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¿Qué es ApoCas9 en el sistema CRISPR-Cas9?

¿Qué es ApoCas9 en el sistema CRISPR-Cas9?


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Actualmente estoy leyendo un artículo sobre un ensayo particular de nucleasas Cas9. En uno de los experimentos, han utilizado ApoCas9 (variantes Apo de otras nucleasas CRISPR) como algún tipo de control.

¿Pero todo el artículo no han definido ApoCas9? Verifiqué en línea la definición y actividad de ApoCas9, pero encontré sin ningún resultado fructífero.

Un método universal para la detección sensible y sin células de nucleasas asociadas a CRISPR


En general, "apo" se usa para indicar una apoenzima, que es la parte proteica de una enzima sin cofactor (es) esencial (s).

En realidad, esto se define en el Experimental sección del papel:

Cas9 / Cpf1 sin gRNA (ApoCas9 / Cpf1)

Entonces, en este caso, ApoCas9 es una endonucleasa Cas9 que no está unida a un ARN guía.


CRISPR-Cas9


Introducción al sistema CRISPR / Cas9

Aunque las herramientas de edición programables desarrolladas recientemente, como las nucleasas con dedos de zinc y las nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción, han mejorado significativamente la capacidad de modificación precisa del genoma, estas técnicas tienen limitaciones. La tecnología CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas) / Cas9 representa una mejora significativa sobre estas otras herramientas de edición del genoma de próxima generación, alcanzando un nuevo nivel de focalización, eficiencia y facilidad de uso. El sistema CRISPR / Cas9 permite el direccionamiento genómico específico del sitio en prácticamente cualquier organismo.

El sistema CRISPR / Cas de tipo II es un sistema de respuesta inmune adaptativa procariota que utiliza ARN no codificantes para guiar a la nucleasa Cas9 para inducir la escisión del ADN específico del sitio. Este daño en el ADN se repara mediante mecanismos celulares de reparación del ADN, ya sea a través de la vía de reparación del ADN de unión del extremo no homólogo (NHEJ) o la vía de reparación dirigida por homología (HDR).

El sistema CRISPR / Cas9 se ha aprovechado para crear un método simple programable por ARN para mediar en la edición del genoma en células de mamíferos, y se puede utilizar para generar knockouts de genes (mediante inserción / eliminación) o knockins (mediante HDR). Para crear alteraciones genéticas (Figura 1), se genera un ARN guía único (ARNsg) para dirigir la nucleasa Cas9 a una ubicación genómica específica. Las roturas de doble hebra inducidas por Cas9 se reparan a través de la vía de reparación del ADN NHEJ. La reparación es propensa a errores y, por lo tanto, se pueden introducir inserciones y deleciones (INDEL) que pueden alterar la función genética.

El principio de alteración genética mediada por CRISPR / Cas9. Un ARN guía único (sgRNA), que consta de una secuencia de crRNA que es específica del ADN diana y una secuencia de tracrRNA que interactúa con la proteína Cas9 (1), se une a una forma recombinante de la proteína Cas9 que tiene actividad de ADN endonucleasa (2 ). El complejo resultante provocará la escisión del ADN bicatenario específico de la diana (3). El sitio de escisión será reparado por la vía de reparación del ADN de unión de extremos no homólogos (NHEJ), un proceso propenso a errores que puede resultar en inserciones / deleciones (INDEL) que pueden alterar la función del gen (4).

La tecnología CRISPR / Cas9 ha revolucionado la edición del genoma, permitiendo un nivel previamente inalcanzable de focalización genómica, eficiencia y simplicidad. Los productos Guide-it mejoran aún más la usabilidad del sistema CRISPR / Cas9 al proporcionar un método simplificado para:


¿Quién posee CRISPR en 2021? Es incluso más complicado de lo que cree

La cuestión de quién es el propietario de CRISPR, la herramienta de edición genética que se espera que transforme la medicina moderna, es un lío confuso de batallas legales, convenciones de nombres oscuros y variaciones sutiles en la forma y función molecular. Es casi seguro que las entidades que eventualmente posean los derechos de patente de estas herramientas controlarán quién puede usarlas, cómo se usan y cuánto cuestan.

La batalla de patentes CRISPR original entre UC Berkeley y el MIT-Harvard Broad Institute no ha sido bonita. Las peleas de patentes rara vez lo son, pero el debate sobre quién es el propietario de CRISPR-Cas9 ha sido especialmente acalorado. No es sorprendente. Dado que CRISPR se anuncia como el futuro de la medicina, la capacidad de poseer y licenciar parte de la herramienta es fundamental para una gran cantidad de empresas fundadas en la tecnología CRISPR-Cas9 original.

Pero quién posee CRISPR en 2021 es significativamente más complicado de lo que era hace unos años. A medida que más empresas, investigadores e instituciones académicas presentan solicitudes de patente para moléculas CRISPR sutilmente diferentes, ya no es posible limitar los derechos de propiedad intelectual a solo dos o tres grandes actores.

Por qué es importante CRISPR

CRISPR es esencialmente un mecanismo de defensa bacteriano. Cuando un virus infecta una bacteria (conocida como bacteriófago), la bacteria puede emplear una molécula asociada a CRISPR (Cas) para cortar el ADN del bacteriófago. Luego, las bacterias insertan fragmentos del ADN del fago en su propio genoma, lo que le permite reconocer y destruir los fagos en el futuro.

Los bacteriófagos insertan su ADN (en rojo, imagen del medio) en una bacteria. CRISPR es esencialmente un sistema inmunológico bacteriano para cortar y almacenar el ADN del fago para que las bacterias puedan reconocer y combatir al fago en el futuro. Crédito: Víctor Padilla-Sánchez, Universidad Católica de América, Fuente: Institutos Nacionales de Salud en Flickr

La belleza de las proteínas Cas es que se pueden programar para reconocer y cortar secuencias de ADN específicas. Es por eso que CRISPR a menudo se conoce como "tijeras genéticas". Al dar instrucciones a una molécula de Cas sobre dónde cortar el ADN con la ayuda de una molécula de ARN guía (gRNA), CRISPR tiene el poder de desactivar cualquier gen que esté programado para encontrar.

Las implicaciones de cortar el ADN son tremendas. Las terapias basadas en CRISPR ya han demostrado ser una promesa clínica para afecciones como la ceguera infantil hereditaria y la anemia de células falciformes. La tecnología podría curar muchas enfermedades genéticas desactivando un gen que no se suponía que estuviera encendido en primer lugar. CRISPR también puede cortar el ADN, reemplazar la ruptura con un nuevo segmento y corregir una mutación genética defectuosa.

Todo el mundo quiere un bocado del CRISPR Pie

La molécula CRISPR-Cas más famosa es Cas9. Aquí es donde comienza la batalla de patentes CRISPR original, y la disputa aún continúa. Tanto UC Berkeley como el MIT-Harvard Broad Institute reclamaron derechos de propiedad intelectual sobre CRISPR-Cas9 en 2012. Dado que Broad Institute pagó para acelerar su solicitud, sus patentes se otorgaron primero a pesar de que UC Berkeley presentó primero. Sin embargo, la Oficina de Patentes y Marcas de los Estados Unidos (USPTO) cambió a un sistema de primer registro que entró en vigor en 2013 y preparó el escenario para la batalla de patentes.

Varias empresas fundadas sobre los derechos de propiedad intelectual de CRISPR-Cas9 iniciales también tienen superposiciones en sus patentes. Y algunas patentes solo cubren el derecho a usar CRISPR-Cas9 para ciertas enfermedades o aplicaciones.

Las fuentes contactadas para este artículo solo aceptaron hablar bajo condición de anonimato y no ser citadas directamente. Por lo tanto, si bien las disputas de patentes de CRISPR-Cas9 no son noticia de primera plana, quienes están directamente involucrados con la tecnología están tomando todas las precauciones para que sus palabras no se malinterpreten en los procedimientos legales actuales o futuros.

Hasta la fecha, las empresas fundadas por cada uno de los jugadores en la disputa central de la patente Cas9 son:

Fuera de la disputa de la patente, Doudna y Charpentier han sido reconocidos como co-descubridores de las "tijeras" CRISPR. Su colaboración original en 2011 finalmente les valió el Premio Nobel de Química en 2020. Fue una victoria histórica: Doudna y Charpentier se convirtieron en las primeras mujeres en compartir el premio y trajo a la biología sintética un nuevo nivel de conciencia pública.

Toda esta atención se ha centrado en CRISPR-Cas9. Pero el Ca9 no es solo una molécula. Es una gran cantidad de enzimas de tipo salvaje (de origen natural) y diseñadas para unir y escindir el ADN. Las moléculas Cas9 tampoco son las únicas enzimas CRISPR. Varias organizaciones, empresas, investigadores e instituciones académicas han descubierto y patentado familias enteras de complejos CRISPR como Cas12, Cas14, CasX y CasY.

Incluso las convenciones de nomenclatura de Cas son confusas. Las diferentes entidades utilizan pautas de nomenclatura ligeramente diferentes: CasX en un sistema de nomenclatura es Cas12e en otro. Algunas enzimas CRISPR Cas también están estrechamente relacionadas con otras, casi como primos moleculares con poca distinción entre ellas.

Hay cientos, si no miles, de variaciones de Cas, todas las cuales podrían potencialmente ser patentadas. Aquí es donde los derechos de propiedad intelectual de CRISPR se fragmentan aún más.

Otros jugadores en el juego de las patentes

Las primeras instituciones en descubrir CRISPR no son las únicas que poseen patentes. Por supuesto, quién descubrió inicialmente CRISPR es producto de mucho debate. Más allá de UC Berkeley y Emmanuelle Charpentier, la Universidad de Vilnius también descubrió cómo usar Cas9 al mismo tiempo. Sin embargo, la Universidad de Vilnius se ha dejado fuera de la lista de descubrimientos originales porque no demostró todos los componentes necesarios para la actividad de edición genética.

CRISPR Cas9 (blanco) utiliza Guide RNA para localizar y cortar la secuencia de ADN objetivo. Fuente: WikiMedia

Ahora, empresas como DowDuPont, MilliporeSigma y Cellectis poseen todas las patentes CRISPR-Cas9.

Algunos, como DowDuPoint, han comprado sus acuerdos de patentes de múltiples entidades CRISPR como Caribou Biosciences y Emmanuelle Charpentier. Una empresa de concesión de licencias de agrupación de patentes, MPEG LA, ha tomado otro camino. La compañía está en proceso de acumular varias patentes de diferentes compañías, lo que le da acceso potencial a una amplia gama de propiedad intelectual CRISPR.

El problema, sin embargo, es que cada una de estas patentes representa pequeños segmentos de un pastel mucho más grande. Todavía no está claro qué enzimas Cas o qué variaciones de esas enzimas serán finalmente útiles. El hecho de que un investigador o una empresa posea las patentes CRISPR-Cas no significa necesariamente que los complejos Cas serán efectivos para la edición genética. Descubrir las moléculas CRISPR Cas es relativamente fácil. Encontrar unos que funcionen es mucho más complicado.

¿Y si todo el mundo posee CRISPR?

Hay cuatro escenarios posibles para el futuro de los derechos de patente CRISPR. Una es que la mayoría de las personas que solicitan patentes CRISPR tienen éxito. En este caso, podría ser muy difícil para los investigadores y empresarios averiguar si una molécula de Cas ya está patentada y quién es el propietario de esa propiedad intelectual. Esto podría crear un cuello de botella en la investigación y el descubrimiento si los investigadores se ven obligados a analizar todas las variedades de CRISPR para encontrar las que necesitan.

CRISPR-Cas9 puede corregir la mutación genética que afecta la producción de la proteína distrofina, la causa subyacente de la distrofia muscular de Duchenne (DMD). Restaurando la distrofina (teñida de verde), cura al menos al 60% de los pacientes con DMD. Crédito: Courtney Young, M.S., laboratorio Melissa Spencer, Universidad de California, Los Ángeles. Fuente: NIH

El segundo escenario crea un mundo en el que muchas instituciones y empresas poseen los derechos CRISPR, pero está relativamente organizado (cuando el polvo inicial finalmente se asienta). Habría reglas que guíen cómo se puede compartir y utilizar CRISPR en la investigación para hacerlo más accesible.

Un tercer escenario sería un monopolio de las patentes CRISPR-Cas9 por uno o dos actores principales. Controlarían el panorama de la investigación y la fabricación fusionándose con otros jugadores o comprándolos. Sin embargo, esto es bastante improbable. Empresas e investigadores ya han desarrollado derechos de propiedad intelectual más claros con sus propias iteraciones de moléculas como CasX. Otras empresas han desarrollado complejos CRISPR patentados. Incluso si todas las patentes de Cas9 fueran adquiridas por una entidad, todavía existirían otras opciones en el mercado CRISPR-Cas.

También hay un cuarto escenario en el que Cas9 no se convierte en la molécula del futuro. Si bien Ca9 fue la primera enzima CRISPR que se descubrió, no es necesariamente la más fácil de trabajar. Los complejos moleculares como CasX son más pequeños, más fáciles de administrar a los pacientes y hacen menos cortes genéticos fuera del objetivo. Aunque Cas9 todavía está de moda en disputas legales, es posible que no termine siendo la molécula elegida para muchas aplicaciones.

Debe decirse que las instituciones académicas probablemente tendrán acceso a las moléculas de Cas a un costo mínimo o gratuito. Es tradicional que los investigadores académicos utilicen herramientas de ciencias biológicas patentadas si no planean obtener ganancias por sí mismos.

El CRISPR tiene y no tiene

Las aplicaciones de CRISPR no se limitan a la biofarmacia y la terapéutica. Las plataformas de tecnología agrícola o las carnes de cultivo celular ya utilizan la tecnología CRISPR. Hasta ahora, este sistema está funcionando lo suficientemente bien: una docena de empresas poseen IP Cas9 inicial, la otorgan licencias y obtienen ganancias al mismo tiempo que desarrollan sus propios productos y terapias. Así es como se supone que funciona el sistema de patentes. Pero en un monopolio de uno o dos grandes actores, las tarifas de licencia que los titulares de la propiedad intelectual podrían cobrar podrían ser prácticamente ilimitadas.

Se espera que la ingeniería de cultivos básicos con CRISPR sea una herramienta clave en la modificación de cultivos para producir mayores rendimientos y ser más resistentes a los efectos del cambio climático. Fuente: DOI: 10.1126 / science.aar7191

Un segundo problema surge si una empresa necesita emplear CRISPR para múltiples aplicaciones, pero más de una empresa tiene segmentos de los derechos CRISPR para aplicaciones específicas. Las empresas más nuevas podrían tener que pagar varias tarifas de licencia para acceder a la tecnología. Como esas tarifas suelen ser altas, especialmente para una herramienta tan poderosa como CRISPR, muchas empresas prometedoras podrían quedarse fuera del juego solo con las tarifas. Este escenario podría sofocar la innovación y la creatividad científica.

¿Aún desea patentar CRISPR? Esto es lo que necesita saber

El mayor desafío para cualquiera que intente resolver los derechos de patente de CRISPR es comprender completamente cuántas patentes hay.

Una búsqueda en la USPTO reveló 262 patentes o solicitudes de patente que enumeran CRISPR-Cas9 y más de 5,000 patentes generales de CRISPR. Y estas son solo las solicitudes de patente para Cas9. Esto no incluye el creciente número de patentes de otras moléculas de Cas o moléculas de Cas que aún no se han descubierto. Esto tampoco incluye las solicitudes de patentes en otras grandes regiones de biología sintética como China, Europa, el Reino Unido e Israel.

Es poco probable que la competencia por las patentes CRISPR disminuya en el futuro a medida que más empresas y centros académicos se unan a la carrera. La carrera se ha vuelto cada vez más global con más países solicitando patentes CRISPR; las nuevas patentes se presentan a un ritmo de 200 por mes.

Lo que no está claro es cómo estas enormes cantidades de patentes CRISPR afectarán el futuro de la ciencia. ¿Obstaculizarán el progreso al limitar el uso comercial de la tecnología, o prevalecerán los investigadores y harán que las nuevas terapias sean accesibles para todos? Cuando el polvo se asiente, si es que lo hace, la esperanza es que la tecnología CRISPR sea accesible para una amplia gama de aplicaciones a un costo competitivo. El poder de diseñar biología no debe limitarse a unos pocos. Ahora estamos en la Era de la Biología. Si queremos construir un futuro mejor, no podemos dejar la promesa fundamental de la ciencia en el polvo.

Un agradecimiento especial a Marianna Limas por la investigación adicional y a Lana Bandoim por la escritura adicional de este artículo.

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Fiona Mischel

Fiona Mischel es la editora en jefe de SynBioBeta. Con frecuencia cubre sostenibilidad, investigación CRISPR, tecnología alimentaria y agrícola y biotecnología para viajes espaciales. Le apasiona mostrar cómo las innovaciones científicas pueden combatir nuestra crisis climática y tener un impacto positivo en las comunidades de todo el mundo.


Cuestiones

En abril de 2015, un grupo chino informó sobre la primera aplicación de CRISPR / Cas9 a embriones humanos (no viables). Este desarrollo, junto con los costos decrecientes de la tecnología, ha desencadenado un importante debate bioético sobre hasta qué punto se debe utilizar la tecnología. La tecnología se enfrenta a dos problemas importantes.

El primer problema es un dilema filosófico. Se centra en la medida en que CRISPR / Cas9 debe usarse para alterar las células de la 'línea germinal' (óvulos y espermatozoides) que son responsables de transmitir los genes a la siguiente generación. Si bien pasarán muchos años más antes de que la tecnología sea viable de usar para crear bebés de diseño, ya ha comenzado un debate público sobre este tema. Tan grande es el temor que algunos científicos, incluidos algunos que ayudaron al pionero CRISPR / Cas9, han pedido una moratoria sobre su uso en células de línea germinal.

El segundo problema es de seguridad. Uno de los principales problemas es que la tecnología aún está en su infancia y el conocimiento sobre el genoma sigue siendo muy limitado. Muchos científicos advierten que la tecnología aún necesita mucho trabajo para aumentar su precisión y asegurarse de que los cambios realizados en una parte del genoma no introduzcan cambios en otra parte que podrían tener consecuencias imprevistas. Este es un tema particularmente importante cuando se trata del uso de la tecnología para aplicaciones dirigidas a la salud humana. Otro problema crítico es que una vez que se modifica un organismo, como una planta o un insecto, es difícil distinguirlo del tipo salvaje y, una vez liberado en el medio ambiente, podría poner en peligro la biodiversidad.

Los responsables de la formulación de políticas todavía debaten sobre las limitaciones que se deben aplicar a la tecnología. En abril de 2015, los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. Emitieron un comunicado que indica que no financiará ninguna investigación que utilice herramientas de edición del genoma como CRISPR en embriones humanos. Mientras tanto, la Autoridad de Embriología y Fertilización Humana del Reino Unido, bajo cuyo mandato recaería dicha investigación, ha indicado que la tecnología CRISPR / Cas9 se puede utilizar en embriones híbridos humano-animal de menos de 14 días. Cualquier investigador que trabaje en esta área deberá obtener primero una licencia de la Autoridad. Otros importantes consejos de investigación del Reino Unido han indicado que apoyan el uso continuo de CRISPR / Cas9 y otras herramientas de edición del genoma en la investigación preclínica.

Mientras los reguladores debaten qué restricciones hacer cumplir con CRISPR / Cas9, la tecnología se ha convertido en objeto de una importante disputa de patentes. La primera solicitud para patentar la tecnología fue presentada por DuPont en marzo de 2007 (WO / 2007/025097). Esto cubre el uso de la tecnología para desarrollar cepas bacterianas resistentes a los fagos para la producción de alimentos, piensos, cosméticos, productos de cuidado personal y productos veterinarios. Desde entonces, tres empresas de biotecnología de nueva creación fuertemente financiadas y media docena de universidades han presentado patentes. En los EE. UU. Se han presentado dos importantes reclamaciones de patentes en competencia. El primero, presentado el 25 de mayo de 2015, se basa en el trabajo dirigido por Jennifer Doudna en la Universidad de California, Berkeley, y Emmanuelle Charpentier, originalmente en la Universidad de Viena y ahora en el Centro Helmholz de Investigaciones Infecciosas en Alemania. La solicitud tiene 155 reivindicaciones y cubre numerosas aplicaciones para una variedad de tipos de células (Solicitud de Patente de Estados Unidos No. PCT / US2013 / 032589). El segundo, fue presentado por MIT-Harvard Broad Institute el 12 de diciembre de 2012 para el trabajo de Feng Zhang, que se centró en el uso de CRISPR / Cas9 para la edición del genoma en células eucariotas. Se le otorgó el estado de vía rápida y se otorgó el 15 de abril de 2014 (Patente de EE. UU. No. 8,697,359). En abril de 2015, Charpentier y las universidades de California y Viena presentaron una impugnación de la patente ante la Oficina de Patentes y Marcas de EE. UU. La disputa de la patente tardará varios años en resolverse. Es poco probable que las disputas legales sobre las patentes afecten el uso de CRISPR para la investigación básica porque la tecnología está disponible a través de un repositorio de código abierto. Sin embargo, podría tener un impacto en las aplicaciones clínicas que utilizan la técnica.

Este perfil científico fue escrito por Lara Marks en junio de 2016 con la generosa contribución de Silvia Camporesi, Xiofan Zeng y Jonathan Lind. La pieza fue actualizada por Lara Marks en octubre de 2020.


La herramienta de 'tijera' de edición de genes CRISPR-Cas9 también puede ser un 'regulador de intensidad' genético

En una serie de experimentos con bacterias cultivadas en laboratorio, los científicos de Johns Hopkins han encontrado evidencia de que existe un segundo papel para el sistema de corte de genes CRISPR-Cas9 & # 8212, ampliamente utilizado, como un regulador de intensidad genética para los genes CRISPR-Cas9. Su función de reducir o atenuar la actividad de CRISPR-Cas9 puede ayudar a los científicos a desarrollar nuevas formas de diseñar células genéticamente con fines de investigación.

Identificado por primera vez en el genoma de las bacterias intestinales en 1987, CRISPR-Cas9 es un grupo de genes de origen natural pero inusual con un potencial para cortar secuencias de ADN en otros tipos de células que se descubrió 25 años después. Su valor en ingeniería genética & # 8212 alteración genética programable en células vivas, incluidas las células humanas & # 8212 fue rápidamente apreciado, y su uso generalizado como "editor" del genoma en miles de laboratorios de todo el mundo fue reconocido en la concesión del Premio Nobel de Química el año pasado a sus co-desarrolladores estadounidenses y franceses.

CRISPR significa repeticiones palindrómicas cortas agrupadas, regularmente interespaciadas. Cas9, que se refiere a la proteína 9 asociada a CRISPR, es el nombre de la enzima que produce el corte de ADN. Las bacterias utilizan naturalmente CRISPR-Cas9 para cortar el ADN viral u otro ADN potencialmente dañino y desactivar la amenaza, dice Joshua Modell, profesor asistente de biología molecular y genética en la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins. En este rol, dice Modell, "CRISPR no es solo un sistema inmunológico, es un sistema inmunológico adaptativo & # 8212 uno que puede recordar las amenazas que ha encontrado previamente al aferrarse a una pequeña parte de su ADN, que es similar a una foto policial". Estas fotos policiales se copian luego en "ARN guía" que le dicen a Cas9 qué cortar.

Los científicos han trabajado durante mucho tiempo para desentrañar los pasos precisos del mecanismo de CRISPR-Cas9 y cómo su actividad en las bacterias aumenta o disminuye. Buscando genes que enciendan o inhiban el sistema de corte de genes CRISPR-Cas9 para la bacteria común que causa la faringitis estreptocócica Streptococcus pyogenes, los científicos de Johns Hopkins encontraron una pista sobre cómo funciona ese aspecto del sistema.

Específicamente, los científicos encontraron un gen en el sistema CRISPR-Cas9 que, cuando se desactivó, condujo a un aumento dramático en la actividad del sistema en las bacterias. El producto de este gen pareció reprogramar Cas9 para que actuara como un freno, en lugar de una "tijera", para reducir el sistema CRISPR.

"Desde la perspectiva de la inmunidad, las bacterias necesitan incrementar la actividad CRISPR-Cas9 para identificar y eliminar las amenazas de la célula, pero también necesitan reducirla para evitar la autoinmunidad & # 8212 cuando el sistema inmunológico ataca por error a componentes de las propias bacterias", dice la estudiante graduada Rachael Workman, bacterióloga que trabaja en el laboratorio de Modell.

Para precisar aún más los detalles del "freno", el siguiente paso del equipo fue comprender mejor el producto del gen desactivado (tracrRNA). El ARN es un primo genético del ADN y es vital para llevar a cabo las "instrucciones" del ADN para producir proteínas. Los ARN tracr pertenecen a una familia única de ARN que no producen proteínas. En cambio, actúan como una especie de andamio que permite que la enzima Cas9 lleve el ARN guía que contiene la foto policial del virus invasor y corte las secuencias de ADN coincidentes del virus.

TracrRNA viene en dos tamaños: largo y corto. La mayoría de las herramientas modernas CRISPR-Cas9 de corte de genes utilizan la forma abreviada. Sin embargo, el equipo de investigación descubrió que el producto del gen desactivado era la forma larga de ARNtracr, cuya función se desconoce por completo.

Las formas larga y corta de tracrRNA son similares en estructura y tienen en común la capacidad de unirse a Cas9. El tracrRNA de forma corta también se une al RNA guía. Sin embargo, el tracrRNA de forma larga no necesita unirse al RNA guía porque ya contiene un segmento que imita al RNA guía. "Esencialmente, los tracrRNA de forma larga han combinado la función del tracrRNA de forma corta y el RNA guía", dice Modell.

Además, los investigadores encontraron que mientras que los ARN guía normalmente buscan secuencias de ADN viral, los ARN tracr de forma larga se dirigen al sistema CRISPR-Cas9 en sí. El tracrRNA de forma larga tiende a asentarse en el ADN, en lugar de cortarlo. Cuando esto sucede en un área particular de un gen, evita que ese gen se exprese & # 8212 o se vuelva funcional.

Para confirmar esto, los investigadores utilizaron ingeniería genética para alterar la longitud de una determinada región en tracrRNA de forma larga para hacer que el tracrRNA se pareciera más a un RNA guía. Descubrieron que con el ARNtracr de forma larga alterado, Cas9 una vez más se comportó más como una tijera.

Otros experimentos mostraron que en bacterias cultivadas en laboratorio con una cantidad abundante de ARNtracr de forma larga, los niveles de todos los genes relacionados con CRISPR eran muy bajos. Sin embargo, cuando se eliminó el ARNtracr de forma larga de las bacterias, la expresión de los genes CRISPR-Cas9 se multiplicó por cien.

Las células bacterianas que carecen del tracrRNA de forma larga se cultivaron en el laboratorio durante tres días y se compararon con células cultivadas de forma similar que contenían el tracrRNA de forma larga. Al final del experimento, las bacterias sin tracrRNA de forma larga habían muerto por completo, lo que sugiere que el tracrRNA de forma larga normalmente protege a las células de la enfermedad y la muerte que ocurren cuando la actividad de CRISPR-Cas9 es muy alta.

"Empezamos a tener la idea de que la forma larga estaba reprimiendo pero no eliminando su propia actividad relacionada con CRISPR", dice Workman.

Para ver si el tracrRNA de forma larga podría reprogramarse para reprimir otros genes bacterianos, el equipo de investigación alteró la región espaciadora del tracrRNA de forma larga para dejarlo reposar en un gen que produce fluorescencia verde. Las bacterias con esta versión mutada de tracrRNA de forma larga brillaron menos verdes que las bacterias que contienen el tracrRNA de forma larga normal, lo que sugiere que el tracrRNA de forma larga puede modificarse genéticamente para reducir otros genes bacterianos.

Los investigadores también encontraron los componentes genéticos del ARNtracr de forma larga en aproximadamente el 40% del grupo de bacterias Streptococcus. El estudio adicional de las cepas bacterianas que no tienen el ARNtracr de forma larga, dice Workman, revelará potencialmente si sus sistemas CRISPR-Cas9 están intactos y otras formas en que las bacterias pueden marcar el sistema CRISPR-Cas9.

La capacidad de atenuación que descubrieron los experimentos, dice Modell, ofrece oportunidades para diseñar nuevas o mejores herramientas CRISPR-Cas9 destinadas a regular la actividad genética con fines de investigación. "En un escenario de edición de genes, un investigador puede querer cortar un gen específico, además de usar el ARNtracr de forma larga para inhibir la actividad del gen", dice.


El nuevo y rápido método CRISPR / Cas9 identifica genes clave en la regeneración de la médula espinal del pez cebra

Un nuevo enfoque de detección rápida utiliza la tecnología CRISPR / Cas9 para identificar genes relacionados con el sistema inmunológico que desempeñan un papel crucial en la reparación de las lesiones de la médula espinal del pez cebra. Marcus Keatinge y Themistoklis Tsarouchas de la Universidad de Edimburgo, Reino Unido, y sus colegas presentan estos hallazgos en la revista de acceso abierto. PLOS Genetics.

En los seres humanos y otros mamíferos, las conexiones nerviosas de la médula espinal cortadas no sanan, por lo que una lesión de la médula espinal puede provocar una parálisis permanente. Por el contrario, el pez cebra es capaz de recuperarse de una lesión de la médula espinal en un proceso que involucra inflamación controlada por macrófagos, un tipo de célula del sistema inmunológico. Sin embargo, el proceso preciso por el cual los macrófagos ayudan a la regeneración de la médula espinal en el pez cebra sigue siendo un misterio.

Para ayudar a aclarar este proceso, Keatinge, Tsarouchas y sus colegas desarrollaron un nuevo método para identificar rápidamente los genes relacionados con los macrófagos que están involucrados en la regeneración de la médula espinal del pez cebra. La estrategia emplea tecnología CRISPR / Cas9, que permite a los investigadores apuntar y alterar genes específicos, revelando así su función. Las moléculas conocidas como ARN sintético Oligo CRISPR guía ARN (sCrRNA) permiten esta orientación específica de genes.

Los investigadores aplicaron el nuevo método para estudiar la regeneración de la médula espinal en larvas de pez cebra. La clave del método fue un paso de preselección en el que probaron más de 350 sCrRNA que se dirigen a genes que ya se sabe que potencialmente juegan un papel importante en la regeneración de la médula espinal relacionada con la inflamación. La introducción de estos sCrRNA en el pez cebra permitió la identificación de 10 genes que, cuando se interrumpieron, afectaron la recuperación de la lesión de la médula espinal.

Un análisis adicional redujo la lista a cuatro genes que parecen ser cruciales para la reparación de conexiones nerviosas espinales cortadas, validando el nuevo método. Un gen en particular, tgfb1, parece desempeñar un papel de señalización esencial en el control de la inflamación durante el proceso de recuperación.

El nuevo método y los hallazgos podrían ayudar a profundizar la comprensión de la regeneración de la médula espinal en el pez cebra. Los investigadores también dicen que el método podría adaptarse para detectar genes que también desempeñan funciones importantes en otros procesos biológicos.

Los autores añaden: "El pez cebra puede regenerar completamente su médula espinal después de una lesión. Usando una plataforma de detección nueva y muy rápida, descubrimos genes del sistema inmunológico que son esenciales para la regeneración. Prevemos que nuestros hallazgos conduzcan a nuevos conocimientos sobre la incapacidad de mamíferos para regenerar y nuestra plataforma de detección versátil para adaptarse a otros modelos de enfermedades o lesiones en el pez cebra ".


CRISPR-Cas9 para terapia: los desafíos y formas de superarlos

Sundaram Acharya,. Debojyoti Chakraborty, en ingeniería del genoma a través del sistema CRISPR-Cas9, 2020

Abstracto

La repetición palindrómica corta agrupada regularmente interespaciada / asociada a CRISPR (CRISPR Cas) es un componente del sistema inmunitario adaptativo procariota que se ha reutilizado para la edición del genoma en los últimos años. La precisión, simplicidad y flexibilidad de este sistema han abierto una amplia gama de aplicaciones biológicas que abarcan desde la investigación básica hasta la biotecnología y la medicina. Además, las capacidades de multiplexación de CRISPR ofrecen un enfoque prometedor para modelar o corregir trastornos poligénicos comunes junto con sus contrapartes monogénicas e infecciosas. Aunque CRISPR no es completamente preciso y quedan dudas sobre su especificidad y modos de entrega, la solidez y amplia aplicabilidad de esta herramienta de edición del genoma ha abierto numerosas formas de abordar estos problemas. En este capítulo, discutiremos sobre el progreso inicial hacia la terapéutica CRISPR, las modalidades de administración existentes, los desafíos antes de la edición CRISPR antes de que se convierta en una posibilidad terapéutica y los esfuerzos continuos para desarrollar un sistema CRISPR perfecto para la aplicación desde el banco hasta la cama.


¿Qué es ApoCas9 en el sistema CRISPR-Cas9? - biología

a CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology, Mathura Road, Nueva Delhi 110025, India
Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Abstracto

El sistema CRISPR-Cas9 ha revolucionado el proceso de realizar cambios en la secuencia de ADN de los organismos. Basándose en un modelo simplista de unión y escisión de ADN guiadas por ARN, esta caja de herramientas moleculares ha encontrado aplicación en casi todas las ramas de las ciencias biológicas. La historia de CRISPR – Cas9 es una historia de descubrimiento y desarrollo en el que un componente de la inmunidad adaptativa bacteriana se ha aprovechado para abordar importantes cuestiones biológicas utilizando importantes aportes de estudios fisicoquímicos de estructura y función. In this review, we trace the evolution of CRISPR–Cas9 from its predecessor genome editing tools and document its current status with an emphasis on chemical biology aspects of modulating its activity to generate a potent tool for gene therapy applications.


We would like to thank the Sharp lab members for discussion and critical reading of the manuscript, and M. Lindstrom for assistance on constructing figures. This work was supported by United States Public Health Service grants RO1-GM34277 and R01-CA133404 from the National Institutes of Health (P.A.S.), PO1-CA42063 from the National Cancer Institute (P.A.S.), and partially by Cancer Center Support (core) grant P30-CA14051 from the National Cancer Institute. X.W. is a Howard Hughes Medical Institute International Student Research fellow.

Conflict of Interests: The authors Xuebing Wu, Andrea J. Kriz and Phillip A. Sharp declare that they have no conflict of interests.

Supplementary Materials: The supplementary materials can be found online with this article at DOI 10.1007/s40484-014-0030-x.


New understanding of CRISPR-Cas9 tool could improve gene editing

The 3D structure of a base editor, comprised of the Cas9 protein (white and gray), which binds to a DNA target (teal and blue helix) complementary to the RNA guide (purple), and the deaminase proteins (red and pink), which switch out one nucleotide for another. (UC Berkeley graphic by Gavin Knott and Audrone Lapinaite)

Within a mere eight years, CRISPR-Cas9 has become the go-to genome editor for both basic research and gene therapy. But CRISPR-Cas9 also has spawned other potentially powerful DNA manipulation tools that could help fix genetic mutations responsible for hereditary diseases.

Researchers at the University of California, Berkeley, have now obtained the first 3D structure of one of the most promising of these tools: base editors, which bind to DNA and, instead of cutting, precisely replace one nucleotide with another.

First created four years ago, base editors are already being used in attempts to correct single-nucleotide mutations in the human genome. Base editors now available could address about 60% of all known genetic diseases – potentially more than 15,000 inherited disorders — caused by a mutation in only one nucleotide.

The detailed 3D structure, reported in the July 31 issue of the journal Ciencias, provides a roadmap for tweaking base editors to make them more versatile and controllable for use in patients.

“We were able to observe for the first time a base editor in action,” said UC Berkeley postdoctoral fellow Gavin Knott. “Now we can understand not only when it works and when it doesn’t, but also design the next generation of base editors to make them even better and more clinically appropriate.”

A base editor is a type of Cas9 fusion protein that employs a partially deactivated Cas9 — its snipping shears are disabled so that it cuts only one strand of DNA — and an enzyme that, for example, activates or silences a gene, or modifies adjacent areas of DNA. Because the new study reports the first structure of a Cas9 fusion protein, it could help guide the invention of myriad other Cas9-based gene-editing tools.

“We actually see for the first time that base editors behave as two independent modules: You have the Cas9 module that gives you specificity, and then you have a catalytic module that provides you with the activity,” said Audrone Lapinaite, a former UC Berkeley postdoctoral fellow who is now an assistant professor at Arizona State University in Tempe. “The structures we got of this base editor bound to its target really give us a way to think about Cas9 fusion proteins, in general, giving us ideas which region of Cas9 is more beneficial for fusing other proteins.“

Lapinaite and Knott, who recently accepted a position as a research fellow at Monash University in Australia, are co-first authors of the paper.

“This structure helps us understand base editors at a much deeper level,” said senior author Jennifer Doudna, UC Berkeley professor of molecular and cell biology and of chemistry and Howard Hughes Medical Institute investigator. “Now that we can see what we’re working with, we can develop informed strategies to improve the system.”

Editing one base at a time

In 2012, researchers first showed how to reengineer a bacterial enzyme, Cas9, and turn it into a gene-editing tool in all types of cells, from bacterial to human. The brainchild of Doudna and her French colleague, Emmanuelle Charpentier, CRISPR-Cas9 has transformed biological research and brought gene therapy into the clinic for the first time in decades.

The 3D structure of a base editor as it edits a stretch of DNA. (UC Berkeley graphic by Gavin Knott)

Scientists quickly co-opted Cas9 to produce a slew of other tools. Basically a mash-up of protein and RNA, Cas9 precisely targets a specific stretch of DNA and then precisely snips it, like a pair of scissors. The scissors function can be broken, however, allowing Cas9 to target and bind DNA without cutting. In this way, Cas9 can ferry different enzymes to targeted regions of DNA, allowing the enzymes to manipulate genes.

In 2016, David Liu of Harvard University and the Broad Institute of the Massachusetts Institute of Technology and Harvard combined a Cas9 with another bacterial protein to allow the surgically precise replacement of one nucleotide with another: the first base editor.

While the early adenine base editor was slow, the newest version, called ABE8e, is blindingly fast: It completes nearly 100% of intended base edits in 15 minutes. Yet, ABE8e may be more prone to edit unintended pieces of DNA in a test tube, potentially creating what are known as off-target effects.

The newly revealed structure was obtained with a high-powered imaging technique called cryo-electron microscopy (cryoEM). Activity assays showed why ABE8e is prone to create more off-target edits: The deaminase protein fused to Cas9 is always active. As Cas9 hops around the nucleus, it binds and releases hundreds or thousands of DNA segments before it finds its intended target. The attached deaminase, like a loose cannon, doesn’t wait for a perfect match and often edits a base before Cas9 comes to rest on its final target.

Knowing how the effector domain and Cas9 are linked can lead to a redesign that makes the enzyme active only when Cas9 has found its target.

“If you really want to design truly specific fusion protein, you have to find a way to make the catalytic domain more a part of Cas9, so that it would sense when Cas9 is on the correct target and only then get activated, instead of being active all the time,” Lapinaite said.

The structure of ABE8e also pinpoints two specific changes in the deaminase protein that make it work faster than the early version of the base editor, ABE7.10. Those two point mutations allow the protein to grip the DNA tighter and more efficiently replace A with G.

“As a structural biologist, I really want to look at a molecule and think about ways to rationally improve it. This structure and accompanying biochemistry really give us that power,” Knott added. “We can now make rational predications for how this system will behave in a cell, because we can see it and predict how it’s going to break or predict ways to make it better.”

“While base editors are now widely used to introduce precise changes in organisms ranging from bacteria to plants to primates, no one has previously observed the three-dimensional molecular structure of a base editor,” said Liu, who obtained his Ph.D. in 1999 from UC Berkeley and is a Howard Hughes Medical Institute investigator. “This collaborative project reveals the beautiful molecular structure of a state-of-the-art, highly active base editor — ABE8e — caught in the act of engaging a target DNA site.”

In addition to Lapinaite, Knott, Doudna and Liu, other paper co-authors are Cody Palumbo and Peter Beal of UC Davis, Enrique Lin-Shiao of UC Berkeley and Michelle Richter and Kevin Zhao of the Broad Institute, a collaboration between Harvard and the Massachusetts Institute of Technology.


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