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13.48: Respuesta inflamatoria y leucocitos - Biología

13.48: Respuesta inflamatoria y leucocitos - Biología



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¿Qué sucede cuando un enemigo pasa la primera línea de defensa?

Para que este corredor pueda pasar la primera línea de defensa, por lo general tiene que haber un agujero o una ruptura en la línea. Luego corre hacia la secundaria, o la segunda línea de defensa. Siempre que la piel se rompe, es posible que los patógenos entren fácilmente en su cuerpo. Pasan la primera línea de defensa y corren hacia la segunda línea de defensa.

La segunda línea de defensa

Si tiene un corte en la mano, la ruptura de la piel proporciona una vía para que los patógenos ingresen a su cuerpo. Suponga que las bacterias entran a través del corte e infectan la herida. Estas bacterias encontrarían la segunda línea de defensa del cuerpo.

Respuesta inflamatoria

El corte en su mano puede enrojecerse, calentarse e inflamarse. Estos son signos de unarespuesta inflamatoria. Ésta es la primera reacción del cuerpo al daño o infección de los tejidos. Como se explica en Figura a continuación, la respuesta es provocada por sustancias químicas llamadas citocinas yhistaminas, que se liberan cuando el tejido se lesiona o infecta. Los químicos se comunican con otras células y coordinan la respuesta inflamatoria. Puede ver una animación de la respuesta inflamatoria en este enlace: http: //www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/inflammination.html.

Este dibujo muestra lo que sucede durante la respuesta inflamatoria. ¿Por qué son importantes los cambios en los capilares para esta respuesta?

Leucocitos

Los químicos que desencadenan una respuesta inflamatoria atraen a los leucocitos al sitio de la lesión o infección. Leucocitos son glóbulos blancos. Su función es combatir las infecciones y eliminar los escombros. Los leucocitos pueden responder con una defensa específica o inespecífica.

  • A defensa inespecífica es el mismo sin importar qué tipo de patógeno esté involucrado. Un ejemplo de defensa inespecífica es fagocitosis. Este es el proceso en el que los leucocitos se tragan y descomponen los patógenos y los desechos. Se ilustra en Figura debajo. La primera línea de defensa del sistema inmunológico también es una defensa inespecífica.
  • A defensa especifica se adapta a un patógeno en particular. Los leucocitos implicados en este tipo de defensa forman parte de la respuesta inmunitaria y se describen en otros conceptos.

En esta imagen, los leucocitos (blancos) atacan a los patógenos (en forma de estrella).

Resumen

  • La segunda línea de defensa ataca a los patógenos que logran ingresar al cuerpo.
  • La segunda línea de defensa incluye la respuesta inflamatoria y la fagocitosis por leucocitos inespecíficos.

Revisar

  1. ¿Qué es una defensa inespecífica?
  2. ¿Cuál es la segunda vida de defensa del cuerpo? ¿Cuándo entra en vigor?
  3. Identificar las funciones de los leucocitos inespecíficos en la segunda línea de defensa del cuerpo.
  4. Jera se cortó el dedo. Al día siguiente, la piel alrededor del corte se puso roja y cálida. ¿Por qué son estos signos de infección?

Actividad sérica de DPPIV y su expresión en linfocitos en pacientes con melanoma y en personas con vitiligo

La dipeptidil peptidasa IV, una serina proteasa multifuncional, está implicada en la regulación de la transformación maligna, promoción y posterior progresión del cáncer, ejerciendo actividades supresoras de tumores o incluso completamente opuestas - promotoras de tumores.

El objetivo de la presente investigación fue determinar la actividad sérica de DPPIV, así como los porcentajes de linfocitos CD26 +, glóbulos blancos totales CD26 + y la intensidad de fluorescencia media de la expresión de CD26 en linfocitos en pacientes con melanoma, personas con vitíligo y en controles sanos.

Métodos

La actividad de DPPIV en suero se determinó mediante prueba colorimétrica. La expresión de DPPIV (como CD26) en glóbulos blancos periféricos inmunocompetentes se realizó usando análisis de citometría de flujo.

Resultados

Los datos de nuestro estudio muestran por primera vez una disminución estadísticamente significativa: en la actividad sérica de DPPIV, en el porcentaje de glóbulos blancos totales CD26 + y en el porcentaje de linfocitos en pacientes con melanoma en comparación con personas de control sanas. Además, se encontró una actividad de DPPIV en suero significativamente menor en el grupo de pacientes con melanoma en relación con las personas con vitíligo también.

Conclusión

Este estudio indica la necesidad de explorar la causa y la importancia de las alteraciones en la actividad sérica de DPPIV y en la expresión de CD26 en células inmunocompetentes en mecanismos moleculares complejos que subyacen al desarrollo y progresión del melanoma.


1. Introducción

Los ganglios linfáticos (NL) son órganos pequeños con forma de frijol que se encuentran a lo largo de los vasos linfáticos que drenan el parénquima de los órganos no linfoides. Al igual que otros órganos linfoides secundarios (SLO), los LN tienen una arquitectura linfoide característica, con dominios de células B y T segregados organizados por distintos tipos de células estromales [1, 2]. Esta estructura facilita el encuentro de linfocitos específicos de antígenos raros con células dendríticas (DC) portadoras de antígenos y, por lo tanto, apoya las respuestas inmunitarias primarias [3, 4]. La formación de LN ocurre durante la embriogénesis tardía de acuerdo con un programa de desarrollo que procede independientemente del antígeno o la inflamación [5]. Sin embargo, los linfocitos también pueden encontrar antígenos fuera de los LN, como se muestra en reptiles y aves (especies que carecen de LN) y en ratones experimentales que carecen de SLO [6]. En estos casos, las células T y B se agregan en el parénquima de los órganos periféricos no linfoides e incluso forman dominios de células B y T distintos similares a los de los SLO convencionales. Debido a que estos agregados linfoides no ocurren como parte de un programa de desarrollo y solo se forman después de una inflamación local, se denominan órganos linfoides terciarios (TLO) [7, 8].

En el pulmón se encuentran tres tipos de TLO: focos inflamatorios nodulares (NIF), compuestos por grupos de células mieloides y granulomas de células T CD8 + [9], como los que se forman durante Tuberculosis micobacteriana Infección, caracterizada por un núcleo central de macrófagos infectados rodeado por células B y células T [10] y tejido linfoide inducible asociado al bronquio (iBALT), que se asemeja más a la arquitectura de los SLO convencionales y se encuentra en el espacio perivascular que rodea la sangre grande vasos sanguíneos ya lo largo de las vías respiratorias del pulmón [7, 11]. La formación de IBALT ocurre en respuesta a numerosas condiciones inflamatorias, utilizando una variedad de vías moleculares. En este capítulo, resumiremos la comprensión actual de los pasos que conducen al desarrollo de iBALT y revisaremos brevemente el impacto de iBALT en las respuestas inmunitarias pulmonares contra infecciones microbianas, alérgenos y autoantígenos.


Resultados

Las PDC humanas expresan ARNm para receptores de adenosina

El patrón de expresión de los 4 subtipos de receptores de adenosina, denominado A1, A2a, A2by A3, en PDC humanas se evaluó mediante RT-PCR. Ex vivo, las PDC expresaron ARNm para A1 pero no para A2b o A3 receptores (Figura 1). A2a La expresión del ARNm del receptor se observó a niveles bajos en algunos donantes y estuvo ausente en otros. La estimulación nocturna con IL-3 y CD40L indujo a la disminución de la regulación de A1 y regulación al alza de A2a ARNm del receptor (Figura 1). Como se observó con PDC inmaduros, no A2b o A3 El ARNm del receptor se detectó en PDC maduras. Este patrón difiere de las CD derivadas de monocitos inmaduras (MoDC), que expresan altos niveles de A1 y A3 receptor de ARNm y niveles bajos de ambos A2a y A2b ARNm (datos no mostrados).

Expresión del receptor de adenosina de las PDC humanas. El ARN mensajero se extrajo de las PDC altamente purificadas (pureza superior al 96%) inmediatamente después del aislamiento o después de un cultivo durante la noche en presencia de IL-3 y CD40L. Perfiles de A1, A2a, A2by A3 La expresión del receptor se generó mediante RT-PCR. Además del producto esperado de 278 pb para el A1 receptor, se amplificó una segunda transcripción de 483 pb (flechas), que contenía la A esperada1 secuencia del receptor con un inserto de 205 pb que pertenece al intrón entre los exones 5 y 6. Se muestra un experimento representativo de 6.

Expresión del receptor de adenosina de las PDC humanas. El ARN mensajero se extrajo de las PDC altamente purificadas (pureza superior al 96%) inmediatamente después del aislamiento o después de un cultivo durante la noche en presencia de IL-3 y CD40L. Perfiles de A1, A2a, A2by A3 La expresión del receptor se generó mediante RT-PCR. Además del producto esperado de 278 pb para el A1 receptor, se amplificó una segunda transcripción de 483 pb (flechas), que contenía la A esperada1 secuencia del receptor con un inserto de 205 pb que pertenece al intrón entre los exones 5 y 6. Se muestra un experimento representativo de 6.

En PDC, la reacción de PCR para el A1 El receptor amplificó una segunda transcripción, que era más grande que el producto esperado de 278 pares de bases (pb) y que también estaba regulada negativamente durante la maduración. La secuenciación del ADN reveló que este producto de 483 pb contenía el A esperado1 secuencia del receptor con un inserto de 205 pb, correspondiente a la región 3 'del intrón ubicado entre los exones 5 y 6 de la A1 gene. Lo más probable es que estos nucleótidos se hayan incorporado al transcrito debido a un sitio alternativo de corte y empalme aguas arriba. Sin embargo, es poco probable que la nueva transcripción codifique un receptor de adenosina funcional, porque el cambio de marco causado por el inserto genera una proteína que se trunca después de la hélice III, afectando el sitio de unión de adenosina predicho (residuos en las hélices III y VII) como así como el sitio de unión a la proteína G. 31

Las PDC movilizan calcio intracelular en respuesta a la adenosina a través de A1 receptores

La A1 y A3 los receptores envían señales a través de la fosfolipasa C y, en consecuencia, movilizan el calcio de las reservas intracelulares. Para evaluar la función del receptor de adenosina en PDC, estudiamos la señalización del calcio en respuesta a la adenosina y agonistas específicos del receptor de adenosina. La adenosina indujo fuertes transitorios de calcio en PDC inmaduros (Figura 2A). Se observaron respuestas a concentraciones tan bajas como 0,1 a 1,0 µM y fueron máximas a 10 µM. Los agonistas específicos del subtipo de receptor revelaron que la señalización del calcio estaba mediada por la A1 receptor, porque los transitorios de calcio solo se observaron en respuesta a la A1 agonista del receptor CHA pero no a DPMA o IB-MECA, agonistas de A2a y A3 receptores, respectivamente (Figura 2B). La sensibilidad de las PDC a la adenosina se reguló durante la maduración. En las PDC maduras con CD40L (24 horas), la señalización de calcio en respuesta a la adenosina se redujo significativamente, lo que se correlaciona con la regulación a la baja de A1 expresión de ARNm del receptor que se muestra en la Figura 1. Después de 48 horas de activación, los transitorios de calcio ya no se indujeron (Figura 2B). Se observó una fuerte señalización de calcio en respuesta a CCL19 (MIP-3β) pero no a CXCL12 (SDF-1α) en PDC maduros con CD40L (datos no mostrados).

Señalización de calcio de las PDC en respuesta a la adenosina y agonistas específicos del receptor de adenosina. Transitorios de calcio en PDC cultivados durante la noche con IL-3 (AB) o IL-3 más CD40L durante 48 horas (B) en respuesta a la adenosina o los agonistas específicos del receptor de adenosina, CHA, DPMA e IB-MECA (cada 1 μM), se analizó mediante citometría de flujo. Después de establecer una línea de base durante 10 segundos, se agregaron los reactivos a las concentraciones indicadas. Se muestran datos representativos de 4 experimentos diferentes.

Señalización de calcio de las PDC en respuesta a la adenosina y agonistas específicos del receptor de adenosina. Transitorios de calcio en PDC cultivados durante la noche con IL-3 (AB) o IL-3 más CD40L durante 48 horas (B) en respuesta a la adenosina o los agonistas específicos del receptor de adenosina, CHA, DPMA e IB-MECA (cada 1 μM), se analizó mediante citometría de flujo. Después de establecer una línea de base durante 10 segundos, se agregaron los reactivos a las concentraciones indicadas. Se muestran datos representativos de 4 experimentos diferentes.

La adenosina induce la quimiotaxis de las PDC inmaduras

Debido a que la capacidad de las PDC para migrar en respuesta a las quimiocinas inflamatorias es deficiente, nos interesó saber si la adenosina puede inducir la quimiotaxis de las PDC, como se informó anteriormente para otros leucocitos. 32-34 En un ensayo de quimiotaxis de Transwell estándar, encontramos que las PDC recién aisladas migran hacia gradientes de adenosina de una manera dependiente de la concentración (Figura 3A). Se observó migración a adenosina a concentraciones fisiológicamente relevantes de 0,1 a 1,0 µM, con una migración máxima entre 1,0 y 10 µM (7,5% a 14,5% del total de PDC). La respuesta quimiotáctica a la adenosina aumentó después de un período de descanso nocturno en presencia de IL-3 para algunos donantes, probablemente reflejando diferencias individuales en la tasa de recuperación del estrés celular inducido por el procedimiento de aislamiento (Figura 3B). Por el contrario, la capacidad de las PDC para migrar hacia CXCL12, que era en magnitud comparable a la de la adenosina, disminuyó después del cultivo durante la noche. Además, las PDC cultivadas con IL-3 mostraron una fuerte respuesta migratoria a CCL21 (Figura 3C), que se correlaciona con la regulación por disminución de CXCR4 y la regulación por aumento de la expresión de CCR7, según lo evaluado por análisis FACS (datos no mostrados). Se observó un patrón de migración distinto para las PDC maduradas con CD40L durante 48 horas. Los PDC maduros con CD40L migraron de manera eficiente en respuesta a CCL21 (datos no mostrados) pero ya no a la adenosina (Figura 3D).

Migración de PDC a adenosina o quimiocinas. (A) Curva dosis-respuesta para la migración de PDC recién aisladas hacia adenosina. Se muestra la media ± SEM de 7 experimentos, cada uno realizado por duplicado. (B) Curva dosis-respuesta para la migración de PDC cultivadas durante la noche en presencia de IL-3 hacia adenosina. Se muestran la media ± SEM de 3 experimentos, cada uno realizado por duplicado. (C) Respuesta migratoria de PDC hacia adenosina, CXCL12 (SDF-1α) o CCL21 (6Ckine) después del aislamiento (ex vivo) y después de 1 día de cultivo con IL-3. Se muestra la media ± SEM de 4 a 6 experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado. (D) Las PDC se cultivaron durante la noche en presencia de IL-3 o durante 48 horas en presencia de IL-3 y trímero de CD40L antes de la evaluación de su respuesta migratoria a la adenosina. Se muestra la media ± SEM de los duplicados.

Migración de PDC a adenosina o quimiocinas. (A) Curva dosis-respuesta para la migración de PDC recién aisladas hacia adenosina. Se muestra la media ± SEM de 7 experimentos, cada uno realizado por duplicado. (B) Curva dosis-respuesta para la migración de PDC cultivadas durante la noche en presencia de IL-3 hacia adenosina. Se muestran la media ± SEM de 3 experimentos, cada uno realizado por duplicado. (C) Respuesta migratoria de PDC hacia adenosina, CXCL12 (SDF-1α) o CCL21 (6Ckine) después del aislamiento (ex vivo) y después de 1 día de cultivo con IL-3. Se muestra la media ± SEM de 4 a 6 experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado. (D) Las PDC se cultivaron durante la noche en presencia de IL-3 o durante 48 horas en presencia de IL-3 y trímero de CD40L antes de la evaluación de su respuesta migratoria a la adenosina. Se muestran la media ± SEM de los duplicados.

La migración de las PDC hacia la adenosina está mediada por la A1 receptor

Regulación descendente de A1 receptores combinados con una pérdida en la función migratoria en PDC madurado con CD40L nos llevó a especular que A1 los receptores median la quimiotaxis a la adenosina. Para probar esta hipótesis, se estudió la influencia de los agonistas y antagonistas selectivos del receptor de adenosina sobre la migración de PDC. Como era de esperar, el A1 agonista del receptor, CHA (1 μM), quimiotaxis fuertemente inducida de PDC, mientras que el A2a y A3 los agonistas del receptor DPMA e IB-MECA fueron ambos ineficaces (Figura 4A). A este respecto, no se observaron diferencias entre las PDC recién aisladas y las cultivadas con IL-3 (datos no mostrados). Además, la A1 el antagonista del receptor DPCPX abolió la migración de las PDC hacia la adenosina. CSC y MRS 1220, antagonistas de A2a y A3 receptores, fueron ineficaces (Figura 4B).

La quimiotaxis de las PDC en respuesta a la adenosina está mediada por la A1 receptor. (A) Migración de PDC cultivadas durante la noche en presencia de IL-3 en respuesta a 1 μM de A1, A2a o A3 agonistas del receptor CHA, DPMA o IB-MECA, respectivamente. (B) Migración de PDC hacia adenosina 100 μM en ausencia o presencia de 10 μM de A1,A2a, o A3 antagonistas del receptor DPCPX, CSC o MRS 1220, respectivamente. Los datos representan la media ± SEM de 3 a 4 experimentos diferentes. *PAG & lt .05.

La quimiotaxis de las PDC en respuesta a la adenosina está mediada por la A1 receptor. (A) Migración de PDC cultivadas durante la noche en presencia de IL-3 en respuesta a 1 μM de A1, A2a o A3 agonistas del receptor CHA, DPMA o IB-MECA, respectivamente. (B) Migración de PDC hacia adenosina 100 μM en ausencia o presencia de 10 μM de A1,A2a, o bien A3 antagonistas del receptor DPCPX, CSC o MRS 1220, respectivamente. Los datos representan la media ± SEM de 3 a 4 experimentos diferentes. *PAG & lt .05.

La adenosina mejora el AMPc citosólico e inhibe la producción de citocinas en PDC maduras

A2a los receptores están acoplados positivamente a la adenilato ciclasa y estimulan la formación del segundo mensajero cAMP. Para evaluar la función de A2a receptores en PDC, analizamos los niveles de AMPc citosólico en respuesta a la adenosina en PDC recién aisladas y después de la activación con CD40L. Para mejorar la sensibilidad del ensayo de AMPc en números bajos de células, las PDC se incubaron con rolipram, un inhibidor de la enzima fosfodiesterasa (PDE) de tipo IV que degrada el AMPc. En comparación con las PDC inmaduras, la adenosina mejoró significativamente los niveles de AMPc en las PDC activadas por CD40L (4,4 veces ± 1,4 veces frente a un aumento de 1,8 veces ± 0,5 veces, n = 4, PAG = .01) (Figura 5). Estos hallazgos son consistentes con funcional A2a expresión del receptor en PDC maduras.

La adenosina aumenta los niveles de AMPc citosólico en PDC maduras. Se incubaron PDC recién aisladas o PDC activadas por trímero CD40L (24 horas) con adenosina 100 µM en presencia de rolipram. Después de 30 minutos, se midieron los niveles de AMPc en lisados ​​celulares mediante inmunoensayo enzimático (EIA). Los datos se expresan como un aumento de n veces de los niveles de AMPc y representan la media ± SEM de 4 donantes diferentes. *PAG & lt .05.

La adenosina aumenta los niveles de AMPc citosólico en PDC maduras. Se incubaron PDC recién aisladas o PDC activadas por trímero CD40L (24 horas) con adenosina 100 µM en presencia de rolipram. Después de 30 minutos, se midieron los niveles de AMPc en lisados ​​celulares mediante inmunoensayo enzimático (EIA). Los datos se expresan como un aumento de n veces de los niveles de AMPc y representan la media ± SEM de 4 donantes diferentes. *PAG & lt .05.

Becaue A2a La señalización del receptor se ha relacionado previamente con propiedades antiinflamatorias, investigamos si la adenosina tiene un impacto en la producción de citocinas de las PDC en respuesta a CpG ODN. El protocolo de estimulación utilizado en nuestro estudio fue informado previamente por Krug et al. Las PDC se activaron con ODN 2006 en combinación con células BKH transfectadas con CD40L, un protocolo de estimulación que induce IFN-α, IL-6, así como IL-12, que es máxima después de un período de precultivo de 60 horas con IL-3. 13 PDC estimuladas con CpG ODN 2006 y CD40L produjeron grandes cantidades de IFN-α e IL-6. La adenosina (hasta 100 μM) no tuvo una influencia significativa en la producción de IFN-α (Figura 6A) o IL-6 (Figura 6B) por PDC inmaduros. Para estudiar el efecto de la adenosina en la producción de citocinas por las células maduras, se cultivaron PDC durante 60 horas con IL-3, lo que resultó en la regulación a la baja de A1 y regulación al alza de A2a receptores (datos no mostrados). En PDC maduras, la adenosina inhibió significativamente la producción de IFN-α e IL-6 en respuesta a CpG y CD40L (Figura 6A-B). Además, el cultivo con IL-3 indujo en las PDC la producción de grandes cantidades de IL-12 en respuesta a CpG ODN 2006 y CD40L, como ya informaron Krug et al. 13 La adenosina también suprimió significativamente la producción de IL-12p40 e IL-12p70 en estas condiciones (Figura 6C-D), destacando el papel potencial de la adenosina en la modulación de la producción de citocinas por PDC maduras. No se observó ningún efecto de la adenosina sobre la viabilidad del PDC para concentraciones de hasta 250 μM, descartando los posibles efectos tóxicos de la adenosina. Además, la adenosina no indujo la maduración de las PDC, según lo evaluado por la regulación positiva de la expresión superficial del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I y MHC clase II, así como las moléculas coestimuladoras CD80 y CD86 (Figura 7).

La adenosina regula la producción de citocinas de las PDC maduras. Las PDC (2,5 x 105 células por mililitro) se activaron con CpG ODN 2006 y células BHK transfectadas con CD40L en presencia o ausencia de adenosina 100 μM, ya sea directamente ex vivo o después del cultivo con IL-3 durante 60 horas. Los sobrenadantes se recogieron después de 48 horas, y las concentraciones de IFN-α (A), IL-6 (B), IL-12p40 (C) e IL-12p70 (D) se midieron mediante ELISA. Los datos representan la media ± SEM de 3 donantes diferentes. *PAG & lt .05.

La adenosina regula la producción de citocinas de las PDC maduras. Las PDC (2,5 x 105 células por mililitro) se activaron con CpG ODN 2006 y células BHK transfectadas con CD40L en presencia o ausencia de adenosina 100 μM, ya sea directamente ex vivo o después del cultivo con IL-3 durante 60 horas. Los sobrenadantes se recogieron después de 48 horas, y las concentraciones de IFN-α (A), IL-6 (B), IL-12p40 (C) e IL-12p70 (D) se midieron mediante ELISA. Los datos representan la media ± SEM de 3 donantes diferentes. *PAG & lt .05.

Expresión de marcadores de superficie de PDC en respuesta a la adenosina. Las PDC se cultivaron con IL-3 durante 48 horas en ausencia o presencia de adenosina 100 µM. La expresión superficial de HLA-ABC, HLA-DR, CD80 y CD86 se evaluó mediante citometría de flujo. Se muestra un experimento representativo de 3.

Expresión de marcadores de superficie de PDC en respuesta a la adenosina. Las PDC se cultivaron con IL-3 durante 48 horas en ausencia o presencia de adenosina 100 µM. La expresión superficial de HLA-ABC, HLA-DR, CD80 y CD86 se evaluó mediante citometría de flujo. Se muestra un experimento representativo de 3.


Migración de DC

La migración de DC desde la piel es uno de los primeros pasos en la fase de inicio de una respuesta inmune (Fig. 2). Se sabe que el contacto de la piel con antígenos estimula diversas citocinas epidérmicas, p. Ej. IL-6, TNF-α, GM-CSF y CXCL2 / CXCL3 (proteína inflamatoria de macrófagos-2, MIP-2) 19, entre los que IL-1β y TNF-α son esenciales en la migración de DC 20, 21.

Migración de células dendríticas. El contacto de la piel con un hapteno desencadena la migración de células dendríticas a través de los vasos linfáticos aferentes hacia los ganglios linfáticos que drenan la piel. La producción de citocinas, en particular TNF-α, IL-1α e IL-1β, facilita la migración de las células de Langerhans (LC) fuera de la epidermis. En una etapa posterior, la interacción CCR7-CCL21 juega un papel fundamental en la migración de LC a las áreas de células T de los ganglios linfáticos. DC, IL de células dentríticas, interleucina MMP, metaloproteinasas de matriz TNF-α, factor de necrosis tumoral-α.

Desenredado de la piel DC

La señalización de citocinas da como resultado una expresión alterada de las moléculas de adhesión, lo que facilita la migración de DC fuera de la epidermis. La movilización de DC se asocia con la pérdida de CD324 (E-cadherina), causada por la producción de TNF-α, IL-1β o IL-1α 21, 22. En resumen, se propone que la IL-1β derivada de LC realiza dos funciones. Primero, la IL-1β derivada de DC activa las DC en un bucle autocrino a través del receptor 1 de IL-1 (IL-1RI). En segundo lugar, la IL-1β también estimula a los queratinocitos epidérmicos (KC) para que secreten TNF-α, que actúa de manera paracrina para facilitar la migración de DC a través de TNF-RII 23. Si la disponibilidad de cualquiera de estas citocinas se ve comprometida, la migración de alérgeno-CL y la movilización de CD en los ganglios linfáticos de drenaje y el desarrollo de la sensibilización por contacto se inhiben parcialmente 24, 25.

Simultáneamente, la producción de enzimas que degradan la membrana basal epidérmica, como las metaloproteinasas de la matriz (MMP), se regula al alza en la LC 26 activada. Se ha descrito que MMP-2, MMP-3 y MMP-9 facilitan el paso de LC a través de la membrana basal. Posteriormente, las MMP también son esenciales para la migración de LC y DDC a través de la matriz de tejido dérmico, mediante la escisión del colágeno tipo IV 27. La actividad de MMP-2 y MMP-9 está bajo el control de inhibidores de proteinasas naturales tales como metaloproteinasa inhibidora de tejidos (TIMP) -1 y TIMP-2, respectivamente. Varios estudios han demostrado que los inhibidores de MMPs impidieron la emigración de LC de la epidermis y la acumulación de DC al ganglio linfático aferente en respuesta a la aplicación epicutánea a sensibilizadores, como níquel, oxazolona (OXA) y dinitroclorobenceno (DNCB) 27- 29. Estos hallazgos sugieren que el desarrollo de hipersensibilidad por contacto podría prevenirse mediante la inhibición de la actividad de MMP. Sin embargo, el desarrollo de hipersensibilidad por contacto no se vio afectado en ratones deficientes en MMP-9, aunque la migración de LC se inhibió drásticamente en estos ratones deficientes en genes 27. Aparentemente, las pocas DDC y LC que aún migran en ausencia de MMP-9 inducen con éxito hipersensibilidad por contacto. Además, la hipersensibilidad de contacto podría ser inducida por la libre difusión del alérgeno de contacto hacia los ganglios linfáticos aferentes donde puede presentarse por las CD locales 30.

Mientras tanto, se induce la expresión diferencial de moléculas de adhesión para mediar interacciones con la matriz extracelular, células epidérmicas y dérmicas. Entre los eventos más importantes se encuentra la expresión reducida de CD324, que permite que LC se disocie de los KC circundantes 31. Se cree que el CD54 (molécula de adhesión intracelular, ICAM-1) y el antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos tienen funciones adicionales porque el bloqueo de estas moléculas de adhesión inhibe la migración de las CD epidérmicas a los ganglios linfáticos regionales. La expresión regulada al alza de la integrina α6 y la integrina β1 comprende el antígeno 6 muy tardío que confiere actividad de unión a laminina LC y, por lo tanto, la capacidad de interactuar con la membrana basal. Otra molécula de adhesión, la molécula de adhesión de unión 1 (JAM-1), es expresada por DC y por lo tanto afecta la migración de DC 32, 33. La ausencia de JAM-1 facilita el tráfico de DC a los ganglios linfáticos 34. Combinados, estos eventos dan como resultado la separación de LC de los KC circundantes, lo que permite la migración de LC.

Quimiocinas y receptores de quimiocinas

La migración de LC también está asociada con la expresión de receptores de quimiocinas en la superficie de las células. Las iDC expresan receptores de quimiocinas, y estos pueden guiarlos a sitios inflamatorios donde ocurre el muestreo de antígenos. Tras el muestreo de antígenos, las CD se diferencian rápidamente en un fenotipo maduro. Este proceso de maduración está asociado con un cambio en el perfil del receptor de quimiocinas. Los receptores de quimiocinas que se dirigen a la piel están regulados negativamente (CCR1, CCR2, CCR5 y CCR6), mientras que los receptores implicados en el direccionamiento al ganglio linfático local están regulados al alza (CCR4, CXCR4 y CCR7) 35. Es importante destacar que la movilización de DC desde la periferia a los ganglios linfáticos aferentes está regulada por el receptor de quimiocinas CCR7 "guardián de puerta" 9, 36. Tanto las vénulas linfáticas como las de endotelio alto producen CCL21, un ligando principal de CCR7 37, 38. Las DC que residen en las áreas paracorticales de los ganglios linfáticos producen CCL19, un segundo ligando de CCR7. Además de la LC portadora de antígeno, también las células T vírgenes expresan CCR7. Esto orquesta el encuentro de DC y células T ingenuas en las áreas de los ganglios linfáticos paracorticales.

Los mediadores de lípidos, cisteinil leucotrienos (cysLT) y prostaglandina E2 (PGE2), todos producidos en sitios de inflamación, también son necesarios para la migración de LC 39, 40. Estos mediadores de lípidos promueven, mediante la regulación positiva de CCR7, la quimiotaxis de DC óptima para la quimiocina CCL19 pero no para CCL21. Además, el transportador cysLT multirresistencia proteína-1 y transportador de lípidos pag-glicoproteínas (multirresistencia, MDR-1) también son expresadas por DC y son necesarias para su entrada en los linfáticos aferentes 41, 42.

Regulación negativa de la migración de CC

En ratones, independientemente de la naturaleza del estímulo (por ejemplo, contacto de la piel con alérgenos, patógenos o traumatismos), solo hasta el 30% de la CL epidérmica abandona el tejido 43, 44. Posiblemente, estos LC residenciales tengan la función de resguardar la piel para posteriores exposiciones. La retención de LC podría deberse al rápido inicio de la producción de reguladores negativos de la migración de LC, como IL-4, IL-10 y TGF-β derivadas de la epidermis.1. La primera citoquina inhibe la migración de LC humana a través de la regulación a la baja de la expresión de TNF-RII [44]. Las dos últimas citocinas inducen la expresión de CCR6, facilitando también la retención de LC en la epidermis 8. Durante la inflamación cutánea, IL-10 proporciona un contrapeso homeostático para IL-1β y TNF-α 19. TGF-β1 inhibe la migración de DC a través de la inhibición de la expresión de CCR7 y la regulación positiva de la expresión de CD324 [45].

Diferencias en la migración de LC y DDC

En ratones, LC y DDC muestran diferentes capacidades migratorias tras la exposición epicutánea a sensibilizadores de antígenos. Los estudios con ratones mostraron que tras la exposición de la piel al tinte fluorescente tetrametil rodamina isotiocianato, la migración de DDC precedió claramente a la migración de LC 46. Esto podría deberse al hecho de que los LC tardan más en llegar a los ganglios linfáticos aferentes porque primero necesitan separarse de los KC vecinos. Curiosamente, dentro de la zona de células T, las DDC están ubicadas en la paracorteza externa justo debajo de los folículos de células B, mientras que las LC están ubicadas en la paracorteza interna rica en células T 46. Estos hallazgos sugieren que las DDC están involucradas en el cebado de las células B, mientras que las LC están involucradas en la activación de las células T. La capacidad de migración diferencial y el destino de los ganglios linfáticos entre LC y DDC podrían resultar de una expresión distinta del receptor mediador de lípidos o quimiocinas en LC y DDC 47. Recientemente, se sugirió que la expresión de CCR7 juega un papel importante en esta controversia. In vitro las DDC generadas adquieren una baja expresión de CCR7, mientras que las LC adquieren un alto nivel de expresión de CCR7 48. Este hallazgo podría explicar la migración de LC, y no de DDC, a zonas de células T dentro del ganglio linfático.


Expresiones de gratitud

Los autores desean agradecer a la Dra. Ann Word por las útiles discusiones y la lectura crítica del manuscrito. Los autores agradecen al Dr. Borna Mehrad por proporcionar el anticuerpo RB6-8C5 y por las útiles discusiones durante el curso de este trabajo. Agradecemos a la Dra. Judith Head por brindar asesoramiento técnico para inmunohistoquímica y por la lectura crítica del manuscrito. También agradecemos al Dr. David Russell por la lectura crítica del manuscrito. Se agradece la excelente asistencia técnica de John Shelton y Kelly Straach.


5 Conclusión y perspectivas

Esta revisión ha destacado algunos ejemplos recientes de complejos de metales de transición que se han investigado por su actividad antiinflamatoria o anti-autoinmune. Una estrategia común que se ha empleado es la coordinación de compuestos antiinflamatorios u otras moléculas bioactivas con iones metálicos, lo que da como resultado una actividad mejorada. Por ejemplo, las actividades antiinflamatorias de los complejos metálicos. 32–35 de un derivado de 1,2-dihidroquinazolinona fueron superiores a los del ligando libre. 46 Esto se atribuyó a la mayor lipofilicidad de los complejos metálicos en comparación con el ligando libre, mejorando potencialmente la capacidad de los complejos para atravesar las membranas celulares y entrar en las células. En el caso del AINE aceclofenaco 9, la complejación con zinc generó un complejo zinc-aceclofenaco que indujo menos úlceras de estómago en ratas, mientras que tenía una actividad antiinflamatoria comparable a la del fármaco original. 29 Los autores postularon que el grupo carboxilo ulcerogénico del aceclofenaco podría enmascararse eficazmente por su coordinación con el zinc, lo que produciría efectos secundarios adversos menos graves en el estómago.

La segunda estrategia utiliza complejos metálicos con ligandos lábiles que pueden coordinarse directamente con biomoléculas. Trávníček y colaboradores demostraron que los complejos de oro (I) 41 que llevaban ligandos sustituidos de 6-bencilaminopurina y trifenilfosfina mostraron una actividad antiinflamatoria más fuerte in vitro e in vivo frente a la auranofina en dosis equitóxicas. 63 Curiosamente, los análogos que contienen un grupo 2-cloro en el resto de adenina estaban inactivos in vivo, lo que indica que cambios menores en la estructura de estos complejos de oro (I) pueden tener un efecto significativo sobre sus propiedades antiinflamatorias. 65 El tercer enfoque descrito en esta revisión involucra complejos metálicos cinéticamente inertes que se dirigen a biomoléculas específicas de una manera no covalente. Por ejemplo, el complejo Ir (III) ciclometalado [Ir (ppy)2(biq)] PF6 desarrollado por Leung, Ma y colaboradores representó el primer inhibidor de TNF-α a base de metal 48. 77 Alternativamente, la porfirina de manganeso, la poliamina cíclica y los derivados salen pueden catalizar reacciones redox que eliminan las especies reactivas y suprimen el estrés oxidativo y la inflamación.

Un aspecto importante que debe considerarse críticamente en el diseño y desarrollo de complejos metálicos como agentes antiinflamatorios es su toxicidad. Los efectos secundarios adversos notables de los medicamentos de oro incluyen úlceras orales, alteración del gusto, erupciones cutáneas, pigmentación de la piel, anemia (trombocitopenia) o toxicidad renal (proteinuria, nefropatía). Además, también se han informado efectos tóxicos en el cerebro. Por otro lado, los compuestos de platino se han relacionado con nefrotoxicidad, neurotoxicidad, cardiotoxicidad y mielosupresión, 115 y su uso en el organismo también puede conducir al desarrollo de quimiorresistencia a través de múltiples mecanismos. 116 Dado que el uso de complejos metálicos como agentes antiinflamatorios es todavía un tema relativamente nuevo y emergente, con poca frecuencia se realizaron estudios extensos sobre la toxicidad de los compuestos descritos en esta revisión. Sin embargo, dado que la toxicidad a menudo representa uno de los límites más comunes para el uso de complejos metálicos en medicina, la evaluación de la toxicidad es un paso esencial que se necesita para determinar la posible aplicación farmacológica de estos complejos metálicos como agentes antiinflamatorios.

De cara al futuro, creemos que es necesaria una mayor elucidación del mecanismo de acción preciso de la actividad antiinflamatoria de los complejos metálicos bioactivos para facilitar el diseño racional de análogos de complejos metálicos que puedan mostrar una potencia o selectividad mejoradas, al tiempo que minimizan la toxicidad. En particular, las posibles transformaciones químicas o reacciones de los complejos metálicos in vivo deberían caracterizarse más completamente. Además, creemos que la aplicación de complejos metálicos cinéticamente inertes para apuntar específicamente a biomoléculas en las células merece una mayor investigación. Los miembros de las vías inmunitarias o inflamatorias celulares interactúan entre sí a través de interfaces proteína-proteína que suelen ser grandes y amorfas. Tales interacciones proteína-proteína podrían ser potencialmente dirigidas por complejos metálicos cinéticamente inertes que poseen ligandos de forma e hidrofobicidad adecuadas para unirse a la interfaz proteína-proteína. Finalmente, los avances en biología molecular e interactómica pueden presentar nuevos objetivos para el desarrollo de nuevos complejos metálicos antiinflamatorios o anti-autoinmunes. Dada la diversa variedad de estudios prometedores resaltados en esta revisión, prevemos que es solo una cuestión de tiempo antes de que los próximos complejos de metales de transición sean aprobados en la clínica para el tratamiento de enfermedades inflamatorias o autoinmunes.


Parte 2: El papel de la proteína reorganizadora de actina Drebrin en la función de los mastocitos

00: 00: 08.02 Hola.
00: 00: 09.12 Soy Avery August,
00: 00: 10.24 Estoy en la Universidad de Cornell,
00: 00: 12.02 y en la segunda parte de esta charla
00: 00: 13.27 Les voy a contar un poquito
00: 00: 15.19 algunos de nuestros estudios de investigación
00: 00: 16.27 tratando de entender la base molecular
00: 00: 18.23 para la respuesta alérgica en los mastocitos.
00: 00: 23.04 Entonces, aquí hay un resumen
00: 00: 25.10 de cómo ocurre la respuesta alérgica.
00: 00: 29.02 Tiene un alérgeno,
00: 00: 30.02 genera una respuesta IgE,
00: 00: 32.16 que la IgE luego recubre los mastocitos y los basófilos
00: 00: 36.20 para que la segunda vez que se exponga a un alérgeno,
00: 00: 39.01 los mastocitos se degranulan
00: 00: 41.11 y tienes estos síntomas
00: 00: 43.18 de una respuesta alérgica.
00: 00: 45.29 Entonces, estamos muy interesados ​​en tratar de entender
00: 00: 48.13 la base molecular de esta respuesta de desgranulación,
00: 00: 50.21 porque nos gustaría entender
00: 00: 52.26 cómo orientar mejor este proceso
00: 00: 55.10 para evitar tanto la desgranulación
00: 00: 57.27 y el desarrollo de estos síntomas.
00: 01: 00.29 Entonces, como les dije en la primera parte de mi charla,
00: 01: 04.24 bloqueo de mastocitos
00: 01: 06.20 y bloqueo de la desgranulación de los mastocitos
00: 01: 08.08 puede reducir la liberación de los componentes,
00: 01: 10.28 y al reducir la liberación de estos componentes,
00: 01: 12.25 en realidad reducimos los síntomas.
00: 01: 14.28 ¿Pero cuál es la base molecular para esto?
00: 01: 17.10 Como le dije, la droga Chromolyn
00: 01: 19.26 es capaz de hacer esto,
00: 01: 21.10 pero no entendemos bien cómo funciona Chromolyn,
00: 01: 23.26 y también Chromolyn tiene efectos secundarios.
00: 01: 26.22 Entonces, lo que sí sabemos es que
00: 01: 29.13 el mastocito tiene un receptor para IgE,
00: 01: 32.00 y que los receptores de IgE
00: 01: 34.00 es en realidad muy similar a los receptores
00: 01: 36.14 que se encuentran en las células T, como el receptor de células T,
00: 01: 38.22 o en las células B, el receptor de las células B.
00: 01: 40.25 Y todos esos receptores,
00: 01: 42.13 lo que tienen en común,
00: 01: 44.03 son colas citoplásmicas
00: 01: 45.23 que tienen lo que se llaman motivos ITAM,
00: 01: 47.11 y estos motivos ITAM
00: 01: 49.10 interactuar con familias de quinasas
00: 01: 52.10 que conducen a una vía de señalización intracelular
00: 01: 54.08 que eventualmente conduce a la desgranulación
00: 01: 56.12 y liberación de histamina,
00: 01: 58.03 como comenté en la primera parte,
00: 01: 59.24 así como la producción de citocinas.
00: 02: 01.25 Y lo que nos interesa mucho es
00: 02: 05.14 tratando de entender cómo estas vías
00: 02: 07.14 en realidad conducen a estos diferentes efectos.
00: 02: 10.01 Entonces, lo que sí sabemos es que
00: 02: 13.00 el receptor FC para IgE
00: 02: 14.16 desencadena un aumento en el calcio intracelular,
00: 02: 16.14 y ese aumento de calcio intracelular
00: 02: 18.10 es muy importante
00: 02: 20.09 tanto para la desgranulación como para la producción de citocinas,
00: 02: 23.08 y uno de los compuestos
00: 02: 26.02 que se ha descubierto que realmente puede
00: 02: 28.24 inhibir esta liberación de calcio es
00: 02: 30.27 una molécula que fue reportada por primera vez por otros laboratorios de Abbott
00: 02: 33.02 como inmunosupresor.
00: 02: 34.27 Y esa molécula, que llamaré BTP para abreviar,
00: 02: 38.12 es realmente muy interesante,
00: 02: 40.27 porque en realidad puede inhibir
00: 02: 42.27 señalización de calcio en las células.
00: 02: 45.14 Y por eso estábamos muy interesados ​​en tratar de entender
00: 02: 47.27 si este compuesto en particular
00: 02: 50.05 también inhibiría la respuesta de los mastocitos in vivo.
00: 02: 53.13 Entonces, para hacer eso, lo que hicimos
00: 02: 56.20 es que tomamos ratones y les inyectamos IgE
00: 03: 00.25 que era específico de una molécula
00: 03: 03.19 llamado DNP-BSA.
00: 03: 06.07 Y cuando inyectamos esa IgE,
00: 03: 08.17 que la IgE ahora circulará dentro del ratón,
00: 03: 11.04 cubrirá los mastocitos y basófilos,
00: 03: 13.27 y ahora cuando inyectamos el mouse
00: 03: 16.06 con el alérgeno,
00: 03: 19.00 en tres minutos,
00: 03: 20.13 podemos determinar si los mastocitos liberarán histamina,
00: 03: 23.16 que luego podemos analizar.
00: 03: 25.07 También determinamos si BTP
00: 03: 27.04 bloquearía este efecto.
00: 03: 29.00 Y lo que encontramos fue que
00: 03: 31.22 cuando inyectamos ratones con BTP
00: 03: 33.26 una hora antes de que les diéramos el alérgeno,
00: 03: 35.28 podríamos reducir la liberación de histamina,
00: 03: 38.24 indica que BTP realmente bloquea
00: 03: 41.12 la liberación de histamina de estos mastocitos.
00: 03: 43.27 La otra cosa que queríamos hacer
00: 03: 45.21 es determinar si este efecto de mastocitos
00: 03: 48.23 daría lugar a diferencias de temperatura.
00: 03: 52.04 Una de las cosas que pasa
00: 03: 54.02 cuando expone ratones a IgE y al alérgeno
00: 03: 57.22 es que en realidad pierden temperatura corporal,
00: 04: 00.04 y podemos medir esa temperatura corporal
00: 04: 01.28 midiendo la temperatura a lo largo del tiempo
00: 04: 04.16 en presencia o ausencia del BTP.
00: 04: 08.10 Y en ese experimento lo que hicimos.
00: 04: 10.26 inyectamos a los ratones con IgE y,
00: 04: 14.16 una hora antes de que les tengamos el alérgeno,
00: 04: 16.16 dimos el BTP
00: 04: 18.02 y luego medimos la cantidad de.
00: 04: 20.04 los cambios de temperatura que ocurrieron.
00: 04: 22.12 Lo que puedes ver aquí
00: 04: 24.12 es una diferencia en la temperatura corporal en estos ratones,
00: 04: 26.25 y puedes ver que los ratones que recibieron el vehículo
00: 04: 29.02 en realidad perdió la temperatura corporal,
00: 04: 31.13 mientras que los ratones que recibieron BTP
00: 04: 33.20 no perdió la temperatura corporal.
00: 04: 35.16 Y entonces lo que ese experimento nos indicó
00: 04: 38.04 fue que BTP pudo inhibir
00: 04: 40.04 tanto la liberación de histamina en los mastocitos,
00: 04: 41.23 sino también los efectos de la desgranulación de los mastocitos,
00: 04: 44.10 es decir, pérdida de temperatura.
00: 04: 47.01 Entonces, BTP, entonces,
00: 04: 49.05 puede inhibir la desgranulación de los mastocitos
00: 04: 51.29 y puede inhibir la liberación
00: 04: 54.11 del contenido de gránulos de mastocitos,
00: 04: 57.17 así que queríamos averiguar si BTP
00: 04: 59.26 podría afectar directamente a los mastocitos.
00: 05: 01.13 Y así, afortunadamente, podemos generar mastocitos de manera muy simple
00: 05: 03.28 tomando médula ósea de ratones,
00: 05: 05.24 cultivarlos en presencia de citocinas,
00: 05: 08.00 interleucina-3,
00: 05: 09.18 y factor de células madre,
00: 05: 11.06 y 4-6 semanas después
00: 05: 12.20 tenemos una población que se compone principalmente de mastocitos,
00: 05: 14.18 casi el 100% de los mastocitos.
00: 05: 16.10 Entonces podemos tomar esos mastocitos y analizarlos.
00: 05: 19.00 Y la forma en que lo hicimos es
00: 05: 21.00 tomamos los mastocitos,
00: 05: 22.16 los incubamos con IgE durante la noche,
00: 05: 24.20 armándolos,
00: 05: 26.12 y luego podemos agregar el antígeno,
00: 05: 28.04 y con el tiempo podemos analizar estos mastocitos.
00: 05: 30.23 Y así lo hicimos,
00: 05: 32.12 y lo que encontramos fue que
00: 05: 34.21 en mastocitos que acaban de ser tratados con vehículo
00: 05: 36.26 tenemos una buena desgranulación,
00: 05: 39.13 mientras que los mastocitos que fueron
00: 05: 41.11 solo tratado con BTP
00: 05: 43.07 y desencadenado con IgE.
00: 05: 45.04 ya no tenemos desgranulación,
00: 05: 46.27 indica que BTP
00: 05: 49.01 en realidad inhibe la desgranulación de los mastocitos,
00: 05: 52.00 impidiéndoles que liberen su contenido,
00: 05: 54.09 incluyendo histamina, heparina y TNF.
00: 05: 57.27 Entonces, lo siguiente que queríamos averiguar es
00: 06: 00.03 cuál es el objetivo de BTP.
00: 06: 01.29 Y entonces colaboramos con un par de químicos,
00: 06: 06.16 Blake Peterson y su estudiante Laurie Mottram,
00: 06: 09.20 y nos sintetizaron
00: 06: 11.26 el BTP acoplado a un enlazador y biotina.
00: 06: 15.13 ¿Y qué podríamos hacer entonces?
00: 06: 17.12 es tomar ese enlace BTP-biotina
00: 06: 19.18 y acoplarlo a una cuenta
00: 06: 21.13 y determinar, utilizando técnicas bioquímicas estándar,
00: 06: 24.18 qué proteínas realmente interactuarían
00: 06: 26.28 con el resto BTP.
00: 06: 29.00 Y ese experimento se muestra aquí.
00: 06: 31.09 Puedes ver que tomaríamos las cuentas de control
00: 06: 34.16 y cúbralos solo con el enlazador y la biotina,
00: 06: 37.18 o perlas que tienen el BTP.
00: 06: 41.05 Pasaríamos un extracto de proteína sobre esas perlas,
00: 06: 44.09 lavaríamos todo el material extraño,
00: 06: 47.00 y luego analizaríamos las proteínas
00: 06: 50.03 que en realidad interactuó específicamente con las cuentas
00: 06: 52.06 en geles SDS-PAGE
00: 06: 54.04 por espectrometría de masas
00: 06: 56.06 para identificar proteínas asociadas a BTP.
00: 06: 58.19 Y así hicimos ese experimento
00: 07: 00.09 usando lisados ​​de células,
00: 07: 03.05 y lo que encontramos fue que
00: 07: 05.15 una proteína prominente que fue purificada
00: 07: 07.09 en estas cuentas BTP
00: 07: 08.22 era una proteína llamada drebrin.
00: 07: 10.12 Y entonces drebrin es en realidad
00: 07: 12.24 una proteína de unión a actina,
00: 07: 14.12 y en realidad puede interactuar con la actina
00: 07: 16.25 y conduce a la polimerización de actina
00: 07: 20.04 cuando lo pones en celdas.
00: 07: 22.24 También encontramos que
00: 07: 25.03 cuando mutas dos residuos
00: 07: 27.14 dentro del dominio de unión a actina de drebrin,
00: 07: 29.28 podríamos abolir la unión de BTP a drebrin,
00: 07: 32.26 indica que BTP interactuó
00: 07: 35.02 directamente con drebrin
00: 07: 36.21 y no de manera indirecta.
00: 07: 38.08 Y esos residuos se muestran aquí en rojo.
00: 07: 39.24 Si mutamos lisina 270 y lisina 271
00: 07: 42.17 a metioninas,
00: 07: 44.11 abolimos por completo la unión de BTP a drebrin,
00: 07: 47.04 mientras que si mutamos la arginina a metionina,
00: 07: 50.17 o glutamina a leucina,
00: 07: 52.23 mantuvimos la interacción,
00: 07: 54.25 indicando que esta interacción es específica.
00: 07: 57.18 Entonces podríamos mostrar,
00: 07: 59.18 que BTP interactúa con esta proteína de unión a actina drebrin,
00: 08: 03.07 y drebrin es una proteína reguladora de actina.
00: 08: 06.05 Así que eso introdujo un área completamente nueva
00: 08: 10.03 que podríamos explorar
00: 08: 11.27 para intentar determinar
00: 08: 13.18 ¿Cuál fue la base molecular de esta respuesta del receptor Fc?
00: 08: 17.24 Entonces, nuevamente, aquí está el camino que les mostré,
00: 08: 19.20 y lo que les mostramos es que
00: 08: 22.04 calcio, mostrado en rojo,
00: 08: 24.02 es inhibido por BTP.
00: 08: 25.11 También acabo de mostrarte ese drebrin
00: 08: 27.16 se identificó como una proteína que interactúa con BTP.
00: 08: 31.22 Y entonces la pregunta era,
00: 08: 33.14 ¿Dónde cae Drebrin dentro de este camino?
00: 08: 36.25 que es activado por el receptor FC?
00: 08: 39.13 Y entonces hicimos algunos experimentos
00: 08: 40.28 para intentar determinar
00: 08: 42.28 si drebrin podría
00: 08: 45.05 para afectar la activación de
00: 08: 47.12 varias de estas diferentes vías.
00: 08: 48.25 Entonces, para hacer eso,
00: 08: 50.10 en realidad generamos ratones knockout drebrin,
00: 08: 52.06 y lo hicimos adquiriendo las células madre embrionarias,
00: 08: 54.24 que tenía un casete
00: 08: 57.26 que estaba atrapado dentro del gen de drebrin,
00: 09: 00.06 que resultó en las células
00: 09: 02.25 no poder producir la proteína.
00: 09: 05.04 Generamos ratones a partir de esas células madre embrionarias
00: 09: 07.16 y luego examinamos los cerebros de esos ratones,
00: 09: 09.23 que también expresó drebrin,
00: 09: 11.21 para la expresión de drebrin.
00: 09: 12.24 Y puedes ver, aquí,
00: 09: 14.12 en esta mancha occidental
00: 09: 16.17 que los cerebros de tipo salvaje
00: 09: 18.12 expresado drebrin de cuerpo entero,
00: 09: 19.26 mientras que los cerebros de los ratones deficientes en drebrin
00: 09: 22.06 no tenía drebrin en absoluto.
00: 09: 24.16 Luego pasamos a caracterizar más estos ratones
00: 09: 27.24 para determinar si sus mastocitos
00: 09: 29.24 eran funcionales.
00: 09: 31.03 Y lo que puedes ver aquí
00: 09: 33.12 es piel del tipo salvaje de ratones deficientes en drebrina,
00: 09: 37.14 teñido con azul de toluidina,
00: 09: 39.11 y en las flechas negras
00: 09: 41.08 puedes ver dónde se encuentran los mastocitos en la piel,
00: 09: 43.00 y puede ver que el desarrollo de los mastocitos
00: 09: 44.18 estaba completamente bien en ausencia de drebrin
00: 09: 47.01 en estos ratones.
00: 09: 48.24 También miramos imágenes de micrografías electrónicas
00: 09: 52.16 y puedes ver, de nuevo,
00: 09: 54.03 que la ultraestructura de estos mastocitos
00: 09: 55.26 estuvo completamente bien,
00: 09: 57.16 si Drebrin estaba allí o no.
00: 09: 59.20 Así que estábamos bastante seguros de que, en ausencia de drebrin,
00: 10: 01.10 al menos in vivo,
00: 10: 03.02 los mastocitos pudieron desarrollarse
00: 10: 04.27 y fueron encontrados en el lugar correcto.
00: 10: 07.02 Entonces, lo siguiente que decidimos hacer
00: 10: 09.05 es preguntar si estos mastocitos
00: 10: 11.11 fueron funcionales in vivo en este análisis,
00: 10: 14.21 que les mostré antes.
00: 10: 16.27 Y aquí, lo que hicimos de nuevo.
00: 10: 19.00 armamos los mastocitos in vivo
00: 10: 21.14 con IgE inyectando IgE,
00: 10: 23.22 y luego, al día siguiente,
00: 10: 26.18 los desafiamos con el alérgeno
00: 10: 27.27 y luego tres minutos más tarde
00: 10: 29.25 recolectamos estos ratones
00: 10: 31.18 y determiné si había histamina.
00: 10: 32.28 Y de nuevo, lo que ves aquí
00: 10: 35.15 es que los ratones de tipo salvaje generaron mucha histamina
00: 10: 37.00 cuando les dimos el alérgeno más IgE,
00: 10: 39.18 mientras que los ratones deficientes en drebrin
00: 10: 41.18 tuvo una respuesta de histamina muy reducida
00: 10: 44.20 en las mismas condiciones.
00: 10: 46.03 Así que estos experimentos nos indicaron
00: 10: 48.19 que drebrin era realmente importante para la liberación de histamina
00: 10: 51.04 de mastocitos in vivo
00: 10: 52.16 cuando los activamos con IgE.
00: 10: 55.10 El segundo experimento que hicimos
00: 10: 57.06 fue el experimento del que hablé antes, que es,
00: 11: 00.13 ¿estos ratones con deficiencia de drebrin realmente pierden temperatura corporal?
00: 11: 03.20 cuando les inyectamos alérgenos?
00: 11: 05.14 Entonces hicimos el mismo experimento.
00: 11: 06.22 Armamos los mastocitos in vivo con IgE,
00: 11: 09.24 les dimos el alérgeno,
00: 11: 11.04 y luego monitoreamos su temperatura
00: 11: 12.24 hasta 60 minutos más tarde
00: 11: 14.28 para determinar si pierden temperatura corporal.
00: 11: 17.05 Y lo que puedes ver aquí es que
00: 11: 22.16 los ratones de tipo salvaje que recibieron vehículo.
00: 11: 24.06 perdieron temperatura corporal,
00: 11: 27.01 en ausencia de drebrin,
00: 11: 29.08 ya no perdieron la temperatura corporal,
00: 11: 32.00 y ratones de tipo salvaje que son tratados con BTP
00: 11: 34.02 también ya no perdió la temperatura corporal.
00: 11: 36.10 Entonces, tanto en el nocaut,
00: 11: 38.02 así como el compuesto,
00: 11: 39.14 obtuvimos el mismo resultado.
00: 11: 40.22 Es decir, anafilaxia sistémica pasiva
00: 11: 43.18 en realidad se redujo
00: 11: 46.02 en respuesta al alérgeno
00: 11: 48.09 cuando inhibimos con BTP
00: 11: 49.26 o cuando anulamos el gen drebrin.
00:11: 53.25 Entonces, lo siguiente que queríamos hacer,
00: 11: 55.27 es mirar los mastocitos individuales
00: 11: 58.01 y pregunte si vimos el mismo resultado.
00:11: 59.11 Entonces, nuevamente, tomamos médula ósea de ratones,
00: 12: 01.26 en este caso ratones de tipo salvaje o deficientes en drebrina,
00: 12: 04.02 los cultivó durante seis semanas,
00: 12: 06.24 y luego los cubrimos con IgE durante la noche
00: 12: 08.20 y luego los activó con alérgenos
00: 12: 10.18 para determinar si responderían.
00: 12: 13.22 Y así, de nuevo,
00: 12: 16.04 estamos viendo la activación de mastocitos
00: 12: 18.23 por el receptor de IgE,
00: 12: 20.22 y primero veremos las respuestas al calcio
00: 12: 22.12 para ver si el calcio se vio afectado
00: 12: 24.10 en ausencia de drebrin,
00: 12: 26.12 y ese experimento se muestra aquí.
00: 12: 29.00 Tomamos mastocitos y los cargamos
00: 12: 30.27 con un tinte sensible al calcio,
00: 12: 33.03 luego los cubrimos con IgE,
00: 12: 35.00 y luego activarlos con el antígeno,
00: 12: 37.14 y puede ver que las células de tipo salvaje,
00: 12: 39.14 en gris claro,
00: 12: 41.16 aumentan el calcio y ese calcio se mantiene durante mucho tiempo,
00: 12: 44.23 mientras que en ausencia de drebrin
00: 12: 46.26 estos mastocitos aumentan el calcio inicialmente,
00: 12: 49.24 pero el calcio no se mantiene alto,
00: 12: 51.20 comienza a disminuir con el tiempo.
00: 12: 54.01 Y en el gráfico inferior
00: 12: 55.29 puedes ver la pendiente de esa desintegración de calcio
00: 12: 58.05 es una pendiente negativa
00: 13: 00.13 en ausencia de drebrin en estos mastocitos,
00: 13: 02.10 mientras que es una pendiente positiva en las células de tipo salvaje,
00: 13: 04.29 indicando que en ausencia de drebrin
00: 13: 06.27 lo que realmente estamos afectando
00: 13: 08.28 es la liberación prolongada de calcio
00: 13: 10.26 que vemos que es necesario
00: 13: 12.26 para que estos mastocitos se desgranulen y liberen su contenido.
00: 13: 16.20 Entonces, desgranulación de mastocitos, entonces,
00: 13: 20.08 requiere la activación de drebrin,
00: 13: 22.26 la activación del receptor FC,
00: 13: 25.04 y publica estos contenidos:
00: 13: 26.16 histamina, heparina y otras citocinas.
00: 13: 29.11 Y entonces preguntamos si podíamos
00: 13: 32.27 ver reducción en la desgranulación
00:13: 34.17 en ausencia de drebrin en estos mastocitos.
00:13: 36.22 Entonces, ese experimento se muestra aquí.
00: 13: 39.04 Podemos estimular estos mastocitos,
00: 13: 41.04 cualquiera de los mastocitos de tipo salvaje
00: 13: 42.16 o mastocitos deficientes en drebrin,
00: 13: 44.02 con IgE y el alérgeno,
00: 13: 46.10 y de manera dependiente de la concentración
00: 13: 48.08 obtienes un aumento en la desgranulación,
00: 13: 50.26 medido por la liberación de β-hexosaminasa.
00: 13: 54.02 Entonces, en mastocitos de tipo salvaje
00: 13: 55.22 obtiene un aumento en la liberación de β-hexosaminasa,
00: 13: 58.14 y cuando falta drebrin,
00: 14: 01.05 puede ver aquí que los mastocitos
00: 14: 04.06 desgranular mucho menos en comparación con el tipo salvaje.
00: 14: 07.06 Entonces, la ausencia de drebrin,
00: 14: 09.07 afecta la desgranulación de mastocitos in vitro,
00: 14: 10.26 además de las reducciones en el calcio intracelular con el tiempo.
00: 14: 16.00 Entonces, ¿qué pasa con las citocinas?
00:14: 17.26 Entonces, te lo dije en la primera parte de mi charla.
00: 14: 20.08 que la activación de mastocitos con alérgenos
00: 14: 22.18 no solo libera histaminas,
00: 14: 24.10 pero también libera citocinas,
00: 14: 26.08 y esas citocinas pueden tener efectos importantes
00: 14: 28.02 sobre el sistema inmunológico,
00: 14: 29.10 así que hicimos un experimento similar
00: 14: 31.09 donde tomamos mastocitos
00: 14: 33.27 y los estimuló
00: 14: 35.25 y preguntó si drebrin, o la ausencia de drebrin,
00: 14: 37.28 afectaría la liberación de citocinas.
00:14: 41.12 Y la liberación de citoquinas.
00: 14: 43.12 algunas de esas citocinas dependen del calcio
00: 14: 44.21 y algunas de las citocinas no dependen del calcio,
00: 14: 46.28 así que analizamos dos patrones diferentes de citocinas:
00: 14: 49.00 citocinas dependientes del calcio
00: 14: 50.11 y citocinas independientes del calcio.
00: 14: 53.04 Y ese experimento se muestra aquí.
00: 14: 55.04 En los dos gráficos superiores se encuentran las citocinas dependientes del calcio,
00: 14: 57.19 interleucina-2 y GM-CSF,
00: 15: 00.23 y puede ver aquí, en los círculos rellenos,
00: 15: 03.29 las células de tipo salvaje producen IL-2 y GM-CSF
00: 15: 08.04 perfectamente bien,
00: 15: 09.16 pero en los mastocitos a los que les falta drebrin,
00: 15: 11.14 puedes ver que ahora ya no
00: 15: 13.20 liberan las citocinas dependientes del calcio.
00: 15: 16.02 Por el contrario, si miramos IL-6, en el gráfico inferior,
00: 15: 19.04 que no es una citoquina dependiente del calcio,
00: 15: 21.18 puedes ver que hay muy poca diferencia
00: 15: 23.03 entre las células de tipo salvaje y las células deficientes en drebrina
00: 15: 24.26 en la producción de citocinas.
00: 15: 27.02 Entonces, estos experimentos muestran que
00: 15: 29.08 drebrin juega un papel fundamental
00: 15: 30.24 en la regulación tanto de la señalización del calcio que conduce a la desgranulación,
00: 15: 34.17 pero también señalización de calcio
00: 15: 36.12 que conduce a la producción de citocinas
00: 15: 38.24 y solo esas citocinas
00: 15: 40.10 que son dependientes del calcio
00: 15: 41.17 se ven afectados por la ausencia de drebrin.
00: 15: 43.24 La otra cosa que queríamos averiguar
00: 15: 48.04 es donde en este camino
00: 15: 50.00 ¿Drebrin miente?
00: 15: 51.02 Entonces hicimos una serie de experimentos
00: 15: 52.19 donde examinamos el
00: 15: 54.17 activación de las quinasas Src, Syk y Tec,
00: 15: 56.18 y no hubo diferencia.
00: 15: 58.05 Preguntamos si la activación de PLC-gamma
00: 16: 00.21 se vio afectado por la ausencia de drebrin,
00: 16: 02.29 y no hubo diferencia.
00: 16: 04.14 Entonces, ¿qué podríamos concluir?
00: 16: 06.12 fue que drebrin juega un papel
00: 16: 08.18 en un camino paralelo o diferente
00: 16: 10.13 que no es anterior a PLC-gamma,
00: 16: 12.25 pero en realidad todavía afecta el calcio
00: 16: 14.24 de una manera
00: 16: 16.22 que no entendemos del todo.
00: 16: 19.06 Ahora, una de las cosas que les dije
00: 16: 22.01 fue que la activación de drebrin
00: 16: 23.16 es importante para la polimerización de actina,
00: 16: 28.03 y por eso queríamos averiguarlo
00: 16: 29.20 si drebrin afectaría a la actina
00: 16: 32.22 en estas celdas.
00: 16: 33.24 Ahora, la actina es realmente importante
00: 16: 35.10 para la estructura de la celda,
00: 16: 38.01 pero también se ha demostrado que es importante
00: 16: 40.18 para desgranulación
00: 16: 42.20 y el movimiento de gránulos dentro de las células,
00: 16: 44.24 y entonces la idea de que drebrin juega un papel
00: 16: 47.03 no solo en la regulación de la señalización del calcio
00: 16: 49.05 sino también en la regulación del citoesqueleto de actina
00: 16: 52.07 nos impulsó a mirar la actina
00: 16: 54.07 en estas celdas.
00: 16: 55.22 Entonces, hicimos algunos experimentos muy simples
00: 16: 57.20 para determinar eso.
00: 16: 59.00 Primero, tomamos cualquiera de los tipos salvajes
00: 17: 01.09 o mastocitos deficientes en drebrin
00: 17: 02.25 y teñí con faloidina,
00: 17: 04.24 que tiñe F, o actina filamentosa.
00: 17: 09.16 Y puedes ver, lo más evidente,
00: 17: 11.20 es que las células de tipo salvaje
00: 17: 13.24 realmente tengo buena actina
00: 17: 16.04 alrededor del perímetro de la celda,
00: 17: 18.11 pero si miramos las células deficientes en drebrin
00: 17: 20.19 puedes ver que tienen más actina
00:17: 22.04 y la actina se distribuye realmente
00: 17: 24.16 no solo en el perímetro de la celda,
00: 17: 26.14 pero comienza a extenderse dentro de la celda.
00:17: 28.04 Entonces, queríamos cuantificar esto un poco más,
00: 17: 30.23 y entonces hicimos citometría de flujo
00: 17: 32.14 con estas celdas
00: 17: 34.01 usando faloidina etiquetada,
00: 17: 36.01 y puedes ver aquí
00: 17: 38.07 que los mastocitos de tipo salvaje, en sólido,
00:17: 41.01 tienen menos actina si miras
00: 17: 43.23 a la intensidad media de fluorescencia
00: 17: 45.14 que los mastocitos que no tienen drebrin.
00:17: 50.13 Entonces, en ausencia de drebrin,
00:17: 51.27 estos mastocitos en realidad tienen un aumento de F-actina,
00: 17: 54.11 que puede estar afectando la respuesta.
00: 17: 57.15 Entonces, queríamos explorar esto un poco más
00:17: 59.01 y pregunte, ¿qué le pasa a la F-actina?
00: 18: 01.11 ¿cuándo se estimulan estas células?
00: 18: 04.06 Y lo que hicimos fue tomar estos mastocitos
00: 18: 06.23 y los estimuló de la misma manera que
00: 18: 08.17 los estimulamos antes,
00: 18: 09.23 con IgE y alérgeno,
00: 18: 11.03 y analizamos la actina F a lo largo del tiempo
00: 18: 13.07 en estas celdas.
00: 18: 15.00 Y esta es una diapositiva un poco complicada
00: 18: 17.11 y lo llevaré a cabo lentamente.
00: 18: 19.07 A la derecha puede ver que los mastocitos de tipo salvaje
00: 18: 22.12 empezar con actina en el tiempo cero,
00: 18: 23.25 la mayor parte de la actina está en el borde de la celda.
00: 18: 26.14 en el perímetro de la celda.
00: 18: 28.05 Dos minutos después de la activación,
00: 18: 29.18 puede ver que la F-actina
00: 18: 31.04 comienza a moverse dentro de la celda,
00: 18: 33.20 con el aumento de la señal
00: 18: 36.14 a 2 minutos, 5 minutos y 10 minutos,
00: 18: 38.26 y luego por 30 minutos, en la parte inferior,
00: 18: 40.29 la celda se parece mucho a una celda
00: 18: 43.03 que no ha sido activado.
00: 18: 44.13 Entonces, en las células de tipo salvaje,
00: 18: 45.29 hay un aumento en F-actina
00: 18: 47.23 que está reorganizado
00: 18: 50.03 lejos del perímetro de la celda
00: 18: 52.15 hacia el centro de la celda
00: 18: 54.03 y luego retrocede
00: 18: 56.01 al perímetro de la celda.
00: 18: 58.04 Si nos fijamos en los mastocitos deficientes en drebrin,
00: 19: 00.04 puede ver que en el tiempo 0,
00: 19: 02.09 la actina se distribuye por toda la célula,
00: 19: 04.07 no solo en el perímetro,
00: 19: 06.07 y ese patrón no cambia mucho
00: 19: 08.27 a medida que estimulamos las células con el tiempo.
00: 19: 11.15 Entonces, cambios inducidos por el receptor de IgE FC
00: 19: 15.05 son diferentes entre las células de tipo salvaje
00: 19: 18.20 y las células deficientes en drebrin,
00: 19: 20.19 en el espacio y en el tiempo.
00: 19: 23.17 Y podemos cuantificar esto
00: 19: 25.03 comparando la diferencia
00: 19: 26.27 entre las células deficientes en drebrin
00: 19: 28.07 y las células de tipo salvaje en cada punto de tiempo,
00:19: 31.04 estadísticamente, y puedes ver eso aquí.
00: 19: 33.14 en el eje y en el gráfico de la izquierda,
00: 19: 37.05 que en el tiempo 0,
00:19: 40.03 hay una gran diferencia en la localización de F-actina en estas células,
00: 19: 42.27 y eso cambia a medida que se activa la celda,
00: 19: 45.19 pero en todos los casos hay una diferencia estadísticamente significativa
00: 19: 49.03 en la ubicación de la actina
00: 19: 51.09 en las células de tipo salvaje
00: 19: 53.01 en comparación con las células deficientes en drebrin.
00:19: 56.09 Entonces, ¿qué estos experimentos
00: 19: 58.29 nos indicó
00: 20: 00.18 era que Drebrin estaba regulando
00: 20: 02.18 la superestructura de F-actina en estos mastocitos.
00: 20: 05.11 Entonces, hicimos la pregunta,
00: 20: 07.28 ¿Podemos relajar la superestructura de F-actina?
00: 20: 10.10 en estas células deficientes en drebrin
00: 20: 12.20 y rescatar la función
00: 20: 14.19 en ausencia de drebrin?
00: 20: 15.29 Entonces, usamos un compuesto
00: 20: 17.26 llamada latrunculina B.
00: 20: 18.29 ¿Qué hace la latrunculina B?
00: 20: 20.19 si se une a F-actina
00: 20: 22.14 y aumenta su movilidad,
00: 20: 24.11 o reduce la cantidad de F-actina en las células.
00: 20: 27.15 Y lo que les muestro aquí a la [izquierda]
00: 20: 30.20 son gráficos de citometría de flujo
00: 20: 32.06 de mastocitos deficientes en drebrin
00: 20: 33.27 tratados con latrunculina B,
00: 20: 35.07 y puedes ver aquí,
00: 20: 36.22 en la tabla de la [derecha],
00: 20: 38.00 a medida que aumentamos la cantidad de latrunculina B,
00: 20: 39.27 reducimos la cantidad de F-actina
00: 20: 42.29 en estas celdas.
00: 20: 44.07 Entonces podemos usar latrunculina B
00: 20: 45.19 para ajustar la cantidad de F-actina en estas células,
00: 20: 47.22 y ahora podemos hacer la pregunta,
00: 20: 49.15 si reducimos la cantidad de F-actina en estas células deficientes en drebrina,
00:20: 52.25 ¿Podemos rescatar la desgranulación?
00: 20: 55.20 Y ese experimento se muestra aquí.
00: 20: 57.25 Entonces, aquí en los círculos negros llenos
00: 21: 00.02 son mastocitos de tipo salvaje
00: 21: 02.14 que hemos estimulado con IgE y antígeno,
00: 21: 05.07 de una manera dependiente de la concentración,
00: 21: 07.01 y obtenemos un aumento en la desgranulación
00: 21: 09.00 durante ese período de tiempo.
00: 21: 11.12 En ausencia de drebrin,
00: 21: 13.01 en los círculos abiertos,
00: 21: 14.08 puede ver que los mastocitos deficientes en drebrin
00:21: 18.19 en realidad se desgranula mucho menos.
00: 21: 22.18 Sin embargo, cuando tratamos estos mastocitos deficientes en drebrin
00: 21: 25.13 con 0.5 o 1 [micromolar] latrunculina B,
00: 21: 28.17 podemos rescatar parcialmente la desgranulación,
00: 21: 30.26 indicando que permitir F-actina
00: 21: 32.11 para ser más fluido en estas células
00: 21: 34.13 permite que estas celdas ahora
00: 21: 37.07 ser capaz de desgranular.
00: 21: 39.17 Entonces, podemos resumir,
00: 21: 41.05 colocando drebrin en este camino,
00: 21: 44.11 en cierto modo
00: 21: 46.13 que el receptor de FC desencadena la activación
00: 21: 48.02 de estas tirosina quinasas,
00: 21: 49.22 que luego conduce a la activación
00: 21: 51.06 de varias vías diferentes,
00: 21: 53.02 incluyendo drebrin,
00: 21: 54.15 y lo que hace Drebrin
00: 21: 56.01 es controlar la cantidad de F-actina en estas células,
00: 21: 57.23 para controlar la señalización del calcio
00: 21: 59.22 y / o desgranulación de estas células
00: 22: 02.14 para que puedan liberar su contenido,
00: 22: 04.15 producen citocinas,
00: 22: 06.11 y participar en la respuesta alérgica.
00: 22: 09.09 Y así, con eso,
00:22: 10.15 Me gustaría agradecer a las personas que hicieron el trabajo en el laboratorio.
00:22: 12.13 La mayor parte de este trabajo se hizo
00:22: 14.27 por las personas que se muestran en rojo.
00:22:16 La ley de Mankit era la principal persona.
00:22: 19.19 quien condujo la mayor parte del trabajo,
00: 22: 21.03 con la ayuda de varios postdoctorados
00:22: 22.25 y estudiantes de posgrado en el laboratorio.
00: 22: 24.17 Colaboramos con Laurie Mottram y Blake Peterson,
00: 22: 27.05 junto con Tomo Shirao y Hiro Yamazaki
00:22: 29.29 en la Universidad de Gunma.

  • Parte 1: Alergias y sistema inmunológico

Discusión

Los resultados presentados demuestran una relación entre el perfil de las supuestas poblaciones de células progenitoras pulmonares y las enfermedades pulmonares crónicas. Se identificaron relaciones específicas entre el aumento de los progenitores de tipo epitelial de CCSP + y la fibrosis quística y entre el aumento de los fibrocitos circulantes y las enfermedades fibróticas como la fibrosis pulmonar y la bronquiolitis obliterante. Además, los resultados sugieren la participación de mediadores quimiotácticos clave, incluidos SDF-1, SCGF-β y MCP-1 en el reclutamiento o mantenimiento de estas poblaciones de células dentro de los grupos de enfermedades específicos estudiados.

En nuestra publicación anterior [8] informamos que la médula ósea murina contiene una población de células que expresan CCSP en su superficie. Esto se confirmó mediante PCR en poblaciones clasificadas por FACS, transferencia de Western y con el uso de ratones knockout CCSP. Esta población demostró una mayor propensión a expresar un fenotipo epitelial pulmonar a nivel de genes y proteínas y se retuvo preferentemente en el pulmón lesionado, en comparación con otras células de la médula ósea y contribuyó al revestimiento epitelial después del trasplante de médula ósea. Como resultado de estas propiedades, denominamos a estas células células progenitoras de tipo epitelial. También informamos que la médula humana contiene una población similar mediante citometría de flujo. Aquí confirmamos que la médula ósea humana y la sangre periférica contienen tales células utilizando sondas de PCR específicas basadas en Taqman. Es de destacar que la cantidad de ARNm de CCSP es aproximadamente 60 veces menor que la de los tejidos bronquiales, pero muchas veces mayor que la de otros tipos de células de la médula ósea.

La evaluación de poblaciones de células progenitoras de fibroblastos y de tipo epitelial en pacientes con enfermedad pulmonar crónica en etapa terminal no se ha informado previamente. Presumimos que al estudiar estas enfermedades variables, la medición de dos poblaciones de células con funciones potencialmente contradictorias proporcionaría una comprensión más completa. De hecho, existen diferencias significativas en estas poblaciones de células cuando se comparan entre enfermedades subyacentes. Específicamente, las células CCSP + en la médula ósea y la sangre periférica aumentaron en pacientes con FQ donde el daño y la lesión del epitelio de las vías respiratorias pequeñas pueden ser un estímulo predominante y persistente. Reconociendo las diferencias entre la lesión pulmonar aguda y crónica, y entre los estudios en ratones y humanos, estos hallazgos apoyan nuestras observaciones originales en ratones donde estas células aumentaron después de una lesión de las vías respiratorias inducida por naftaleno específico del epitelio. Especulamos que esto puede atribuirse a un esfuerzo sostenido pero no resuelto para reparar el epitelio de la FQ dañado que conduce a un entorno inflamatorio persistente que da como resultado una señal de reclutamiento perpetuo a la médula ósea y la acumulación de la población progenitora de tipo epitelial CCSP +. Se ha informado previamente que el epitelio bronquial de los pacientes con FQ es más proliferativo que el de las vías respiratorias sin FQ [12]. Los xenoinjertos humanizados de las vías respiratorias, en los que las células derivadas de la FQ presentaban un mayor potencial proliferativo, se caracterizaron además por remodelación, diferenciación retardada y respuestas proinflamatorias alteradas [13].

La observación de que los fibrocitos circulantes aumentan en las enfermedades fibróticas concuerda con la evidencia previa [10, 14]. También hemos documentado que los pacientes con BO son un subconjunto particularmente sorprendente en términos de números muy altos de fibrocitos [11]. Esto apoya la hipótesis de que los fibrocitos circulantes pueden contribuir a la población de fibroblastos pulmonares, ya sea a través de la activación paracrina de fibroblastos endógenos o por injerto y contribución directa a la deposición y remodelación de la matriz. La medición de poblaciones progenitoras tanto epiteliales como mesenquimales ha identificado cambios en estos números de células que se corresponden con cambios en la patología pulmonar epitelial o mesenquimatosa subyacente. Específicamente, se identificaron progenitores de tipo epitelial aumentados en la FQ donde el epitelio es hiperplásico, mientras que los progenitores mesenquimales aumentaron en la enfermedad caracterizada por fibroproliferación. Aunque existen muchos mecanismos comunes en pacientes con enfermedad pulmonar en etapa terminal, la biología única de la FQ frente a la enfermedad pulmonar fibrótica puede describirse con más detalle mediante estas nuevas diferencias en el número de células progenitoras, lo que abre nuevas vías de investigación.

Es importante destacar que no se encontraron correlaciones entre la edad, el sexo o el IMC del paciente, lo que sugiere que estos parámetros demográficos no parecen influir en los cambios observados en los perfiles celulares. Sin embargo, se identificó una correlación entre la proporción de CCSP + BMC y PBMC, lo que sugiere una relación entre el número de células de la médula ósea en reserva y el número que puede salir y transitar a través de la sangre periférica. Se encontró que SCGF-β se correlaciona significativamente con el número de ambas poblaciones de células CCSP +. Es posible que SCGF-β pueda actuar como mitógeno endógeno para los progenitores de tipo epitelial, como se ha descrito para las células hematopoyéticas CD34 + [15], aunque en este estudio no se ha determinado la fuente directa de este factor. No se identificaron correlaciones entre las poblaciones de células CCSP + y la proporción de fibrocitos circulantes. Esto sugiere que distintos mecanismos pueden ser responsables del reclutamiento de cada población y argumenta en contra de una alteración generalizada en la movilización o el tráfico de células derivadas de la médula.

Este estudio tiene varias limitaciones, la más importante es el diseño transversal. Se necesitarán estudios futuros para obtener datos de pacientes en varios puntos durante el desarrollo de su enfermedad pulmonar. Sin embargo, es dudoso que el muestreo de la médula ósea sea posible en un estudio de seguimiento longitudinal de este tipo. En estos pacientes, todos con enfermedad pulmonar grave en etapa terminal en espera de trasplante de pulmón, no hubo una relación significativa entre CCSP + BMC / PBMC o células CD45 + Colágeno-1 + y la relación FEV1 / FVC en pacientes con FQ o EPOC o con el% predicho FVC para pacientes con fibrosis pulmonar. Esto no excluye la posibilidad de que estas poblaciones de células contribuyan a la patología de la enfermedad pulmonar, y los análisis adicionales en pacientes en etapas mucho más tempranas de la enfermedad pulmonar serán importantes prioridades futuras. Además, muchos otros parámetros clínicos importantes influyen en la función pulmonar y estas variables de confusión pueden haber oscurecido cualquier relación entre el número de células y la función pulmonar. Otra limitación es el uso de donantes de pulmón como grupo de control. Si bien no es ideal, ya que este grupo bien puede tener daño agudo o crónico en el pulmón, representó la única opción para el análisis de la médula ósea, ya que la extracción esternal de controles verdaderamente normales no sería ética.

En un esfuerzo por comprender los mecanismos responsables de los diferentes perfiles de células progenitoras entre las enfermedades pulmonares, se analizaron quimiocinas y receptores clave. Se ha informado anteriormente que los fibrocitos expresan varios receptores de quimiocinas importantes, incluidos CXCR4 [9], CCR2 [16] y CCR7 [17]. Cuando se analizaron CCSP + BMC y PBMC para un panel de receptores similares, se identificó la expresión de CCR2, CCR4, CXCR3 y CXCR4. Se espera que algunas vías sean redundantes y que algunas citocinas tengan la capacidad de activar ambas poblaciones de células. Ésta es quizás una prueba del origen de la médula ósea de ambas poblaciones.

Se realizaron estudios de migración para CCSP + para investigar la in vitro respuesta a varias quimiocinas. La migración no se analizó en busca de fibrocitos, como se informó anteriormente [9, 18]. Aquí, encontramos que el factor derivado del estroma (SDF-1) fue un estímulo de migración importante para las células CCSP +, como también se informó para los fibrocitos. Se ha informado previamente que los anticuerpos neutralizantes contra SDF-1 pueden atenuar los efectos fibróticos de la lesión pulmonar de ratón inducida por bleomicina [9]. La expresión pulmonar de SDF-1 también se ha informado en el contexto de la lesión pulmonar y el reclutamiento de células derivadas de la médula ósea [19]. También se encontró que SCGF-β induce la migración de CCSP + PBMC y BMC en pacientes con enfermedad pulmonar en etapa terminal. Esto apoya la correlación observada entre esta citocina plasmática y el número de células CCSP + medidas. La expresión de las transcripciones de SCGF-β está restringida, según se informa, a las células del linaje mieloide [20], que pueden incluir macrófagos pulmonares residentes. La expresión de CCR2 por ambas poblaciones de células, así como el aumento de los ligandos IP-10 y MCP-1 en la fibrosis pulmonar resalta aún más el papel de la inflamación en muchas enfermedades pulmonares en etapa terminal. Se demostró además que la concentración plasmática de MCP-1 se correlaciona con el número de fibrocitos circulantes, identificando de nuevo un papel para el reclutamiento de células progenitoras mediado por CCR2, que puede potenciarse en el paciente fibrótico.

Curiosamente, se encontró que el MIF aumentaba específicamente en los pacientes con FQ, lo que quizás sugiere un papel único para CD74 o CXCR4 en el mecanismo de reclutamiento de células CCSP +. Se ha informado de que MIF puede actuar como un ligando para CXCR4 e inducir la migración de monocitos y células T, sugiriendo quizás un mecanismo novedoso de tráfico de células progenitoras de tipo epitelial [21, 22]. El MIF es un mediador inflamatorio pleiotrópico con funciones similares a las de las quimiocinas que puede dirigir la migración de leucocitos a sitios inflamatorios [21].También se ha demostrado que el MIF es producido por células epiteliales [23] y macrófagos alveolares activados [24], lo que sugiere un mecanismo potencial por el cual el epitelio de FQ dañado recluta células CCSP + circulantes. Mejorar el reclutamiento de CCSP + usando MIF puede no ser una opción terapéutica viable ya que MIF actúa sobre múltiples tipos de células y puede exacerbar las respuestas inflamatorias.


Materiales y métodos

Animales.

C57BL / 6, CX3CR1 gfp / + (9) y CD11b-DTR (proporcionado por J.S. Duffield, Harvard Medical School, Boston, MA) (47) se criaron y usaron ratones de acuerdo con la legislación francesa. Los experimentos se realizaron entre las 4 y 8 semanas de edad.

Lesión muscular y preparación muscular.

Se inyectaron 10 µl de notexina (25 µg / ml en PBS Latoxan) en el TA. Para el análisis histológico, los músculos se prepararon como se describió anteriormente (27). Se realizó un análisis cuantitativo de la regeneración muscular en toda el área lesionada: se analizaron aproximadamente siete campos (20 × PL objetivo Flustar Carl Zeiss MicroImaging, Inc.) en cada ratón, lo que representa de 300 a 400 fibras por ratón. El diámetro de las miofibras se evaluó después del inmunomarcaje de colágeno IV (ver Inmunomarcaje) en aproximadamente siete campos (objetivo 20x) en cada ratón. El pequeño diámetro de sólo miofibras nucleadas centralmente se evaluó en el músculo de regeneración tardía (área no sombreada en la Fig. 8 B) con el software Axiovision 4.6 (Carl Zeiss MicroImaging, Inc.), lo que representa 250-350 fibras por ratón. En ratones inyectados con PBS, el fascículo perforado se omitió del análisis.

Aislamiento de MO / MP del músculo.

Se eliminó la fascia del TA. Los músculos se disociaron en DMEM que contenía colagenasa B al 0,2% (Roche Diagnostics GmbH) y tripsina-EDTA al 0,2% a 37ºC durante 45 min dos veces, se filtraron y se contaron. Las células CD45 + se aislaron usando clasificación magnética (Miltenyi Biotec) y se tiñeron con anticuerpo anti-Gr1 conjugado con PE o PC5 (que reacciona con Ly-6C y Ly-6G, pero solo Ly-6C es expresado por MOs eBioscience). Las células se clasificaron usando un clasificador de células (Epics Elite Beckman Coulter). Se utilizaron poblaciones que presentaban una pureza & gt90%. En algunos experimentos, se utilizaron anticuerpos CD11c, I-A b (BD Biosciences) y F4 / 80 (AbD Serotec) conjugados con PE. El análisis se realizó con un citómetro (FACSCalibur BD Biosciences).

Etiquetado de OM de sangre.

El etiquetado de los MO circulantes se realizó exactamente como se describió anteriormente (15) con microesferas simples (Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres 0.5μm, 2.5% solids PolySciences, Inc.) y clo-lip, que se prepararon como se describió anteriormente (79). El clodronato fue un regalo de Roche Diagnostics GmbH.

Agotamiento de MO circulantes e i.m. Diputados.

12 ng / g de DT fue i.v. inyectado en ratones CD11b-DTR. La sangre se recogió retroorbitalmente en varios momentos después de la inyección, y las células se marcaron con anticuerpos anti-CD11b, anti-Gr1 y F4 / 80 y se analizaron mediante citometría de flujo. Debido a las altas variaciones interindividuales (3–12% de PBMC), el número de MO circulantes en ratones de control se normalizó al 5% de PBMC para cada serie (media calculada con ratones & gt25). Para agotar los MO / MP infiltrados, 25 ng / g de DT en & lt10 μl fueron i.m. inyectado en los días 5 y 6 después de la lesión. Los controles incluyeron la inyección de PBS.

Inmunomarcaje.

Los portaobjetos de músculo se incubaron con anticuerpo anticolágeno IV (1:50 Chemicon International, Inc.) revelado con anticuerpo anticonejo conjugado con Cy5. Las células clasificadas de ratón se centrifugaron en portaobjetos y se marcaron con 1 μg / ml de anticuerpo anti-Ki67 (Abcam plc), revelado con anticuerpo anti-conejo conjugado con FITC. Las mpcs humanas cultivadas se incubaron con 60 μg / ml de anticuerpo antidesmina (Abcam plc), revelado por un anticuerpo anticonejo conjugado con Cy3, y con 10 μg / ml de anticuerpo antimiogenina (BD Biosciences), revelado por un anti-ratón biotinilado (Vector Laboratorios) y mediante diclorotriandolaminofluoresceína-estreptavidina (Beckman Coulter). Los controles incluyeron incubación con IgG de conejo o ratón enteras. Otros anticuerpos secundarios e IgG se obtuvieron de Jackson ImmunoResearch Laboratories.

RT-PCR.

El ARN total se preparó a partir de células clasificadas utilizando el mini kit RNeasy (QIAGEN). Se sometieron a transcripción inversa 0,5 μg de ARN total utilizando transcriptasa inversa Superscript II y se amplificó con una ADN polimerasa Taq de platino (Invitrogen) y los siguientes cebadores específicos (sentido y antisentido, respectivamente): microglobulina β2, 5′-CAGTTCCACCCGCCTCAC-3 ′ y 5 ′ -CACATGTCTCGATCCCAG-3 ′ TNF-α, 5′-TTCCAGATTCTTCCCTGAGGT-3 ′ y 5′-TAAGCAAAAGAGGAGGCAACA-3 ′ IL-1β, 5′-TGACGTTCCCATTAGACAACTG-3 ′ y 5′GACT-CCGAC1′ GAGACGGAATACAGGGCTTTC-3 ′ y 5′-TCTCTGTGGAGCTGAAGCAAT-3 ′ IL-10, 5′-ACCAGCTGGACAACATACTGC-3 ′ y 5′-TCACTCTTCACCTGCTCCACT-3 ′ SLPI, 5′-CCTTAAGGAGCTGAAGCAAT-3 ′ IL-10, 5′-ACCAGCTGGACAACATACTGC-3 ′ y 5′-TCACTCTTCACCTGCTCCACT-3 ′ SLPI, 5′-CCTTAAGCTCCACT-3 ′ SLPI, 5′-CCTTAAGAGCTGAAGCAAT-3 ′ IL-10, 5′-ACCAGCTGGACAACATACTGC-3 ′ y 5′-TCACTCTTCACCTGCTCCACT-3 ′ SLPI, 5′-CCTTAAGCTCCACT-3 ′ SLPI, 5′-CCTTAAGCTCCACT-3 ′ SLPI, 5′-CCTTAAGCCACT-3 ′ 5′-AAGAGCTGACCCAATGGTTG-3 ′ y 5′-GGATCCGGCAGTTAAGATCA-3 ′. La amplificación se realizó a 94 ° C, 60 ° C y 72 ° C durante 1 min para cada paso durante 30 ciclos. Se sometieron 10 µl de productos de amplificación a electroforesis en un gel de agarosa al 2% que contenía bromuro de etidio para visualización. La cuantificación se realizó utilizando el software Image (Scion).

Cultivo de mpc humano.

Los componentes de los medios de cultivo se adquirieron de Invitrogen. Se cultivaron mpcs humanas a partir de muestras de músculo en el momento de la cirugía correctiva, de conformidad con la legislación francesa (Code de la Santé Publique, livre II), como se describió anteriormente (26).

Cultivo de células MP humanas.

Los MP se diferenciaron de los OM aislados de sangre humana, como se describió anteriormente (26). Los MP diferenciados se cultivaron adicionalmente en medio RPMI 1640 que contenía FBS al 15% o en medio RPMI 1640 avanzado que contenía FBS al 0,5% (suplementado con piruvato de sodio al 1%, Hepes 10 mM, β-mercaptoetanol 50 μM, 1% de aminoácidos no esenciales, 100 × 1 % de vitaminas). Los MP se trataron, o no, durante 48 h con 1 μg / ml de LPS (Sigma-Aldrich) y 10 ng / ml de IFN-γ (PeproTech), o 10 ng / ml de IL-4 (PeproTech) o 80 ng / ml DEX (Sigma-Aldrich) y 10 ng / ml de IL-10 (PeproTech).

Fagocitosis.

La necrosis mpc fue inducida por H2O tratamiento durante 1 ha 37 ° C. El 100% de las células fueron positivas para yoduro de propidio. Se sembraron mpcs necróticos en MP (cinco mpcs muertas para un MP) durante 3 ha 37 ° C. Los cultivos de MP se lavaron tres veces para eliminar el material no ingerido y se cultivaron adicionalmente en medio complementado con RPMI 1640 avanzado sin suero durante 24 h para preparar el medio acondicionado. En algunos experimentos, las células se trataron, como se describió anteriormente, con 10 μg / ml de colchicina (Sigma-Aldrich) (40), 1 μg / ml de citocalasina D (Sigma-Aldrich) (41) o 40 μg / ml de anexina V recombinante. (BD Biociencias) (42). La fagocitosis se cuantificó en las mismas condiciones después de la incubación con microesferas fluorescentes (como se describe en Etiquetado de OM de sangre). El número de células LX + se cuantificó bajo un microscopio invertido y se expresó como el porcentaje de células totales.

Co-culturas.

Las mpcs se sembraron en cultivos de MP previamente preparados (relación MP / mpc 3: 1) en medio suplementado con RPMI 1640 avanzado, excepto en algunos experimentos en los que las MP y las mpcs se sembraron juntas antes de aplicar el tratamiento con MP, como se describe en Cultivo de células MP humana.

Comportamiento de mpc.

El crecimiento de mpc se evaluó como se describió previamente (26). La proliferación de mpc se estimó mediante la incorporación de BrdU (Roche Diagnostics GmbH). La diferenciación de mpc se evaluó contando el número de células de miogenina + entre las células desmina +. La fusión de mpc se estimó contando el número de núcleos por miotubo.

Análisis estadístico.

Todos los experimentos se realizaron utilizando al menos tres cultivos o animales diferentes en experimentos independientes. Los estudiantes t La prueba se utilizó para los análisis estadísticos. P & lt 0,05 se consideró significativo.


Ver el vídeo: THE INFLAMMATORY RESPONSE (Agosto 2022).