solvente en un radio de 0.14 nm para carbono, 0.13 nm para oxígeno y fósforo y 0.10 nm para hidrógeno. Un par de bases cerrado se define como un átomo de superficie accesible al disolvente de menos de 0,001 nm 2.

Las barreras de energía para el cambio de base se definieron por la diferencia entre los valores mínimo y máximo de la curva PMF.


Reacción en cadena de la polimerasa: técnicas y variaciones

Lea este artículo para conocer las técnicas y variaciones de la reacción en cadena de la polimerasa con diagrama.

Reacción en cadena de la polimerasa :

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio (in vitro) para generar grandes cantidades de un ADN específico.

Obviamente, la PCR es una técnica de amplificación sin células para sintetizar múltiples copias idénticas (miles de millones) de cualquier DMA de interés. Desarrollada en 1984 por Karry Mullis, la PCR se considera ahora una herramienta básica para el biólogo molecular. Así como una fotocopiadora es un requisito básico en una oficina, ¡también lo es la máquina de PCR en un laboratorio de biología molecular!

Principio de PCR:

El ADN de doble hebra de interés se desnaturaliza para separarlo en dos hebras individuales. A continuación, se deja que cada hebra se hibride con un cebador (renaturalización). El dúplex cebador-molde se utiliza para la síntesis de ADN (la enzima-ADN polimerasa). Estos tres pasos: desnaturalización, renaturalización y síntesis se repiten una y otra vez para generar múltiples formas de ADN diana.

Técnica de PCR:

Los requisitos esenciales para la PCR se enumeran a continuación:

1. Un ADN diana (100-35.000 pb de longitud).

2. Dos cebadores (oligonucleótidos sintéticos de 17-30 nucleótidos de longitud) que son complementarios a las regiones que flanquean el ADN diana.

3. Cuatro desoxirribonucleótidos (dATP, dCTP, dCTP, dTTP).

4. Una ADN polimerasa que puede soportar una temperatura de hasta 95 ° C (es decir, termoestable).

La mezcla de reacción contiene el ADN diana, dos cebadores (en exceso), una ADN polimerasa termoestable (aislada de la bacteria Thermus aquaticus (es decir, la ADN polimerasa Taq) y cuatro desoxirribonucleótidos. La técnica real de la PCR implica ciclos repetidos para la amplificación de ADN objetivo.

Cada ciclo tiene tres etapas:

Al elevar la temperatura a aproximadamente 95 ° C durante aproximadamente un minuto, el ADN se desnaturaliza y las dos hebras se separan.

2. Renaturalización o recocido:

A medida que la temperatura de la mezcla se enfría lentamente a aproximadamente 55 ° C, las bases de los cebadores se emparejan con las regiones complementarias que flanquean las cadenas de ADN diana. Este proceso se llama renaturalización o recocido. La alta concentración de cebador asegura el apareamiento entre cada hebra de ADN y el cebador en lugar de las dos hebras de ADN.

El inicio de la síntesis de ADN se produce en el extremo 3 & # 8242-hidroxilo de cada cebador. Los cebadores se extienden uniendo las bases complementarias a las cadenas de ADN. El proceso de síntesis en la PCR es bastante comparable a la replicación del ADN de la cadena principal.

Sin embargo, la temperatura debe mantenerse óptima según lo requiera la enzima ADN polimerasa. Para la ADN polimerasa Taq, la temperatura óptima es de alrededor de 75 ° C (para la ADN polimerasa de E. coli, es de alrededor de 37 ° C). La reacción se puede detener elevando la temperatura (hasta aproximadamente 95 ° C).

Las 3 etapas de la PCR en relación con la temperatura y el tiempo se muestran en la Fig. 8.1. Cada ciclo de PCR dura entre 3 y 5 minutos. En la práctica habitual, la PCR se realiza en una máquina automatizada.

Como es evidente en la Fig. 8.2 (ciclo I), la nueva cadena de ADN unida a cada cebador está más allá de la secuencia que es complementaria al segundo cebador. Estas nuevas hebras se denominan plantillas largas y se utilizarán en el segundo ciclo.

Para el segundo ciclo de PCR, las cadenas de ADN (original + plantilla larga recién sintetizada) se desnaturalizan, se hibridan con cebadores y se someten a síntesis de ADN. Al final de la segunda ronda, se forman moldes largos y moldes cortos (hebras de ADN con secuencia de cebador en un extremo y secuencia complementaria al cebador del otro extremo).

En el tercer ciclo de la PCR, las cadenas de ADN originales junto con las plantillas largas y cortas son los materiales de partida. Se repite la técnica de desnaturalización, renaturalización y síntesis. Este procedimiento se repite una y otra vez para cada ciclo. Se estima que al final del ciclo 32 de la PCR, se sintetiza aproximadamente un millón de veces el ADN diana (tabla 8.1). Se acumulan las plantillas cortas que poseen precisamente el ADN diana como moléculas bicatenarias.

Fuentes de ADN polimerasa:

En la técnica original de PCR, se utilizó el fragmento Klenow de la ADN polimerasa de E. coli. Esta enzima se desnaturaliza a una temperatura más alta, por lo tanto, se tuvo que agregar una nueva enzima para cada ciclo. Se produjo un gran avance con la introducción de la ADN polimerasa Taq de la bacteria termófila Thermus aquaticus. La ADN polimerasa Taq es resistente al calor, por lo que no es necesario agregar nuevamente esta enzima para cada ciclo de PCR.

Factores clave para una PCR óptima:

Los cebadores juegan un papel importante en la determinación de la PCR. Los cebadores (17-30 nucleótidos) sin estructura secundaria y sin complementariedad entre sí son ideales. Los cebadores complementarios pueden hibridar para formar un dímero de cebadores y amplificarse en PCR. Esto evita la multiplicación del ADN diana.

Como ya se ha descrito, se prefiere la ADN polimerasa Taq ya que puede soportar altas temperaturas. En el protocolo de inicio en caliente, la ADN polimerasa se agrega después del paso de desnaturalización por calor del primer ciclo. Esto evita la extensión de los cebadores que no coinciden que suelen ocurrir a baja temperatura.

La polimerasa Taq carece de actividad de exonucleasa de lectura de pruebas (3 & # 8242-5 & # 8242) que podría contribuir a errores en los productos de la PCR.Se han identificado algunas otras ADN polimerasas termoestables con actividad de corrección de pruebas, por ejemplo, ADN polimerasa Tma de Thermotoga maritama Pfu ADN polimerasa de Pyrococcus furiosus.

En general, cuanto más corta sea la secuencia de ADN diana, mejor será la eficacia de la PCR. Sin embargo, en los últimos años se ha informado de la amplificación de fragmentos de ADN de hasta 10 kb. La secuencia del ADN diana también es importante en la PCR. Por tanto, las regiones ricas en CC de la cadena de ADN dificultan la PCR.

Promotores e inhibidores:

La adición de proteínas como la albúmina de suero bovino (BSA) mejora la PCR al proteger la enzima ADN polimerasa. Los ácidos húmicos, que se encuentran con frecuencia en muestras arqueológicas de ADN diana, inhiben la PCR.

Variaciones de PCR:

Se ha descrito la técnica básica de la PCR. Al ser una técnica versátil, la PCR se modifica según las demandas específicas de la situación. Por tanto, existen muchas variaciones en la PCR original, algunas de las cuales se comentan a continuación.

PCR anidado:

Se observan con mucha frecuencia similitudes de secuencia entre el ADN diana y el ADN relacionado. Como resultado de esto, los cebadores pueden unirse a ambos ADN y, por lo tanto, incluso el ADN no deseado también se amplifica en la PCR. El uso de cebadores anidados aumenta la especificidad de la PCR y amplifica selectivamente el ADN diana. La PCR anidada se ilustra en la figura 8.3. En el primer ciclo de PCR, los productos son tanto del ADN diana como del ADN no deseado. Ahora se usa un segundo conjunto de cebadores internos. Se unirán selectivamente al ADN diana y procederá la amplificación.

PCR inversa:

En la PCR inversa, la amplificación del ADN de las secuencias desconocidas se lleva a cabo a partir de la secuencia conocida (Fig. 8.4). El ADN diana se escinde con una endonucleasa de restricción que no corta la secuencia conocida sino que corta la secuencia desconocida en ambos lados. Los fragmentos de ADN así formados se invierten y se circularizan (se emplea ADN ligasa como agente sellante).

El círculo que contiene las secuencias conocidas se corta ahora con otra enzima de restricción. Esto escinde solo la secuencia conocida. El ADN diana así formado contiene la secuencia conocida en ambos extremos con el ADN diana en el medio. Ahora puede llevarse a cabo la amplificación por PCR. Cabe señalar que los cebadores se generan en la dirección opuesta a la normal, ya que la secuencia original se invierte durante la circularización.

PCR anclado:

En la PCR anclada, se puede unir (etiquetar) una pequeña secuencia de nucleótidos al ADN diana, es decir, el ADN está anclado. Esto es particularmente útil cuando se desconoce la secuencia que rodea al ADN diana. El ancla es frecuentemente una cola de poli G en la que se usa una imprimación de poli C. El anclaje también se puede realizar mediante el uso de adaptadores. Como los adaptadores poseen una secuencia conocida, se puede elegir el cebador.

PCR de transcripción inversa:

La técnica de PCR también se puede emplear para la amplificación de moléculas de ARN, en cuyo caso se denomina transcripción inversa - PCR (RT-PCR). Para ello, la molécula de ARN (ARNm) debe convertirse primero en ADN complementario (ADNc) mediante la enzima transcriptasa inversa. El cDNA luego sirve como molde para la PCR. Pueden emplearse diferentes cebadores para la síntesis de la primera hebra de ADNc. Estos incluyen el uso de cebadores aleatorios, cebador oligo dT y un cebador específico de secuencia (Fig. 8.5).

PCR asimétrica:

La técnica de PCR también se puede utilizar para la síntesis de moléculas de ADN monocatenarias, particularmente útil para la secuenciación de ADN. En la PCR asimétrica, se utilizan dos cebadores en una proporción de 100: 1. Después de 20-25 ciclos de PCR, se agota un cebador. El resultado es que en los siguientes 5-10 ciclos de PCR, solo se generan ADN monocatenarios.

PCR cuantitativa en tiempo real:

La cuantificación de los productos de la PCR en diferentes ciclos no es tan simple como lo proyectan las consideraciones teóricas (Tabla 8.1). En la práctica, ocurren grandes variaciones. La técnica más comúnmente utilizada para medir la cantidad de PCR es empleando un compuesto de fluorescencia como el bromuro de eitidio.

El principio es que las moléculas de ADN de doble hebra se unen al bromuro de etidio, que emiten una fluorescencia que puede detectarse y cuantificarse el ADN. La síntesis de genes por PCR y el papel de la PCR en la mutagénesis dirigida al sitio se describen en otra parte.

ADN polimórfico amplificado aleatorio (RAPD):

Normalmente, el objetivo de la PCR es generar fragmentos definidos de ADN a partir de cebadores altamente específicos. En el caso de RAPD (pronunciado como rápido), se seleccionan arbitrariamente cebadores oligonucleotídicos cortos para amplificar un conjunto de fragmentos de ADN distribuidos aleatoriamente por todo el genoma. Esta técnica, el ADN polimórfico amplificado al azar, también se conoce como PCR cebada arbitrariamente (AP-PCR).

El procedimiento de RAPD es comparable a la técnica general de PCR. Este método básicamente implica el uso de un solo cebador con poco rigor. Un único oligonucleótido corto (normalmente un cebador de 9-10 bases) se une a muchos sitios del genoma y los fragmentos de ADN se amplifican a partir de ellos. La rigurosidad de la unión del cebador se puede aumentar después de unos pocos ciclos de PCR. Esto permite la amplificación de los mejores desajustes.

RAPD puede diseñarse cuidadosamente para que finalmente produzca patrones de bandas específicos del genoma que sean útiles para el análisis comparativo. Esto es posible porque el ADN genómico de dos individuos diferentes a menudo produce diferentes patrones amplificados por RAPD. Por tanto, se puede generar un fragmento de ADN particular para un individuo y no para el otro, y esto representa un polimorfismo de ADN que puede usarse como marcador genético.

RAPD es ampliamente utilizado por biólogos moleculares de plantas para la identificación genética de especies vegetales. Para ello, se han diseñado diferentes combinaciones de nucleótidos, la mayoría de ellos cebadores oligonucleotídicos aleatorios y están disponibles comercialmente. A medida que cada cebador aleatorio se hibrida con una región diferente de ADN, se pueden identificar muchas regiones diferentes de loci en el ADN. Por tanto, RAPD es útil para la construcción de mapas genéticos y como método para la toma de huellas genómicas.

Limitaciones de RAPD:

El principal problema de RAPD está asociado con la reproducibilidad. A menudo es difícil obtener niveles similares de unión de cebadores en diferentes experimentos. Por tanto, es difícil correlacionar los resultados obtenidos por diferentes grupos de investigación en RAPD.

Polimorfismo de longitud de fragmento amplificado (AFLP):

AFLP es un método muy sensible para detectar polimorfismo en el genoma. Se basa en el principio de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción y RAPD. La AFLP puede considerarse apropiadamente como una técnica de diagnóstico por huellas dactilares que detecta fragmentos de restricción genómica.

En AFLP, se usa la amplificación por PCR en lugar de la transferencia Southern (que se usa principalmente en RFLP) para la detección de fragmentos de restricción. Cabe señalar que se emplea AFLP para detectar la presencia o ausencia de fragmentos de restricción, y no las longitudes de estos fragmentos. Esta es la principal diferencia entre AFLP y RFLP. AFLP se utiliza mucho en genética vegetal.

No ha resultado útil en el mapeo de genomas animales, ya que esta técnica se basa principalmente en la presencia de altas tasas de variaciones sustitutivas que no se encuentran en los animales. Por otro lado, las variaciones sustitutivas que dan lugar a RFLP son más comunes en las plantas. El principio básico de AFLP implica la amplificación de subconjuntos de RFLP mediante PCR (fig. 8.6).

Un ADN genómico se aísla y se digiere simultáneamente con dos endonucleasas de restricción diferentes: EcoRI con un sitio de reconocimiento de 6 pares de bases y Msel con un sitio de reconocimiento de 4 pares de bases. Estas dos enzimas pueden escindir el ADN y dar como resultado pequeños fragmentos (& lt 1 kb) que pueden amplificarse mediante PCR. Para ello, los fragmentos de ADN se ligan con adaptadores EcoRI y Msel.

Estas secuencias adaptadoras comunes (secuencias genómicas flanqueantes) sirven como sitios de unión de cebadores en los fragmentos de restricción. Los fragmentos de ADN se pueden amplificar con cebadores AFLP, cada uno de los cuales tiene solo un nucleótido selectivo. Estos productos de PCR se diluyen y se utilizan como plantillas para la amplificación selectiva empleando dos nuevos cebadores AFLP que tienen 2 o 3 nucleótidos selectivos.

Después de la amplificación selectiva por PCR, los productos de ADN se separan en un gel. La huella de ADN resultante se identifica mediante autorradiografía. Los fragmentos de AFLP representan posiciones únicas en los genomas y, por lo tanto, pueden usarse como puntos de referencia para cerrar las brechas entre los mapas genéticos y físicos de los genomas. En plantas, AFLP es útil para generar mapas de alta densidad y para detectar clones genómicos.

Amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE):

Como ya se describió (Ver pág. 115), la transcripción inversa, seguida de PCR (RT-PCR) da como resultado la amplificación de secuencias de ARN en forma de ADNc. Pero la principal limitación de la RT-PCR está relacionada con las secuencias de ADN incompletas en el ADNc. Este problema se resuelve utilizando la técnica de amplificación rápida de extremos de cDNA. RACE se muestra en la Fig. 8.7 y se describe brevemente a continuación.

El ARN diana se convierte en un ADNc parcial mediante la extensión de un cebador de ADN. Este cebador de ADN se hibridó primero en una posición de intervalo del ARN, no demasiado lejos del extremo 5 & # 8242 de la molécula. Ahora, la adición de dATP (As) y desoxinucleotidil transferasa terminal extiende el extremo 3 & # 8242 del cDNA.

Esto sucede debido a la adición de una serie de como al ADNc. Estos como serie ahora actúan como imprimación para recocer con la imprimación de anclaje. Se puede formar una segunda hebra de ADN extendiendo el cebador de anclaje. El ADN de doble hebra ahora está listo para la amplificación mediante PCR. El procedimiento descrito anteriormente se denomina 5 & # 8242-RACE, ya que se lleva a cabo mediante amplificación del extremo 5 & # 8242 del ARN de partida. Se puede utilizar un protocolo similar para realizar 3 & # 8242-RACE cuando se desea la secuencia de ARN del extremo 3 & # 8242.

Limitaciones de RACE:

Dado que se usa un cebador específico, la especificidad de amplificación de RACE puede no ser muy alta. Otra desventaja es que la transcriptasa inversa puede no alcanzar completamente los extremos 5 & # 8242 del ARN, y esto limita la utilidad de RACE. En los últimos años, se han realizado algunas modificaciones para mejorar RACE.


Parte I: Viaje al descubrimiento y mdash

El retorcido camino hacia la doble hélice del ADN

[Definir la naturaleza química del gen] "es una de las grandes tareas urgentes de la humanidad. Una vez que lo hemos logrado, los límites de nuestros horizontes se ensanchan más allá de la imaginación, vislumbran por fin lo que somos".

- Florence Bell, de su tesis doctoral (1939). Ver referencias.

El problema

¿Cómo se transmiten los rasgos de padres a hijos? El primer avance en este problema lo hizo Gregor Mendel, un monje del siglo XIX que estudió los guisantes. Mendel mostró que los rasgos se heredan como unidades discretas, que luego se conocieron como genes (ver Narrativa sobre la herencia de Tilghman). El gen se convirtió en un concepto muy importante en biología y, a principios del siglo XX, se sabía que los genes podían:

1) Información de la tienda. El trabajo anterior había demostrado que un gen contiene información que instruye la producción de una proteína.

2) Replicar. Debe existir un mecanismo de copia que permita que la información genética se propague de una generación a la siguiente.

3) Mutar. Los cambios ocasionales en los genes producen descendencia con rasgos distintos a los de sus padres. Esta variación es el motor de la evolución a través de la selección natural (ver Narrativa sobre mutaciones de Doug Koshland).

Pero, ¿qué es un gen? ¿De qué está hecho? Cómo se ve? Si uno conociera la naturaleza físico-química de los genes, tal vez podría comprender cómo los genes almacenan información, se replican y mutan.

La evidencia a principios del siglo XX sugirió que los genes residen en los cromosomas (ver Profundizar 1). Los cromosomas se componen de ADN y proteínas. ¿Cuál fue el gen? Durante gran parte de la primera mitad del siglo XX, los científicos pensaron que los genes estaban hechos de proteínas, no de ADN, por las siguientes razones:

1) Los polipéptidos (otro nombre para las proteínas) son cadenas lineales compuestas por 20 bloques de construcción diferentes: los aminoácidos. El ADN, por otro lado, se compone de solo 4 bloques de construcción diferentes: las bases. Debido a que las proteínas son más complejas que el ADN, los polipéptidos se consideraron una mejor opción para almacenar la información compleja de la vida.

2) Se pensaba que el ADN era una cadena monótona y repetitiva de nucleótidos, que no sería útil para el almacenamiento de información. Phoebus Levene promovió este punto de vista con su "hipótesis del tetranucleótido", que postulaba que las cuatro bases del ADN están presentes en cantidades iguales y se repiten una y otra vez a lo largo del cromosoma en un patrón fijo. Esta hipótesis resultó ser completamente errónea, pero fue influyente en su época.

Como resultado de este marco de pensamiento, muchos científicos pensaron que el ADN era aburrido durante aproximadamente los primeros 80 años después de su descubrimiento. El ADN es un ejemplo de por qué eliminar ideas incorrectas es a menudo tan importante como crear nuevas.

En nuestro viaje al descubrimiento, encontraremos dos experimentos famosos, uno de Avery-MacLeod-McCarty y otro de Hershey-Chase, que en conjunto anularon la idea de que las proteínas son la molécula de la herencia y señalaron directamente al ADN (explicado en Clue 3 a continuación). La hipótesis del tetranucleótido finalmente fue anulada por los datos que se describen a continuación en la Pista 4.

Sin embargo, incluso con estos errores corregidos en 1952, nadie podía imaginar cómo funciona el ADN en la herencia. Incluso la noción de que el ADN contiene un código, un hecho básico sobre el ADN que la mayoría de la gente conoce hoy, no fue apreciada en ese momento. Max Delbruck (un conocido científico que aparece en Narrative on Mutations de Koshland y el Experimento clave Meselson-Stahl) dijo:

"Nadie, absolutamente nadie, hasta el día de la estructura Watson-Crick, había pensado que la especificidad podría ser transmitida de esta manera extremadamente simple, por una secuencia, por un código".

- Cita del octavo día de la creación (ver lista de referencias)

Nuestro viaje al descubrimiento termina con el modelo de la doble hélice del ADN propuesto por Jim Watson y Francis Crick. La estructura sugirió inesperadamente un elegante mecanismo para la replicación y herencia de genes, resolviendo el rompecabezas planteado por Mendel un siglo antes. La alguna vez aburrida molécula de ADN ha estado en el centro de atención desde entonces.

Pista 1: La química del ADN

En 1869, Johann Friedrich Miescher estaba estudiando la naturaleza química del "pus", que obtuvo de los vendajes quirúrgicos desechados en una clínica de cirugía local. Sus estudios del pus llevaron al descubrimiento de una nueva sustancia, a la que llamó "nucleína", que era ácida, rica en fósforo y carecía de azufre, lo que la diferenciaba de las proteínas. Poco después, encontró una fuente aún mejor de nucleína: el esperma de salmón. Lo que descubrió Miescher ahora se conoce como ácido desoxirribonucleico o ADN.

Se descubrió que la nucleína está compuesta por cuatro unidades químicas distintas llamadas bases: adenina, guanina, timina, citosina (Figura 1). La guanina (abreviada como "G") se encontró por primera vez en 1844 en los excrementos de aves (llamado "guano"). La adenina (abreviada como "A") se aisló en 1885 del páncreas de res. La guanina y la adenina son similares entre sí (un hexágono de carbonos unidos a un pentágono con un lado común) y se denominan "purinas". Las otras bases de ADN, timina (T) y citosina (C) se aislaron por primera vez de las glándulas del timo de ternera. La timina y la citosina (hexágonos) se llaman pirimidinas.

Figura 1 Las bases del ADN y su fuente / fecha de descubrimiento.

La estructura química del ADN se esclareció aún más a través del trabajo de varios científicos, entre los que destaca Alexander Todd, quien ganó un Premio Nobel por su trabajo. Se presentarán más detalles en la descripción general del conocimiento, pero los fundamentos se presentan aquí, ya que pertenecen al descubrimiento de la estructura del ADN. Los componentes básicos del ADN no son solo las bases, sino los nucleótidos. Un nucleótido es una base (una de las cuatro) conectada a un azúcar (desoxirribosa para el ADN), que a su vez está conectada a un fosfato (Figura 2). El ADN es un polímero largo de nucleótidos y a veces se le llama polinucleótido (muchos nucleótidos). Los nucleótidos están conectados de cabeza a cola por enlaces formados entre un fosfato y dos azúcares adyacentes, uno de los enlaces conecta el fosfato con lo que se conoce como el carbono 5 'de un azúcar, y el otro enlace se forma con el carbono 3 ′ en otro azúcar. Por lo tanto, los fosfatos y azúcares crean una columna vertebral continua de la molécula de ADN con las bases sobresaliendo a intervalos regulares. La cadena de ADN tiene direccionalidad, definida por la forma en que apuntan los carbonos 5 ′ y 3 ′ de los azúcares (Figura 2).

Figura 2 El ADN es un polímero de nucleótidos. El polímero de ADN tiene una polaridad definida por la orientación de los carbonos 5 'y 3' en el azúcar desoxirribosa.

Pista 2: La primera estructura de rayos X del ADN por Florence Bell

Rosalind Franklin produjo una famosa fotografía de rayos X del ADN en 1952, de la que hablaremos pronto. Sin embargo, la primera fotografía de rayos X del ADN fue obtenida 14 años antes en la Universidad de Leeds por una joven estudiante graduada: Florence Bell.

Nacida en Londres en 1913, Florence Bell (Figura 3) estudió química y física en la universidad y dos destacados expertos científicos le enseñaron cristalografía de rayos X. Bien entrenada, luego se mudó a Leeds en 1937 para comenzar su doctorado. estudia con William Astbury, otro conocido cristalógrafo de rayos X. Bell recibió su Ph.D. en 1939 su tesis se tituló "Rayos X y estudios relacionados de la estructura de las proteínas y los ácidos nucleicos" (ver referencias). Bell produjo un extraordinario doctorado, que en gran parte se ha pasado por alto. No debería ser así.

Figura 3 Fotografía de Florence Bell (obtenida de Wikipedia) pegada en la portada de su tesis de los archivos de la biblioteca de la Universidad de Leeds (obtenida con permiso y disponible en la lista de referencias).

La investigación de Bell implicó hacer brillar un haz de rayos X a través de fibras biológicas alineadas, como el ADN. Las fibras dispersan algunos de los rayos X, que luego se capturan como una imagen utilizando una película sensible a los rayos X. Una imagen difusa y borrosa en la película indica una falta de un orden regular de moléculas en la fibra. Sin embargo, un patrón de manchas o líneas refleja un orden subyacente de átomos en la fibra. Como se discutirá más adelante, la información sobre la disposición de los átomos en la fibra se puede deducir potencialmente del patrón de rayos X. Sin embargo, Bell estuvo trabajando en los primeros días del uso de rayos X para sondear las estructuras de las moléculas. Se habían utilizado rayos X para determinar la disposición de los átomos en cristales de sal simples, pero las estructuras de las moléculas biológicas, que son más complicadas que las sales simples, aún no se habían resuelto con este método.

Bell pasó rayos X a través de una cantidad extraordinaria de sustancias biológicas, que suenan como un brebaje de brujas: tendones de dedos de rana, medusas, cabello humano, costillas de aletas de tiburón, etc. Estas muestras están hechas de proteínas. Sin embargo, Bell también examinó el ADN de varias fuentes. Una muestra de ADN (del timo de ternera) produjo resultados interesantes.

Si preparó ADN de fresas en la escuela primaria o secundaria, es posible que recuerde el ADN como una mancha pegajosa. Como se discutió anteriormente, una mancha de moléculas desorganizadas producirá una imagen de rayos X borrosa sin información. Por lo tanto, Bell primero tuvo que encontrar una forma de alinear las moléculas de ADN. Lo hizo secando el ADN en un marco que se podía estirar lentamente.El estiramiento ayudó a alinear las moléculas de ADN en la misma dirección, creando así cierto grado de orden.

Bell pasó el haz de rayos X a través de las fibras de ADN del timo de la pantorrilla y los rayos X dispersos produjeron una imagen en la película fotográfica (Figura 4). Estaba un poco manchado, pero había un patrón. El simple hecho de observar un patrón fue un gran resultado, fue la primera indicación de que el ADN tiene algún tipo de orden molecular. Esta no era una conclusión inevitable. Por ejemplo, los rayos X no producirían ningún patrón si pasaran a través de una preparación de ARN (otro polinucleótido) o polisacáridos (polímeros de azúcares) estos polímeros pueden adoptar numerosas estructuras 3D y así producir fibras irregulares.

Figura 4 Difracción de rayos X de fibras de ADN según lo estudiado por Florence Bell. La fotografía es de la tesis de Bell (https://explore.library.leeds.ac.uk/special-collections-explore/650413).

Bell aprendió varias cosas sobre el ADN a partir de sus fotografías de rayos X. Primero, la gran banda semicircular en la parte superior e inferior (que se llama "reflexión" en la jerga de la difracción de rayos X) reveló que algún elemento en el ADN se repite a intervalos regulares de 3.4 angstroms (angstrom, abreviado con la símbolo "Å", es de 10 a 10 metros una décima parte de un nanómetro). Verificó esta periodicidad en el ADN obtenido de virus y páncreas, demostrando así que debe ser una propiedad universal del ADN. A partir de otra información de la fotografía, determinó que el ancho de una molécula de ADN era de 18,1 Å (cerca del valor actualmente aceptado de 20 Å). A partir de estos datos, Bell produjo un modelo en su tesis (Figura 5) que muestra que:

1) El ADN es una columna larga que forma una estructura rígida.

2) Las bases se encuentran perpendiculares al eje de la columna y se apilan cada

3,4 Å. (Este fue un parámetro clave en el modelo de Watson y Crick, como veremos pronto).

Figura 5 El modelo de ADN de Bell y Astbury muestra bases apiladas a lo largo de una columna rígida a intervalos regulares de

3.4 Å (https://explore.library.leeds.ac.uk/special-collections-explore/650413.). También especularon que esta estructura regular de ADN creaba un andamio para las proteínas, que podrían ser necesarias para la herencia (Dig Deeper 2).

Ese ADN es una columna rígida con un ancho de ∼20 Å y sus bases se apilan cada 3.4 Å es correcto. Sin embargo, Bell no llegó a la conclusión de que el ADN es una doble hélice. Su preparación de ADN (como las primeras de Franklin) fue una mezcla de dos formas de ADN, lo que complicó las cosas y desdibujó la imagen. Incluso si tuviera la fotografía "correcta", la teoría para interpretar un patrón de rayos X de estructura helicoidal no existía en ese momento.

Si bien el modelo de ADN que se muestra en la Figura 5 no es completamente correcto, el trabajo pionero de Bell en 1938 representó un logro significativo, 15 años antes de los famosos artículos de ADN que aparecieron en 1953. Bell fue la primera persona en demostrar que el ADN tiene un orden estructura subyacente. Su trabajo indicó que obtener una estructura para el ADN era una empresa factible y atrajo a otros (Franklin, Wilkins) a llevar el problema al siguiente nivel. De hecho, Franklin continuó estudiando el ADN del timo, la misma fuente de ADN que Bell descubrió que funcionaba mejor en sus estudios estructurales. La ciencia avanza por pasos, que sientan las bases necesarias para grandes avances.

Muchos años más tarde, en 1951, el asesor de Bell, William Astbury, produjo una mejor fotografía de rayos X del ADN, de hecho una similar a la famosa fotografía realizada por Rosalind Franklin (que se analiza a continuación). Sin embargo, Astbury nunca publicó ni presentó públicamente este resultado; era probable que no comprendiera su significado. Si hubiera sido publicado y accesible para Linus Pauling y Francis Crick, la historia de la doble hélice del ADN probablemente se habría alterado.

¿Podría Florence Bell haber resuelto el problema de la doble hélice del ADN? No podemos saber la respuesta. La Segunda Guerra Mundial interrumpió su trabajo científico (como sucedió con el de Francis Crick, como veremos más adelante). Astbury trató de intervenir en su reclutamiento por la Oficina de Guerra Británica, afirmando que "difícilmente podría continuar sin su ayuda". Pero Bell se unió al esfuerzo de guerra como operadora de radio en la Fuerza Aérea Auxiliar de Mujeres. Luego se casó con un militar estadounidense, vino a los Estados Unidos y dejó la ciencia para siempre. Regresaremos a Florence Bell en los pensamientos finales.

Pista 3: Los experimentos de Avery-MacLeod-McCarty y Hershey-Chase apuntan al ADN, y no a las proteínas, como el material de la herencia

Como se discutió anteriormente, los cromosomas están compuestos de proteínas y ADN. Pero, ¿cuál almacena la información del gen? Se favorecieron las proteínas, pero se necesitaba un experimento para resolver este problema. Ese experimento fue realizado en 1944 por Oswald Avery, Collin MacLeod y Maclyn McCarty.

Avery, MacLeod y McCarty siguieron una observación notable hecha por Frederick Griffith en 1928. Griffith estaba estudiando dos cepas relacionadas de la bacteria Streptococcus pneumonia: una cepa que era virulenta y causaba neumonía cuando se inyectaba en ratones y otra tinción que no era virulento (no causó enfermedad). La diferencia entre las dos cepas era que la cepa virulenta tenía un recubrimiento que la protegía de la destrucción por parte del sistema inmunológico. Griffith hizo un experimento en el que mató bacterias virulentas con calor y co-inyectó estas bacterias muertas con bacterias vivas no virulentas en ratones. Lo que lo poseyó para hacer este experimento no está claro en mi lectura, pero los resultados fueron asombrosos. Griffith descubrió que algunas de las bacterias no virulentas se "transformaban" permanentemente en bacterias virulentas que producirían neumonía (Figura 6). Este resultado sugirió que los genes (en este caso, los que confieren la capa protectora que haría virulentas a las bacterias) eran transmisibles entre bacterias, incluso, increíblemente, de bacterias muertas a vivas. Esta fue la primera demostración experimental de transferencia de genes, un método que impulsa la industria biotecnológica actual. Los pacientes diabéticos, por ejemplo, son tratados con insulina humana producida por bacterias transformadas con el gen de la insulina humana.

Figura 6 El experimento de Griffith que demuestra que los genes se pueden transferir de una bacteria (en este caso, incluso muerta) a otra. Este proceso se denominó "transformación".

¿Cuál fue el agente químico que se transfirió entre las bacterias durante la "transformación" genética? Avery, MacLeod y McCarty descubrieron que el agente responsable era el ADN, y no la proteína. Argumentaron que los genes estaban hechos de ADN. Este resultado fue sorprendente y se opuso al dogma de la época. Puede obtener más información sobre el experimento de Avery, MacLeod y McCarty en el video 1.

Video 1 Un video de pizarra que explica el experimento de Avery, MacLeod y McCarty.

Sin embargo, muchos científicos se resistieron a la conclusión de que los genes están hechos de ADN. Los científicos disidentes pensaron que podrían haber quedado algunas proteínas que contaminaron la preparación de ADN. A pesar de la elegancia del experimento de Avery, MacLeod y McCarty, la naturaleza química del gen permaneció sin resolver en la mente de muchas personas.

Las ideas antiguas a menudo son difíciles de destronar. Sin embargo, las ideas equivocadas eventualmente se derrumbarán bajo el peso de la evidencia científica. La siguiente evidencia a favor del ADN llegó 8 años después (1952) en un experimento realizado por Alfred Hershey y Martha Chase. Hershey y Chase estudiaron la replicación de virus, llamados bacteriófagos (fagos para abreviar), que infectan bacterias. Los fagos aterrizan en la superficie de la bacteria e inyectan una molécula en su interior. Luego, se producen muchos fagos nuevos dentro de las bacterias. La molécula que se inyectó en las bacterias seguramente debe ser responsable de la herencia, ya que posee información para especificar la producción de nuevos fagos. Hershey y Chase descubrieron que el fago inyectaba ADN, y no proteína, en las bacterias. Para saber cómo Hershey y Chase hicieron su experimento, vea el Video 2.

Video 2 Un video de pizarra que explica el experimento Hershey-Chase.

Dado que los experimentos de Avery-MacLeod-McCarty y Hershey-Chase, utilizando métodos muy diferentes, llegaron a la misma conclusión, la comunidad científica comenzó a abrazar más ampliamente la noción de que los genes están hechos de ADN.

En nuestra siguiente pista, nos encontraremos con un científico que inmediatamente reconoció la importancia del experimento de Avery-MacLeod-McCarty y cambió su programa de investigación de las proteínas al ADN. Ese individuo era Erwin Chargaff.

Pista 4: Hallazgos de Chargaff

Erwin Chargaff fue un bioquímico que abordó una pregunta simple: ¿qué cantidad de cada una de las cuatro bases está presente en el ADN? La hipótesis del tetranucleótido, propuesta por Phoebus Levene, afirmó que las bases deberían estar presentes en proporciones iguales (un cuarto de cada una). Chargaff analizó químicamente el ADN para ver si esto era cierto o no. Los resultados de Chargaff se resumen en la Figura 7.

Figura 7 Resultados de Chargaff sobre la composición básica del ADN. Los resultados anteriores se compilan de dos de las publicaciones de Chargaff (consulte la lista de referencias). Los resultados se volvieron a calcular en términos de% de cada base (donde las cuatro bases suman 100%), en lugar de% de fosfato, como en los documentos originales.

Pregunta del explorador: ¿Qué dicen estos resultados sobre la "hipótesis del tetranucleótido"?

Respuesta: La hipótesis del tetranucleótido propuso que las bases se repiten de manera regular a lo largo del ADN, lo que predice cantidades iguales (25%) de las cuatro bases. Los datos de Chargaff, sin embargo, mostraron que este no es el caso. En otros datos, Chargaff también encontró que la abundancia de las bases difiere hasta cierto punto en diferentes organismos (por ejemplo, levaduras, bacterias, humanos), mientras que la hipótesis del tetranucleótido preveía un porcentaje similar de las bases en todos los organismos.

Pregunta del explorador: ¿Notas alguna similitud en las cantidades relativas de bases de nucleótidos?

Respuesta: Los porcentajes de adenina y timina son similares. También lo son los porcentajes de guanina y citosina (aunque difieren algo en el timo humano, probablemente debido a variaciones o errores experimentales).

El hallazgo de Erwin Chargaff de porcentajes iguales de adenina y timina, y de guanina y citosina ahora se conoce como "Regla de Chargaff". Sin embargo, parecía menos obvio como "regla" en ese momento. El mismo Chargaff parecía inseguro del significado en su artículo de 1950:

"Es digno de mención, aunque posiblemente no más que accidental, que en todos los ácidos nucleicos desoxipentosa examinados hasta ahora, las proporciones molares de purinas totales a pirimidinas totales no estaban lejos de 1. No se debe leer más en estas cifras".

Si uno creía en los datos de Chargaff, las relaciones unitarias de G a C y A a T sugerían fuertemente algún tipo de complementariedad. Una cerradura y una llave a juego es un ejemplo de complementariedad estructural. ¿Eran cerraduras y llaves complementarias G-C y A-T?

Volveremos a los datos de Chargaff, ya que confirmaron el modelo de ADN de Watson-Crick. Las pistas son más fáciles de ver en retrospectiva y a menudo se pierden en ese momento. Incluso Watson y Crick no captaron el significado de los datos de Chargaff desde el principio. Sin embargo, una vez que se dieron cuenta de su significado, las dos hebras de ADN se unieron en sus mentes en una doble hélice, como veremos en breve.

El descubrimiento: el ADN es una doble hélice

La Figura 8 es una ilustración de una de las fotografías más famosas de la biología: Jim Watson y Francis Crick de pie frente a su modelo metálico en 3-D de la doble hélice del ADN en Cambridge, Inglaterra, en marzo de 1953. El trabajo de detective científico que llevó a este modelo se desarrolló en un período de tiempo sorprendentemente corto, aproximadamente 4 semanas. Exploraremos lo que sucedió en este mes milagroso.

Figura 8 Watson y Crick de pie frente a su modelo de la doble hélice de ADN.

Antes de examinar cómo Watson y Crick llegaron a su momento triunfal, introduzcamos a los científicos en la historia.

Linus Pauling: el favorito

Si uno fuera a apostar sobre quién resolvería la estructura del ADN, el dinero inteligente se habría colocado en Linus Pauling. Pauling, profesor de Caltech, fue uno de los científicos más famosos del siglo XX; literalmente "escribió el libro" sobre química moderna: La naturaleza del enlace químico. Pauling también fue un pionero en la aplicación de la química a la biología. En 1949, postuló correctamente que la anemia de células falciformes es una enfermedad que implica un defecto molecular en la hemoglobina. En 1951, solo 2 años antes de la estructura del ADN, Pauling hizo otro gran revuelo al construir un modelo atómico para la hélice alfa, un motivo estructural común en las proteínas. Linus Pauling también articuló el concepto de complementariedad molecular, un mecanismo similar a una cerradura y una llave sobre cómo dos moléculas pueden interactuar de forma única entre sí. En 1948, declaró por qué la complementariedad podría ser relevante para cómo un gen hace una copia de sí mismo, presagiando de hecho el gran concepto detrás de la doble hélice del ADN:

"Si la estructura que sirve como plantilla (el gen o la molécula del virus) consta de, digamos, dos partes, que son ellas mismas complementarias en estructura, entonces cada una de estas partes puede servir como molde para la producción de una réplica de la otra parte, y el complejo de dos partes complementarias puede así servir como molde para la producción de duplicados de sí mismo ".

Jim Watson y Francis Crick: los desamparados

Watson y Crick, jóvenes científicos desconocidos que trabajaban en el Laboratorio Cavendish en Cambridge, Inglaterra, tenían habilidades y personalidades complementarias, lo que les permitió idear el modelo de la doble hélice.

Jim Watson: Watson estudió ornitología por primera vez como estudiante en la Universidad de Chicago y luego se interesó por la genética. Rechazado por Caltech y Harvard para la escuela de posgrado, Watson terminó en la Universidad de Indiana entrenando con el excelente genetista bacteriano Salvador Luria (Luria aparece en la narrativa de Koshland sobre mutaciones). Después de obtener su Ph.D. a la edad de 22 años, Watson se fue a Europa para realizar estudios posdoctorales en Dinamarca. Al ver a Maurice Wilkins (discutido a continuación) presentar su trabajo de rayos X sobre el ADN en una reunión científica, Watson decidió que investigar la estructura del ADN con Wilkins sería más emocionante que su trabajo actual en Copenhague, sin embargo, Wilkins no invitó a Watson a unirse a su grupo. . Luego, Watson se postuló para el Laboratorio Cavendish en Cambridge, un centro líder para estudios de rayos X. Llegó a Cambridge en octubre de 1951, con 23 años en ese momento, donde conoció a Francis Crick. Durante su primera reunión, ambos expresaron un gran interés en el ADN y resolvieron trabajar juntos en él, aunque no era el trabajo principal que se les asignó.

Francis Crick: Crick comenzó su Ph.D. estudia física en el University College London, pero su trabajo se vio interrumpido cuando su departamento tuvo que evacuar a Gales al comienzo de la Segunda Guerra Mundial. Crick luego se unió al esfuerzo de guerra, diseñando minas navales. Después de que terminó la guerra, Crick volvió a la ciencia, pero se interesó en cómo la física podía aplicarse a la biología (ver también la historia de Luria y Delbruck, dos físicos entrenados que se volcaron a la biología en la Narrativa de Koshland). Luego, Crick ingresó en el Laboratorio Cavendish en 1949 para realizar un doctorado. capacitación. Cuando Watson y Crick se conocieron en 1951, Crick era 12 años mayor que Watson pero estaba más atrasado en su formación, ya que todavía era un estudiante graduado mientras Watson era un becario postdoctoral. Aunque se le reconoce por su tremendo intelecto, Crick también puede ser ruidoso, audaz y, a veces, molesto para los científicos de alto nivel. Para obtener un respiro de Crick, los científicos superiores del Laboratorio Cavendish trasladaron a Crick y al nuevo recluta Watson a su propia habitación. ¿Habría surgido el modelo de doble hélice si Watson y Crick hubieran sido asignados a trabajar en habitaciones separadas? No se puede decir, pero ciertamente, su cercanía permitió una discusión constante, que fue un ingrediente clave para su éxito.

Rosalind Franklin y Maurice Wilkins: los experimentalistas que obtuvieron los datos

La información de la fotografía de rayos X obtenida por Florence Bell (descrita anteriormente en la Pista 2) fue insuficiente para determinar la estructura del ADN. Una nueva generación de cristalógrafos de rayos X aceptó el desafío: Maurice Wilkins y Rosalind Franklin en King's College, Londres.

Maurice Wilkins: Wilkins, como Crick, se formó originalmente como físico (obtuvo su doctorado en 1940) y ayudó a los esfuerzos bélicos británicos y estadounidenses en la Segunda Guerra Mundial. Luego, Wilkins se unió a una nueva Unidad de Biofísica en el King's College de Londres y comenzó los estudios de rayos X del ADN. Obtuvo fotografías decentes de rayos X del ADN en 1950, que Watson vio un año después. Wilkins mantuvo una estrecha comunicación con Watson y Crick entre 1951 y 1953. Watson y Crick invitaron a Wilkins a ser coautor de su artículo sobre la estructura del ADN, pero Wilkins rechazó la oferta y publicó su propio trabajo de rayos X. El trabajo en curso de Wilkins sobre el ADN ayudó a solidificar el modelo de doble hélice; fue co-receptor del Premio Nobel con Watson y Crick en 1962.

Rosalind Franklin: Franklin nació en Londres y asistió a la Universidad de Cambridge. Formada originalmente como química física, trabajó en París como becaria postdoctoral, donde se convirtió en una consumada cristalografía de rayos X. Franklin recibió una beca de 3 años para trabajar en proteínas en el King's College de Londres. Sin embargo, John Randall, el director de King's College, la reasignó para trabajar en el ADN. La mala comunicación entre Randall, Wilkins y Franklin llevó a una relación enconada entre Franklin y Wilkins. Wilkins pensó que a Franklin se le asignó trabajar con él, y Franklin pensó que se le permitiría trabajar de forma independiente. Regresaremos a este punto en los pensamientos finales.

Los enfoques: experimentales y modeladores

Los experimentales: Maurice Wilkins y Rosalind Franklin

Franklin y Wilkins buscaron un enfoque directo para resolver la estructura del ADN utilizando datos de rayos X. El patrón de manchas en la fotografía de rayos X proporciona información que, en principio, podría usarse para reconstruir una imagen en 3D de la molécula de ADN.

¿Cómo se usan los rayos X para generar una imagen de ADN? Una cámara utiliza luz visible y lentes para recrear imágenes del mundo macroscópico. Un microscopio utiliza los mismos principios, con una lente más potente, para crear imágenes del mundo microscópico de las células. Sin embargo, el mundo atómico más pequeño no se puede visualizar con luz visible. En cambio, la longitud de onda más corta de los rayos X (∼0,1 nm en comparación con los 400-700 nanómetros de la luz visible) se adapta bien a las dimensiones de los átomos. Pero como no es posible hacer lentes que enfoquen rayos X, no se pueden generar imágenes directas de átomos usando rayos X. Sin embargo, los rayos X desenfocados dispersos por la muestra pueden capturarse en una película, produciendo un patrón de puntos o líneas llamado patrón de difracción. El patrón de difracción contiene información sobre la disposición 3D de los átomos en una muestra. Un tratamiento matemático (transformada de Fourier) del patrón de difracción puede recrear una imagen, cumpliendo así una función comparable a una lente.

El uso de información de difracción de rayos X para reconstruir un modelo 3D detallado de átomos en una molécula es muy común hoy en día (si se puede hacer que la molécula forme un cristal o fibra bien ordenados).Sin embargo, en la época de Bell, Wilkins y Franklin, este método estaba todavía en su infancia: la estructura de una molécula biológica tan compleja como una proteína o el ADN aún no se había resuelto en ese momento. Para complicar aún más las cosas, la reconstrucción matemática de una imagen tuvo que calcularse a mano en la década de 1950, mientras que las potentes computadoras realizan estas tareas en la actualidad.

Los modeladores: Watson y Crick y, por separado, Pauling

Watson y Crick querían determinar la estructura del ADN, pero sin el lento y arduo trabajo de resolverlo mediante una reconstrucción de datos de rayos X. Además, sabían que Wilkins y Franklin en King's College iban por ese camino y no parecía tener sentido duplicar su esfuerzo. Watson, en particular, estaba impaciente y quería resolver el rompecabezas lo antes posible. Entonces Watson y Crick se dedicaron a la construcción de modelos. Sin embargo, otros proyectos ocuparon la mayor parte de su tiempo y, esporádicamente, recurrieron a la construcción de modelos de ADN.

Hacer un modelo es un proceso de deducción basado en una cantidad limitada de información conocida. Es un poco un juego, algo así como "nombrar esa melodía". Identificar una canción después de escuchar un minuto de música puede ser relativamente fácil. Pero puede ser difícil de adivinar a partir de 2 o 3 notas. El trabajo de Florence Bell generó dos piezas de información: (1) la distancia entre las bases y (2) el ancho de la molécula de ADN. Pero esa no fue información suficiente para hacer un modelo correcto. Se necesitaba más información, pero ¿cuánta más? La construcción de modelos también depende en gran medida de tener buenos datos, los datos incorrectos serán engañosos y conducirán a un modelo incorrecto.

Linus Pauling fue el constructor de modelos por excelencia. La capacidad de Pauling para deducir la estructura de la hélice alfa de la proteína a través de la intuición y las reglas de la química inspiró a Watson y Crick. Watson relata:

"Pronto me enseñaron que el logro de Pauling era un producto del sentido común, no el resultado de un razonamiento matemático complicado. En ocasiones, las ecuaciones aparecían en su argumento, pero en la mayoría de los casos, las palabras habrían sido suficientes. La clave del éxito de Linus fue su confianza en las leyes simples de la química estructural. La hélice alfa no se había encontrado simplemente mirando imágenes de rayos X, el truco esencial, en cambio, era preguntar qué átomos les gusta sentarse uno al lado del otro. En lugar de lápiz y papel, el Las principales herramientas de trabajo eran un conjunto de modelos moleculares que se parecían superficialmente a los juguetes de los niños en edad preescolar. Por lo tanto, no podíamos ver ninguna razón por la que no deberíamos resolver el ADN de la misma manera. Todo lo que teníamos que hacer era construir un conjunto de modelos moleculares y comenzar a play- con suerte, la estructura sería una hélice. Cualquier otro tipo de configuración sería mucho más complicado ".

En el octavo día de la creación (ver lista de referencias)

Un modelo no es un hecho, es una hipótesis sobre cómo funciona algo que necesita ser examinado y probado. A veces, los científicos se enamoran de hermosos modelos que son incorrectos. ¿Cómo llegan los científicos a la conclusión de que un modelo es correcto? Esta es a menudo una pregunta difícil ya que varios modelos pueden ser consistentes con los datos experimentales disponibles, especialmente si los datos son limitados. Sin embargo, un buen modelo hace nuevas predicciones que guían nuevos experimentos que probarán aún más si un modelo es correcto o distingue entre modelos competidores.

Antes de examinar cómo Watson y Crick llegaron a su momento triunfal, examinemos el menú de opciones involucradas en la conversión de la estructura química 2D del ADN en una estructura tridimensional:

1) ¿Cuántas cadenas de ADN hay en una molécula de ADN biológico? ¿Es uno, dos, tres o más?

2) Si hay más de uno, ¿cómo están orientadas las cadenas? ¿Corren en la misma dirección o en direcciones opuestas?

3) Si hay más de una cadena, ¿cómo interactúan entre sí? ¿Las cadenas interactúan de forma plana o se retuercen entre sí? Si está torcido, ¿cuál es la dirección del giro y a qué distancia el giro da un giro completo?

4) Si hay más de una cadena, ¿están los fosfatos en el interior y las bases en el exterior? ¿O viceversa?

El número limitado de parámetros en la construcción de un modelo 3D puede hacer que esto parezca un rompecabezas fácil de resolver. Sin embargo, ese ADN es una doble hélice solo parece obvio en retrospectiva. Watson / Crick y Pauling favorecieron las elecciones incorrectas primero antes de que se identificara la solución correcta. La historia del ADN revela que es difícil encontrar la solución correcta a un problema desconocido. Por lo general, los científicos no gravitan inmediatamente hacia la respuesta correcta, sino que llegan allí a través de un proceso iterativo.

Watson y Crick produjeron su primer modelo en noviembre de 1951, justo después de que Watson escuchara una presentación sobre el trabajo de rayos X sobre el ADN de los científicos del King's College. El primer modelo de Watson-Crick consistió en tres hebras de ADN envueltas en una triple hélice con los fosfatos en el centro y las bases apuntando hacia afuera. Esta idea fue agradable en ese momento. Si las bases, la parte más interesante y variable del ADN, se colocaran en el exterior, podrían interactuar más fácilmente con las proteínas.

Watson y Crick presentaron su modelo de tres hélices a Wilkins y Franklin. Fue prematuro. Watson no digirió completamente la información de rayos X presentada por Franklin, lo que provocó errores en su modelo. Franklin inmediatamente llamó la atención sobre esos errores, incluido el hecho de tener los fosfatos en el centro. Fue un momento humillante, no solo para Watson y Crick, sino también para el Laboratorio Cavendish en general. El Director del Laboratorio Cavendish, Sir Lawrence Bragg, prohibió a Watson y Crick trabajar con ADN e indicó que debían dejar la estructura del ADN para que King's College la resolviera. Hubo una larga pausa (más de un año) antes de que Watson y Crick volvieran a trabajar seriamente en el ADN.

Mientras tanto, Linus Pauling estaba teniendo su turno en la construcción de modelos de ADN en Caltech. Watson y Crick eran amigos del hijo de Linus, Peter Pauling, que estudiaba en Cambridge en ese momento. A finales de enero de 1953, Linus Pauling finalmente produjo un manuscrito que describe su modelo de ADN, que Watson y Crick vieron a través de Peter.

El modelo de Pauling (que apareció impreso en febrero de 1953) tenía el mismo error que el primer modelo de Watson y Crick. También era una hélice de tres hebras con los fosfatos en el centro (Figura 9).

Figura 9 Estructura incorrecta de Linus Pauling para el ADN, que colocó los fosfatos en el centro de una hélice de tres hebras. Rediseñado con modificaciones del artículo de Pauling de 1953 (ver lista de referencias).

¿Por qué Pauling, el héroe de la hélice alfa de la proteína 2 años antes, ideó la estructura de ADN incorrecta? Pauling no tuvo acceso a la fotografía informativa de ADN de Rosalind Franklin, que se discutirá a continuación. Pero su modelo también era incompatible con la química conocida, como las fuerzas atractivas y repulsivas entre los átomos (colocar los fosfatos cargados negativamente en el centro repelería y no mantendría las cadenas juntas). Su modelo tampoco incorporó su propia idea (descrita anteriormente) sobre genes que tienen mitades complementarias.

Algunos especulan que Pauling sintió que estaba en una carrera por la estructura del ADN y necesitaba sacar algo rápido. Sin embargo, una explicación más plausible fue que el ADN no era una gran prioridad para Pauling. Pauling podría haber pensado que el ADN sería otra hélice biológica, quizás interesante desde un punto de vista estructural, pero no una estructura que revelaría el "secreto de la vida". Matt Meselson (autor del Experimento clave de cómo se replica el ADN) era un estudiante graduado de Pauling en ese momento y no sabía que su asesor incluso estaba trabajando en el ADN (comunicación personal). El propio Pauling dijo más tarde, "no estábamos trabajando muy duro en eso. No estaba dedicando mucho de mi tiempo a determinar la estructura". (Octavo Día de la Creación ver referencias). Si hubiera anticipado que la estructura del ADN revelaría el enigma de la herencia, probablemente habría dado mayor prioridad a resolver su estructura.

El éxito: el camino hacia la doble hélice del ADN

Con un mejor equipo de rayos X, Franklin y Wilkins mejoraron las fotografías de rayos X del ADN en comparación con las producidas por Florence Bell y William Astbury. Sin embargo, sus fotografías iniciales aún eran difíciles de interpretar. Franklin luego se dio cuenta de que las fotografías estaban borrosas porque eran una imagen mixta producida por dos formas diferentes de ADN en la fibra. Variando la cantidad de humedad de forma controlada, encontró las condiciones para fabricar fibras puras de las dos formas de ADN, que llamó "forma A" y "forma B". Este avance experimental de Franklin fue una contribución importante y un punto de inflexión importante en la historia.

El 2 de mayo de 1952, Franklin y su estudiante graduado Raymond Gosling revelaron la fotografía 51, una exposición de rayos X de & gt60 horas de la forma B del ADN, que reveló un patrón de líneas cortas que formaban una "X" (Figura 10). Sobre esta imagen se ha escrito toda una obra de teatro (fotografía 51), una de las más famosas en biología.

Figura 10 Fotografía 51 de Rosalind Franklin. Consulte Dig Deeper 3 para obtener la información contenida en este patrón de difracción de rayos X.

Sin embargo, la fotografía 51 no produjo un momento eureka, sus pistas no fueron fáciles de detectar en ese momento. Franklin decidió centrarse en la forma A del ADN, que pensó que era más rica en información y podría proporcionar una solución directa a la estructura. Al no lograr mucho progreso en la forma A, Franklin volvió a analizar la forma B más simple en 1953, aproximadamente al mismo tiempo que Watson y Crick comenzaron su carrera hacia la doble hélice que se describe a continuación.

El "mes mágico" de la doble hélice comenzó el 30 de enero de 1953 ese día, Jim Watson tomó un tren al King's College para compartir la noticia del manuscrito de ADN incorrecto de Pauling con Wilkins y Franklin. En esa visita, Wilkins mostró la fotografía 51 a Watson, sin saber que esta información era interpretable para Watson. Watson, explotando de emoción, se apresuró a regresar a Cambridge para compartir la noticia de lo que vio, una clara evidencia de que el ADN es una hélice. Watson convenció a Bragg, el Director del Laboratorio Cavendish, de permitir un esfuerzo renovado en el modelado de ADN. Pensaron que Pauling pronto se daría cuenta de los errores en su modelo de ADN y posiblemente descubriría la estructura correcta. Watson y Crick estaban de vuelta en el modelado empresarial del ADN el 1 de febrero de 1953. En ese momento, sabían que el ADN era una hélice, pero aún quedaba un largo camino por recorrer para lograr una solución completa. Sorprendentemente, cuatro semanas después, llegaron a un modelo exitoso. El 28 de febrero, según cuenta la leyenda, Crick proclamó en el Eagle Pub que él y Watson habían descubierto "el secreto de la vida". Los principales eventos de la historia de la doble hélice del ADN se muestran en la línea de tiempo de la Figura 11.

Figura 11 Cronología de los eventos que llevaron al modelo de la doble hélice.

Tres piezas de rompecabezas importantes se unieron para hacer el modelo final.

Pieza del rompecabezas 1: el ADN es una doble hélice

Después del primer intento fallido de un modelo de ADN, Crick volvió a la cristalografía de rayos X de proteínas, en particular, la queratina, la principal proteína del cabello. La queratina está formada por hélices de cadenas polipeptídicas. Crick, Cochran y Vand desarrollaron una teoría sobre cómo debería verse el patrón de rayos X de una hélice como una característica definitoria: un patrón de manchas en forma de X.

Watson, un genetista bacteriano de formación, ni físico ni cristalógrafo, comenzó a aprender la difracción de rayos X de Crick y otros en Cavendish. Gracias al trabajo de Crick sobre estructuras helicoidales y a través de sus constantes discusiones, Watson comprendió que un patrón de manchas en forma de X en una fotografía de rayos X significaba una estructura helicoidal. Impulsado con ese conocimiento, Watson supo instantáneamente que el ADN era una hélice cuando vio la fotografía 51 el 30 de enero en King's College.

Las líneas espaciadas regularmente que componen el patrón en forma de X de la fotografía 51 también proporcionaron a Watson otra pieza crítica de información: la distancia de repetición de la hélice (34 Å ver Dig Deeper 3). Esta es la distancia en la que la cadena de ADN se retuerce y llega al mismo punto relativo a lo largo del eje (Figura 12). Ahora Watson y Crick conocían tres parámetros numéricos críticos para hacer un modelo 3D: la distancia de repetición de la hélice (34 Å), el ancho de la molécula (20 Å) y el espaciado de la escalera entre las bases (3.4 Å).

Watson volvió rápidamente a la construcción de modelos. Sin embargo, basándose en su inspección de la fotografía 51, Watson no sabía si la estructura helicoidal del ADN estaba formada por una, dos o tres cadenas. Supuso que podrían ser dos cadenas orientadas en la misma dirección. Sin embargo, su modelo no estaba funcionando. Quizás algo andaba mal.

Figura 12 Basándose en su inspección de la fotografía 51 de Franklin, Watson dedujo que el ADN era una especie de estructura helicoidal con una distancia de repetición de 34 Å. No sabía cuántas hebras había en la estructura helicoidal, pero hizo una suposición inicial de que eran dos hebras orientadas en la misma dirección.

Pieza del rompecabezas 2: el ADN se compone de dos hebras que corren en direcciones opuestas

Con Watson atascado en su modelado, fue Crick quien proporcionó la siguiente información crítica. El grupo de liderazgo de los Laboratorios Cavendish recibió un informe de progreso del King's College que estuvo disponible para Crick. La información se había presentado públicamente anteriormente y, a primera vista, podría no haber parecido muy útil. Sin embargo, Crick se apoderó de una frase que describe el ADN en forma de A como "monoclínico centrado en la cara". Este detalle técnico proporcionó información sobre la simetría de moléculas en la fibra de ADN. Crick se dio cuenta, lo que Wilkins y Franklin no supieron en ese momento, que esta simetría significaba que el ADN estaba compuesto por dos partes idénticas, una coincidente con la otra pero en una orientación inversa. Crick dedujo que el ADN debe estar formado por dos hebras orientadas en direcciones opuestas (Figura 13). Extrapolando que la simetría del ADN en forma A también es cierta para el ADN en forma B, Watson y Crick ahora estaban seguros de que el ADN es una doble hélice y ahora conocían la orientación de las hebras.

Figura 13 Crick obtiene una idea de los datos de rayos X de que el ADN es una doble hélice compuesta por dos hebras orientadas en direcciones opuestas.

Pregunta del explorador: Está construyendo un modelo de escalera de caracol de la doble hélice de ADN con una distancia de repetición de 34 Å. En una escalera de caracol, los escalones se desplazan en un ángulo específico. ¿Qué ángulo introducirías entre las bases de tu modelo de ADN? (Sugerencia: use la información de Florence Bell sobre la distancia entre las bases, así como la distancia de repetición revelada por la fotografía 51 de Rosalind Franklin).

Respuesta: Una vuelta completa de la doble hélice es de 34 Å. La distancia entre las bases es de 3,4 Å. Por lo tanto, diez bases hacen un giro completo de la hélice. El desplazamiento angular entre dos bases adyacentes sería

36 ° (360 ° (una rotación completa) / 10 bases).

Pieza del rompecabezas 3: El emparejamiento de bases complementario mantiene las dos hebras juntas

Los datos de rayos X del ADN en forma A y B revelaron una doble hélice con una distancia de repetición de 34 Å y las hebras corriendo en direcciones opuestas. Pero Watson y Crick carecían de más detalles. ¿Dónde están las bases? ¿Qué mantiene unidas las dos hebras?

El modelo de 1951 de Watson y Crick y el modelo de 1953 de Pauling colocaron los fosfatos en el centro. Después de haber sido alertados por Franklin sobre los problemas con esta orientación, Watson y Crick comenzaron a construir modelos con las bases colocadas en el centro y los fosfatos en el exterior.

Watson comenzó apilando bases cada 3.4 Å, como en el modelo de Florence Bell (Pista 3). Pero a diferencia del modelo de Bell, que era de una sola hebra, Watson tuvo que buscar formas plausibles en las que las bases pudieran interactuar para mantener unidas las dos hebras de la doble hélice. Una fuerza de atracción bien conocida es un enlace de hidrógeno, que involucra a un donante de hidrógeno que interactúa con un "aceptor" (generalmente un átomo electronegativo como nitrógeno (N) u oxígeno (O)) (consulte la Descripción general del conocimiento). Watson comenzó a buscar posibles formas en las que se pudieran formar enlaces de hidrógeno entre bases a través de la doble hélice.

Para comenzar este esfuerzo, Watson buscó las estructuras químicas de las bases en un libro de texto bien considerado. (¡Como verá pronto, no siempre puede confiar en lo que lee en un libro de texto!). A Watson se le ocurrió lo que pensó que era una solución: me gusta interactúa con me gusta. En esta idea de emparejamiento de bases homo (que significa "mismo"), la adenina se empareja con adenina, guanina con guanina, citosina con citosina y timina con timina (Figura 14).

Figura 14 Modelo de Watson para el emparejamiento homo entre bases idénticas (un modelo incorrecto y de corta duración). Los enlaces covalentes se indican con líneas continuas y los enlaces de hidrógeno se indican con líneas discontinuas.

Pregunta del explorador: ¿El modelo de ADN de emparejamiento de homo bases proporciona una solución de cómo se podría replicar un gen?

Respuesta: Si. El emparejamiento homogéneo de bases es una forma de complementariedad y proporciona una regla simple sobre cómo se puede copiar una nueva hebra de ADN de una hebra preexistente. En este modelo, las dos cadenas estarían compuestas por secuencias idénticas de letras.

Pregunta del explorador: ¿Puedes pensar en un problema con este modelo de emparejamiento de bases homo?

Respuesta: El modelo tiene un gran problema para crear una doble hélice de diámetro constante. Los emparejamientos de purina (G-G y A-A) son más anchos (ya que son anillos dobles) que los emparejamientos de pirimidina (T-T y C-C) (bases de un solo anillo), lo que da como resultado una variación en el ancho de la molécula.

Pregunta del explorador: ¿El modelo de emparejamiento de bases homo es coherente con los datos de Chargaff?

Respuesta: No. El modelo de emparejamiento de homo bases no proporciona una justificación de por qué la relación de G a C y A a T son ambas iguales a 1.

Watson estaba entusiasmado con el modelo de emparejamiento de bases homo porque proporcionaba una regla simple para replicar un gen. Sin embargo, hubo problemas con el modelo, como se discutió en las Preguntas del Explorador arriba.

Entonces, ocurrió otro evento fortuito en el mes mágico. Jerry Donohue, un experto en química de bases de nucleótidos, estaba de visita en el Laboratorio Cavendish y fue asignado a trabajar en la misma habitación que Watson y Crick. Cuando Watson presentó su modelo de emparejamiento de bases homo, Donohue le dijo que las estructuras químicas del "libro de texto" para la guanina y la timina probablemente eran incorrectas. Las bases de nucleótidos pueden adoptar dos estructuras químicas ligeramente diferentes, llamadas tautómeros, que contienen el mismo conjunto de átomos pero difieren en la posición de un solo átomo de hidrógeno. Si bien esta diferencia es pequeña, es muy importante para determinar el conjunto correcto de enlaces de hidrógeno entre las bases. Donohue dijo que los tautómeros de guanina y timina utilizados en el modelo de emparejamiento de bases homo de Watson probablemente eran incorrectos. Si uno tiene la idea o el modelo equivocados, lo mejor que puede pasar es descartarlo rápidamente. El modelo de Watson se deshizo en un lapso de dos días.

Ahora, utilizando las estructuras de base correctas descritas por Donohue, Watson comenzó a construir nuevos modelos el 28 de febrero de 1953. Comenzó a jugar con pedazos de cartón recortados en las formas de las cuatro bases, buscando formas en las que pudieran interactuar.Luego vino lo que se puede considerar el "momento eureka" en la historia de la doble hélice del ADN, como fue recreado por Jim Watson muchos años después en este breve video (Video 3). Ese mismo día, Watson y Crick disfrutaron de una pinta de celebración en el Eagle Pub, anunciando el "secreto de la vida" a una clientela bebedora de cerveza que tal vez no haya apreciado completamente el significado histórico del momento.

Video 3 Jim Watson recuerda cómo encontró el emparejamiento correcto de las bases en el ADN. Este videoclip se derivó de un video más largo sobre la doble hélice realizado por HHMI Biointeractive. https://www.biointeractive.org/classroom-resources/double-helix

Lo que Watson descubrió el 28 de febrero de 1953 fueron algunas reglas de emparejamiento de bases muy simples. La guanina (la estructura tautomérica señalada por Donohue) formó enlaces de hidrógeno coincidentes con la citosina. Usando la estructura correcta para la timina, Watson también vio que la adenina y la timina formaban un par perfecto de enlaces de hidrógeno. Watson y Crick se dieron cuenta de que el enlace de hidrógeno G-C y A-T era el ingrediente clave necesario para mantener unida la doble hélice (Figura 15).

Figura 15 Los pares de bases de adenina con timina y guanina con citosina mantienen unida la doble hélice. Las líneas discontinuas representan los enlaces de hidrógeno que se forman entre estas bases. La columna vertebral de fosfato-azúcar está coloreada de púrpura.

Pregunta del explorador: ¿El nuevo modelo de emparejamiento de bases G-C y A-T proporcionó una solución sobre cómo se podría replicar un gen?

Respuesta: Si. Al igual que el modelo de homopareamiento, esto proporciona una regla simple para crear una hebra recién replicada a partir de una hebra de plantilla. Si la hebra parental tiene una G, entonces la hebra de la pareja que se replica debe colocar una C frente a ella.

Pregunta del explorador: ¿Por qué el modelo de emparejamiento A-T y G-C fue una mejor solución estructural que el modelo de emparejamiento homogéneo?

Respuesta: Los dos pares de purina-pirimidina (G-C y A-T) son idénticos en ancho. No importa cuál sea el orden de los nucleótidos en el ADN, el ancho de la doble hélice será constante.

Pregunta del explorador: ¿El modelo de emparejamiento básico A-T y G-C es coherente con los datos de Chargaff?

Respuesta: Si. En este modelo, hay una explicación estructural de por qué la razón de G a C y A a T es igual a 1. Sin embargo, Watson y Crick no incorporaron inicialmente los datos de Chargaff al hacer el modelo, como Crick explica en The Eighth Day de la Creación: "La paradoja de todo esto es que cuando se trataba de construir, inicialmente no usamos la idea. No lo hicimos hasta que fuimos impulsados ​​hacia ella ... Y puedo recordar el momento en que nos dimos cuenta de que, por Dios, podríamos construir una estructura en la que las bases fueran complementarias. Y explicar las proporciones de uno a uno de Chargaff de esa manera ".

Hoy, los científicos usan computadoras para construir modelos moleculares. Sin embargo, en los días previos a las computadoras, Watson y Crick construyeron un modelo físico, muy parecido a construir un modelo de avión. El taller de maquinaria del Laboratorio Cavendish cortó placas de hojalata en formas de bases, fieles a sus dimensiones relativas, pero 300.000.000 de veces más grandes que la realidad. Watson y Crick unieron las bases a una columna vertebral de azúcares y fosfatos metálicos, creando una escultura retorcida. Era un modelo del mundo biológico atómico concebido en la mente humana. La doble hélice de metal era hermosa, pero su forma no fue el avance importante. Más bien, fue la poderosa idea de complementariedad (el emparejamiento A-T y G-C). Pauling y otros pensaron que la complementariedad podría proporcionar un mecanismo para copiar un gen. Ahora, en el modelo de Watson y Crick, la complementariedad proporcionó una explicación física de cómo las dos hebras de la doble hélice del ADN se mantenían juntas. Además, proporcionó una posible explicación de cómo se replican los genes, que se discutirá en las próximas secciones Qué sucedió después y Descripción general del conocimiento. Bell, Astbury, Watson, Crick, Pauling, Wilkins y Franklin no podían imaginar al comienzo de sus estudios que una comprensión clara de la replicación genética surgiría de la estructura del ADN. Sin embargo, el hecho de que surgiera una explicación simple hizo que el modelo de doble hélice fuera aún más creíble. Como dijo Watson,

"Hubo demasiados días en los que Francis y yo nos preocupamos de que la estructura del ADN pudiera resultar superficialmente muy aburrida, lo que no sugería nada sobre su replicación o su función en el control de la bioquímica celular. Pero ahora, para mi deleite y asombro, el La respuesta resultó ser profundamente interesante ". En The Double Helix (ver referencias).

Muchos lectores de esta narrativa probablemente estén familiarizados con el juego "Clue". En este juego, los jugadores acumulan pistas, hasta que un jugador siente que ha acumulado suficientes pistas para anunciar una solución al crimen: "fue el Sr. Green quien cometió el asesinato con una Cuerda en la Biblioteca". Después de hacer el anuncio, el jugador espera ansiosamente para ver si su solución puede ser refutada por alguno de los otros jugadores.

Watson y Crick anunciaron su primer modelo de una estructura de ADN en 1951. Era demasiado pronto para que no hubieran acumulado suficientes pistas y estaban fuera del juego, al menos temporalmente. Ahora, Watson y Crick estaban listos para anunciar su nuevo modelo y ver si alguien podía derribarlo: el ADN es una doble hélice con pares de bases G-C y A-T en el centro. Se lo presentaron a Donohue y al experto en nucleótidos Alexander Todd (ver Pista 1), quienes no pudieron encontrar un defecto desde el punto de vista de la química. Llamaron a Lawrence Bragg, el jefe del Laboratorio Cavendish, quien no pudo ofrecer objeciones desde un punto de vista estructural. Entonces llegó el momento de invitar a Wilkins y Franklin a Cambridge para ver su modelo. Franklin y Wilkins supieron instantáneamente que el modelo de Watson y Crick era consistente con sus datos y, por lo tanto, era probable, aunque no seguro, correcto.

¿Qué sucedió después?

Watson y Crick presentaron a Nature un manuscrito sobre el modelo de doble hélice. Un lanzamiento de moneda decidió el orden de los autores en el papel. (Podríamos llamarlo el modelo de Crick y Watson si la moneda aterrizara de manera diferente). Franklin y Wilkins prepararon artículos separados sobre los datos de rayos X, que se enviaron a Nature en un momento similar. Los tres artículos se publicaron juntos el 25 de abril de 1953.

El artículo de Watson y Crick sobre la estructura del ADN del modelo ocupaba esencialmente una sola página impresa (consulte el artículo guiado). Dejó al lector con este mensaje provocativo:

"No se nos ha escapado que el emparejamiento específico que hemos postulado sugiere de inmediato un posible mecanismo de copia del material genético".

Watson y Crick se abstuvieron de proponer pensamientos más detallados sobre la replicación en su primer artículo, porque aún no habían visto todos los datos de rayos X de Wilkins y Franklin. Todavía no estaban seguros de si su modelo era correcto. Sin embargo, una vez que vieron los papeles de Wilkins y Franklin, se sintieron más confiados. Watson y Crick luego publicaron sus ideas más provocativas sobre la replicación del ADN en un artículo posterior de Nature publicado el 30 de mayo. En este artículo, Watson y Crick proporcionaron más información sobre el emparejamiento de bases. Sin embargo, postularon solo dos enlaces de hidrógeno para el par de bases G-C, que Pauling más tarde señaló correctamente que deberían ser tres. Incluso los papeles clásicos tienen imperfecciones. En su modelo de replicación, Watson y Crick sugirieron que los enlaces de hidrógeno que mantienen unidas las cadenas están rotos (de alguna manera) y que cada hebra individual sirve como plantilla para crear una nueva hebra complementaria. Este modelo se denominó más tarde "replicación semiconservadora" (Figura 16).

Figura 16 Replicación semiconservadora de ADN propuesta por Watson y Crick. La doble hélice se desenreda y cada hebra parental (mostrada en púrpura) actúa como plantilla para la síntesis de una nueva hebra de ADN.

El modelo de la hélice de ADN y su replicación fueron recibidos con una mezcla de entusiasmo y cautela. Pauling reconoció graciosamente que el modelo de Watson y Crick, y no el suyo, era correcto. Otros científicos se mantuvieron escépticos, al darse cuenta de que los datos del trabajo de rayos X no podían respaldar completamente los detalles del modelo Watson-Crick. Además, la hipótesis de Watson-Crick para la replicación del ADN carecía de evidencia de apoyo.

Los modelos deben probarse con experimentos. Dos científicos de 24 años, Matthew Meselson y Frank Stahl, aceptaron el desafío. Su experimento (acuñado como "el experimento más hermoso en biología") apoyó la hipótesis de Watson y Crick de replicación semiconservadora y descartó modelos competidores (Video 4). Puede aprender sobre este experimento de primera mano de Meselson y Stahl en su Experimento clave en XBio. La publicación de Meselson y Stahl de 1958 tuvo un impacto significativo en el campo. Después de ver estos resultados claros, el escepticismo sobre el modelo de Watson y Crick se desvaneció, y la aceptación del modelo de doble hélice marcó el comienzo de una nueva era de biología molecular. En el mismo año del experimento Meselson-Stahl, Arthur Kornberg anunció el descubrimiento de una enzima llamada ADN polimerasa que puede copiar ADN (discutido en el Resumen de conocimientos).

Video 4 Video de pizarra que describe el experimento Meselson-Stahl.

Curiosamente, el modelo Watson-Crick solo se probó definitivamente en 1980, cuando la estructura atómica del ADN en forma B se determinó utilizando datos de rayos X de alta resolución de un cristal en lugar de una fibra (que se muestra más adelante en el Video 6). Fue el resultado con el que soñó Rosalind Franklin, pero solo sucedería 30 años después.

¿Qué pasó con los personajes principales después de la doble hélice de ADN? Watson y Crick siguieron siendo amigos, pero se separaron por diferentes actividades científicas. Watson comenzó a trabajar en la estructura del ARN. Pero los rayos no cayeron dos veces. El ARN tiene una estructura compleja y variable, y sus esfuerzos no tuvieron éxito. Sin embargo, Watson hizo otras contribuciones importantes, incluido el descubrimiento conjunto del ARN mensajero. Francis Crick se graduó con un doctorado en 1954 a la edad de 37 años y luego centró su atención en cómo el ADN sirve como código. Crick propuso el Dogma Central, que establece que la información del ADN fluye unidireccionalmente del ADN al ARN y a la proteína (aunque el descubrimiento posterior de la transcripción inversa demostró ser una excepción a esta regla). El código se analiza brevemente en la descripción general de conocimientos, pero se tratará con más profundidad en otra narrativa.

Franklin y Wilkins también se separaron. Debido a sus dificultades en King's College, Franklin hizo arreglos para unirse a Birkbeck College en junio de 1952, solo un mes después de obtener la fotografía 51, y luego se mudó a mediados de marzo de 1953, justo después de que Watson y Crick desarrollaran su modelo de ADN. Como parte de esta transición, se le pidió a Franklin que resumiera su trabajo el 28 de enero de 1953 y luego que transfiriera sus datos de ADN al King's College. Después de dejar King's, Franklin dejó el ADN. Pasó a estudiar la estructura de los virus, publicó 17 artículos y realizó un trabajo innovador en este campo. Wilkins continuó trabajando y haciendo contribuciones importantes sobre el ADN, incluido el desarrollo de evidencia más convincente para la doble hélice utilizando datos de rayos X y la construcción de modelos más precisos.

Franklin murió de cáncer a la edad de 37 años en 1958, 4 años antes de que se concediera el Premio Nobel por la estructura del ADN. Antes de su muerte, no había amargura entre Franklin y Watson y Crick, por el contrario, desarrolló una amistad con ambos e incluso se quedó en la casa de Crick en Cambridge mientras se recuperaba de sus tratamientos para el cáncer.

La estructura regular y simple del ADN fue mucho más fácil de resolver que las de las proteínas y los ARN, que tienen formas más complejas. Sin embargo, relativamente poco después de la doble hélice, Max Perutz y John Kendrew en el Laboratorio Cavendish lograron resolver la estructura 3D de la mioglobina, una proteína que transporta oxígeno del músculo que es similar a la hemoglobina. Ahora, se han resuelto más de 150.000 estructuras de proteínas, y la predicción experimental de la estructura de las proteínas sigue siendo muy difícil incluso con las supercomputadoras modernas. Cada una de esas estructuras de proteínas cuenta una historia interesante, aunque el ADN todavía ocupa el trono como la estructura más iluminadora e impactante de todos los tiempos.

La Figura 17 resume el viaje científico del ADN, comenzando con los guisantes de Mendel. Pero la línea de tiempo comienza al menos un par de miles de millones de años antes. En ese momento, existía una molécula de ADN con la misma estructura que se encuentra hoy. Ese ADN se propagó y evolucionó, produciendo finalmente seres capaces de descifrar la estructura de la molécula responsable de su propia existencia.

Figura 17 Cronología de algunos de los principales avances en genética y tecnología del ADN.

Respuestas de biología

1. A: Todos los organismos comienzan su vida como una sola célula.
2. B: Los científicos sugieren que la evolución se ha producido a través de un proceso llamado selección natural.
3. D: Los dos tipos de medición importantes en ciencia son cuantitativos (cuando se usa un resultado numérico) y cualitativos (cuando se informan descripciones o cualidades).
4. C: Un espermatozoide normal debe contener uno de cada uno de los pares de cromosomas humanos. Hay 23 pares de cromosomas en total. De estos, 22 son cromosomas autosómicos, que no juegan un papel en la determinación del género. El par restante consta de dos cromosomas X en el caso de una mujer o de un cromosoma X e Y en el caso de un hombre. Por lo tanto, un espermatozoide normal contendrá 22 cromosomas autosómicos y un cromosoma X o Y, pero no ambos.
5. E: Todos los organismos vivos de la Tierra utilizan el mismo código genético triplete en el que una secuencia de tres nucleótidos llamada codón proporciona información correspondiente a un aminoácido particular que se agregará a una proteína. Por el contrario, muchos organismos, especialmente ciertos tipos de bacterias, no utilizan oxígeno. Estos organismos viven en ambientes pobres en oxígeno y pueden producir energía a través de la fermentación. Otros organismos pueden vivir en ambientes oscuros, como en cuevas o bajo tierra. Muchos organismos se reproducen asexualmente por gemación o autofertilización, y solo los organismos evolutivamente más avanzados hacen uso de neurotransmisores en sus sistemas nerviosos.
6. B: La reproducción sexual permite que la información genética de dos padres se mezcle. Pueden ocurrir eventos de recombinación entre las dos copias parentales de genes individuales, creando nuevos genes. La producción de nuevos genes y de nuevas combinaciones de genes conduce a un aumento de la diversidad dentro de la población, lo que es una ventaja en términos de adaptación a los cambios del medio.
7. A: La segunda parte del nombre científico de un organismo es su especie. El sistema de denominación de especies se denomina nomenclatura binomial. El primer nombre es el género y el segundo nombre es la especie. En la nomenclatura binomial, especie es la designación más específica. Este sistema permite utilizar el mismo nombre a nivel mundial para que los científicos puedan comunicarse entre sí. El género y la especie son solo dos de las categorías en la clasificación biológica, también conocida como taxonomía. Los niveles de clasificación, del más general al más específico, son reino, filo, clase, orden, familia, género y especie. Como se muestra, la nomenclatura binomial incluye solo las dos categorías más específicas.
8. D: La fisión es el proceso de división de una célula bacteriana en dos nuevas células. La fisión es una forma de reproducción asexual en la que un organismo se divide en dos componentes, cada una de estas dos partes se convertirá en un organismo distinto. Las dos células, conocidas como células hijas, son idénticas. La mitosis, por otro lado, es la parte de la división celular eucariota en la que se divide el núcleo celular. En la meiosis, los cromosomas homólogos en una célula diploide se separan, reduciendo a la mitad el número de cromosomas en cada célula. En la replicación, una célula crea copias duplicadas de ADN.
9. A: Las células bacterianas no contienen mitocondrias. Las bacterias son procariotas compuestas por células individuales, sus paredes celulares contienen peptidoglicanos y las funciones que normalmente se realizan en las mitocondrias se realizan en la membrana celular de la célula bacteriana. El ADN es el ácido nucleico que contiene la información genética del organismo. Tiene forma de doble hélice. El ADN puede reproducirse y sintetizar ARN. Una vesícula es una pequeña cavidad que contiene líquido. Un ribosoma es una partícula diminuta compuesta de ARN y proteína en la que se construyen polipéptidos.


ADN de 'cuádruple hélice' descubierto en células humanas

En 1953, los investigadores de Cambridge Watson y Crick publicaron un artículo que describía la estructura del ADN de "doble hélice" entrelazada, el código químico de toda la vida.

Ahora, en el año del 60 aniversario de ese hito científico, los investigadores de Cambridge han publicado un artículo que demuestra que las estructuras de ADN de cuatro hebras de 'cuádruple hélice', conocidas como G-cuádruples, también existen dentro del genoma humano. Se forman en regiones de ADN que son ricas en el bloque de construcción guanina, generalmente abreviado como 'G'.

Los hallazgos marcan la culminación de más de 10 años de investigación por parte de científicos para mostrar estas estructuras complejas in vivo, en células humanas vivas, trabajando desde lo hipotético, a través de modelos computacionales hasta experimentos de laboratorio sintéticos y finalmente la identificación en células cancerosas humanas utilizando biomarcadores fluorescentes. .

La investigación, publicada el 20 de enero en Química de la naturaleza y financiado por Cancer Research UK, muestra vínculos claros entre las concentraciones de cuádruplex de cuatro hebras y el proceso de replicación del ADN, que es fundamental para la división y producción celular.

Al apuntar a los cuadruplex con moléculas sintéticas que atrapan y contienen estas estructuras de ADN, evitando que las células repliquen su ADN y, en consecuencia, bloqueando la división celular, los científicos creen que puede ser posible detener la proliferación celular descontrolada en la raíz del cáncer.

"Estamos viendo vínculos entre atrapar los cuádruplex con moléculas y la capacidad de detener la división de las células, lo cual es muy emocionante", dijo el profesor Shankar Balasubramanian del Departamento de Química de la Universidad de Cambridge y el Instituto de Investigación de Cambridge, cuyo grupo produjo la investigación.

"La investigación indica que es más probable que los cuádruplex ocurran en genes de células que se dividen rápidamente, como las células cancerosas. Para nosotros, apoya firmemente un nuevo paradigma que debe investigarse: el uso de estas estructuras de cuatro hebras como dianas para tratamientos personalizados. en el futuro."

Los estudios físicos realizados durante las últimas dos décadas habían demostrado que el ADN cuádruplex se puede formar in vitro, en el "tubo de ensayo", pero la estructura se consideró más una curiosidad que una característica que se encuentra en la naturaleza. Los investigadores ahora saben por primera vez que realmente se forman en el ADN de las células humanas.

"Esta investigación destaca aún más el potencial de explotar estas estructuras de ADN inusuales para vencer al cáncer; la siguiente parte de este proceso es descubrir cómo apuntar a ellas en las células tumorales", dijo la Dra. Julie Sharp, gerente senior de información científica de Cancer Research UK .

"Han pasado sesenta años desde que se resolvió su estructura, pero un trabajo como este nos muestra que la historia del ADN sigue dando vueltas y vueltas".

El estudio publicado el 20 de enero fue dirigido por Giulia Biffi, investigadora del laboratorio de Balasubramaninan en el Cambridge Research Institute.

Basándose en investigaciones anteriores, Biffi pudo generar proteínas de anticuerpos que detectan y se unen a áreas en un genoma humano rico en ADN estructurado cuádruplex, lo que demuestra su existencia en células humanas vivas.

Usando fluorescencia para marcar los anticuerpos, los investigadores pudieron identificar 'puntos calientes' para la aparición de ADN de cuatro hebras, tanto en qué lugar del genoma como, fundamentalmente, en qué etapa de la división celular.

Si bien el ADN cuádruplex se encuentra de manera bastante consistente en todo el genoma de las células humanas y sus ciclos de división, se mostró un marcado aumento cuando la tinción fluorescente se hizo más intensa durante la 'fase s', el punto en un ciclo celular donde el ADN se replica antes que el la célula se divide.

Los cánceres generalmente son impulsados ​​por genes llamados oncogenes que han mutado para aumentar la replicación del ADN, lo que hace que la proliferación celular se salga de control y provoque el crecimiento del tumor.

El aumento de la tasa de replicación del ADN en los oncogenes conduce a una intensidad en las estructuras cuádruples. Esto significa que la actividad celular potencialmente dañina puede dirigirse con moléculas sintéticas u otras formas de tratamientos.

"Hemos descubierto que al atrapar el ADN cuádruple con moléculas sintéticas podemos secuestrarlas y estabilizarlas, proporcionando información importante sobre cómo podríamos detener la división celular", dijo Balasubramanian.

"Hay muchas cosas que aún no sabemos. Una idea es que estas estructuras cuádruples podrían ser un poco molestas durante la replicación del ADN, como nudos o marañas que se forman.

"¿Evolucionaron para una función? Es una cuestión filosófica en cuanto a si están ahí por diseño o no, pero existen y la naturaleza tiene que lidiar con ellos. Tal vez al enfocarlos estamos contribuyendo a la disrupción que causan".

El estudio mostró que si se usa un inhibidor para bloquear la replicación del ADN, los niveles cuádruples bajan, lo que demuestra la idea de que el ADN es dinámico, con estructuras que se forman y no forman constantemente.

Los investigadores también encontraron previamente que un gen hiperactivo con niveles más altos de ADN Quadruplex es más vulnerable a la interferencia externa.

"Los datos apoyan la idea de que ciertos genes del cáncer pueden ser interferidos de manera útil por pequeñas moléculas diseñadas para unirse a secuencias de ADN específicas", dijo Balasubramanian.

"Muchos tratamientos actuales contra el cáncer atacan el ADN, pero no está claro cuáles son las reglas. Ni siquiera sabemos en qué parte del genoma reaccionan algunos de ellos; puede ser un enfoque disperso.

“La posibilidad de que células cancerosas particulares que albergan genes con estos motivos ahora puedan ser atacadas, y parecen ser más vulnerables a la interferencia que las células normales, es una perspectiva emocionante.

"La estructura de ADN de 'cuádruple hélice' bien puede ser la clave para nuevas formas de inhibir selectivamente la proliferación de células cancerosas. La confirmación de su existencia en células humanas es un verdadero hito".


Tn7: más inteligente de lo que pensamos

Los transposones, una clase de elementos genéticos móviles, son de naturaleza generalizada y están presentes en prácticamente todos los organismos que se han examinado. El transposón bacteriano Tn7 es de particular interés debido a su capacidad para utilizar varios tipos diferentes de sitios diana. Las vías de selección de sitios diana altamente evolucionadas de Tn7 ayudan a su dispersión entre poblaciones bacterianas al dirigir inserciones en plásmidos, pero desalientan cualquier inserción aleatoria potencialmente dañina en cromosomas bacterianos.

Las proteínas Tn7 TnsA, TnsB y TnsC constituyen la maquinaria central para la transposición de Tn7. TnsA y TnsB colaboran para formar la transposasa. La TnsC es un regulador de la actividad de la transposasa, que se comunica entre la transposasa TnsAB y las proteínas de selección de sitios diana alternativos, TnsD y TnsE.

Cuando la proteína TnsE se utiliza con la maquinaria central de TnsABC, Tn7 dirige preferentemente las inserciones en plásmidos conjugables, que pueden moverse entre las células. La interacción entre TnsE y una estructura que está asociada con la replicación del ADN de la hebra retrasada es probablemente crucial para el reconocimiento de la diana en esta vía.

Cuando la proteína TnsD se utiliza con la maquinaria central, las inserciones se dirigen a un solo sitio en el cromosoma bacteriano, llamado attTn7. Este sitio está muy conservado entre los cromosomas bacterianos. TnsD reconoce específicamente attTn7 e induce una distorsión en el extremo 5 'del sitio de unión que probablemente sea crucial en el reclutamiento de TnsC. Los resultados de la huella indican que TnsC podría formar una plataforma debajo del ADN diana para recibir y activar la transposasa TnsAB para llevar a cabo la recombinación.

TnsC actúa como un regulador de la transposición de Tn7 por su capacidad para interactuar tanto con la transposasa TnsAB como con el ADN diana que está unido por TnsD o TnsE. La TnsC también es responsable de la inmunidad a los transposones, un proceso que impide que se produzcan inserciones en un ADN diana cuando una copia de Tn7 ya reside en ese ADN. TnsC podría utilizar un mecanismo similar al interruptor molecular Ras para equilibrar las diversas señales "ON" y "OFF" que controlan la transposición.

La investigación futura con Tn7 debería proporcionar más información sobre cómo las máquinas multiproteínas se ensamblan en el ADN en la replicación, reparación y recombinación.


Ver el vídeo: Triplex DNA and Hoogsteen Base Pairing (Junio 2022).