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4.11.7: Virus de ADN bicatenario - Virus de la viruela - Biología

4.11.7: Virus de ADN bicatenario - Virus de la viruela - Biología



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Los poxvirus son una familia de virus de ADN grandes, complejos y con envoltura que infectan a una variedad de huéspedes vertebrados e invertebrados.

Objetivos de aprendizaje

  • Examinar los virus de la viruela por su relevancia para la investigación y las enfermedades humanas

Puntos clave

  • El más famoso de los poxvirus fue la viruela. La viruela es una de las dos enfermedades infecciosas que se han erradicado, la otra es la peste bovina, que fue declarada erradicada en 2011.
  • La forma infecciosa más abundante y más simple de la partícula de poxvirus, el virión maduro, consiste en el genoma del ADN viral encerrado en un núcleo proteico y una membrana lipoproteica externa.
  • Los poxvirus exhiben un programa de expresión génica regulado temporalmente: los genes tempranos, intermedios y tardíos impulsan la replicación del ADN seguida de la expresión de proteínas estructurales necesarias para el ensamblaje del virión de la progenie.

Términos clave

  • recombinante: Este término se refiere a algo formado al combinar elementos existentes en una nueva combinación. Por lo tanto, la frase ADN recombinante se refiere a un organismo creado en el laboratorio al agregar ADN de otra especie.
  • lipoproteína: Cualquiera de un gran grupo de complejos de proteínas y lípidos con muchas funciones bioquímicas.

Los poxvirus son una familia de virus de ADN grandes, complejos y con envoltura que infectan a una variedad de huéspedes vertebrados e invertebrados. Los poxvirus son importantes tanto desde el punto de vista médico como científico debido a su amplia distribución, patogenicidad y ciclo de vida replicativo citoplasmático. Varios miembros destacados, incluidos el virus de la variola (agente causante de la viruela), el virus del molusco contagioso (causa de una infección cutánea común en niños pequeños y adultos inmunodeprimidos) y el virus de la viruela del simio (agente de una enfermedad similar a la viruela en algunas partes de África), son de considerable preocupación por la salud pública y la biodefensa.

El más famoso de los poxvirus fue la viruela. La viruela era una enfermedad infecciosa exclusiva de los seres humanos, causada por cualquiera de las dos variantes del virus, Variola major y Variola minor. La enfermedad también se conoce con los nombres latinos Variola o Variola vera, que es un derivado del latín varius, que significa "manchado", o varus, que significa "espinilla". ”El término" viruela "se utilizó por primera vez en Gran Bretaña en los 15th siglo para distinguir la variola de la "gran viruela" (sífilis). El último caso natural de viruela (Variola minor) fue diagnosticado el 26 de octubre de 1977. Después de las campañas de vacunación a lo largo del 19th y 20thsiglos, la Organización Mundial de la Salud (OMS) certificó la erradicación de la viruela en 1979. La viruela es una de las dos enfermedades infecciosas que han sido erradicadas, la otra es la peste bovina, que fue declarada erradicada en 2011.

El poxvirus prototípico y más estudiado, el virus vaccinia (VACV), sirve como una vacuna eficaz contra la viruela, una plataforma para vacunas recombinantes contra otros patógenos y un vector de expresión génica eficaz para la investigación básica. A lo largo de su genoma de ADN bicatenario de aproximadamente 195 kpb, el VACV codifica aproximadamente 200 proteínas, que varían en función desde el ARN viral y la síntesis de ADN y el ensamblaje del virión hasta la modulación de las defensas inmunitarias del huésped.

La forma infecciosa más abundante y más simple de la partícula de poxvirus, el virión maduro (MV), consiste en el genoma de ADN viral encerrado en un núcleo proteico y una membrana lipoproteica externa con aproximadamente 60 y 25 proteínas virales asociadas, respectivamente. Tras la unión a las superficies celulares y la fusión con el plasma o la membrana endosomal, la replicación del poxvirus se inicia mediante la entrada del núcleo viral en el citoplasma, donde tienen lugar todos los pasos posteriores del ciclo de vida. Los núcleos de poxvirus albergan la ARN polimerasa dependiente del ADN viral y los factores de transcripción necesarios para la expresión de genes tempranos, que constituyen casi la mitad del genoma viral y codifican proteínas necesarias para la replicación del ADN y la transcripción de genes intermedios, así como un gran número de inmunomoduladores.

Los poxvirus exhiben un programa de expresión génica regulado temporalmente, es decir, la expresión de genes tempranos que codifican la replicación del ADN y factores de transcripción intermedios desencadena la expresión de genes intermedios que codifican factores de transcripción específicos de genes tardíos. Los productos de genes tardíos consisten principalmente en proteínas estructurales necesarias para el ensamblaje del virión de la progenie, así como de las enzimas destinadas a la incorporación en los viriones de la progenie y que se utilizan para la expresión génica temprana durante la siguiente ronda de infección. El montaje del MV implica más de 80 productos génicos virales. Además, durante el tránsito a través del citoplasma, un subconjunto de MV de la progenie adquiere dos bicapas de membrana adicionales, una de las cuales se pierde durante la exocitosis de la partícula, para producir el virión envuelto (EV) menos abundante. Por lo tanto, un EV es esencialmente un MV con una membrana adicional en la que se asocian al menos seis proteínas únicas. Los EV son antigénicamente distintos de los MV y son importantes para la diseminación eficaz del virus en el huésped infectado y la protección contra las defensas inmunitarias. Por el contrario, las VM se liberan tras la lisis celular y pueden ser importantes para la transmisión de animal a animal.


Los investigadores descubren cómo los poxvirus como la viruela evolucionan rápidamente, a pesar de las bajas tasas de mutación

SEATTLE - 16 de agosto de 2012 - Los poxvirus, un grupo de virus que contienen ADN que incluye la viruela, son responsables de una amplia gama de enfermedades en humanos y animales. Son muy virulentos y pueden cruzar las barreras de las especies, pero cómo lo hacen ha sido en gran parte un misterio debido a sus bajas tasas de mutación.

Si bien la Organización Mundial de la Salud consideró oficialmente erradicada la viruela en 1980, las preocupaciones sobre su uso como agente de bioterrorismo y el hallazgo de que otros poxvirus, como la viruela del simio, pueden transmitirse de animales a humanos, han despertado un renovado interés en comprender cómo reproducir exactamente. Tener esta información a mano podría conducir al desarrollo de mejores estrategias antivirales.

Una nueva investigación de científicos del Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson e instituciones colaboradoras ha descubierto cómo los poxvirus evolucionan para adaptarse rápidamente contra las defensas del huésped, a pesar de sus bajas tasas de mutación.

El descubrimiento proporciona una nueva perspectiva sobre cómo los virus de ADN de doble cadena grandes evaden la inmunidad del huésped y se vuelven resistentes a los medicamentos, y tiene implicaciones particulares para comprender los mecanismos de transmisión de enfermedades infecciosas entre animales y humanos.

El autor principal Harmit S. Malik, Ph.D., miembro de la División de Ciencias Básicas del Centro Hutchinson, y el primer autor Nels C. Elde, Ph.D., ex investigador postdoctoral en el laboratorio de Malik, describen sus hallazgos en línea antes de la Edición impresa del 17 de agosto de Celda.

"Los poxvirus codifican una variedad de genes que los ayudan a contrarrestar las defensas inmunitarias del huésped y promover la infección", dijo Elde, ahora profesor asistente de genética humana en la Facultad de Medicina de la Universidad de Utah. "A pesar de la amplia evidencia de que el genoma del poxvirus puede sufrir cambios adaptativos para superar las defensas del huésped en evolución, todavía no sabemos mucho sobre los mecanismos involucrados en esa adaptación".

Para determinar los mecanismos de adaptación, Elde, Malik y sus colegas llevaron a cabo un experimento en cultivo celular utilizando el virus vaccinia, el tipo de poxvirus utilizado en la vacuna contra la viruela, para imitar la adaptación y evolución viral como ocurre en la naturaleza.

Investigaciones anteriores habían demostrado que una proteína de defensa del huésped llamada proteína quinasa R (PKR) es un obstáculo importante para la infección por poxvirus. En respuesta, los poxvirus han evolucionado para superar la PKR al codificar dos genes, K3L y E3L, que frustran los mecanismos de defensa del huésped que normalmente previenen la infección viral.

El equipo estudió cómo el virus vaccinia, cuando se modificó para eliminar el gen E3L, evolucionó para replicarse con éxito en presencia de PKR humana.

"Dramáticamente, la propagación en serie de este virus 'más débil' resultó rápidamente en cepas que se volvieron mucho más exitosas en la replicación en células humanas", dijo Malik, quien también es un científico de carrera temprana del Instituto Médico Howard Hughes.

Un examen más detenido de su modo de adaptación reveló que el virus fue capaz de vencer rápidamente a PKR aumentando selectivamente el número de copias del gen K3L en su genoma.

Malik comparó esta rápida adaptación con la expansión de los fuelles de un acordeón musical. "A medida que aumentaba el número de copias de K3L en las rondas posteriores de replicación, también lo hacía la expresión de la proteína K3L y la posterior inhibición de la respuesta inmune", dijo. Esto demostró que los virus que pueden expandir rápidamente su genoma tienen una ventaja evolutiva inmediata sobre los que no pueden.

En una extensión adicional de la analogía del acordeón, además de observar una rápida expansión genética en la cepa de vaccinia deficiente en E3L, los investigadores también observaron que el virus se contraía después de adquirir una mutación adaptativa, intercambiando una mutación beneficiosa por una huella genómica más pequeña.

“Nuestros estudios sugieren que a pesar de su naturaleza transitoria, las expansiones de genes pueden proporcionar un medio potente de adaptación en los poxvirus, permitiéndoles sobrevivir a desafíos inmunes o farmacológicos”, dijo Malik. “Reconocer los medios por los que se someten a esta expansión puede proporcionar estrategias antivirales más efectivas contra estos patógenos importantes e importantes relacionados”.

Los Institutos Nacionales de Salud, la Fundación Nacional de Ciencias, el Instituto Médico Howard Hughes y la Fundación de Investigación en Ciencias de la Vida financiaron la investigación. Además de los investigadores del Centro Hutchinson y la Facultad de Medicina de la Universidad de Utah, el estudio también involucró a colaboradores de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington.


Los investigadores revelan el funcionamiento interno de un motor de empaquetado de ADN viral

IMAGEN: Un trío de estudios ha revelado cómo funciona un motor de empaquetado de ADN viral, lo que potencialmente proporciona información para nuevas terapias o máquinas moleculares sintéticas. Cada una de las cinco proteínas se aprieta. Ver más

Crédito: Joshua Pajak, Universidad de Duke

DURHAM, Carolina del Norte - Un grupo de investigadores ha descubierto el funcionamiento interno detallado del motor molecular que empaqueta el material genético en virus de ADN de doble hebra. El avance proporciona información sobre un paso crítico en el ciclo de reproducción de virus como el pox-herpes y los adenovirus. También podría inspirar a los investigadores que crean máquinas microscópicas basadas en biomotores naturales.

La investigación fue realizada por científicos de la Universidad de Duke, la Universidad de Minnesota, la Universidad de Massachusetts y la Rama Médica de la Universidad de Texas (UTMB). Los resultados aparecen en línea en una trilogía de artículos publicados en Avances de la ciencia, procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias y Investigación de ácidos nucleicos.

"Faltaban varias piezas de información que nos impidieron comprender cómo funcionan estos tipos de motores de empaque de ADN, lo que obstaculizó nuestra capacidad para diseñar terapias o desarrollar nuevas tecnologías", dijo Gaurav Arya, profesor de ingeniería mecánica y ciencia de los materiales, ingeniería biomédica. y química en Duke. "Pero con nuevos conocimientos y simulaciones, pudimos armar un modelo de este fantástico mecanismo, que es el más detallado jamás creado para este tipo de sistema".

Los virus vienen en muchas variedades, pero su clasificación generalmente depende de si codifican sus planos genéticos en ARN o en ADN monocatenario o bicatenario. La diferencia importa de muchas maneras y afecta la forma en que el material genético se empaqueta en nuevos virus. Mientras que algunos virus construyen un contenedor de proteínas llamado cápside alrededor del ARN o ADN recién producido, otros crean primero la cápside y luego la llenan con el material genético.

La mayoría de los virus de ADN de doble hebra toman la última ruta, lo que presenta muchos desafíos. El ADN está cargado negativamente y no quiere amontonarse en un espacio pequeño. Y está empaquetado en una estructura extremadamente densa, casi cristalina, que también requiere mucha fuerza.

"El beneficio de esto es que, cuando el virus está listo para infectar una nueva célula, la presión ayuda a inyectar ADN en la célula una vez perforada", dijo Joshua Pajak, un estudiante de doctorado que trabaja en el laboratorio de Arya. "Se ha estimado que la presión supera los 800 PSI, que es casi diez veces la presión en una botella de champán tapada con corcho".

Forzar el ADN en una cápside diminuta a esa cantidad de presión requiere un motor extremadamente potente. Hasta hace poco, los investigadores solo tenían una vaga idea de cómo funcionaba ese motor debido a lo difícil que es visualizarlo. El motor solo se ensambla en la partícula de virus, que es enorme en comparación con el motor.

"Tratar de ver el motor conectado al virus es como tratar de ver los detalles en la antorcha de la Estatua de la Libertad tomando una foto de toda la estatua", dijo Pajak.

Pero en una conferencia reciente, Pajak se enteró de que Marc Morais, profesor de bioquímica y biología molecular en UTMB, y Paul Jardine, profesor de diagnóstico y ciencias biológicas en la Universidad de Minnesota, habían estado trabajando en este motor durante años y tenían el equipo y habilidades necesarias para ver los detalles. Algunos de sus resultados iniciales parecían coincidir con los modelos que Pajak estaba construyendo con la poca información que ya estaba disponible. El grupo se emocionó de que sus hallazgos separados convergieran hacia un mecanismo común y rápidamente se dispusieron a resolver juntos el misterio del motor viral.

En un artículo publicado en Avances de la ciencia, Morais y sus colegas resolvieron los detalles de todo el motor en una de sus configuraciones. Descubrieron que el motor está formado por cinco proteínas unidas entre sí en una formación similar a un anillo. Cada una de estas proteínas es como dos ventosas con un resorte en el medio, lo que permite que la parte inferior se mueva verticalmente en una formación helicoidal para que pueda agarrarse a la columna vertebral helicoidal del ADN.

"Debido a que se pueden colocar alrededor de 100.000 de estos motores en la cabeza de un pasador y todos se mueven, verlos bien resultó difícil", dijo Morais. "Pero después de que mis colegas de la UTMB, Michael Woodson y Mark White, nos ayudaron a obtener imágenes con un microscopio crioelectrónico, un marco general del mecanismo encajó".

En un segundo artículo, publicado en Investigación de ácidos nucleicos, el grupo de Morais capturó el motor en una segunda configuración utilizando cristalografía de rayos X. Esta vez, las ventosas inferiores del motor estaban todas juntas en un anillo plano, lo que llevó a los investigadores a imaginar que el motor podría mover el ADN hacia el virus al alternar entre las dos configuraciones.

Para probar esta hipótesis, Pajak y Arya realizaron simulaciones de alto rendimiento en Anton 2, la supercomputadora más rápida disponible actualmente para ejecutar simulaciones de dinámica molecular. Sus resultados no solo respaldaron el mecanismo propuesto, sino que también proporcionaron información sobre cómo se contorsionan exactamente los engranajes del motor entre las dos configuraciones.

Mientras que las partes superiores de las proteínas permanecen unidas estáticamente a la partícula del virus, sus mitades inferiores se mueven hacia arriba y hacia abajo en un patrón cíclico impulsado por una molécula transportadora de energía llamada ATP. Una vez que todas las proteínas se han movido hacia arriba, arrastrando el ADN con ellas, las proteínas liberan el subproducto de la reacción química del ATP. Esto hace que el anillo inferior libere el ADN y vuelva a su estado helicoidal original, donde una vez más se aferran a más ATP y ADN para repetir el proceso.

"Joshua reunió muchas pistas e información para crear este modelo", dijo Arya. "Pero un modelo solo es útil si puede predecir nuevos conocimientos que aún no conocíamos".

En esencia, el modelo es una serie de acciones mecánicas que deben encajar y tener lugar en orden secuencial para que todo funcione correctamente. Las simulaciones de Pajak predijeron una serie específica de señales mecánicas que le dicen a las partes inferiores de las proteínas si deberían o no agarrar el ADN. Como una línea de dominó cayendo, eliminar una de las vías de señalización del medio debería detener la reacción en cadena y bloquear la señal.

Para validar esta predicción, los investigadores recurrieron a Jardine y sus colegas Shelley Grimes y Dwight Anderson para ver si la eliminación de una de las fichas de dominó de señalización realmente impedía que el motor empaquetara el ADN. Un tercer artículo, publicado en PNAS, muestra que el sabotaje funcionó. Después de mutar un dominó en la vía de señalización para que no pudiera funcionar, el motor aún podía unirse y quemar combustible tan bien como siempre, pero era mucho peor empaquetando el ADN.

"El nuevo mecanismo predicho por las estructuras de alta resolución y las predicciones detalladas proporcionaron un nivel de detalle mayor que nunca antes", dijo Jardine. "Esto nos permitió probar el papel de los componentes críticos del motor y, por lo tanto, evaluar la validez de este nuevo mecanismo tal como lo entendemos actualmente".

El resultado es una fuerte indicación de que el modelo está muy cerca de describir cómo se comporta el motor en la naturaleza. El grupo planea continuar con su enfoque estructural, bioquímico y de simulación altamente integrado para probar y perfeccionar el modelo propuesto. Esperan que este conocimiento fundamental pueda potencialmente usarse para algún día combatir enfermedades o crear un motor molecular sintético.

"Toda la tecnología está inspirada en la naturaleza de una forma u otra", dijo Arya. "Ahora que sabemos realmente cómo funciona este motor molecular, esperamos que inspire a otros investigadores a crear nuevos inventos utilizando estos mismos mecanismos".

Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (GM118817, GM122979, GM127365) y la Fundación Nacional de Ciencias (MCB1817338). Los datos de Cryo-EM también se recopilaron en instalaciones regionales de imágenes de crio-EM respaldadas por los NIH (1U24 GM116787-01, 1U24 GM116792-01). Las simulaciones se realizaron en la supercomputadora Anton 2 puesta a disposición por D.E. Shaw Research y alojado en el Pittsburgh Supercomputing Center a través del NIH (R01GM116961) y el superordenador Comet alojado en el San Diego Supercomputer Center a través de NSF (ACI-1053575).

"Las ATPasas de empaquetado viral utilizan un interruptor de glutamato para acoplar la actividad de la ATPasa y la translocación del ADN". Joshua Pajak, Rockney Atz, Brendan J. Hilbert, Marc C. Morais, Brian A. Kelch, Paul Jardine y Gaurav Arya. PNAS, 27 de abril de 2021118 (17) e2024928118. DOI: 10.1073 / pnas.2024928118

"Un motor de empaquetamiento del genoma viral hace una transición entre la simetría cíclica y helicoidal para translocar el dsDNA", Michael Woodson, Joshua Pajak, Bryon P. Mahler, Wei Zhao, Wei Zhang, Gaurav Arya, Mark A. White, Paul J. Jardine y Marc C. Morais. Avances de la ciencia, 07 de mayo de 2021: Vol. 7, no. 19, eabc1955. DOI: 10.1126 / sciadv.abc1955

"Base atomística de la generación de fuerza, la translocación y la coordinación en un motor de empaquetado del genoma viral", Joshua Pajak, Erik Dill2, Emilio Reyes-Aldrete, Mark A. White, Brian A. Kelch, Paul J. Jardine, Gaurav Arya1 y Marc C. Morais. Investigación de ácidos nucleicos, 2021. DOI: 10.1093 / nar / gkab372

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Los investigadores revelan el funcionamiento interno de un motor de empaquetado de ADN viral

Modelo 3D de ADN. Crédito: Michael Ströck / Wikimedia / Licencia de documentación libre GNU

Un grupo de investigadores ha descubierto el funcionamiento interno detallado del motor molecular que empaqueta el material genético en virus de ADN de doble hebra. El avance proporciona información sobre un paso crítico en el ciclo de reproducción de virus como la viruela, el herpes y los adenovirus. También podría inspirar a los investigadores que crean máquinas microscópicas basadas en biomotores naturales.

La investigación fue realizada por científicos de la Universidad de Duke, la Universidad de Minnesota, la Universidad de Massachusetts y la Rama Médica de la Universidad de Texas (UTMB). Los resultados aparecen en línea en una trilogía de artículos publicados en Avances de la ciencia, procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias y Investigación de ácidos nucleicos.

"Faltaban varias piezas de información que nos impidieron comprender cómo funcionan estos tipos de motores de empaque de ADN, lo que obstaculizó nuestra capacidad para diseñar terapias o desarrollar nuevas tecnologías", dijo Gaurav Arya, profesor de ingeniería mecánica y ciencia de los materiales, ingeniería biomédica. y química en Duke. "Pero con nuevos conocimientos y simulaciones, pudimos armar un modelo de este fantástico mecanismo, que es el más detallado jamás creado para este tipo de sistema".

Los virus vienen en muchas variedades, pero su clasificación generalmente depende de si codifican sus planos genéticos en ARN o en ADN monocatenario o bicatenario. La diferencia importa de muchas maneras y afecta la forma en que el material genético se empaqueta en nuevos virus. Mientras que algunos virus construyen un contenedor de proteínas llamado cápside alrededor del ARN o ADN recién producido, otros crean primero la cápside y luego la llenan con el material genético.

Un trío de estudios ha revelado cómo funciona un motor de empaquetado de ADN viral, lo que potencialmente proporciona información para nuevas terapias o máquinas moleculares sintéticas. Cada una de las cinco proteínas se arruga a su vez, arrastrando el ADN junto con ellas, antes de volver a liberarse en su patrón helicoidal original. Crédito: Joshua Pajak, Universidad de Duke

La mayoría de los virus de ADN de doble hebra toman la última ruta, lo que presenta muchos desafíos. El ADN está cargado negativamente y no quiere amontonarse en un espacio pequeño. Y está empaquetado en una estructura extremadamente densa, casi cristalina, que también requiere mucha fuerza.

"El beneficio de esto es que, cuando el virus está listo para infectar una nueva célula, la presión ayuda a inyectar ADN en la célula una vez perforada", dijo Joshua Pajak, un estudiante de doctorado que trabaja en el laboratorio de Arya. "Se ha estimado que la presión supera los 800 PSI, que es casi diez veces la presión en una botella de champán tapada con corcho".

Forzar el ADN en una cápside diminuta a esa cantidad de presión requiere un motor extremadamente potente. Hasta hace poco, los investigadores solo tenían una vaga idea de cómo funcionaba ese motor debido a lo difícil que es visualizarlo. El motor solo se ensambla en la partícula de virus, que es enorme en comparación con el motor.

"Tratar de ver el motor conectado al virus es como tratar de ver los detalles en la antorcha de la Estatua de la Libertad tomando una foto de toda la estatua", dijo Pajak.

Pero en una conferencia reciente, Pajak se enteró de que Marc Morais, profesor de bioquímica y biología molecular en UTMB, y Paul Jardine, profesor de diagnóstico y ciencias biológicas en la Universidad de Minnesota, habían estado trabajando en este motor durante años y tenían el equipo y habilidades necesarias para ver los detalles. Algunos de sus resultados iniciales parecían coincidir con los modelos que Pajak estaba construyendo con la poca información que ya estaba disponible. El grupo se emocionó de que sus hallazgos separados convergieran hacia un mecanismo común y rápidamente se dispusieron a resolver juntos el misterio del motor viral.

En un artículo publicado en Avances de la ciencia, Morais y sus colegas resolvieron los detalles de todo el motor en una de sus configuraciones. Descubrieron que el motor está formado por cinco proteínas unidas entre sí en una formación similar a un anillo. Cada una de estas proteínas es como dos ventosas con un resorte en el medio, lo que permite que la parte inferior se mueva verticalmente en una formación helicoidal para que pueda agarrarse a la columna vertebral helicoidal del ADN.

"Debido a que se pueden colocar alrededor de 100.000 de estos motores en la cabeza de un pasador y todos se mueven, verlos bien resultó difícil", dijo Morais. "Pero después de que mis colegas de la UTMB, Michael Woodson y Mark White, nos ayudaron a obtener imágenes con un microscopio crioelectrónico, un marco general del mecanismo encajó".

En un segundo artículo, publicado en Investigación de ácidos nucleicos, el grupo de Morais capturó el motor en una segunda configuración utilizando cristalografía de rayos X. Esta vez, las ventosas inferiores del motor estaban todas juntas en un anillo plano, lo que llevó a los investigadores a imaginar que el motor podría mover el ADN hacia el virus al alternar entre las dos configuraciones.

Para probar esta hipótesis, Pajak y Arya realizaron simulaciones de alto rendimiento en Anton 2, la supercomputadora más rápida disponible actualmente para ejecutar simulaciones de dinámica molecular. Sus resultados no solo respaldaron el mecanismo propuesto, sino que también proporcionaron información sobre cómo se contorsionan exactamente los engranajes del motor entre las dos configuraciones.

Mientras que las partes superiores de las proteínas permanecen unidas estáticamente a la partícula del virus, sus mitades inferiores se mueven hacia arriba y hacia abajo en un patrón cíclico impulsado por una molécula transportadora de energía llamada ATP. Una vez que todas las proteínas se han movido hacia arriba, arrastrando el ADN con ellas, las proteínas liberan el subproducto de la reacción química del ATP. Esto hace que el anillo inferior libere el ADN y vuelva a su estado helicoidal original, donde una vez más se aferran a más ATP y ADN para repetir el proceso.

"Joshua reunió muchas pistas e información para crear este modelo", dijo Arya. "Pero un modelo solo es útil si puede predecir nuevos conocimientos que aún no conocíamos".

En esencia, el modelo es una serie de acciones mecánicas que deben encajar y tener lugar en orden secuencial para que todo funcione correctamente. Las simulaciones de Pajak predijeron una serie específica de señales mecánicas que le dicen a las partes inferiores de las proteínas si deberían o no agarrar el ADN. Como una línea de dominó cayendo, eliminar una de las vías de señalización del medio debería detener la reacción en cadena y bloquear la señal.

Para validar esta predicción, los investigadores recurrieron a Jardine y sus colegas Shelley Grimes y Dwight Anderson para ver si la eliminación de una de las fichas de dominó de señalización realmente impedía que el motor empaquetara el ADN. Un tercer artículo, publicado en PNAS, muestra que el sabotaje funcionó. Después de mutar un dominó en la vía de señalización para que no pudiera funcionar, el motor aún podía unirse y quemar combustible tan bien como siempre, pero era mucho peor empaquetando el ADN.

"El nuevo mecanismo predicho por las estructuras de alta resolución y las predicciones detalladas proporcionaron un nivel de detalle mayor que nunca antes", dijo Jardine. "Esto nos permitió probar el papel de los componentes críticos del motor y, por lo tanto, evaluar la validez de este nuevo mecanismo tal como lo entendemos actualmente".

El resultado es una fuerte indicación de que el modelo está muy cerca de describir cómo se comporta el motor en la naturaleza. El grupo planea continuar con su enfoque estructural, bioquímico y de simulación altamente integrado para probar y perfeccionar el modelo propuesto. Esperan que este conocimiento fundamental pueda potencialmente usarse para algún día combatir enfermedades o crear un motor molecular sintético.

"Toda la tecnología está inspirada en la naturaleza de una forma u otra", dijo Arya. "Ahora que sabemos realmente cómo funciona este motor molecular, esperamos que inspire a otros investigadores a crear nuevos inventos utilizando estos mismos mecanismos".


Patogénesis

Transmisión de la influenza y mecanismos de la enfermedad

Los virus de la influenza se transmiten por grandes gotitas respiratorias al toser, estornudar o hablar o por contacto con superficies infectadas [54]. Los virus de la influenza se unen a restos de azúcar en la superficie de las células epiteliales de las vías respiratorias donde se produce la replicación, la propagación y la diseminación virales tempranas durante un promedio de 1 & # x020132 & # x000a0 días de período de incubación [55 & # x0201357]. El pico de replicación viral ocurre típicamente dentro de los 4 & # x000a0 días del inicio de los síntomas y se resuelve dentro de los 7 & # x0201310 & # x000a0 días, durando más tiempo en niños y huéspedes inmunodeprimidos [58 & # x0201360]. En promedio, una persona infecta & # x02014 de una a dos personas adicionales, sin embargo, este número reproductivo (R0) varía según la cepa viral y los factores sociales y ambientales [61]. La infección viral altera la barrera de la mucosa de las vías respiratorias y altera la membrana alveolar-capilar, lo que contribuye a la fuga de líquido y células inflamatorias al espacio alveolar, lo que altera el intercambio de gases y produce hipoxemia [62, 63]. La coinfección bacteriana a menudo complica los casos graves que contribuyen a la insuficiencia respiratoria y la muerte, con Staphylococcus aureus y Especies de Streptococcus como copatógenos predominantes [64]. La infección por el virus de la influenza estacional se limita en gran medida al tracto respiratorio, sin embargo, los virus H5 y H7 HPAI tienen un sitio de escisión polibásico dentro de la hemaglutinina que permite la replicación fuera del tracto respiratorio [65, 66]. La infección con una cepa de influenza no confiere inmunidad completa a otras cepas o subtipos [67].

Transmisión del sarampión y mecanismos de la enfermedad

El sarampión es una de las infecciones respiratorias más altamente contagiosas, que se transmite por exposición a grandes gotas respiratorias al toser, estornudar o hablar por contacto indirecto con superficies infectadas o por pequeñas gotas infecciosas que pueden permanecer suspendidas en el aire por hasta 2 & # x000a0 horas [10, 68 ]. Las células dendríticas del tracto respiratorio, los linfocitos y los macrófagos alveolares son objetivos tempranos de la infección en la que, durante un período de incubación promedio de 8 a 12 días, el sarampión se replica y se propaga a los linfáticos locales y al epitelio respiratorio y luego se disemina en la sangre a través de los linfocitos infectados a las células epiteliales y endoteliales. en la mayoría de los órganos [69 & # x0201371]. El período infeccioso comienza con la aparición de fiebre y se prolonga durante varios días después de que aparece la erupción [72]. La R estimada0 de sarampión depende de la susceptibilidad del huésped y de factores sociales y ambientales [73]. El sarampión infecta y altera los tejidos de todo el cuerpo; sin embargo, la enfermedad grave se debe principalmente a complicaciones neurológicas y del tracto respiratorio inferior [72]. La infección natural por sarampión confiere inmunidad de por vida, y la transferencia pasiva de anticuerpos maternos protege a los recién nacidos durante el período posnatal temprano [74]. Las personas que se recuperan de la infección por sarampión tienen un mayor riesgo de infección secundaria [75, 76].

Transmisión del SARS y MERS-CoV y mecanismos de la enfermedad

El SARS-CoV se transmite por gotas respiratorias grandes y por contacto con superficies infectadas. Los datos epidemiológicos también apoyan la transmisión aérea de gotitas pequeñas del SARS-CoV, aunque la R estimada0 de 0.86 & # x020131.83 argumenta en contra de que esta sea una ruta predominante de propagación [77, 78]. El SARS-CoV se une a los receptores de la enzima convertidora de angiotensina (ECA) -2 en las células epiteliales respiratorias, neumocitos y macrófagos alveolares, lo que produce daño alveolar difuso e insuficiencia respiratoria [79, 80]. El SRAS es una infección sistémica con viremia detectada en la mayoría de los casos que afecta a múltiples tipos de células y órganos [81, 82]. La lesión renal aguda es multifactorial con signos de necrosis tubular aguda, vasculitis y fibrosis glomerular, y las manifestaciones del sistema nervioso central son, al menos en parte, atribuibles a la infección directa de las neuronas que produce edema y degeneración [83].

El MERS-CoV se transmite a través de gotitas respiratorias grandes y por contacto con superficies infectadas con un R0 estimado de & # x0003c1 a & # x0003e1 fuera o dentro de los entornos sanitarios, respectivamente [84]. MERS-CoV se une a la dipeptidil peptidasa 4 (DPP4) en células epiteliales respiratorias y neumocitos donde experimenta una replicación productiva durante un período de incubación de 2 días [16]. La diseminación viral del tracto respiratorio inferior puede persistir durante semanas [85, 86]. La viremia, aunque no está documentada en todos los casos, se asocia con una enfermedad grave y una infección productiva de las CD, y se cree que los macrófagos facilitan la desregulación inmunitaria [87, 88]. DPP4 se expresa ampliamente en células fuera del pulmón, sin embargo, hay pocos datos de autopsias disponibles para definir la distribución viral [16, 89].

Transmisión del virus de la variola y mecanismos de la enfermedad

El VARV se transmite principalmente por gotas respiratorias grandes y, en menor grado, a través del contacto con objetos contaminados como costras, ropa de cama o ropa o por pequeñas gotas respiratorias en el aire [90, 91]. Se cree que el VARV se replica en el epitelio de las vías respiratorias y se disemina a los ganglios linfáticos regionales [92, 93]. El VARV se replica dentro de los ganglios linfáticos y se disemina a través del torrente sanguíneo sembrando lugares distantes como piel, bazo, médula ósea, hígado, riñón y otros órganos [94]. La fiebre se manifiesta después de una incubación promedio de 12 & # x000a0 días, y la erupción sigue a la fiebre a los 3 & # x020134 & # x000a0 días, concurrente con la excreción viral de alto nivel de las secreciones orofaríngeas [95, 96]. La R estimada0 de viruela está entre 3,5 y 6 [97]. La viremia de alto nivel se detecta con mayor frecuencia con la viruela hemorrágica en comparación con la viruela de tipo ordinario, aunque los mecanismos exactos de falla orgánica observados en casos fatales no están bien definidos [98 & # x02013101].


Investigadores revelan el funcionamiento interno de un motor de empaquetado de ADN viral

Un grupo de investigadores ha descubierto el funcionamiento interno detallado del motor molecular que empaqueta el material genético en virus de ADN de doble hebra. El avance proporciona información sobre un paso crítico en el ciclo de reproducción de virus como el pox-herpes y los adenovirus. También podría inspirar a los investigadores que crean máquinas microscópicas basadas en biomotores naturales.

La investigación fue realizada por científicos de la Universidad de Duke, la Universidad de Minnesota, la Universidad de Massachusetts y la Rama Médica de la Universidad de Texas (UTMB). Los resultados aparecen en línea en una trilogía de artículos publicados en Science Advances, Proceedings of the National Academy of Sciences e Nucleic Acids Research.

"Faltaban varias piezas de información que nos impidieron comprender cómo funcionan estos tipos de motores de empaque de ADN, lo que obstaculizó nuestra capacidad para diseñar terapias o desarrollar nuevas tecnologías", dijo Gaurav Arya, profesor de ingeniería mecánica y ciencia de los materiales, ingeniería biomédica. y química en Duke. "Pero con nuevos conocimientos y simulaciones, pudimos armar un modelo de este fantástico mecanismo, que es el más detallado jamás creado para este tipo de sistema".

Los virus vienen en muchas variedades, pero su clasificación generalmente depende de si codifican sus planos genéticos en ARN o en ADN monocatenario o bicatenario. La diferencia importa de muchas maneras y afecta la forma en que el material genético se empaqueta en nuevos virus. Mientras que algunos virus construyen un contenedor de proteínas llamado cápside alrededor del ARN o ADN recién producido, otros crean primero la cápside y luego la llenan con el material genético.

"Tratar de ver el motor conectado al virus es como tratar de ver los detalles en la antorcha de la Estatua de la Libertad tomando una foto de toda la estatua".

Joshua Pajak.

La mayoría de los virus de ADN de doble hebra toman la última ruta, lo que presenta muchos desafíos. El ADN está cargado negativamente y no quiere amontonarse en un espacio pequeño. Y está empaquetado en una estructura extremadamente densa, casi cristalina, que también requiere mucha fuerza.

"El beneficio de esto es que, cuando el virus está listo para infectar una nueva célula, la presión ayuda a inyectar ADN en la célula una vez perforada", dijo Joshua Pajak, un estudiante de doctorado que trabaja en el laboratorio de Arya. "Se ha estimado que la presión supera los 800 PSI, que es casi diez veces la presión en una botella de champán con corcho".

Forzar el ADN en una cápside diminuta a esa cantidad de presión requiere un motor extremadamente potente. Hasta hace poco, los investigadores solo tenían una vaga idea de cómo funcionaba ese motor debido a lo difícil que es visualizarlo. El motor solo se ensambla en la partícula de virus, que es enorme en comparación con el motor.

"Tratar de ver el motor conectado al virus es como tratar de ver los detalles en la antorcha de la Estatua de la Libertad tomando una foto de toda la estatua", dijo Pajak.

Pero en una conferencia reciente, Pajak se enteró de que Marc Morais, profesor de bioquímica y biología molecular en UTMB, y Paul Jardine, profesor de diagnóstico y ciencias biológicas en la Universidad de Minnesota, habían estado trabajando en este motor durante años y tenían el equipo y habilidades necesarias para ver los detalles. Algunos de sus resultados iniciales parecían coincidir con los modelos que Pajak estaba construyendo con la poca información que ya estaba disponible. El grupo se emocionó de que sus hallazgos separados convergieran hacia un mecanismo común y rápidamente se dispusieron a resolver juntos el misterio del motor viral.

En un artículo publicado en Science Advances, Morais y sus colegas resolvieron los detalles de todo el motor en una de sus configuraciones. Descubrieron que el motor está formado por cinco proteínas unidas entre sí en una formación similar a un anillo. Cada una de estas proteínas es como dos ventosas con un resorte en el medio, lo que permite que la parte inferior se mueva verticalmente en una formación helicoidal para que pueda agarrarse a la columna vertebral helicoidal del ADN.

“Debido a que se podían colocar alrededor de 100.000 de estos motores en la cabeza de un alfiler y todos se movían, verlos bien resultó difícil”, dijo Morais."Pero después de que mis colegas de la UTMB, Michael Woodson y Mark White, nos ayudaron a obtener imágenes con un microscopio crioelectrónico, se estableció un marco general del mecanismo".

En un segundo artículo, publicado en Nucleic Acids Research, el grupo Morais capturó el motor en una segunda configuración utilizando cristalografía de rayos X. Esta vez, las ventosas inferiores del motor estaban todas juntas en un anillo plano, lo que llevó a los investigadores a imaginar que el motor podría mover el ADN hacia el virus al alternar entre las dos configuraciones.

“Joshua reunió muchas pistas e información para crear este modelo. Pero un modelo solo es útil si puede predecir nuevos conocimientos que aún no conocíamos ".

gaurav arya

Para probar esta hipótesis, Pajak y Arya realizaron simulaciones de alto rendimiento en Anton 2, la supercomputadora más rápida disponible actualmente para ejecutar simulaciones de dinámica molecular. Sus resultados no solo respaldaron el mecanismo propuesto, sino que también proporcionaron información sobre cómo se contorsionan exactamente los engranajes del motor entre las dos configuraciones.

Mientras que las partes superiores de las proteínas permanecen unidas estáticamente a la partícula del virus, sus mitades inferiores se mueven hacia arriba y hacia abajo en un patrón cíclico impulsado por una molécula transportadora de energía llamada ATP. Una vez que todas las proteínas se han movido hacia arriba, arrastrando el ADN con ellas, las proteínas liberan el subproducto de la reacción química del ATP. Esto hace que el anillo inferior libere el ADN y vuelva a su estado helicoidal original, donde una vez más se aferran a más ATP y ADN para repetir el proceso.

“Joshua reunió muchas pistas e información para crear este modelo”, dijo Arya. "Pero un modelo solo es útil si puede predecir nuevos conocimientos que aún no conocíamos".

En esencia, el modelo es una serie de acciones mecánicas que deben encajar y tener lugar en orden secuencial para que todo funcione correctamente. Las simulaciones de Pajak predijeron una serie específica de señales mecánicas que le dicen a las partes inferiores de las proteínas si deberían o no agarrar el ADN. Como una línea de dominó cayendo, eliminar una de las vías de señalización del medio debería detener la reacción en cadena y bloquear la señal.

"Toda la tecnología está inspirada en la naturaleza de una forma u otra. Ahora que sabemos realmente cómo funciona este motor molecular, esperamos que inspire a otros investigadores a crear nuevos inventos utilizando estos mismos mecanismos".

gaurav arya

Para validar esta predicción, los investigadores recurrieron a Jardine y sus colegas Shelley Grimes y Dwight Anderson para ver si la eliminación de una de las fichas de dominó de señalización realmente impedía que el motor empaquetara el ADN. Un tercer artículo, publicado en PNAS, muestra que el sabotaje funcionó. Después de mutar un dominó en la vía de señalización para que no pudiera funcionar, el motor aún podía unirse y quemar combustible tan bien como siempre, pero era mucho peor empaquetando el ADN.

“El nuevo mecanismo predicho por las estructuras de alta resolución y las predicciones detalladas proporcionaron un nivel de detalle mayor que nunca antes”, dijo Jardine. "Esto nos permitió probar el papel de los componentes críticos del motor y, por lo tanto, evaluar la validez de este nuevo mecanismo tal como lo entendemos actualmente".

El resultado es una fuerte indicación de que el modelo está muy cerca de describir cómo se comporta el motor en la naturaleza. El grupo planea continuar con su enfoque estructural, bioquímico y de simulación altamente integrado para probar y perfeccionar el modelo propuesto. Esperan que este conocimiento fundamental pueda potencialmente usarse para algún día combatir enfermedades o crear un motor molecular sintético.

“Toda la tecnología está inspirada en la naturaleza de una forma u otra”, dijo Arya. "Ahora que sabemos realmente cómo funciona este motor molecular, esperamos que inspire a otros investigadores a crear nuevos inventos utilizando estos mismos mecanismos".

Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (GM118817, GM122979, GM127365) y la Fundación Nacional de Ciencias (MCB1817338). Los datos de Cryo-EM también se recopilaron en instalaciones regionales de imágenes de crio-EM respaldadas por los NIH (1U24 GM116787-01, 1U24 GM116792-01). Las simulaciones se realizaron en la supercomputadora Anton 2 puesta a disposición por D.E. Shaw Research y alojado en el Pittsburgh Supercomputing Center a través del NIH (R01GM116961) y el superordenador Comet alojado en el San Diego Supercomputer Center a través de NSF (ACI-1053575).

"Las ATPasas de empaquetado vírico utilizan un interruptor de glutamato para unir la actividad de la ATPasa y la translocación del ADN". Joshua Pajak, Rockney Atz, Brendan J. Hilbert, Marc C. Morais, Brian A. Kelch, Paul Jardine y Gaurav Arya. PNAS, 27 de abril de 2021118 (17) e2024928118. DOI: 10.1073 / pnas.2024928118


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4.11.7: Virus de ADN bicatenario - Virus de la viruela - Biología

¡Bienvenido a mi página sobre el virus de la viruela! Este sitio web fue construido para una clase en la Universidad de Stanford llamada Biología Humana 115: Humanos y Virus, impartida por el Dr. Robert Siegel. Haga clic aquí para obtener enlaces a sitios web sobre otras familias de virus humanos.

El tema central de esta página es la viruela, que, desde el comienzo de la historia, causó devastadoras epidemias en todo el mundo. Sin embargo, en octubre de 1977, después de enérgicos esfuerzos de la Organización Mundial de la Salud, esta enfermedad se convirtió en la primera en ser completamente erradicada.

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Los virus de la viruela son los más grandes y complejos de todos los virus. De hecho, son lo suficientemente grandes, con un tamaño de virión de 220-350 x 115-260 nm, para ser vistos bajo un microscopio óptico. Infectan a una amplia gama de huéspedes y se dividen en dos subfamilias: Chordopoxvirinae y Entomopoxviridae. Todos los virus de la viruela humana pertenecen a la subfamilia Chordopoxovirinae, y la mayoría de ellos pertenecen al género Orthopoxvirus (variola, vaccinia, cow pox) o Parapoxvirus (virus Orf). ¡El virus de la varicela no pertenece a esta familia! - Es un herpesvirus.

  • genoma: ADN bicatenario, monopartita, lineal, no infeccioso codifica más de 100 genes, incluida la ARN transcripasa dependiente del ADN
  • morfología: nucleocápside "compleja", ovoide o con forma de ladrillo
  • sobre: la ortopox está envuelta, la parapox no está
  • replicación: tiene lugar en el citoplasma
  • rango de host: el rango de hospedadores varía según el virus específico, las zoonosis son comunes, pero la viruela solo infecta a los humanos
  • oncogenicidad: puede causar tumores benignos
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Los virus de la viruela se transmiten con mayor frecuencia por contacto directo. En el caso de la viruela, el virus se encuentra en lesiones en el tracto respiratorio superior, que puede transmitirse a otros en secreciones de gotitas y en lesiones cutáneas. Aunque se considera que el virus es muy contagioso, esta vía de transmisión hace que su propagación sea relativamente lenta.

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La infección por un poxvirus da como resultado una inmunidad mediada por células. Las personas infectadas con viruela generalmente son inmunes a la enfermedad por el resto de sus vidas.

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  • Poxvirus, con impresionantes diagramas del genoma y el proceso de replicación.
  • Virus de la viruela humana, con fotografías en primer plano de la viruela.
  • Familia: Poxviridae
  • VIRUS DE LA VINO
  • Edward Jenner (1749-1823)
  • Los pockes

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  • Dulbecco R y Ginsberg HS. Virología (2ª ed.), Filadelfia: J.B. Lippincott Company, 1988, págs. 179-191.
  • Leland DS. Virología clínica, Filadelfia: W.B. Saunders Company, 1996, pág. 152-3.
  • Metselaar D y Simpson DIH. Virología práctica para estudiantes y practicantes de medicina en países tropicales, Oxford: Oxford University Press, 1982, págs. 37, 173-83.
  • Siegel R, M.D., Ph.D.
  • White DO y Fenner FJ. Virología médica (3ª ed.), Orlando: Academic Press, 1986, págs. 278-280, 433-443.

Creado por Jennifer Yuan, Biología Humana, Promoción de 1998
Universidad de Stanford, Stanford, CA
Última modificación: 17 de febrero de 1999


Reconocimiento de anticuerpos de las proteínas de la envoltura del virus de la vacuna inmunodominante

El virus de la vacuna (VACV) es un virus de ADN bicatenario con envoltura y el ingrediente activo de la vacuna contra la viruela. La administración sistemática de esta vacuna condujo a la erradicación de la viruela circulante (virus variola, VARV) de la población humana. Como tributo a su éxito, la inmunización mundial se puso fin a finales de la década de 1970. La eficacia de la vacuna se atribuye a una sólida producción de anticuerpos protectores contra varias proteínas de la envoltura del VACV, que protegen de forma cruzada contra la infección por VARV patógeno. Desde que terminó la vacunación mundial, la mayoría de los niños y adultos jóvenes no poseen inmunidad contra la viruela. Esto es motivo de preocupación, ya que la viruela se considera un arma biológica potencial. Aunque la vacuna contra la viruela se considera el estándar de oro de todas las vacunas y los antígenos dirigidos se han estudiado ampliamente, los epítopos que son el blanco de los anticuerpos protectores y su mecanismo de unión habían sido, hasta hace poco, poco caracterizados. Comprender la interacción precisa entre los anticuerpos y sus epítopos será útil en el diseño de mejores vacunas contra otras enfermedades. En esta revisión discutiremos la base estructural del reconocimiento de los antígenos inmunodominantes VACV A27, A33, D8 y L1 por anticuerpos protectores y discutiremos las implicaciones potenciales con respecto a su capacidad protectora.

Palabras clave: Anticuerpos Complejos anticuerpo-antígeno Vacunación Cristalografía de rayos X del virus vaccinia.


RESULTADOS

Variola K7L recombinante es una proteasa dimérica

K7L marcado con GST se expresó en E. coli como una proteína soluble (cultivo bacteriano de 1 mg / litro), purificada y escindida con trombina como se describe en & # x0201c Procedimientos experimentales & # x0201d (ver Fig. 1). K7L migró en SDS-PAGE con el tamaño esperado de 45 kDa (Fig.1 B). La cromatografía de exclusión por tamaño sugirió una masa molecular de 75 & # x0201380 kDa, más consistente con la homodimerización en solución (Fig.1 C). Esto fue corroborado por experimentos de reticulación, que demostraron un dímero pero no polímeros de orden superior (Fig.1 B). La ultracentrifugación analítica (que no se ve afectada por la forma molecular) confirmó que K7L existe como un dímero bastante fuerte, ya sea en ausencia o en presencia de glicerol al 25% (figura complementaria 2), con KD valores de 0.4 & # x000b1 0.2 & # x003bc m (sin glicerol) y 0.2 & # x000b1 0.1 & # x003bc m (25% de glicerol). A las concentraciones utilizadas en nuestros ensayos de actividad, se predice, por tanto, que K7L es principalmente dimérico. K7L podría almacenarse durante varios meses en glicerol al 50% a & # x0221220 & # x000b0C o & # x0221280 & # x000b0C sin pérdida de actividad proteolítica. Sin embargo, la enzima perdió actividad a temperaturas más altas, con una vida media de & # x0223c5 ha 23 & # x000b0C y & # x0223c30 min a 37 & # x000b0C. Por lo tanto, las mediciones de actividad se realizaron a 20 ° C.

Los objetivos informados de K7L son P25K, P4a y P4b. Para determinar la actividad del K7L recombinante, lo incubamos con in vitro proteínas P25K, P4a y P4b traducidas expresadas a partir de construcciones que codifican proteínas de vaccinia muy similares (porque el ADN de variola no estaba disponible). Variola y vaccinia P25K, P4a y P4b difieren entre 1 & # x020133%, y todas las diferencias de secuencia están distantes de los sitios de escisión, véanse alineaciones suplementarias. Debido a que las secuencias muestran un grado de identidad tan alto, es muy probable que la actividad de la variola K7L hacia las proteínas de la vacuna sea esencialmente idéntica a la escisión de las correspondientes proteínas de la variola. Los ensayos de actividad se realizaron en presencia de glicerol al 40% (Fig. 2). Hay un sitio de escisión putativo en P4b (Gly 60 & # x02193Ser 61) y dos en P25K (Gly 18 & # x02193Ser 19 y Gly 32 & # x02193Ala 33). De acuerdo, observamos dos productos de escisión de la masa molecular esperada para P25K (32 y 30 kDa Fig.2 C) y uno para P4b (64 kDa Fig.2 D). La escisión de uno de los sitios P25K fue especialmente rápida y observamos una escisión más lenta del otro sitio y P4b por K7L. Por el contrario, P4a no fue escindido por K7L en nuestras condiciones experimentales (Fig.2 mi).

Presuntos objetivos virales de K7L y sus in vitro patrones de escote. A, P4a, P4b, P25K y P17K son proteínas del núcleo viral, mientras que P21K es la proteína de la membrana de la envoltura. Nombres alternativos basados ​​en genes (en paréntesis), así como los sitios de escisión putativos y sus números de residuos. B, se muestra la alineación de los sitios de escisión. Los residuos ácidos que mejoran la escisión se encuentran en negrita. C, D, y mi, los plásmidos que codifican las proteínas indicadas se transcribieron y tradujeron in vitro. Se añadió GST-K7L recombinante durante los tiempos indicados y la reacción se terminó hirviendo en tampón de muestra SDS. Los geles SDS-PAGE se desarrollaron con estreptavidina-HRP para revelar las proteínas de sustrato procesadas y no procesadas. Las bandas comunes a los geles de P4b y P4a pertenecen a proteínas teñidas de forma inespecífica. Las reacciones de escisión emplearon 0,3 & # x003bc m GST-K7L a 25 & # x000b0C en 50 m m NaCl, 2 m m DTT, 30 m m Tris, pH 8,0, tampón que contenía 40% de glicerol y 12% v / v del producto de traducción.

El glicerol mejora la actividad de K7L

Para evaluar la actividad de las muestras de K7L, sintetizamos varios sustratos de peptidilo correspondientes a los supuestos sitios de escisión de P25K, P4a y P4b (Tabla 1). Los péptidos se acetilaron N-terminalmente y contenían ACC como fluoróforo. La actividad se midió mediante la liberación del fluoróforo libre usando un fluorímetro que operaba en modo cinético. K7L exhibe baja actividad contra Ac-ISAG-ACC, pero su actividad se incrementó dramáticamente en presencia de 45% de glicerol (Fig.3 A). Al igual que el glicerol, otros osmolitos como la betaína y la sacarosa también aumentaron la actividad contra Ac-ISAG-ACC (Fig.3 B). Como resultado, las mediciones de actividad de rutina se realizaron en presencia de 40 & # x0201345% de glicerol a un pH óptimo de 8,0 (Fig.3 C) a menos que se indique lo contrario. El glicerol aumentó la actividad de K7L contra otros péptidos fluorescentes distintos de Ac-ISAG-ACC y sustratos de proteína de longitud completa (datos no mostrados), y por lo tanto concluimos que el efecto osmolito es sobre la enzima, no sobre el sustrato.

TABLA 1

Proteólisis K7L de péptidos fluorogénicos

Los parámetros cinéticos se evaluaron en tampón Tris-HCl 30 m m, pH 8,0, NaCl 100 nM, DTT 2 m m y glicerol al 45% con un intervalo de concentraciones de péptidos y K7L de 0,2 a 1,0 & # x003bc m. NM, no medido. Los errores indican la desviación estándar observada de tres mediciones.

Fuente de secuenciaSecuencia de péptidoskgato/KmetroKmetro
metro & # x022121 s & # x022121& # x003bc metro
P25K, Gly 18 y # x02193Ser 19 Ac-FFAG-ACC300 & # x000b1 5100 & # x000b1 15
P25K, Gly 32 y # x02193Ala 33 Ac-VIAG-ACC120 & # x000b1 30Nuevo Méjico
P4b, Gly 60 & # x02193Ser 61 Ac-ISAG-ACC80 & # x000b1 30830 & # x000b1 110
P4a, Gly 614 y # x02193Ser 615 Ac-FYAG-ACC560 & # x000b1 90Nuevo Méjico
P4a, Gly 697 y # x02193Thr 698 Ac-TNAG-ACCSin escoteSin escote
P25K, Gly 18 y # x02193Ser 19 Ac-TIFFAG-ACC570 & # x000b1 307.5 & # x000b1 3
P25K, Gly 18 y # x02193Ser 19 Ac-EDTIFFAG-ACC14,400 & # x000b1 30026 & # x000b1 7
P4a, Gly 614 y # x02193Ser 615 Ac-RYFYAG-ACC880 & # x000b1 140Nuevo Méjico
P4a, Gly 614 y # x02193Ser 615 Ac-CPRYFYAG-ACC1010 & # x000b1 20150 & # x000b1 30

Efectos estabilizadores de los osmolitos, la sal, el pH y la concentración de enzimas sobre la actividad de K7L. A, se muestra la actividad (velocidad en función de la concentración de Ac-ISAG-ACC) en presencia de glicerol al 10 y al 45%. B, se muestra una comparación de la activación de K7L por betaína, glicerol y sacarosa (velocidad en función de la concentración de osmolitos) en 35 & # x003bc m Ac-ISAG-ACC. C, se muestra el efecto de la concentración de NaCl sobre la actividad de K7L en 35 & # x003bc m Ac-ISAG-ACC. Las velocidades iniciales se midieron a 25 ° C en Tris de 30 m m, pH 8,0 y DTT de 2 m m con la adición de los diversos componentes. C, se muestra el efecto del pH sobre la actividad de K7L en presencia de glicerol al 45%. D, se muestra el efecto de la concentración de K7L sobre la actividad específica de K7L hacia 30 & # x003bc m Ac-EDTIFFAG-ACC en presencia de glicerol al 10%.

La dimerización mejora la actividad de K7L

Analizamos el efecto de la dimerización de K7L sobre la actividad específica observando la dependencia de la concentración de la escisión de un sustrato peptídico marcado con ACC (Fig.3 D). La dependencia tenía forma sigmoidea con AC50 = 0.2 & # x000b1 0.1 & # x003bc m, que corresponde al KD valor determinado por ultracentrifugación analítica (ver arriba). Este resultado vincula claramente la actividad de K7L con la dimerización.

Finalmente, comparamos las actividades del K7L recombinante producido en E. coli versus células de mamífero infectadas con el virus de la vacuna (Fig. 3 suplementaria). No se observaron diferencias significativas, lo que indica que K7L no se activa diferencialmente en células de mamíferos (p.ej. por modificación postraduccional).

Sondando la especificidad del sustrato

La especificidad de sustrato de vaccinia I7L ha sido definida previamente por en vivo ensayos de escisión de P25K mutante (5, 42, 43). Sin embargo, debido a que los datos publicados no proporcionaron comparaciones cuantitativas de las eficiencias de escisión, realizamos un análisis en profundidad de K7L. El sitio P1 de todos los sustratos K7L naturales putativos es un residuo Gly.Para probar la tolerancia de K7L cuantitativamente, mutamos el Gly conservado en las posiciones 18 y 32 de P25K a Ala y comparamos sus eficiencias de escisión con P25K de tipo salvaje. Como se muestra en la Fig.4 A, ambos sitios de WT P25K se escindieron completamente en 1 y 9 h, respectivamente, mientras que no se obtuvo evidencia de escisión del doble mutante después de 9 h de incubación. Esto indica una preferencia muy fuerte por Gly en la posición P1 de los sustratos proteicos.

Perfilado del subsitio de K7L y comparación con las preferencias de sustrato de proteasa relacionadas. A, P25K y su doble mutante, G18A / G32A, se produjeron en un in vitro sistema de transcripción / traducción (Promega), escindido por K7L-GST recombinante durante los tiempos indicados y visualizado después de SDS-PAGE como se describe en & # x0201c Procedimientos experimentales. & # x0201d B, se muestran las preferencias de aminoácidos en las posiciones P3-P1 & # x02032 del sitio de escisión Gly & # x02193Ser 18 de P25K. Gly 32 siempre se mutó a Ala para facilitar el análisis cuantitativo. Los análisis se realizaron de la misma manera que se muestra en el panel A. Se introdujeron mutaciones únicas en las posiciones P3-P1 & # x02032 del sitio Gly & # x02193Ser 18, como se indica en la eje horizontal. los eje vertical muestra las tasas de escisión relativas (%). C, se construyó una biblioteca de péptidos que exploran las posiciones P2-P4 como se describe en Procedimientos experimentales, y las actividades relativas de K7L 0,5 & # x003bc m se expresan en relación con el sustrato escindido más eficazmente en cada posición. Todas las reacciones se llevaron a cabo en glicerol al 40%. los eje horizontal muestra los aminoácidos escritos en el código estándar de una letra, los aminoácidos no naturales son: O, norleucina B, & # x003b2-alanina. D, las preferencias relativas se comparan para las proteasas desSUMOilantes y desubiquitinantes relacionadas. rojo indica la actividad más alta negro indica el más bajo. Las preferencias están agrupadas por su similitud con K7L.

A continuación, estudiamos la escisión de los sustratos tetrapéptidos y empleamos un enfoque de biblioteca de sustratos de exploración posicional para definir las preferencias óptimas en las posiciones P2, P3 y P4. La posición P1 se fijó como Gly, y las posiciones P2, P3 y P4 se alteraron aleatoriamente a uno de los 18 & # x0201320 aminoácidos, incluida la norleucina y & # x003b2-alanina (Fig.4 C). Debido a que empleamos concentraciones de péptidos similares, las contribuciones relativas de las sustituciones de aminoácidos a la actividad podrían medirse directamente. Los resultados demuestran una alta preferencia por Ala en P2. La selectividad en P3 fue menor, pero los residuos hidrófobos se toleraron especialmente bien. La posición P4 era más restringida que P3 y demostró una clara preferencia por los residuos hidrófobos (Fig.4 C). Estos resultados concuerdan bien con los motivos de secuencia que existen en las dianas de escisión natural de K7L (Fig.2 C) y distinguir K7L de las proteasas estrechamente relacionadas en el Clan CE (Fig.4 D) (39).

A continuación, utilizamos nuestras observaciones basadas en péptidos en un análisis mutacional del supuesto sustrato natural P25K. Mutamos las posiciones P3, P2 y P1 & # x02032 en el sitio de escisión de Gly 18 & # x02193Ser 19 mientras introdujimos una mutación Ala en Gly 31 para silenciar cualquier contribución de la escisión secundaria (Fig.4 B). P1 & # x02032 en el sitio Gly 18 & # x02193Ser 19 demostró una clara preferencia por Ser y Ala, los residuos que ocurren con mayor frecuencia en todos los sitios de escisión de K7L naturales putativos (Fig.2 B). También encontramos que la sustitución de Ala en P2 por Gly no afectó la tasa de escisión, lo que confirma la propuesta de que la exosita puede influir en la escisión de sustratos naturales (12).

Para corroborar estos hallazgos, sintetizamos sustratos de ACC tetrapéptidos individuales correspondientes a la secuencia de tetrapéptidos óptima y los sitios de escisión de P25K, P4b y P4a y los co-incubamos con K7L. los kgato/Kmetro A continuación, se calcularon los parámetros a partir de los datos de escisión (Tabla 1), revelando una preferencia por Tyr y Phe en la posición P3. Estos resultados indican que la especificidad de K7L en las posiciones P2, P1 y P1 & # x02032 que rodean el enlace escindible se correlaciona bien con los sitios de escisión de las secuencias de proteínas naturales (Fig.2, C & # x02013E). Sin embargo, más allá de esta región, las correlaciones se rompen.

Mapeo del sitio de unión de sustrato extendido de K7L

Las discrepancias en las especificidades del sitio de escisión entre los sustratos de péptidos y proteínas más allá de la hendidura catalítica sugirieron que residuos más distantes que P4-P1 podrían afectar la actividad. Para determinar el efecto de las posiciones de los residuos distantes sobre la actividad de K7L, utilizamos dos estrategias. En la primera estrategia ampliamos los sustratos de peptidilo basados ​​en ACC para abarcar los residuos P1-P8 que coinciden con los sitios de escisión P25K y P4a. Las mediciones cinéticas revelan que la extensión de ambos sustratos a los residuos P5 y P6 proporcionó solo una mejora menor en la velocidad de hidrólisis del péptido. Por el contrario, la extensión de los sustratos a las posiciones P7 y P8 promovió la hidrólisis hasta 25 veces mientras dejaba la hidrólisis del péptido basado en P4a casi sin cambios. En particular, se prefirieron los residuos cargados negativamente en P7 y P8, derivados de los sitios de escisión de P25K, sobre los residuos neutros que se encuentran en estas posiciones en las secuencias de los sitios P4a y P4b.

En una segunda estrategia, sintetizamos péptidos que cubrían los residuos P9-P4 & # x02032 de P25K, P4a y P4b, derivatizados en su terminal N con FAM. Esto nos permitió monitorear la escisión por PR-HPLC de muestras cronometradas a concentraciones de sustrato bajas & # x003bc m, lo que permite una estimación de la eficiencia catalítica (kgato/Kmetro) (ver & # x0201c Procedimientos experimentales & # x0201d). Los sitios de escisión se confirmaron independientemente mediante espectrometría de masas MALTI-TOF. De acuerdo con los resultados presentados en la Tabla 1, los péptidos que abarcan el sitio Gly 18 & # x02193Ser 19 de P25K fueron escindidos por K7L mucho más eficientemente que los péptidos derivados de otros sitios de las proteínas P25K, P4a y P4b.

Curiosamente, el péptido FAM-LDRIITNAGTCTV que abarca el sitio de escisión Gly 697 & # x02193Thr 698 de P4a parecía resistente a la proteólisis de K7L. Esto estaba de acuerdo con los datos sobre el péptido Ac-TNAG-ACC que demuestran que este sitio es muy desfavorable para la escisión por K7L (Tabla 2). De acuerdo, los datos de espectrometría de masas MALDI-TOF confirmaron que el péptido FAM-LDRIITNAGTCTV no se escindió incluso con niveles muy altos de K7L (no mostrado). De manera similar al sustrato Ac-EDTIFFAG-ACC, la eliminación de residuos P9-P7 de la secuencia óptima del péptido P25K redujo su velocidad de escisión en & # x0223c40 veces. Significativamente, extender los sustratos más allá de la unión escindible en la dirección principal (aguas abajo de la unión escindible) no tuvo un impacto importante en las tasas de escisión, y la extensión de P2 & # x02032 a P4 & # x02032 proporcionó solo una mejora modesta (menos de 2 veces) en catálisis (Tabla 2). En general, nuestros datos de escisión para péptidos más largos se correlacionan muy bien con la actividad de K7L in vitro contra sustratos proteicos (P25K y P4b). Según nuestros datos, es probable que el sitio Gly 697 & # x02193Thr 698 de la proteína P4a sea un sustrato subóptimo de K7L.

TABLA 2

Proteólisis K7L del péptido marcado con FAM P9-P4 & # x02032

Los parámetros cinéticos se evaluaron en tampón Tris-HCl 30 m m, pH 8,0, NaCl 100 nM, DTT 2 m m y glicerol al 45% con péptido 10 & # x003bc my K7L de 0,1 a 1,0 & # x003bc m. Se usó O (norleucina) en lugar de Met para evitar la oxidación de este último durante la síntesis de la secuencia DDLQMVIAG & # x02193AKSK. Los errores indican S.D. de dos medidas. ND, no determinado.

Proteína, sitio de escisiónSecuencia de péptidoskgato/Kmetro
45% de glicerol15% de glicerol
metro & # x022121 s & # x022121
P25K, Gly 18 y # x02193Ser 19 EEDPELEAAG& # x02193SISE28000 & # x000b1 30001300 & # x000b1 400
P25K, Gly 18 y # x02193Ser 19 EEDPELEAAG& # x02193SI17500 & # x000b1 1500
P25K, Gly 18 y # x02193Ser 19 PELEAAG& # x02193SISE670 & # x000b1 220
P25K, Gly 32 y # x02193Ala 33 DDLQ O VIAG& # x02193AKSK3500 & # x000b1 800220 & # x000b1 100
P4b, Gly 60 & # x02193Ser 61 VDDDFISAG& # x02193ARNQ2000 y # x000b1 500
P4a, Gly 614 y # x02193Ser 615 YCPRYFYAG& # x02193SCLAVIJA2100 & # x000b1 500
P4a, Gly 697 y # x02193Ser 698 LDRIITNAG& # x02193TCtelevisorDAKOTA DEL NORTE
P4a, Gly 697 & # x02193Thr 698 mutanteLDRIITNAG& # x02193T S televisorDAKOTA DEL NORTE
Evidencia de la activación de K7L mediada por exositos alostéricos

La estimulación sustancial de la actividad de la catálisis de K7L en sustratos que ocupan las posiciones P7 y P8 sugirió dos posibilidades 1) reconocimiento de sustrato concertado extendido o 2) una interacción exosita que actúa como un interruptor alostérico. Para abordar estas hipótesis, probamos si P25K podría mejorar la proteólisis de K7L del sustrato Ac-ISAG-ACC. Co-incubamos K7L (0.5 & # x003bc m) con P25K (0.1 & # x02013100 & # x003bc m) y luego medimos la velocidad de escisión del sustrato fluorescente. Las proteínas de control, albúmina de suero bovino (BSA) y lisozima no tuvieron ningún efecto sobre la velocidad de escisión, pero la proteína P25K aumentó la actividad de K7L hasta 2,4 veces, con un efecto estimulante máximo a 8 & # x003bc m P25K. Las concentraciones más altas de P25K condujeron a la inhibición de la actividad de K7L contra Ac-ISAG-ACC (Fig.5 A). Por el contrario, el péptido FAM-EEDTIFFAGSISE no mostró estimulación de Ac-ISAG-ACC y, en cambio, se inhibió con un IC50 de 37 & # x003bc m, similar a la concentración a la que P25K comienza a inhibir la escisión del sustrato indicador tetrapéptido (Fig.5 B). Estos hallazgos son consistentes con un pequeño efecto alostérico, pero indican que el principal mecanismo de escisión mejorada de péptidos largos es la presencia de reconocimiento de sustrato extendido y concertado.

Influencia de P25K de longitud completa y polinucleótidos en la actividad de K7L. A, se muestra la activación por P25K de la escisión de Ac-ISAG-ACC. La activación dependiente de la concentración se ajusta a una curva dosis-respuesta en forma de campana, con KA = 8 & # x003bc my KI = 45 & # x003bc m. Se usaron BSA y lisozima como controles de unión inespecífica. B, se muestra la inhibición por FAM-EEDTIFFAGSISE de la escisión de Ac-ISAG-ACC, con datos ajustados a una curva de dosis-respuesta de primer orden, KI = 37 & # x003bc m. Las reacciones se llevaron a cabo en Tris 30 m m, pH 8,0, que contenía glicerol al 40%, NaCl 50 m m, K7L 0,2 & # x020130,5 & # x003bc m, y 50 & # x003bc m el sustrato Ac-ISAG-ACC. C, se muestra la escisión de P25K por K7L en presencia de varios cofactores. 0.3 & # x003bc m K7L se incubó conjuntamente durante los tiempos indicados con 8 & # x003bc m P25K en presencia de 1 m m Mg 2+ (panel izquierdo), ARN humano (0,1 mg / ml) + Mg 2+ (panel medio), o ADN viral (0,1 mg / ml) + 1 m m Mg 2+ (panel derecho). Los experimentos se realizaron al 3, 15 o 40% de glicerol como se indica. Los digeridos se separaron mediante SDS-PAGE. D, las imágenes en C fueron digitalizados para calcular el respectivo kgato/Kmetro valores como se describe en & # x0201c Procedimientos experimentales. & # x0201d mi, efectos del glicerol, ARN humano y Mg 2+ Se muestran los iones sobre la escisión de Ac-EDTIFFAG-ACC por K7L. Se co-incubó K7L (0,1 & # x003bc m) a 25 & # x000b0C con el péptido (10 & # x003bc m). Las reacciones contenían Tris-HCl 30 m m, pH 8,0, NaCl 50 m m y DTT 2 m m, y las concentraciones indicadas de glicerol. Donde se indique, 1 m m MgCl2 o se añadieron a las reacciones 0,1 mg / ml de ARN.

Los polinucleótidos estimulan la proteólisis de P25K por K7L

P25K es un aglutinante de polinucleótidos de alta afinidad (KD = 1 & # x020132 n m), incluyendo tanto ARN como ADN (44). Para probar si los polinucleótidos afectan la escisión de P25K, co-incubamos K7L con P25K en presencia y ausencia de ARN, ADN de vaccinia bicatenario y glicerol. El ADN, y especialmente el ARN (ambos a 0.1 mg / ml), estimularon sustancialmente la escisión de ambos sitios P25K, y su efecto fue particularmente fuerte a concentraciones más bajas de glicerol (3 & # x0201315%) (Fig.5, C y D). Es posible que se requieran polinucleótidos para estimular la proteólisis K7L de la proteína P25K y que esta estimulación no requiera la presencia de alto contenido de glicerol. Es importante destacar que el ARN (y el ADN viral no mostrado) inhibieron la escisión del péptido Ac-EDTIFFAG-ACC por K7L en & # x0223c4 veces (Fig.5 mi), lo que sugiere que K7L tiene una propensión a unirse a polianiones. Además, la estimulación polinucleotídica de la catálisis en P25K fue mucho mayor que el efecto inhibidor hacia el sustrato octapéptido. Debido a que la activación es específica de la proteína, proponemos que el ADN y el ARN víricos influyen en la escisión de P25K al promover su interacción con K7L en un sitio alostérico.

Inhibidores de péptidos y sondas de actividad

La huella dactilar del sustrato preferido de K7L se utilizó para diseñar sondas basadas en la actividad que serían reconocidas por la proteasa K7L. Para este propósito, las secuencias de péptidos FYAG y EDTIFFAG se funcionalizaron con una etiqueta de biotina N-terminal y una VME C-terminal reactiva & # x0201cwarhead & # x0201d (Fig.6 A). La selectividad y eficacia de la biotina-AEEAc-EDTIFFA-VME se confirmó directamente en experimentos de marcaje utilizando K7L. Para visualizar el material marcado, las muestras se sometieron a transferencia Western con estreptavidina-HRP. Aunque la sonda corta no pudo marcar visiblemente K7L, la sonda más larga de biotina-AEEAc-EDTIFFA-VME a 25 n m fue suficiente para marcar el sitio activo de K7L, de acuerdo con las constantes de tasa de inhibición medidas (Fig.6 B). El bloqueo del marcaje por N-etilmaleimida indicó que la sonda se dirige al sitio activo (Fig.6 B).

Una sonda basada en actividad etiqueta K7L in vitro y en extractos celulares. A, se muestran fórmulas químicas de sondas basadas en péptidos biotinilados. Las constantes de inhibición se calcularon observando la disminución de la actividad de pseudoprimer orden (kobs) en presencia de concentración de inhibidor (I). B, Panel superior, K7L (0.2 & # x003bc m) fue etiquetado con las concentraciones indicadas de corto (S) y largo (L) sondas durante 15 min a 25 ° C y se visualizan con estreptavidina-HRP mediante SDS-PAGE. Panel inferior, la enzima total se visualizó mediante transferencia Western usando un anticuerpo anti-K7L en el mismo gel. C, se muestra el marcaje de K7L e I7L en células BSC-1 infectadas con virus vaccinia (multiplicidad de infección = 5, 24 h). Cuando se indica, el K7L recombinante se coexpresó a partir de un vector pTF7-3 transfectado. Se añadió EDTIFFAG-VME biotinilado 10 & # x003bc m a muestras homogeneizadas, se incubó durante 15 min y se cargó en SDS-PAGE. Las proteínas biotiniladas se visualizaron con estreptavidina-HRP. los flechas negras indicar las posiciones de K7L recombinante e I7L viral en el gel. los flecha abierta apunta a la ausencia de la banda I7L en una muestra que carece del virus.

Para probar si la sonda de biotina-EDTIFFAG-VME marca el K7L celular, añadimos concentraciones de 10 & # x003bc m de sonda a lisados ​​de células BSC-1 infectadas con virus vaccinia. Después de una breve incubación, los lisados ​​se analizaron mediante Western blot con estreptavidina-HRP (Fig.6 C) y también con un anticuerpo K7L (Fig. 4 complementaria). Los resultados demuestran que la sonda marcó predominantemente una banda de 48 kDa en las células infectadas por virus. Se requerirán experimentos futuros y optimización de la sonda para determinar si las sondas descritas aquí pueden inhibir la infectividad viral y / o la replicación.

Conclusiones

K7L está designado por el sistema de clasificación MEROPS como miembro de la familia C57 de peptidasas Clan CE (45), un clan que contiene proteasas de procesamiento de adenovirus y virus de la peste porcina africana, enzimas desSUMOilantes de levaduras a humanos y enzimas desubiquitinantes de plantas y bacterias patógenas de animales (24 & # x0201329, 35). Los ortólogos K7L están presentes y presumiblemente se requieren en todos los ortopoxvirus. Al emplear expresión transitoria y análisis de virus letales condicionales, se ha demostrado previamente que I7L, el ortólogo de vaccinia de K7L, es necesario para el procesamiento de proteínas centrales (7, 16, 18). Un estudio seminal utilizó extractos de células infectadas por virus que contienen I7L para demostrar que la enzima es una cisteína proteasa capaz de escindir los precursores de proteínas centrales P4a, P4b y P25K (17). Sin embargo, los autores no pudieron producir I7L catalíticamente activo sintetizado in vitro, lo que los lleva a concluir que se requiere un cofactor para la actividad.

Nuestro éxito en la producción de K7L catalíticamente activo por expresión en E. coli nos lleva a proponer que la dimerización de K7L, y por inferencia I7L, es necesaria para la actividad y que la in vitro El sistema de traducción empleado previamente (17) produjo concentraciones insuficientes de proteína para permitir una dimerización significativa. Además, nuestros resultados sugieren fuertemente que K7L de hecho requiere un cofactor para una actividad máxima. Aunque no conocemos su identidad, hemos demostrado que el glicerol y otros osmolitos que estabilizan el pliegue tienen un efecto estimulante. Además, encontramos que los polianiones tienen efectos diferenciales sobre la actividad de la enzima en la proteína. vis & # x000e0 vis sustratos de péptidos. Juntas, estas características apuntan a una regulación de K7L que es multivariante y más compleja que para otros miembros del Clan CE, posiblemente como consecuencia del estricto requisito de que su actividad se localice predominante o exclusivamente en el virión en condensación (7, 16, 18). ).

La información sobre otras proteasas virales del Clan CE es sumamente limitada y, hasta la fecha, solo la proteasa adenoviral procesadora de adenaína se ha caracterizado bioquímica y estructuralmente con un detalle significativo (29, 35, 46, 47). Curiosamente, algunas propiedades de K7L parecen ser distintas de las de otros miembros del Clan CE, mientras que otras están relacionadas. Por lo tanto, K7L funciona de manera más eficiente como un homodímero, que no es un requisito informado para otras enzimas Clan CE. Sin embargo, al igual que otros miembros del Clan CE, hemos proporcionado in vitro evidencia de que los cofactores mejoran la actividad de K7L, aunque los detalles varían. Por lo tanto, la adenaína se activa mediante la unión simultánea de dos cofactores, el fragmento de 11 residuos de la proteína central pIV y el ADN viral (29), mientras que nuestros datos sugieren que los oligonucleótidos de ARN y ADN pueden mejorar la actividad de K7L hacia su sustrato afín. P25K.

Nuestro análisis de las características de unión de sustrato extendido de K7L ayuda a explicar la especificidad de la proteasa para sus sustratos predichos, revelando que la presencia de residuos cargados negativamente en las posiciones P7 y P8 mejora en gran medida la escisión de algunos sustratos.Esto implica que se requiere una interacción exosita distante del sitio activo para la escisión óptima de los sustratos naturales. De acuerdo con nuestros hallazgos, ninguno de los péptidos que abarcan el sitio de escisión de P4a, Gly 614 & # x02193Ser 615, ni la proteína P4a en sí, es escindido por K7L recombinante.

K7L se ha propuesto como un objetivo prometedor para la terapia de la viruela (10, 11). De hecho, se ha informado de una pequeña molécula que previene la maduración de la proteína central de la vacuna (10, 11) y puede ser un inhibidor de I7L. Nuestro análisis de sonda basado en la actividad biotinilada demuestra que el K7L es activo y puede dirigirse a los lisados ​​de las células infectadas. En conclusión, nuestros resultados proporcionan muchos conocimientos novedosos sobre el mecanismo, la especificidad y la regulación de la proteasa viral K7L. Nuestro trabajo también proporciona una base sólida, así como herramientas moleculares específicas (métodos de producción de proteasas, diseño de ensayos, diseño de inhibidores y síntesis) que ahora se pueden utilizar para probar la función de K7L en un entorno celular.


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