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¿Qué canales iónicos de marcapasos pueden trabajar en frecuencias muy bajas en extrasístole?

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A frecuencia 0-3 Hz. Como procesadores de computadora que pueden trabajar a bajas frecuencias y controlar subtensión y sobretensión.

Los canales normales más importantes son Ca2 + y K + que están cambiando. Sin embargo, no estoy convencido de que puedan funcionar con frecuencias tan bajas. Debe haber otros canales que estén activando la extrasístole.

¿Qué canales iónicos de los marcapasos pueden funcionar en 2-3 Hz desencadenando extrasístole?


Creo que ninguno. Es un rango de frecuencia tan específico que las posibles fuentes son

  • sistema nervioso autónomo y
  • algún arco reflejo.

Además, la frecuencia es lógicamente baja con activación autónoma. Mi conjetura es que sympaticus inicia extrasístoles. Creo que debe pasar por algún arco reflejo para ser tan específico.


Función de canal iónico en acción Generación de potencial: perspectiva actual

Hace más de 50 años, Hodgkin y Huxley sentaron las bases de nuestra comprensión actual de los canales iónicos. Se ha logrado un progreso impresionante durante los años siguientes que culminó con la revelación de los detalles de la estructura del canal de potasio. Sin embargo, incluso hoy, no podemos separar bien las corrientes registradas en las neuronas centrales de los mamíferos. Muchos conceptos modernos sobre la función de las corrientes de sodio y potasio se basan en experimentos realizados en células de no mamíferos. El reconocimiento reciente de la corriente rectificadora retardada rápida indica que necesitamos reevaluar el papel biofísico de las corrientes de sodio y potasio. Esta revisión considerará datos de pinzamiento de voltaje de alta calidad obtenidos del soma de neuronas de mamíferos centrales en vista de nuestro conocimiento actual sobre proteínas que forman canales iónicos. Las corrientes rápidas de sodio y tres tipos de corrientes de potasio de salida, el rectificador retardado, el subumbral tipo A y las corrientes de potasio tipo D, se describen aquí. Se proporciona una clasificación actual actualizada con el papel biofísico de cada subtipo actual. Esta revisión muestra que los detalles de la cinética de las corrientes de sodio y potasio de salida difieren significativamente de las descripciones clásicas y estas diferencias pueden ser de importancia funcional.

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Abstracto

La actividad del marcapasos eléctrico impulsa las contracciones peristálticas y segmentarias en el tracto gastrointestinal. Las células intersticiales de Cajal (ICC) son responsables de la actividad espontánea del marcapasos. Los ICC permanecen rítmicos en la cultura y generan corrientes de entrada independientes del voltaje a través de una conductancia catiónica no selectiva. La liberación de Ca 2+ del retículo endoplásmico y la captación por las mitocondrias inicia las corrientes de marcapasos. Este nuevo mecanismo proporciona la base para la ritmicidad eléctrica en los músculos gastrointestinales.

El aparato ritmoneuromuscular del tracto gastrointestinal (GI) es más complicado que un sincitio de células musculares lisas inervadas por neuronas motoras. Durante muchos años, los estudios morfológicos de la tunica muscularis observaron la presencia de células especializadas adicionales que se conocen comúnmente como células intersticiales de Cajal (ICC). Los CCI se encontraron con frecuencia en estrecha asociación con los nervios y, en muchos casos, se describieron como "intercalados" entre las terminales nerviosas y las células del músculo liso (2). También se observó que ICC formaba conexiones de unión gap entre sí y con las células de músculo liso vecinas. Así, el sincitio eléctrico de la túnica muscular del tracto gastrointestinal está compuesto por al menos dos tipos de células. La morfología también sugirió que la inervación del músculo liso podría ser indirecta y ocurrir principalmente a través de estructuras similares a sinapsis entre los nervios y la CCI. Estos estudios fueron interesantes y estimulantes, pero solo fue posible especular sobre la función de la CCI a partir de análisis morfológicos.

El trabajo intensivo en modelos animales (principalmente ratón, conejillo de indias y perro) durante la última década ha proporcionado evidencia fisiológica de que ICC proporciona la actividad de marcapasos típica de los músculos GI fásicos del estómago, intestino delgado y colon (es decir, ondas eléctricas lentas cf . Ref. 9). Los ICC de marcapasos se encuentran generalmente en la región del plexo mientérico en el espacio entre las capas musculares circular y longitudinal. Nos referimos a las células de la región mientérica como IC-MY. Los ICC a lo largo de la superficie submucosa de la capa de músculo circular en el colon (IC-SM) también pueden generar actividad de marcapasos, particularmente en animales más grandes como el perro. IC-MY e IC-SM forman redes extensas dentro de las regiones de marcapasos. Estas células también se extienden a la mayor parte de las capas musculares en los tabiques que dividen los haces de células del músculo liso. Por tanto, la actividad del marcapasos no se limita necesariamente a las regiones mientérica y submucosa del marcapasos, sino que estos marcapasos son dominantes en los músculos intactos. Los procesos finos del ICC del marcapasos se interconectan a través de uniones gap, y también se realizan conexiones eléctricas con las células vecinas del músculo liso. Por lo tanto, los eventos eléctricos que ocurren en ICC son capaces de conducir a las células del músculo liso. Los registros simultáneos de actividad eléctrica de IC-MY y las células del músculo liso cercanas han demostrado que la actividad eléctrica ocurre primero en IC-MY y luego inicia respuestas eléctricas en las células del músculo liso (3). Las conexiones entre ICC son necesarias para la propagación regenerativa de ondas lentas, y la extensión de las redes ICC en los tabiques entre haces musculares puede proporcionar vías de propagación para la transmisión de ondas lentas a través de la túnica muscular (quizás análoga a las fibras de Purkinje en el corazón). Las redes de IC-MY y algunas de las características ultraestructurales de IC-MY se muestran en la Fig.1.

FIGURA 1. Características morfológicas de las células intersticiales marcapasos de Cajal (ICC) e ICC implicadas en la neurotransmisión. A: red de ICC mientérico (IC-MY) en antro gástrico murino inmunoteñido con un anticuerpo anti-Kit. Múltiples procesos se extienden desde los cuerpos celulares (flechas). B: micrografía electrónica de baja potencia (EM) que muestra la posición de IC-MY dentro de la región del plexo mientérico. Es probable que un gran tronco nervioso (mg) sea un conectivo interganglionar del plexo mientérico. CM, flecha circular de la capa muscular, ICC adyacente al CM. Una gran cantidad de perfiles mitocondriales llenan la parte de la imagen del IC-MY. C: EM de mayor potencia de una parte del IC-MY en B. Tenga en cuenta un gran número de perfiles mitocondriales (m) y asociaciones muy estrechas entre las mitocondrias y la membrana plasmática. Tenga en cuenta también el retículo sarcoplásmico (puntas de flecha SR) y los frecuentes contactos estrechos entre SR y mitocondrias. D: marcapasos ICC en cultivo doble marcado con anticuerpo Kit (rojo) y MitoTracker verde FM (verde). Los píxeles con ambas etiquetas aparecen en amarillo. Las mitocondrias están ampliamente distribuidas por los cuerpos celulares (flechas) y los procesos (puntas de flecha) del ICC del marcapasos. mi: ICC intramuscular (IC-IM) de fondo gástrico murino marcado doblemente con anticuerpos contra Kit (flechas verdes) y transportador vesicular de acetilcolina (puntas de flecha rojas). Tenga en cuenta la estrecha asociación entre las neuronas motoras colinérgicas y IC-IM. Un solo proceso neural inerva múltiples IC-IM (*). F: montaje EM de un IC-IM y su relación con una terminal nerviosa que contiene óxido nítrico sintasa (NOS *). Tenga en cuenta el contacto muy estrecho, similar a una sinapsis, entre las neuronas NOS y el IC-IM (flecha). También se muestra un espacio de unión entre el IC-IM y una célula de músculo liso vecina (punta de flecha). GRAMO: Conexión de empalme de separación de detalles EM de mayor potencia entre IC-IM en F y célula de músculo liso. H: imagen de mayor potencia de una estructura sináptica entre el IC-IM y una terminal nerviosa motora que contiene NOS (flecha) que se muestra en F. Yo: conexión similar de tipo sináptico (flecha) entre un IC-IM y una neurona motora que contiene inmunorreactividad vesicular de tipo transportador de acetilcolina (*). F — yo se reproducen de la Ref. 14.

También se pueden encontrar otros tipos de ICC en los músculos GI. Los ICC se entremezclan con las fibras de las capas musculares circulares y longitudinales del esófago, el estómago, el colon y los esfínteres. Los hemos llamado ICC intramuscular (IC-IM). Las IC-IM están estrecha y extensamente asociadas con las fibras nerviosas del sistema nervioso entérico (1) y forman conexiones similares a sinapsis muy cercanas (& lt20 nm) con las terminales nerviosas varicosas de las neuronas motoras excitadoras e inhibidoras. Es probable que las células con características similares, llamadas IC-DMP, sean un tipo especializado de IC-IM y se encuentren en la región del plexo muscular profundo en el intestino delgado. IC-IM y asociaciones con neuronas entéricas se ilustran en la Fig.1, E – I.

IC-IM e IC-DMP están funcionalmente inervados y parecen mediar una parte significativa de la información motora del sistema nervioso entérico. En ratones mutantes que carecen de IC-IM, la estimulación de campo de las neuronas intrínsecas en el estómago dio como resultado respuestas postuniónicas muy reducidas a la estimulación nerviosa colinérgica y nitrérgica (1, 14). Aunque el papel de la CCI en la neurotransmisión es extremadamente importante en la motilidad GI, esta breve revisión se centrará en los nuevos hallazgos sobre cómo la CCI genera ritmicidad eléctrica. IC-IM e IC-DMP pueden tener o no la capacidad de generar corrientes similares a marcapasos, pero estas células juegan un papel extremadamente importante en la regulación de la respuesta del músculo liso a la actividad del marcapasos.


Abstracto : La interacción entre un oscilador de membrana generado por canales iónicos dependientes de voltaje y un oscilador de señal de calcio intracelular estuvo presente en los primeros modelos (1984 a 1985) utilizando representaciones del retículo sarcoplásmico. La liberación oscilatoria de calcio es inherente al proceso de liberación de calcio inducido por calcio. Estos resultados históricos apoyan plenamente la síntesis propuesta en los artículos de esta serie de revisión. Los mecanismos del oscilador no compiten principalmente entre sí. Sin embargo, existe cierta asimetría: el oscilador de membrana puede continuar indefinidamente en ausencia del oscilador de calcio. Lo contrario parece ser cierto solo en condiciones patológicas. Los estudios del trabajo a nivel de tejido y sobre el desarrollo del corazón también proporcionan información valiosa sobre la acción integradora del marcapasos cardíaco.

Los primeros modelos de ritmo cardíaco, comenzando con el de Noble, 1 se restringieron a las interacciones entre los canales iónicos de la membrana de la superficie. El primer modelo de células cardíacas que incorporó el sistema de señalización de calcio intracelular involucrado en el acoplamiento de excitación-contracción fue el de DiFrancesco y Noble. 2 Ese modelo fue desarrollado para fibras de Purkinje de oveja, y fue el primero en predecir un papel importante para la corriente de intercambio de sodio / calcio durante el potencial de acción. De hecho, identificó los componentes más lentos de la corriente de entrada que previamente se habían atribuido a la corriente del canal de calcio como atribuibles en su lugar al intercambiador. La actividad del marcapasos en ese modelo se atribuyó casi en su totalidad a la lenta aparición de la corriente catiónica inespecífica, iF, activado por hiperpolarización. En ese caso, no se predijo que la corriente de intercambio desempeñara ningún papel en el ritmo del marcapasos.

Sin embargo, el modelo de fibra DiFrancesco-Noble Purkinje se desarrolló casi de inmediato para crear el primer modelo matemático para reproducir formas de onda de voltaje similares a las observadas en las células del nodo sinoauricular (SAN) de conejo. 3 También se desarrolló posteriormente para crear los primeros modelos de células auriculares de conejo. 4,5 Para los mecanismos de señalización del calcio intracelular, los modelos de la década de 1980 se basaron en el trabajo de Fabiato sobre la liberación de calcio inducida por calcio. 6

La base experimental del modelo SAN fue el trabajo de Brown et al, 7,8 que reveló la presencia de componentes muy lentos de la corriente de entrada similar a la predicha para la corriente de intercambio sodio / calcio durante el potencial de acción. De hecho, el modelado dio confianza en que estas grabaciones experimentales no eran artefactos de sujeción de voltaje.

Uno de los colaboradores en ese trabajo experimental, Junko Kimura, colaboró ​​posteriormente con Akinori Noma para medir la dependencia del voltaje y la concentración de iones de la corriente de intercambio sodio / calcio en condiciones altamente controladas. 9,10 Los resultados coincidieron notablemente con las ecuaciones utilizadas en los modelos. Se puede ver que todos los desarrollos posteriores de modelos de señalización de calcio y de intercambio de sodio / calcio en el corazón derivan de los modelos de la década de 1980.

Entre los resultados experimentales sobre la SAN de conejo, hubo 2 hallazgos importantes que se relacionan con las controversias actuales. La primera fue que, al investigar las corrientes de entrada durante las despolarizaciones de pinza de voltaje, a menudo se observaron 2 componentes claros. Basado en el trabajo de modelado, el primero de estos se atribuyó a la activación de la corriente de calcio tipo L (llamada Isi en trabajos iniciales), mientras que el segundo componente, mucho más lento, se atribuyó a la activación del intercambio sodio / calcio durante la liberación de calcio después de la aparición del potencial de acción.

El modelo de computadora reprodujo correctamente estos 2 componentes (ver Figura 9 en Brown et al 8). Esos cálculos originales se realizaron utilizando OXSOFT HEART. Hemos repetido los cálculos para este artículo utilizando el software COR (www.cor.physiol.ox.ac.uk) disponible públicamente y la versión codificada CellML del modelo descargado del repositorio de modelos CellML (www.cellml.org). Los resultados se muestran en la Figura 1. Son muy similares a la figura original pero la amplían al revelar las contribuciones separadas de ICalifornia y INaCa. El trabajo experimental posterior 11 confirmó completamente las predicciones de los modelos con respecto a la corriente de intercambio de sodio / calcio durante el potencial de acción.

Figura 1. Corrientes de intercambio de sodio / calcio en el modelo de DiFrancesco-Noble (1985). 2 Arriba (A), Resultados experimentales obtenidos por Kimura et al 1987 utilizando células ventriculares de cobaya. 10 Corriente de intercambio en el modo de entrada (correspondiente a la entrada de sodio y la salida de calcio) en función del potencial de membrana a diferentes concentraciones de iones de sodio extracelulares. Arriba (B), Curvas correspondientes calculadas a partir de las ecuaciones utilizadas para la corriente de intercambio sodio / calcio en el modelo (tenga en cuenta que estos resultados se obtuvieron antes que los experimentales). Fondo, Variaciones de corrientes iónicas (IK, ICoste y flete [ahora ICalifornia], IF, y INaCa) durante la acción calculada y los potenciales de marcapasos. Nótese la importante corriente de intercambio hacia adentro predicha durante la meseta del potencial de acción. Este cálculo se realizó para este artículo utilizando COR y es exactamente el mismo que el publicado en 1985.

Habiendo establecido el rendimiento de esos modelos en lo que respecta al potencial de acción, pasamos ahora a la despolarización del marcapasos. Ésta es la pregunta crítica. Durante las despolarizaciones por pinzamiento de voltaje, la corriente de intercambio de sodio / calcio, que refleja el curso temporal del calcio intracelular transitorio, siguió invariablemente el inicio y la inactivación de la corriente del canal de calcio. Por el contrario, esta relación temporal a menudo se invirtió durante la despolarización del marcapasos. La Figura 2 muestra el protocolo experimental utilizado para revelar esto en el trabajo de 1984. La despolarización natural del marcapasos se interrumpió en varios momentos fijando el voltaje al alcanzado en el momento del inicio de la pinza. Si este tiempo fue lo suficientemente tarde (aproximadamente, durante el último tercio de la despolarización del marcapasos), se registró una corriente de entrada lenta cuyo curso de tiempo se asemejaba al componente lento registrado durante las despolarizaciones estándar de pinza de voltaje. Sin embargo, no hubo una activación anterior visible de la corriente de calcio. Se interpretó que esto indicaba la posibilidad de que la liberación de calcio durante la actividad del marcapasos del nódulo sinusal pudiera preceder a la activación de la corriente de calcio, como lo observaron Lakatta et al. 12 La Figura 2 muestra nuevos cálculos de este fenómeno utilizando COR y el archivo CellML descargado para el modelo SAN de 1984.

Figura 2. Liberación de calcio que precede a la activación de ICaL. Arriba a la izquierda, Uno de los registros experimentales realizados en el nódulo sinoauricular de conejo por Brown et al (Figura 9 en el artículo, 8 traza a -44 mV). Se permitió que el potencial de membrana cambiara espontáneamente durante un potencial de acción y durante la mayor parte de la despolarización posterior del marcapasos. Cerca del final de esta despolarización, pero claramente antes de la subida del potencial de acción, el potencial de membrana estaba sujeto al potencial alcanzado. Se registró una corriente interna transitoria lenta, cuyo inicio es mucho más lento que el de la corriente de calcio tipo L. Requiere ≈100 ms para alcanzar su pico. Abajo a la izquierda, Protocolo de voltaje utilizado para repetir la simulación de 1984 de estos resultados utilizando el modelo SAN desarrollado a partir del modelo DiFrancesco-Noble. La escala vertical está en milivoltios. La escala horizontal está en segundos. Parte superior derecha, Corrientes iónicas netas calculadas correspondientes a los tres niveles del potencial de pinza en el protocolo de abajo a la izquierda. La sujeción en el medio de la despolarización del marcapasos simplemente genera un desarrollo suave de la corriente interna neta correspondiente a la desintegración de IK y comienzo de IF. La curva media (interrumpida) genera una corriente interna transitoria lenta similar a la de la traza experimental (arriba a la izquierda). los curva punteada genera un pico doble cuando la corriente de calcio tipo L. comienza a activarse. La escala vertical está en nA escala horizontal en segundos. Abajo a la derecha, Variaciones calculadas en la corriente de intercambio de sodio / calcio durante los tres protocolos de voltaje.

Por tanto, la esencia de la hipótesis de Lakatta estuvo presente en las primeras simulaciones de la señalización del calcio en las células cardíacas.

¿Por qué Brown et al no atribuyeron la despolarización del marcapasos en sí a este mecanismo? La razón principal fue que, aunque en los experimentos se registraron a menudo corrientes iónicas de entrada lentas de este tipo, casi siempre se extinguieron después de 1 o 2 oscilaciones. Por tanto, el mantenimiento del oscilador de señal de calcio no era independiente del oscilador de corriente iónica dependiente del voltaje.

Tabla 2. Abreviaturas y acrónimos no estándar

¿Cómo interactúan los diferentes osciladores?

Para investigar la contribución de las diversas corrientes de iones, comparamos los resultados de simulación de los 6 modelos matemáticos de células SAN disponibles en el repositorio CellML: Demir et al, 12a Dokos et al, 12b Kurata et al, 12c Maltsev y Lakatta, 12d Noble y Noble, 12e y Zhang et al. 12f Para mayor claridad de las figuras, mostramos solo los resultados de los últimos 4 modelos en las figuras, pero incluimos los resultados de todos los modelos en el texto.

La Figura 3 muestra el potencial de membrana, la concentración de calcio intracelular y las corrientes de entrada que los modelos tienen en común: Corriente de tipo L de Ca 2+ (ICalifornia), Intercambiador de Na + / Ca 2+ (INaCa), corriente divertida (IF), y la corriente de sodio de fondo (IbNa).

Figura 3. Resumen de modelos, oscilaciones y corrientes subyacentes. Tenga en cuenta que IF(línea continua en los gráficos inferiores) es siempre la más pequeña de las corrientes de entrada (ICalifornia, INaCa, IbNa, y IF).

los ICalifornia muestra la mayor amplitud de las corrientes en todos los modelos, y la máxima INaCa la corriente es mayor que IF y IbNa, excepto en el modelo de Zhang, que tiene una concentración de calcio intracelular constante para simplificar el modelo. IF es en todos los modelos más pequeño que el IbNa.

Cuando ahora bloqueamos las diversas corrientes, una a la vez (ver Figura 4), ¿qué sucede con las oscilaciones del potencial de membrana (y del calcio) en los modelos de células SAN? Todos los modelos (Demir, Zhang, Maltsev, Dokos, Noble, Kurata) coinciden en la importancia de ICalifornia: sin activación de esta corriente de calcio, las oscilaciones SAN no se producen. Los modelos están de acuerdo con la observación experimental de que sin absorción o liberación de calcio del retículo sarcoplásmico (SR), las oscilaciones no se detienen (y un aumento del 2% en la corriente de sodio de fondo conduce a que no falten latidos en el modelo de Maltsev). Además, bloque completo de IF no detiene las oscilaciones en ninguno de los modelos.

Figura 4. El voltaje se rastrea cuando una o varias corrientes del modelo están completamente bloqueadas en t = 2 segundos. Las filas denotan bloque de ICalifornia y IGato, de INaCa, de las corrientes de fondo (ver más abajo), de IF, y de Ihasta. Los latidos que faltan en el modelo de Maltsev en el bloque de SERCA desaparecen cuando IbNa se incrementa en un 2%. "Corrientes de fondo" bloqueadas en los modelos respectivos: Maltsev (IbCa y IbNa), Kurata (IbNa y IS tN / A), Zhang (IbCa y IbNa), Dokos (IbNa y IN / A).

Entonces, es solo ICalifornia necesario para las oscilaciones? ¿Qué está causando realmente las oscilaciones en los modelos? En todos los modelos, existe una serie de corrientes internas de fondo o sostenidas (IbNa, IbCa, IS t), y ponerlos a cero suprime o disminuye las oscilaciones en 4 de los modelos (Kurata, Maltsev, Noble, Demir) ¿significa eso que las corrientes de fondo pueden ser más importantes que IF y el ciclo de Ca 2+ intracelular? Claramente, estamos tratando aquí con un sistema multifactorial en el que incluso corrientes iónicas que no muestran propiedades dinámicas intrínsecas (que es la definición de una corriente de "fondo") o corrientes que aún no se han caracterizado completamente (como IS t) juegan un papel cuantitativo importante. IS t Guo et al (1995) lo caracterizaron por primera vez como una corriente de entrada sostenida de Na +, que está activa durante la fase de despolarización, pero debido a la falta de disponibilidad de un bloqueador específico, ha sido imposible investigar la importancia de esta corriente en células SAN completas. .

La eliminación de INaCa también suprime las oscilaciones (en todos los modelos, excepto en el modelo de Zhang, que tiene concentraciones de iones fijas). INaCa la mayor parte del tiempo es una corriente de entrada que expulsa Ca 2+ de la celda (ver Figura 4). Al establecer adicionalmente la concentración de SR Ca 2+ para constante el bloqueo de INaCa solo cambia la frecuencia, pero no elimina las oscilaciones por completo. Por lo tanto, es la sobrecarga de Ca 2+ resultante con total INaCa bloque que conduce a la terminación de las oscilaciones. Como también existen otras bombas e intercambiadores en las celdas SAN para extruir Ca 2+ de la celda (evitando la sobrecarga de Ca 2+), que no están presentes en los modelos matemáticos, no está claro si el bloque completo de INaCa aboliría las oscilaciones en las células reales.

El análisis de sensibilidad del período SAN con respecto al bloqueo de corrientes de iones y bombas se realizó en el estado estacionario del modelo (300 segundos después del cambio). La Tabla muestra que los modelos muestran consistentemente un aumento en el período de 0,7 a 1,87%, 0,77 a 4,82%, 0,14 a 0,83% y 0,83 a 1,34% con un bloque de 10% IGato, IbNa, IF, y IS t, respectivamente. Las corrientes y bombas relacionadas con el sistema de calcio intracelular muestran resultados bastante diversos para los diferentes modelos (bloque de ICalifornia, INaCa, y Ihasta condujo a una disminución en el período en Demir versus un aumento en Maltsev). Suponemos que esta falta de consistencia es atribuible a las diferencias en el manejo del calcio en los modelos.

Tabla 1. Análisis de sensibilidad del período SAN

En general, se pueden observar las mayores sensibilidades para IbNa/IS t y viene el segundo IGato (ignorando los valores inconsistentes para ICalifornia). El modelo de Maltsev proporciona una excepción, con Ihasta inducir el mayor cambio en el período (seguido de IbNa y IGato).

Un análisis de bifurcación podría proporcionar más información sobre el comportamiento dinámico de los modelos, pero estaría más allá del alcance de este artículo. Tenga en cuenta también que todos los resultados detallados deben interpretarse con precaución porque los modelos no se han ajustado y construido para este tipo de investigaciones, es decir, el análisis podría estar fuera del rango predictivo de los modelos.

Los modelos sugerirían 3 características importantes de acción concertada que conducen y mantienen las oscilaciones en las células SAN: la fase de despolarización lenta a través de corrientes de entrada (IF, IS t, [IbNa]), activación de las corrientes de calcio hacia el interior (ICalifornia, IGato), extrusión de calcio (INaCa, IpCa?). La importancia de la liberación de SR podría residir en la estabilización de las oscilaciones a través de frecuencias como lo indicaron Maltsev y Lakatta, 12d, pero en su artículo, también muestran que la liberación de SR no está realmente impulsando las oscilaciones (ver Figura 5C en su artículo).

Perspectivas de los estudios de tejidos y del desarrollo del corazón

Los estudios que hemos comentado hasta ahora se centran en el nivel de los canales iónicos y la integración de su actividad en el nivel de las células individuales. Las otras contribuciones a este tema hacen valiosas contribuciones al debate a nivel tisular, particularmente en lo que respecta al uso de imágenes con indicadores sensibles al voltaje o al calcio 13 y los conocimientos que surgen del estudio del desarrollo de los tejidos del marcapasos. 14

Estos estudios muestran que la fisiología integradora de la actividad del marcapasos no termina con el análisis de la actividad celular. De hecho, ha sido evidente desde el primer trabajo de mapeo electrofisiológico que el nodo sinusal actúa como algo más que unos pocos miles de células que laten en sincronía. Dependiendo de las condiciones fisiológicas precisas, el origen aparente de la actividad del marcapasos puede cambiar de una región del nodo a otra. 15-17 Nos referimos al “origen aparente” porque sería una simplificación excesiva suponer que el área que conduce la despolarización determina de manera única lo que sucede (ver también en otra parte 18). La corriente eléctrica fluye entre dos celdas conectadas que se encuentran a diferentes potenciales, y esta corriente debe influir en las celdas principales (ralentizándolas) tanto como influye en las celdas seguidoras (acelerándolas). Los primeros cálculos de la interacción de célula a célula en el nodo sinusal utilizando computadoras paralelas mostraron que incluso una conectividad muy baja (solo unos pocos canales de conexina entre cada célula) podría sincronizar las células con ritmos inherentemente diferentes. 19-21 Estos cálculos también revelaron que las células con un ritmo intrínsecamente rápido, ubicadas en la periferia del nodo, y que por lo tanto 'conducirían' la despolarización en un nodo aislado, se convierten en las células seguidoras cuando el nodo está conectado a la aurícula. . Boyett y sus colegas demostraron experimental y computacionalmente 22 que aislar el nodo sinusal altera la dirección de propagación, con las células principales cambiando del centro a la periferia, y un trabajo más reciente de Boyett y sus colegas ha enfatizado aún más cómo la arquitectura del nodo influye en su función. 23 La anatomía y la fisiología interactúan necesariamente a nivel de los tejidos. Un valioso conjunto de ideas del debate entre Efimov y Federov versus Joung y Lin en Investigación de circulación 13 es que el origen del impulso es multicéntrico y que las células individuales y el nódulo intacto reaccionan de manera diferente a los fármacos y a los cambios genéticos.

¿El trabajo a nivel de tejido arroja algo de luz sobre las funciones relativas de la membrana y las oscilaciones generadas por el calcio? Este es el foco central del debate entre Efimov y Federov versus Joung y Lin. En principio, el uso de marcadores sensibles al voltaje para buscar múltiples formas de onda podría ser una contribución importante. Y, de hecho, los tintes sensibles al voltaje dan resultados que difieren de los registros de microelectrodos. Efimov y Federov atribuyen esto al hecho de que los tintes registran desde una región extendida que puede incluir células y tejidos de diferentes tipos y, por lo tanto, necesariamente dan resultados compuestos. En contra de esto, Joung y Lin señalan el hecho de que las imágenes de calcio confocal a veces pueden mostrar cambios de calcio que conducen a cambios de voltaje hacia el final de la despolarización del marcapasos, particularmente en presencia de isoproterenol. Será difícil analizar un conjunto tan complicado de interrelaciones. Coincidimos con la observación de que el trabajo futuro “requerirá una estrecha colaboración entre los modeladores matemáticos y los experimentadores para diseccionar el papel de los componentes individuales” 13, pero agregaríamos que “diseccionar” ya sesga el análisis. En los sistemas interactivos no lineales, atribuir roles relativos a diferentes componentes puede ser engañoso. Lo que importa es la función "integradora". Como también se señaló en ese estudio, los diferentes mecanismos funcionan de manera sinérgica. Debido a la no linealidad, esto significa necesariamente que la atribución de las contribuciones cuantitativas de los componentes individuales depende del contexto fisiológico y patológico. Este contexto incluye el hecho de que el flujo de información entre el genoma y el fenotipo no es unidireccional. El fenotipo no es un producto estático de sus genes (revisado en otra parte 24,25). Hay retroalimentación descendente del fenotipo para controlar la expresión génica. En esta serie de reseñas hay disponibles buenos ejemplos, que incluyen, en particular, la regulación a la baja de 2 corrientes importantes de marcapasos, IF y IKs, durante las taquiarritmias auriculares. Por lo tanto, la actividad en la aurícula puede remodelar el perfil de expresión génica en el nódulo sinusal.

La remodelación de la expresión génica nos lleva naturalmente a considerar la otra contribución importante a este número específico de la revista porque, como muestran Christoffels et al 14, el desarrollo del corazón depende de la supresión de la expresión génica a medida que el embrión se convierte en adulto. Todos los miocitos cardíacos en el embrión temprano muestran ritmo de marcapasos. El cambio a las formas adultas se produce mediante la represión de los patrones de expresión génica que se desarrollan para permitir que las células miocárdicas adultas en funcionamiento se diferencien. Como consecuencia, las células marcapasos adultas se parecen a las del embrión temprano. Por tanto, la identificación de los represores transcripcionales implicados es un objetivo importante. Como muestran Christoffels et al, esta es un área de rápido desarrollo y contiene la promesa de que eventualmente conoceremos la base molecular del desarrollo embrionario del corazón. Estos conocimientos también serán importantes para comprender la función adulta porque hay un recambio continuo de la expresión génica. Ponard et al 18 han demostrado recientemente que las variaciones en los niveles de expresión durante la renovación de los canales iónicos desempeñan un papel en la variabilidad de la frecuencia cardíaca utilizando una combinación de cultivos de miocitos y modelos informáticos.

Conclusiones

Los datos experimentales y el trabajo de modelado in silico muestran la complejidad del sistema multifactorial de excitación SAN. La contribución de IF y su importancia como objetivo farmacéutico ha sido probada por el desarrollo exitoso de la ivabradina y se describe con más detalle en el artículo de revisión de DiFrancesco 26 en esta serie de revisión. Otras corrientes parecen estar involucradas en la fase de despolarización (IS t, corrientes mecanosensibles 27 y otros) cuyas contribuciones relativas aún están por determinar.

Parece casi obvio que también la aceleración rápida al final de la fase de despolarización tiene un gran impacto en la frecuencia de despolarización mediante el ajuste del umbral de activación. La evidencia presentada por Lakatta et al 12 en esta serie de revisión subraya también la influencia de la liberación de SR Ca 2+ en la generación de la carrera ascendente (además de IGato y ICalifornia), mostrando en extremo similitudes con las posdespolarizaciones tardías.

Ya, el trabajo experimental y de modelado más temprano mostró (consistente con los hallazgos actuales) que ninguno de los dos IF ni la liberación espontánea de Ca 2+ del SR por sí sola es o puede estar impulsando la actividad de marcapasos. Siempre es necesaria una acción concertada e interacción entre los diversos canales iónicos. Además, la regulación de la frecuencia cardíaca a través de cAMP está influenciada e influye en múltiples canales de iones, bombas e intercambiadores, creando así un sistema robusto y estable, pero aún flexible, que mantiene los miles de millones de latidos cardíacos en una vida normal.

El trabajo futuro probablemente descubrirá incluso más mecanismos que influyen en la frecuencia cardíaca que podrían ser objetivos aún más relevantes en enfermedades y patologías específicas que las vías conocidas actualmente.

Original recibido el 12 de febrero de 2010 revisión recibida el 27 de abril de 2010 aceptado el 28 de abril de 2010.

Recursos de fondos

El trabajo en el laboratorio de los autores está financiado por la Unión Europea (Framework 6, BioSim y Framework 7, VPH-PreDiCT) y la British Heart Foundation.


RESULTADOS

Cinética monocanal de los canales GIRK1 / 5 y GIRK1 / 4

La inyección de ARN GIRK1 provoca la aparición de canales GIRK funcionales en Xenopus ovocitos (Dascal et al. 1993 Kubo et al. 1993), debido a la presencia de proteína GIRK5 endógena que forma heterómeros con GIRK1 (Hedin et al. 1996). Los canales GIRK1 / 5 son un modelo conveniente para la investigación porque su baja densidad en la membrana de los ovocitos, muy probablemente el resultado de una disponibilidad limitada de GIRK5, permite la selección de registros con un solo canal. Por lo tanto, comenzamos este estudio con un análisis cinético de GIRK1 / 5. Los ovocitos se inyectaron con 500-1000 pg de ARN GIRK1, que siempre dio una expresión máxima alcanzable de corriente GIRK1 / 5 en registros de células completas (Vorobiov et al. No se muestran los datos de 1998). La actividad GIRK se midió en parches de adentro hacia afuera con ∼150 mM de KCl en ambos lados de la membrana y con 6 mM de NaCl, 4 mM de MgCl.2 y ATP 2 mM en el baño. Estas condiciones aseguran que no habrá un "deterioro" de la membrana de fosfatidilinositol bisfosfato (PIP2), que es necesaria para la actividad del canal (Sui et al. 1998 Huang et al. 1998). Cabe señalar que las grabaciones en parches unidos a células con ACh en la pipeta (datos no mostrados) revelaron dos características que socavaron un análisis significativo de un solo canal. Primero, incluso cuando el parche parecía ser de un solo canal, la escisión adicional en una solución de baño que contiene GTPγS o Gβγ aumentó la probabilidad de apertura del canal (PAGo) y generalmente reveló la presencia de más de un canal. En segundo lugar, a altas concentraciones de ACh (10 μM) el PAGo fue a menudo menor, y el tiempo medio cerrado más largo, que con concentraciones bajas de ACh (10-100 nM), lo que sugiere la participación de un proceso de desensibilización evocado por agonistas, que ha sido bien descrito tanto en células auriculares como en ovocitos (Bunemann et al. 1996 Vorobiov et al. 1998). Por lo tanto, optamos por analizar la compuerta del canal en parches extirpados utilizando G purificadoβγ, que no causó una desensibilización dependiente del tiempo (ver más abajo, Figuras 1 y 2) y dio una mayor PAGo, asegurando grabaciones reales de un solo canal (ver Discusión).

Análisis de la cinética de un canal GIRK1 / 4 activado por 20 nM Gβγ en un parche representativo

A, registro de la actividad del canal después de la activación por 20 nM Gβγ. GRAMOβγ se aplicó aproximadamente 1 min antes del comienzo del trazo superior. El final del trazo superior corresponde al momento en que se terminó el experimento. Las trazas media e inferior muestran segmentos del registro en una escala de tiempo expandida. B, distribución del tiempo abierto en el p.d.f. formulario. Se analizaron un total de & gt 5500 eventos. Para un ajuste exponencial, τ = 2.58 ms para un ajuste dos exponencial, τo1= 0,69 ms, ao1= 0,451 τo2= 4,14 ms, ao2= 0.548. C, distribución horaria cerrada. Se analizaron un total de & gt 5500 eventos. El histograma de tiempo cerrado con intervalos de tiempo logarítmicos se dibujó utilizando los parámetros del p.d.f. encajar (ver recuadro), como se explica en la Fig.1C. El recuadro muestra una gráfica de densidad de probabilidad y ajustes exponenciales de cuatro y cinco en el p.d.f. formulario. Para un ajuste de cuatro exponenciales, τc1= 0,63 ms, ac1= 0,417 τc2= 8,56 ms, ac2= 0,302 τc3= 129,5 ms, ac3= 0,231 τc4= 1085 ms, aC4= 0.049 para ajuste de cinco exponenciales, τc1= 0,564 ms, ac1= 0,377 τc2= 4,58 ms, ac2= 0,235 τc3= 26,32 ms, ac3= 0,172 τc4= 190 ms, ac4= 0,183 τc5= 1352 ms, ac5= 0.033. D, probabilidades abiertas de canales GIRK1 / 5 y GIRK1 / 4 activados por 20 nM Gβγ. mi, contribución de componentes de distribuciones de tiempos abiertos y cerrados al total de tiempos abiertos y cerrados. En D y mi, los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas ( PAG & lt 0,05).

Tanto en la configuración unida a las células como después de la escisión del parche, sin ningún agonista en la pipeta, se observaron niveles muy bajos de actividad basal.En los parches que posteriormente se verificó que contenían un solo canal, a menudo se observaron de una a cuatro aberturas por minuto. Adición de G recombinante purificado 20 nMβ1γ2 fue seguido, después de 0.2-2 min, por una activación robusta del canal (Fig.1A cf. Schreibmayer et al. 1996) caracterizado por ráfagas de aberturas separadas por períodos de duración variable durante los cuales no se detectaron aberturas (Fig.1Ab y C.A). Después de la activación completa por Gβγ (a juzgar por el ojo), la grabación se continuó sin interrupción a -80 mV durante 6-11 min. Por lo general, estaban presentes de cero a cuatro canales por parche, con electrodos de 1–1,8 MΩ de resistencia (diámetro interno, 3,5–2,5 μm). Trece de cincuenta parches que mostraron activación por Gβγ contenía un solo canal.

Para el análisis cinético, seleccionamos nueve registros en los que no hubo superposición de aperturas durante todo el tiempo del registro. La selección por este criterio asegura, con un alto nivel de confianza, la presencia de un solo canal en el parche (ver Discusión). Cada una de las grabaciones se sometió a un análisis cinético en el entorno Matlab utilizando el procedimiento descrito en los Métodos. Un ejemplo de dicho análisis se muestra en la Fig. 1. Distribución de tiempo abierto, presentada como un histograma de función de densidad de probabilidad (p.d.f.) en la Fig. 1B, podría ajustarse bien a una función biexponencial, con constantes de tiempo (τo1 y τo2) de ∼0,8 y 5 ms (consulte la Tabla 1 [enlace] para obtener más detalles). El ajuste con una sola exponencial no describió satisfactoriamente los datos.

GIRK1 / 4
GIRK1 / 5 (9 celdas) GIRK1 / 4 (4 celdas) Modo de ráfaga Bajo-PAGnorte modo GIRK1 / 4 + Gαi1(4 celdas)
Horarios abiertos
τo1 (Sra) 0.81 ± 0.11 0.71 ± 0.01 1.24 0.50 0.57
to1 (Sra) 0.23 ± 0.04 0.38 ± 0.05 0.86 0.41 0.35
ao1 0.30 ± 0.04 0.52 ± 0.06 0.698 0.81 0.605
τo2 (Sra) 5.00 ± 0.80 2.86 ± 0.52 4.07 2.63 3.59
to2 (Sra) 3.43 ± 0.52 1.40 ± 0.36* 1.23 0.50 1.42
ao2 0.70 ± 0.04 0.47 ± 0.06 0.302 0.19 0.395
Total to (Sra) 3.85 ± 0.55 1.98 ± 0.32 2.09 0.91 1.77
Horarios cerrados
τc1 (Sra) 0.54 ± 0.04 0.62 ± 0.02 0.67 0.93 0.78
tc1 (Sra) 0.27 ± 0.03 0.22 ± 0.02 0.30 0.22 0.34
ac1 0.503 ± 0.046 0.355 ± 0.029 0.444 0.239 0.438
τc2 (Sra) 3.97 ± 0.55 4.9 ± 0.95 5.67
tc2 (Sra) 0.64 ± 0.08 1.41 ± 0.38 2.36
ac2 0.171 ± 0.018 0.279 ± 0.051* 0.415
τc3 (Sra) 35.7 ± 5.05 31.4 ± 3.7 46.6 23.3 14.4
tc3 (Sra) 8.33 ± 2.04 6.73 ± 1.42 5.83 8.29 4.66
ac3 0.208 ± 0.030 0.209 ± 0.019 0.125 0.356 0.324
τc4 (Sra) 236 ± 61.4 240.4 ± 31 238.5 314.1
tc4 (Sra) 18.6 ± 2.5 31.3 ± 7.2 84.1 48.5
ac4 0.104 ± 0.014 0.128 ± 0.026 0.352 0.154
τc5 (Sra) 1432 ± 215 2200 ± 403 760 2637 6703
tc5 (Sra) 15.2 ± 2.2 54.6 ± 19.4* 11.87 138.7 561.3
ac5 0.013 ± 0.002 0.029 ± 0.012 0.016 0.053 0.084
Total tC (Sra) 43.4 ± 5.6 94.3 ± 25.2* 20.3 231.3 614.8
  • Datos en ráfaga y bajaPAGnorte los modos se agruparon de todas las celdas ( norte= 4) antes del análisis. * Diferencia estadísticamente significativa de GIRK1 / 5 ( PAG & lt 0,05).

La distribución del tiempo cerrado fue significativamente más compleja. Esta distribución se presenta en la Fig.1California en la forma en que se realizó el procedimiento de ajuste real (con intervalos de tiempo lineales de longitud variable, consulte Métodos) y en la forma más convencional de un histograma con intervalos de tiempo logarítmicos en la Fig.1Cb. Los ajustes exponenciales de los datos a una función de densidad de probabilidad se realizaron utilizando un algoritmo de máxima verosimilitud con dos, tres, cuatro o cinco exponentes. Se requirieron al menos cuatro componentes exponenciales para describir esta distribución, pero el ajuste de cinco exponenciales fue visiblemente mejor en la mayoría de las celdas (Fig.1Cb). Las constantes de tiempo características τc1 a τc5 fueron, en promedio, aproximadamente 0,5, 4, 36, 236 y 1432 ms (Tabla 1 [enlace]). (Algunos cierres muy largos de & gt 10 s, como el de la Fig.1Automóvil club británico, fueron excluidos del ajuste en unas pocas celdas. Pueden representar una población adicional de cierres, pero eran demasiado infrecuentes para un ajuste confiable).

Los canales GIRK1 / 4 se estudiaron en ovocitos inyectados con cantidades mucho más pequeñas e iguales de ARN GIRK1 y GIRK4 (25-100 pg de ovocito -1). Es importante enfatizar que, cuando se inyectó ARN GIRK1 solo en estas concentraciones, las corrientes de células completas fueron muy pequeñas (Vorobiov et al. 1998), y por lo general no pudimos detectar ninguna actividad del canal GIRK con electrodos de parche de 1–1,8 MΩ de resistencia. Por el contrario, cuando se coexpresó GIRK4, incluso estas pequeñas cantidades de ARN dieron lugar a corrientes de células completas de varios microamperios (no mostrado). Por lo general, varios canales se activaban con 20 nM Gβγ en pequeños parches (pipetas de 1,5–2,5 MΩ de resistencia, 2,7–1,5 μm de diámetro interno), y se obtuvieron registros de un solo canal en solo cuatro de los & gt 70 parches. Cada uno de los cuatro registros de un solo canal se analizó por separado.

El patrón general de actividad de GIRK1 / 4 fue similar al de GIRK1 / 5 (Fig.2A). La distribución de tiempo abierto podría ajustarse satisfactoriamente mediante una función biexponencial con constantes de tiempo de 0,7 y 2,9 ms (Fig.2B y Tabla 1 [enlace]). Al igual que GIRK1 / 5, fueron necesarios al menos cuatro exponentes para describir la distribución de tiempo cerrada, pero el ajuste se mejoró sustancialmente mediante el uso de una función de cinco exponenciales (Fig.2C). Los valores de las constantes de tiempo cerradas τc1 a τc5 eran similares a los de GIRK1 / 5. La fracción del área total bajo la curva ajustada (ak) del segundo componente fue significativamente diferente (Tabla 1 [enlace]).

La diferencia más notable entre GIRK1 / 4 y GIRK1 / 5 fue ∼3 veces menor PAGo de GIRK1 / 4 (Fig.2D). Para comprender los factores que determinan la baja PAGo de GIRK1 / 4, los resultados se procesaron adicionalmente como se explica en los Métodos (eqns (4) - (8)). Para evaluar la contribución a PAGo de un kEn la población de eventos (componente exponencial) de una distribución de tiempo abierta o cerrada, fue necesario calcular los tiempos medios de apertura y cierre de cada población (to,k y tC,k, respectivamente). Estos tiempos medios, así como los tiempos medios totales de apertura y cierre de todo el registro (to y tC, respectivamente), se calcularon a partir de los resultados de los ajustes exponenciales descritos anteriormente. La contribución de una población de aberturas al tiempo medio total de apertura y, por lo tanto, a PAGo es dado por to,k/to lo mismo se aplica a los tiempos cerrados (eqns (8a) y (8B)). Ya que tk=akτk (ecuación (4)), utilizando la fracción del área total bajo la curva ajustada (ak) para estimar la contribución de una población exponencial dada a PAGo Es engañoso la escasez de eventos prolongados se compensa con su larga duración. También es importante señalar que en una sola distribución exponencial el tiempo medio (t) es igual a la constante cinética de tiempo (τ). En una distribución multiexponencial, el tiempo medio abierto o cerrado de un kEl componente exponencial (población de eventos) no corresponde a τk en realidad, pueden diferir en órdenes de magnitud (comparar, por ejemplo, τc5 y tc5 en la Tabla 1 [enlace]).

Figura 2mi resume las contribuciones de los diferentes componentes exponenciales al total de tiempos abiertos y cerrados. En la distribución de tiempo abierto, GIRK1 / 5 y GIRK1 / 4 mostraron diferencias estadísticamente significativas: la población de eventos con τ más largooo2) contribuyeron con más del 90% del tiempo abierto total en GIRK1 / 5 y menos del 75% en GIRK1 / 4 correspondientemente, las contribuciones de la población con τ más cortosoo1) mostró una relación inversa. En las distribuciones de tiempo cerrado, una característica destacable de ambos tipos de canales fue la destacada contribución de los largos tiempos de cierre. Los cierres más largos con τC de aproximadamente 1-2 s (τc5), que representó solo el 1-3% de todos los tiempos cerrados por área (Tabla 1 [enlace]), contribuyó del 30% (GIRK1 / 5) al 55% (GIRK1 / 4) del tiempo cerrado total (Fig. 2mi). En GIRK1 / 4, esta población de cierres contribuyó con una parte significativamente mayor del tiempo total de cierre que en GIRK1 / 5. La segunda población más larga de cierres con un τC de ∼240 ms (τc4) contribuyó con & lt 13% por área pero entre 33 y 44% por tiempo. Los cierres cortos con τC de 0.5–0.6 y 4–4.9 ms contribuyeron con menos del 5%, aunque fueron los más abundantes por área.

Un examen más detallado de la Tabla 1 [enlace] revela que el tiempo abierto medio total de GIRK1 / 4 fue ∼1,9 veces más corto y el tiempo cerrado medio total fue ∼2,2 veces más largo ( PAG & lt 0.05) que los de GIRK1 / 5. El mas largo to2 de GIRK1 / 5 es el único factor subyacente a la diferencia en el tiempo de apertura total el valor más alto del tiempo de cierre más largo, tc5, de GIRK1 / 4 es la razón principal del mayor tiempo de cierre total de GIRK1 / 4. Las diferencias en tiempos abiertos y cerrados explican y contribuyen aproximadamente por igual a la diferencia observada en PAGo valores de los dos canales. Los cierres largos (tc4 y tc5) constituyen el 89% del tiempo total de actividad GIRK1 / 4 y explican el bajo valor de PAGo.

Análisis de frecuencia de aperturas GIRK1 / 4

figura 3A muestra el diagrama de frecuencia de una porción de 100 s de un registro después de la activación por Gβγ (de un total de ∼460 s en esta celda, el mismo parche que en la Fig. 2). Similar a lo que se ha observado en las células auriculares (Ivanova-Nikolova et al. 1998), este diagrama demuestra la presencia de segmentos de 400 ms con un gran número de aperturas (alta frecuencia de apertura), probablemente reflejando la ocurrencia de ráfagas de aperturas, intercaladas con segmentos de baja frecuencia de apertura. Se observó un patrón similar durante todo el tiempo de grabación en este parche y en los otros tres parches probados. Para mejorar la precisión y resolución del análisis adicional, los datos de los cuatro parches se combinaron en una distribución (tiempo total de grabación, 27 min). La fracción de segmentos "nulos" (sin aberturas) fue 0,48.

El histograma de frecuencia se ajustó mejor con tres geométricos con frecuencias características de 0,6, 4 y 34,5 Hz (Fig.3B) encajar con cuatro geométricos no dio mejores resultados. Así, como en las células auriculares (Ivanova-Nikolova et al. 1998), se pueden detectar al menos tres poblaciones de segmentos de 400 ms con diferentes características de frecuencia después de la activación por Gβγ.

A continuación, analizamos la distribución de los tiempos abiertos dentro de los segmentos de 400 ms. figura 3C muestra una presentación de todos los puntos de esta distribución. Curiosamente, los segmentos con la menor Fo (es decir, aquellos que mostraron una o algunas aberturas por 400 ms) mostraron una amplia gama de tiempos abiertos, en lugar de tener el más corto to como se esperaría si representaran la actividad del canal con el menor número de límites Gβγ y la apertura más pobre (Ivanova-Nikolova et al. 1998). figura 3D muestra que el promedio to, s los valores en las diferentes clases de frecuencia fueron bastante similares en todo el rango de frecuencias. Es importante destacar que estos datos son prácticamente idénticos a los obtenidos por Ivanova-Nikolova. et al. (1998) después de la activación de GIRK cardíaco con Gβ1γ5, apoyando fuertemente la relevancia de estudiar GIRK1 / 4 en ovocitos. El significado to fue 1,77 ± 0,10 ms (1920 segmentos), muy cercano al valor de 1,86 ± 0,09 ms obtenido por Ivanova-Nikolova et al. (1998) con Gβ1γ5 (y también similar a 1,98 ± 0,32 ms calculado a partir del análisis cinético de la Tabla 1 [enlace]).

Puerta modal lenta de GIRK1 / 4

A partir del examen visual de nuestros registros, fue evidente que el canal "cicla" entre períodos de muchos segundos con actividad explosiva, e incluso períodos más largos dominados por aperturas únicas, cierres largos y ráfagas cortas y escasas. Esto se ejemplifica en la Fig.4 que muestra un tramo de 320 s de registro desde el mismo parche que en las Figs 2 y 3.A. Este comportamiento es un signo de activación modal, como se encuentra en los canales de Ca 2+ y Na + dependientes del voltaje (Delcour & Tsien, 1993 Keynes, 1994).

GIRK1 / 4 activado por Gβγ "Ciclos" entre períodos de baja y alta PAGo

Un segmento de 320 s del registro de actividad GIRK1 / 4 después de la activación por 20 nM Gβγ. Los triángulos invertidos muestran los límites entre los grupos de ráfagas y bajasPAGo modos, como en la Fig.5A.

PAG o diarios con contenedores de 0,4, 2 o 5 s (Fig.5A 2 s bins) apoyó la impresión de que el canal alterna entre largos períodos de un modo de "ráfaga" de aperturas y un "bajo-PAGo' modo. Los datos del contenedor de 2 s se eligieron para seleccionar períodos del registro (grupos o ejecuciones) con valores bajos o altos. PAGo, con el promedio PAGo de todo el registro como corte PAGo (se incluyeron segmentos nulos). los | Z | los valores se calcularon según lo descrito por Colquhoun y Sakmann (1985) para cada registro y se encontraban en el rango de 5,8 a 7,3. Tales valores de | Z | sugieren que los segmentos con similares PAGo Es poco probable que se distribuyan aleatoriamente y, por lo tanto, segmentos con similares PAGo probablemente se agrupen. Aunque el análisis de corridas es un indicador relativamente burdo de la activación modal (Colquhoun y Sakmann, 1985), también respalda el supuesto de comportamiento modal de GIRK1 / 4 a una concentración constante de Gβγ en la escala de tiempo largo.

Para un análisis más detallado, los grupos de segmentos con PAGo por encima del nivel de corte se designaron como pertenecientes al modo de ráfaga y el resto se clasificó como perteneciente alPAGo modo se realizaron listas de eventos independientes para cada grupo. El proceso de selección se ilustra en las Figuras 4 y 5.A, donde los límites de ráfaga / bajaPAGo los grupos se indican mediante triángulos. Se omitieron algunos períodos del registro porque eran de baja calidad o por simplicidad (por ejemplo, ráfaga relativamente corta o bajaPAGo períodos, generalmente inferiores a 10 s, lo que hace que el análisis sea muy tedioso). Un ejemplo es el tramo entre ∼310 y ∼365 s en el registro de la Fig.5A (indicado por una línea discontinua entre dos triángulos). Las duraciones medias de los conglomerados fueron 19,8 ± 3,9 s ( norte= 15) en el modo ráfaga y 46,8 ± 7,6 s ( norte= 16) en el bajoPAGo modo. En total, se procesaron datos de aproximadamente el 70% del tiempo total de registro, que contenía el 77,3% de todas las aperturas. Datos de clústeres en modo ráfaga y de bajaPAGo Se combinaron grupos de modo de los cuatro parches, formando dos conjuntos de datos que se analizaron por separado. El general PAGo en los dos conjuntos de datos fue 0.102 en modo ráfaga y 0.0034 enPAGo modo (Fig.6C).

Análisis cinético de la compuerta GIRK1 / 4 dentro de ráfaga y bajaPAGo modos

Los datos se combinaron de cuatro parches antes del análisis. A, distribuciones de tiempo abierto (en la forma p.d.f.) correspondientes a ráfagas y bajasPAGo modos, que se muestran superpuestos. Las líneas continuas muestran los correspondientes ajustes de dos exponenciales. Los parámetros del ajuste se muestran en la Tabla 1 [enlace]. B, distribuciones de tiempo cerradas (con intervalos de tiempo logarítmicos) correspondientes a ráfagas y bajasPAGo modos, que se muestran superpuestos. Solo para fines de presentación, los dos primeros contenedores se subdividieron en otros más pequeños y se interpolaron los números de eventos en cada contenedor. Las curvas muestran los resultados del procedimiento de ajuste estándar a la p.d.f. histogramas (como se explica en las Figs 1C y 2C) con cuatro exponentes. Los parámetros del ajuste se muestran en la Tabla 1 [enlace]. C, probabilidades abiertas en los dos modos. D, contribución de las componentes exponenciales de las distribuciones de los tiempos de apertura y cierre a los tiempos totales de apertura y cierre en ráfagas y bajasPAGo modos.

El análisis de frecuencia con segmentos de 400 ms, como se realizó anteriormente para todo el registro, reveló diferencias notables entre ráfagas y bajas frecuencias.PAGo modos. Doscientos de 712 segmentos en el modo de ráfaga (28%) y 1244 de 2130 segmentos en el modo de ráfagaPAGo modo (58%) estaban vacíos, es decir, no contenían aberturas. Los tiempos abiertos medios de los dos conjuntos de datos fueron claramente diferentes en todo el rango de frecuencias (Fig.5B). En bajaPAGo modo, to, s fue siempre 2-3 veces menor que en la clase de frecuencia correspondiente del modo de ráfaga en la mayoría de las clases de frecuencia, la diferencia fue estadísticamente significativa. Tenga en cuenta especialmente la clase de frecuencia más baja, 2,5 Hz (una apertura por segmento de 400 ms), que se supone que es la más baja to clase en el modelo de Ivanova-Nikolova et al. (1998). Existía tanto en ráfagas como en bajasPAGo modos, aunque era más abundante en el bajo-PAGo modo, pero la media to, s difiere mucho: 3,41 ± 0,58 ms (64 segmentos) vs. 1,14 ± 0,06 ms (468 segmentos, PAG & lt 0,001) para ráfaga y baja-PAGo modo, respectivamente. El promedio general to fue 2,74 ± 0,11 ms (502 segmentos) en el modo de ráfaga, y 1,24 ± 0,04 ms (886 segmentos) en el modo de ráfagaPAGo modo, la diferencia de 2,2 veces fue muy significativa ( PAG & lt 0,001). La mayor parte del tiempo abierto fue contribuido por el modo de ráfaga: el 79% de todas las aberturas aparecieron dentro de los períodos del modo de ráfaga, y solo el 21% apareció enPAGo modo. Por lo tanto, bajoPAGo y el modo de ráfaga se caracterizaron por diferentes to valores, que generalmente se considera una indicación de diferentes modalidades de activación (Delcour et al. 1993). Los histogramas de frecuencia de apertura también fueron notablemente diferentes entre los dos modos (Fig.5C y D).En ambos casos, las distribuciones de frecuencia se podrían ajustar con dos geométricos asumiendo que tres geométricos no mejoraron el ajuste. Los dos modos compartían solo la población de baja frecuencia con una frecuencia característica de 1,24 a 1,46 Hz. Cada uno de los modos tenía solo una población de frecuencia adicional: el modo de ráfaga tenía una frecuencia característica de 88,6 Hz, y el de baja frecuenciaPAGo El modo tenía una frecuencia característica de 10,7 Hz.

Para caracterizar aún más las diferencias entre los dos modos de activación, realizamos un análisis cinético completo de la altaPAGo y bajoPAGo conjuntos de datos. Los resultados se resumen en la Fig. 6 y en la Tabla 1 [enlace]. Un examen visual de los histogramas de tiempo abiertos y cerrados que se muestran en la Fig.6A y B revela diferencias significativas entre estallido y bajoPAGo modos (el uso de gráficos de densidad de probabilidad, que muestran frecuencias normalizadas de aperturas y cierres, permite la comparación directa de los diferentes conjuntos de datos). Histogramas de tiempo abierto (Fig.6A) reveló una abundancia relativa de aberturas más cortas en los bajosPAGo modo (barras grises) en comparación con el modo de ráfaga (barras abiertas). Las distribuciones de tiempo abierto dentro de cada modo no se pudieron ajustar satisfactoriamente a una función exponencial simple (no se muestra), y se requirieron dos exponenciales en ambos casos (se muestra en la Fig.6A). Ambas constantes de tiempo abierto, especialmente la más corta, fueron sustancialmente menores en elPAGo modo que en el modo de ráfaga (Tabla 1 [enlace]). Estos resultados sugirieron que la distribución de tiempo abierto total, sin separación en modos (Fig. 2), probablemente contenía más de dos componentes exponenciales a pesar del ajuste razonable obtenido con la función de dos exponenciales. El tiempo medio abierto fue más de 2 veces mayor en la ráfaga que en la bajaPAGo modo (Tabla 1 [enlace]) sin embargo, esta diferencia por sí sola no podría explicar el 30 veces mayor PAGo del modo ráfaga.

Las diferencias entre las distribuciones de tiempo cerradas fueron aún más llamativas (Fig.6B) los tiempos cerrados prolongados eran obviamente mucho más abundantes en losPAGo modo (barras grises) que en el modo ráfaga (barras abiertas). Se detectaron cuatro componentes exponenciales tanto en ráfagas como en bajasPAGo modos (Fig.6B Tabla 1 [enlace]). El uso de cinco exponentes no mejoró la calidad ni la estabilidad del ajuste en ninguno de los casos. Además, algunas de las constantes de tiempo características obtenidas en los ajustes de cuatro exponenciales dentro de los modos mostraron similitudes sorprendentes con las cinco constantes de tiempo cerradas de la distribución total (Tabla 1 [enlace]). El más corto, τc1, fue muy similar en la distribución total de los parches GIRK1 / 4 y en los dos modos, siendo de 0,6 a 0,9 ms. τc2 (5 ms) de la distribución total se representó audazmente en el modo de ráfaga, pero ausente de la bajaPAGo modo. La siguiente constante de tiempo, de 23 y 46 ms para la ráfaga y bajaPAGo modo, respectivamente, probablemente corresponde a τc3 de la distribución total (31 ms). La siguiente población de cierres, caracterizada por un τc4 de 240 m, fue indudablemente aportado exclusivamente por una subpoblación importante que está presente en elPAGo modo (τ = 238,5 ms), pero ausente del modo de ráfaga. Finalmente, la constante de tiempo más larga, τc5, apareció más pequeño en el modo ráfaga (760 ms) que en la población total o en elPAGo Sin embargo, la estimación de esta constante de tiempo no fue muy precisa debido a la relativa rareza de los cierres largos en el modo de ráfaga.

El tiempo medio cerrado total en la bajaPAGo modo fue más de 10 veces mayor que en el modo de ráfaga (Tabla 1 [enlace]), lo que sugiere que la gran diferencia en el PAGo se debió principalmente a este factor. Análisis de las contribuciones de los componentes de las distribuciones exponenciales en los dos modos (Fig.6D) mostró que las poblaciones con tiempos abiertos cortos y largos contribuyeron aproximadamente por igual al tiempo abierto total. Nuevamente, las diferencias entre los modos en los tiempos cerrados son notables. En el bajoPAGo modo, los cierres cortos no son importantes, y las dos poblaciones con el τ más largo, τc4 y τc5 (∼240 y ∼2700 ms) representan & gt el 95% del tiempo de cierre total. Por el contrario, en el modo de ráfaga, dos de las tres clases más cortas de cierres (τc2 y τc3 ∼6 y 47 ms) hacen una contribución sustancial (& gt 40%) al tiempo de cierre total.

Comportamiento modal de los canales GIRK1 / 5

De la inspección visual de los registros y PAGo datos (segmentos de 2 s) parecía que el comportamiento modal es mucho menos obvio en los canales GIRK1 / 5 que en los canales GIRK1 / 4. Sin embargo, el análisis de ejecuciones representado | Z | valores en el rango de 4 a 8,4, lo que sugiere que la agrupación de segmentos con similares PAGo Es poco probable que suceda por casualidad. Por lo tanto, se realizó un análisis más detallado para los canales GIRK1 / 4 (para evitar la ambigüedad de las diferentes frecuencias de muestreo, se seleccionaron 5 celdas con una frecuencia de muestreo de 2,5 kHz para el presente análisis). Significar to Los valores correspondientes a los dos modos presuntivos fueron significativamente diferentes (4,37 ± 0,16 ms para el modo de ráfaga y 2,73 ± 0,07 ms paraPAGo modo, PAG & lt 0,001). El general PAGo valores en ráfaga y bajaPAGo modo fueron 0,122 y 0,029, respectivamente. Tenga en cuenta que esta diferencia de ∼4 veces en la media PAGo era mucho más pequeño que en los canales GIRK1 / 4 (∼30 veces).

El análisis de frecuencia no mostró diferencias explícitas entre modos de la misma manera que para los canales GIRK1 / 4. Tanto en modo ráfaga como bajo-PAGo Las distribuciones de frecuencia de modo podrían ajustarse bien con dos geométricos que dieron valores bastante cercanos de frecuencias características (1,16 y 38,03 Hz para el modo de ráfaga, 1,09 y 18,66 Hz para el bajo-PAGo modo). Del mismo modo, el análisis cinético de la alta y bajaPAGo Los conjuntos de datos no ofrecían una imagen tan clara como en el caso de GIRK1 / 4. Las distribuciones de tiempo abierto en ambos modos se ajustaron satisfactoriamente con dos exponentes, de los cuales solo el más largo pareció divergir sustancialmente entre los modos (1,06 y 6,28 ms para el modo de ráfaga, 0,85 y 3,52 ms para el bajo-PAGo modo). Según el análisis de distribución de tiempo cerrado, parecía que la baja-PAGo El modo probablemente contenía los cinco componentes de tiempo cerrado que se encontraron en los registros completos. La distribución de tiempo cerrada en modo ráfaga podría ajustarse con cuatro exponentes, omitiendo el exponente largo encontrado en el bajo-PAGo modo.

Puerta GIRK1 / 4 después de la inhibición por Gαi1

Los canales GIRK1 / 5 son inhibidos por G miristoilado activado por GTPγSαi1 con un CI50 cerca de 15 pM a 100 pM, la inhibición alcanza el 95% (Schreibmayer et al. 1996). Esta inhibición no se debe al secuestro de Gβγ sino a otro mecanismo desconocido. En miocitos auriculares de rata, la inhibición fue ~ 85%, aparentemente menor que la de GIRK1 / 5 (Schreibmayer et al. 1996). Aunque en el mismo trabajo también observamos inhibición de los canales GIRK1 / 4 expresados ​​en los ovocitos, ni la cinética del canal ni el mecanismo de inhibición por Gαi1 fue analizado en detalle. El patrón de actividad del canal en presencia de Gαi1 se caracterizó por largos períodos de cierre y baja PAGo, asemejándose al bajoPAGo modo y planteando la posibilidad de que Gαi1 puede ser uno de los factores celulares que controlan el comportamiento modal de GIRK. Por ello, decidimos hacer un análisis detallado de Gαi1-inhibición de GIRK1 / 4 inducida.

Los parches extirpados se expusieron a 20 nM Gβγ solo o junto con 25 o 100 pM Gαi1. Como puede verse en la Fig.7A, en muchos parches el efecto inhibidor de Gαi1 se podía ver fácilmente. Sin embargo, en la mayoría de los casos todavía se observó una activación sustancial de GIRK1 / 4 en presencia de Gαi1. Para cuantificar los efectos de Gβγ y Gαi1, el grado de activación por Gβγ en cada parche se normalizó a la actividad basal en el mismo parche, calculando notario públicoo en presencia de Gβγ dividido por basal notario públicoo. notario públicoo en presencia de Gβγ se midió durante un período de 1 minuto de actividad máxima, entre 2 y 7 minutos después de la adición de Gβγ. Basal notario públicoo se midió durante el segundo minuto después de la extirpación del parche. La estimación de notario públicoo en parches con actividad basal muy baja (menos de 3-4 aberturas min -1) no fue confiable, por lo tanto, parches con basal notario públicoo & lt 0,00005 se han excluido del análisis (4 de 37 parches).

En la figura 7 se muestra un resumen de estos experimentos.B. GRAMOβγ solo activó el canal en & gt 770 veces. En presencia de G activado por GTPγSαi1 la activación se atenuó en aproximadamente un 70%, pero todavía fue muy sustancial en ~ 200 veces. La inhibición podría pasarse por alto fácilmente si se realizaran comparaciones exhaustivas con la activación del control por Gβγ no se realizaron en los mismos lotes de ovocitos.

En cuatro parches activados por Gβγ en presencia de Gαi1, no se observaron superposiciones de aberturas durante todo el tiempo del registro (7-10 min después de Gβγ solicitud). Dado que había relativamente pocas aperturas en cada uno de estos registros, los datos de estos cuatro parches se combinaron y la cinética abierta y cerrada se analizaron como anteriormente. La distribución del tiempo abierto se ajustó con dos exponentes (Fig.7C y Tabla 1 [enlace]). La distribución del tiempo cerrado se ajustó con cuatro exponentes (Fig.7D), cercanos pero no idénticos a los de losPAGo modo (Tabla 1 [enlace]). Análisis de frecuencia de la compuerta GIRK1 / 4 en presencia de Gαi1 representaron frecuencias características de 1,13 y 7,47 Hz, similares a las que se encuentran en los-PAGo modo de GIRK1 / 4 (1,46 y 10,7 Hz).


MODELOS DE CORRIENTE DE 3 IONES

Los modelos de PA cardíaca se componen de varios submodelos, que describen corrientes iónicas particulares a través de canales y transportadores, flujos difusivos entre compartimentos intracelulares y amortiguación y liberación de calcio en el retículo sarcoplásmico. De estos componentes, las corrientes de los canales de iones pasivos sensibles al voltaje fueron los primeros en modelarse, y el problema de ajustar modelos matemáticos a los datos electrofisiológicos de experimentos de "pinzamiento de voltaje de célula completa" ha sido particularmente bien estudiado en el ámbito cardíaco, neuronal, y fisiología general de células excitables.

3.1 Canales iónicos sensibles al voltaje

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3.1.1 Estados estacionarios y constantes de tiempo

Varios estudios se han centrado en el problema de estimar las corrientes de estado estacionario y las constantes de tiempo de la activación / disminución de la corriente a partir de registros de corriente de celda completa a voltajes particulares. Si bien estos análisis a menudo se realizan con datos sintéticos y pueden ser altamente matemáticos, sus resultados son relevantes tanto para los experimentadores como para los modeladores, ya que las constantes de tiempo y los estados estacionarios todavía se usan comúnmente para informar resultados experimentales (aunque, por razones que quedarán claras, imploramos a cualquier experimentador que esté leyendo que complazca además publicar los cursos de tiempo actual en formato digital).

Muchos estudios publicados consideran el problema específico de ajustar un modelo de Hodgkin-Huxley de dos puertas (es decir, con una puerta de activación y una de inactivación). Dichos modelos se pueden escribir en una forma en la que la cinética de cada puerta se describa mediante un estado estacionario dependiente del voltaje y una constante de tiempo, y el procedimiento de ajuste implica extraer estas cantidades de las mediciones de corriente. independientemente para varios voltajes. Se dan ejemplos detallados de estos métodos de análisis en los materiales complementarios de Clerx, Beattie, et al. (2019). A continuación, se hace un "ajuste" del modelo ajustando curvas (a menudo algo arbitrarias) a través de los puntos resultantes e insertando la ecuación resultante directamente en un modelo. En la Figura 5a se muestra una descripción esquemática de este procedimiento.

Beaumont, Roberge y Leon (1993) señalaron un punto crucial con respecto a este método, quienes demostraron que los estados estacionarios solo pueden medirse correctamente si las constantes de tiempo de las diferentes puertas (por ejemplo, activación e inactivación) están “bien separadas . " En otras palabras, nuestra capacidad para medir estados estables de activación e inactivación a cualquier voltaje V, depende de que exista una gran diferencia en las constantes de tiempo de activación e inactivación a ese voltaje. La misma conclusión fue reforzada por Willms, Baro, Harris-Warrick y Guckenheimer (1999) y Lee, Smaill y Smith (2006). Tener constantes de tiempo bien separadas a menudo significa que uno de los procesos es muy rápido (por ejemplo, IN / A activación) o muy lento (p. ej., IKr activación). Hay una consideración experimental interesante aquí, en el sentido de que los procesos muy rápidos son difíciles de medir y pueden requerir equipo especializado (Sherman, Shrier y Cooper, 1999), mientras que para procesos lentos se debe tener mucho cuidado de que los pasos de voltaje sean lo suficientemente largos ( Clerx, Beattie, et al., 2019 Vandenberg et al., 2012), lo que plantea dificultades si las células se vuelven inestables durante la medición. Es preferible no tener que esperar a que surjan estados estacionarios para ajustarse a los parámetros de un modelo.

3.1.2 Parámetros del modelo de Hodgkin-Huxley

Un segundo artículo de Beaumont, Roberge y Lemieux (1993) investigó el problema de encontrar los estados estacionarios de un modelo HH con constantes de tiempo no separables. Como parte de su solución, que denominaron un procedimiento de inversión, utilizaron una curva de Boltzmann para conectar los estados estacionarios en todos los voltajes medidos (lo que proporciona una restricción más fuerte a los datos que ajustar cada voltaje de forma independiente) y luego la ajustaron utilizando la corriente máxima y el tiempo hasta el pico, razonando que estos Los puntos proporcionan la relación señal-ruido más alta. A continuación, se obtienen los parámetros finales mediante optimización numérica. Wang y Beaumont (2004) presentaron una extensión adicional de este método, que evita la optimización numérica, pero requiere un protocolo de paso de voltaje actualizado que no es bien tolerado por todos los tipos de células. El cuarto artículo de la serie (Raba, Cordeiro, Antzelevitch y Beaumont, 2013) proporcionó una confirmación experimental de la necesidad de un protocolo experimental actualizado y contenía experimentos con datos sintéticos que mostraban una versión mejorada del método de Wang y Beaumont (2004). .

Willms y col. (1999) y Lee et al. (2006) realizaron análisis similares de modelos HH de dos puertas, y ambos mostraron que estimar los estados estacionarios y las constantes de tiempo de forma independiente (o "disjuntamente") conduce a un error en la estimación de la activación del estado estacionario que escala con la razón del tiempo constantes de activación e inactivación. El trabajo de Lee et al. (2006) prosiguió recomendando un enfoque que minimiza un error en las corrientes pico, el tiempo hasta el pico y las corrientes de estado estable, mientras que Willms et al. (1999) recomendó ajustar directamente las trazas de corriente (ver Figura 5c). Ambos estudios utilizaron simulaciones para mostrar la superioridad de sus métodos sobre un enfoque convencional.

Csercsik et al. (2010) y Csercsik, Hangos y Szederkenyi (2012), quienes investigaron la identificabilidad teórica de estados estacionarios y constantes de tiempo a partir de un solo paso de voltaje. Para los modelos HH con dos puertas, cada una con el exponente 1, pudieron demostrar que las constantes de tiempo son identificables, mientras que la conductancia máxima y los estados estacionarios forman un par no identificable. Este análisis se extendió a modelos HH generales (cualquier número de puertas con cualquier exponente) por Walch y Eisenberg (2016), con el resultado adicional de que los propios exponentes son identificables. Este es un trabajo valioso para el análisis de pasos de voltaje único, pero el análisis aún no se ha extendido a protocolos de pasos de voltaje múltiple, donde sabemos por experimentos prácticos de identificación que el conocimiento de la relación entre parámetros a diferentes voltajes puede proporcionar una identificación completa de parámetros (por ejemplo, asumiendo tasas dependientes del voltaje de la forma que se muestra en la Figura 1).

3.1.3 Modelos de Markov y enfoques de optimización

Muchos modelos postulan un esquema cinético más complicado que las puertas HH independientes, por lo que el sistema ya no puede describirse mediante un conjunto de constantes de tiempo independientes y estados estacionarios. En cambio, estos modelos se ajustan mediante la definición de una medida de error entre los datos experimentales y las simulaciones utilizando una estimación inicial de los parámetros, y luego ajustando iterativamente los parámetros hasta que se minimice el error. A diferencia de los métodos discutidos en las secciones anteriores, que están restringidos a los modelos HH, los métodos basados ​​en optimización pueden usarse para cualquier modelo de corriente iónica.

Un método común para usar la optimización para la calibración del modelo es simular protocolos convencionales de fijación de voltaje, calcular estados estacionarios y constantes de tiempo (asumiendo temporalmente un formalismo HH) y luego ajustar los parámetros hasta que se minimice la diferencia entre los valores simulados y experimentales (ver Figura 5b). Este método tiene la ventaja de que solo requiere estados estacionarios y constantes de tiempo como entrada, que son fáciles de encontrar en la literatura experimental, pero puede conducir a grandes errores y un procedimiento de ajuste innecesariamente complejo (Clerx, Beattie, et al., 2019 ).

Un método alternativo, que se muestra en la Figura 5c, es comparar las corrientes registradas y simuladas directamente. Un ejemplo temprano de este método se mostró en Balser, Roden y Bennett (1990), quienes simularon la probabilidad de apertura del canal en un modelo de Markov de tres estados (con tasas de Eyring) y lo ajustaron a la probabilidad de apertura estimada a partir de registros macroscópicos de células completas. . Mostraron la aplicabilidad de su método a las mediciones en miocitos ventriculares de cobaya, pero también verificaron su desempeño en un conjunto simulado de 90 "células" virtuales.

La identificabilidad de los parámetros del modelo de Markov se ha centrado en local análisis que parte de una solución conocida en el espacio de parámetros. Si se determina que el modelo no es identificable en este punto, esto demuestra una falta de identificabilidad global, pero no se pueden dar garantías para la identificabilidad global de los resultados identificables localmente. Fink y Noble (2009) probaron varios modelos y protocolos de voltaje para determinar la identificabilidad local, y los utilizaron para resaltar varios parámetros no identificables en los modelos de Markov publicados. Más tarde se presentó una extensión de este método basada en la descomposición de valores singulares en Sher et al. (2013) y se utiliza para crear modelos reducidos eliminando parámetros redundantes. Tenga en cuenta que incluso un análisis de identificabilidad práctico basado en la optimización global sigue siendo local con respecto al conjunto único de parámetros que generó los datos sintéticos, por lo que también se recomienda repetir estos ejercicios con múltiples conjuntos de parámetros posibles.

3.1.4 Diseño de protocolo

El análisis práctico de identificabilidad se ha utilizado como herramienta para diseñar protocolos de sujeción de tensión.Por ejemplo, Fink y Noble (2009) analizaron y acortaron los protocolos populares de fijación de voltaje al eliminar los pasos que no afectaban la identificación de los parámetros. Zhou y col. (2009) también probaron varios protocolos para la identificabilidad antes de realizar experimentos, y el trabajo sobre la identificabilidad del modelo HH por Csercsik et al. (2012) finaliza con varias recomendaciones para el diseño de protocolos.

Millonas y Hanck (1998b) habían adoptado previamente un enfoque más radical para el diseño de protocolos, que midieron IN / A corrientes resultantes de protocolos que fluctuaban rápidamente entre un voltaje alto y bajo y lo usaban para la calibración del modelo. Luego ajustaron un modelo a las corrientes de los protocolos convencionales de fijación de voltaje y demostraron que no podía predecir la respuesta al protocolo novedoso, mostrando que el protocolo que fluctuaba rápidamente tenía el potencial de descubrir nueva información (Millonas y Hanck, 1998b, 1998a). . Un estudio de seguimiento (Kargol, Smith y Millonas, 2002) investigó el diseño de protocolos sistemáticos y mostró un ejemplo en el que se diseñó un protocolo para maximizar las predicciones de dos modelos en competencia que mostraban una respuesta similar a los protocolos convencionales. Un método para generar (y comparar) protocolos sistemáticamente es crearlos superponiendo formas de onda similares, por ejemplo, ondas sinusoidales de diferentes frecuencias y amplitudes, y los autores analizan brevemente esto antes de sugerir wavelets como una base más adecuada (que exploraron con más detalle en Hosein-Sooklal y Kargol, 2002 Kargol, 2013).

Una superposición de ondas sinusoidales también formó la base de un protocolo introducido en Beattie et al. (2018). En este estudio, medimos IKr actual en respuesta a un protocolo optimizado de 8 s, y lo usó para ajustar un modelo de Markov de cuatro estados (equivalente a un modelo de Hodgkin-Huxley con dos puertas independientes). Luego, el modelo se usó para predecir la respuesta a un protocolo de validación de forma de onda AP (es decir, no se usó en los datos de ajuste), y se encontró que supera a los modelos publicados en la literatura que se ajustaron a los protocolos de pasos convencionales. En particular, este estudio realizó un protocolo de calibración sinusoidal y protocolos de validación independientes en forma de (versiones abreviadas de) protocolos de abrazadera de voltaje convencionales y una abrazadera de AP, todo en las mismas celdas. En una publicación de seguimiento (Clerx, Beattie, et al., 2019), usamos este conjunto de datos para comparar cuatro métodos de ajuste diferentes (cada uno de los cuales caracteriza un grupo común de métodos encontrados en la literatura) en términos de poder predictivo y robustez. Estos métodos se resumen en la Figura 5. De acuerdo con los estudios teóricos discutidos anteriormente, encontramos que el ajuste de traza completa superó en gran medida al ajuste basado en el estado estacionario y la aproximación constante de tiempo, y que el nuevo protocolo abreviado funcionó tan bien como sus contrapartes convencionales .

Las plataformas de pinzamiento de parche automatizadas están disponibles recientemente y ofrecen la oportunidad de realizar experimentos en un número mucho mayor de lo que era posible antes. Un estudio reciente de Lei, Clerx, Beattie, et al. (2019) adaptó el trabajo de protocolo rico en información de Beattie et al. (2018) para estas máquinas, reemplazando las ondas sinusoidales por un protocolo de escalera (para superar las limitaciones prácticas) y creando 124 modelos específicos de celda en una sola pasada.

3.1.5 Combinación de fuentes de datos

Una ventaja de los métodos de ajuste basados ​​en optimización es que proporcionan una manera sencilla de incorporar datos de diferentes fuentes. Por ejemplo, Vandenberg y Bezanilla (1991) e Irvine, Saleet Jafri y Winslow (1999) combinaron mediciones de corriente de celda completa, corriente de un solo canal y corriente de activación (la corriente microscópica generada por la carga desplazada en los canales conformacionales). cambios) en un solo modelo. Más recientemente, las mediciones de fluorometría de pinza de voltaje se han utilizado junto con datos de electrofisiología para calibrar y / o validar modelos matemáticos de compuertas de canales iónicos (Moreno, Zhu, Mangold, Chung y Silva, 2019 Zaydman et al., 2014) . Si bien la combinación de datos de esta manera tiene un gran potencial, también puede generar problemas para encontrar una solución única si los diferentes conjuntos de datos sugieren una "mejor" respuesta diferente. Esto podría suceder si se sabe y se acepta que el modelo es imperfecto, en cuyo caso, ajustar la ponderación de los diferentes conjuntos de datos podría permitir al modelador "modificar" el resultado, dirigiéndolo hacia un modelo que se supone que es más útil en el contexto esperado. de uso. Pero incluso si asumimos que el modelo tiene la capacidad de ajustarse a todos los conjuntos de datos a la vez, aún podríamos esperar dificultades de tal multiobjetivo problema de optimización, por ejemplo, si cada medición se realizó en diferentes celdas o en condiciones ligeramente diferentes.

Por último, varios autores han investigado la adaptación de modelos de canales iónicos sensibles al voltaje a datos de fuentes distintas de las grabaciones de corriente de células completas. Por ejemplo, medidas de pinza de tensión de un solo canal (ver más abajo), pero también de pinza de corriente de un solo canal (Tveito, Lines, Edwards y McCulloch, 2016). Varios estudios han investigado el ajuste a las mediciones del AP y del calcio transitorio (Bueno-Orovio et al., 2008 Cairns, Fenton y Cherry, 2017 Dokos & Lovell, 2004), lo que permitiría determinar la cinética de los miocitos sin utilizar bloqueadores de canales. o protocolos de separación de corriente (consulte la Sección 4.3.2). Milescu, Yamanishi, Ptak, Mogri y Smith (2008) introdujeron otro enfoque para la identificación multicanal, que midieron el AP en una celda y luego bloqueó la corriente de interés, inyectó una corriente simulada usando una pinza dinámica y ajustó los parámetros de simulación hasta que la celda mostró su comportamiento original. Este proceso puede repetirse luego agregando más bloqueadores y modelos para las corrientes posteriores.

3.2 Sensibilidad a la tensión modulada

El siguiente paso en la complejidad de los canales puramente sensibles al voltaje es estudiar la situación en la que el comportamiento sensible al voltaje de una corriente iónica está modulado por otros factores, por ejemplo, la temperatura o la unión de ligandos. Esto entra en juego de varias maneras en la fisiología cardíaca, por ejemplo, cuando las mediciones se ajustan a la temperatura para incorporar datos a temperatura ambiente o estudiar la fiebre y la hipotermia, cuando se estudian los efectos de mutaciones, fármacos o señales (p. Ej., A través de la fosforilación de canales). , o cuando se modelan corrientes como el calcio de tipo L que exhiben cinéticas dependientes del voltaje y del Ca.

Las modificaciones para incorporar la modulación pueden incluir cambios en (a) la conductancia máxima, por ejemplo, bloqueo de poros inducido por fármacos (Mirams et al., 2011), mutaciones que reducen la corriente de células completas (Sadrieh et al., 2014), o iones -dependencia de concentración (Fink, Noble, Virag, Varro, & Giles, 2008) (b) parámetros cinéticos, por ejemplo, para cambios de temperatura (Li et al., 2016), mutaciones (Clancy & Rudy, 2001), o nuevamente iones -dependencia de concentración (Fink et al., 2008 Mazhari, Greenstein, Winslow, Marbán, & Nuss, 2001) o (c) el esquema cinético en sí mismo, por ejemplo, para modelar la disponibilidad de sitios receptores de drogas (Starmer, Grant, & Strauss, 1984) o para incorporar nuevos "modos" creados por mutaciones (Clancy & Rudy, 2002) o ligando vinculante (Bondarenko, 2014). Para los cambios inducidos por fármacos específicamente, se puede encontrar una descripción general útil en Brennan, Fink y Rodríguez (2009).

El caso más simple, desde el punto de vista del modelado, es cuando los canales se pueden dividir en un grupo alterado y otro inalterado, de modo que simplemente realizamos inferencias dos veces para crear dos modelos independientes cuyo comportamiento combinado representa la situación de interés. Por ejemplo, las mutaciones homocigóticas en SCN5A (donde un solo gen codifica la subunidad alfa completa) se han modelado simplemente reemplazando la totalidad IN / A modelo (Clancy y Rudy, 1999). Las mutaciones heterocigotas se han modelado asumiendo una cierta proporción entre los dos tipos heredados (Loewe et al., 2014), aunque a menudo la corriente heterocigótica de células completas se modela como una sola entidad (Whittaker, Ni, Harchi, Hancox y Zhang , 2017). Para procesos como la fosforilación de canales, también es común incluir dos modelos de canales independientes (O'Hara et al., 2011), pero con una relación variable en lugar de fija entre los dos.

Una representación alternativa de la misma idea es conectar los dos modelos en un solo esquema cinético, con constantes de velocidad (quizás insensibles al voltaje) que permitan que el canal cambie de un modo a otro. Esta representación es común para los modelos de calcio de tipo L (Jafri, Rice y Winslow, 1998 Mahajan et al., 2008) pero también se ha utilizado para modelar los efectos de los fármacos (Brennan et al., 2009 Li et al., 2017).

Para algunos factores de modulación, puede ser más apropiado mantener fija la estructura del modelo pero modificar las constantes de velocidad. Esta es una estrategia común para la temperatura (Destexhe y Huguenard, 2000) pero también para las mutaciones (ver Carbonell-Pascual, Godoy, Ferrer, Romero y Ferrero, 2016 para una discusión sobre la modificación de tasas versus la estructura del modelo). Recientemente, Lei, Clerx, Gavaghan, et al. (2019) medido y ajustado IKr-cinética de forma independiente a varias temperaturas, de modo que se puedan hacer gráficos de las velocidades cinéticas frente a la temperatura. Tenga en cuenta que la identificabilidad es crucial para un ejercicio de este tipo, ya que la falta de identificabilidad podría introducir cambios sin sentido en los parámetros obtenidos (en este caso, previamente se habían mostrado buenas propiedades de identificabilidad [Lei, Clerx, Beattie, et al., 2019]). Puede ser posible extrapolar esta estrategia de ajustes independientes a otras áreas, por ejemplo, para ver qué tasas se ven afectadas por un fármaco, y en este contexto, los protocolos abreviados ricos en información podrían ser particularmente útiles. Finalmente, si se conoce una ecuación para el efecto de modulación en las tasas, también puede ser posible variar tanto el voltaje como los factores de modulación durante un solo experimento, y ajustar un solo modelo a los resultados.

3.3 Canales activados por ligando

Los canales puramente activados por ligando no han recibido tanta atención en la literatura cardíaca como sus homólogos activados por voltaje. Una excepción notable es el receptor (canal) de ryanodina, que desempeña un papel crucial en el manejo del calcio y se ha incluido en los modelos de PA cardíaca desde el trabajo de Hilgemann y Noble (1987). En la literatura neurológica abundan los estudios de canales controlados por ligandos, con especial interés en el problema de ajustar los modelos de Markov a las corrientes de un solo canal. Por ejemplo, Colquhoun y Sigworth (1995), Horn y Lange (1983) y Bauer, Bowman y Kenyon (1987) proporcionan descripciones preliminares detalladas de los métodos estadísticos (máxima verosimilitud) involucrados, y Fredkin, Montal y Rice (1985 ) derivó un resultado importante sobre la identificabilidad de la tasa. Ball y Rice (1992) compilaron una descripción general de la literatura inicial sobre este tema, y ​​Colquhoun, Hatton y Hawkes (2003) ofrecen una evaluación más reciente de los métodos de máxima verosimilitud.

Varios estudios han abordado la identificabilidad en este contexto, tanto analíticamente (Edeson, Ball, Yeo, Milne y Davies, 1994) como utilizando métodos de muestreo bayesiano (MCMC) (Hines et al., 2014 Siekmann et al., 2012). El uso generalizado de métodos estadísticos también ha llevado naturalmente a métodos basados ​​en la probabilidad para la selección de modelos (Hodgson y Green, 1999 Horn y Vandenberg, 1984) y al análisis bayesiano (Epstein, Calderhead, Girolami y Sivilotti, 2016 Hodgson, 1999). En un interesante paralelo con el trabajo de fijación de voltaje de celda completa, estudios como VanDongen (2004) han comparado métodos que pre-analizan (“idealizan”) los datos antes de ajustarlos, con métodos que realizan ambos pasos simultáneamente.

3.4 Bombas y transportadores

Las bombas y los transportadores desempeñan funciones clave en los miocitos cardíacos, restaurando los gradientes electroquímicos necesarios para el transporte pasivo a través de los canales iónicos y rellenando el retículo sarcoplásmico después de la liberación de calcio para la contracción (Eisner, Caldwell, Kistamás y Trafford, 2017). A pesar de esto, la literatura sobre el modelado del transporte activo en cardiomiocitos es escasa. Por ejemplo, un análisis de Bueno-Orovio, Sánchez, Pueyo y Rodríguez (2014) encontró que las formulaciones de bombas de Na / K en AP se heredaron predominantemente de DiFrancesco y Noble (1985) o Luo y Rudy (1994), mientras que Niederer, Fink, Noble y Smith (2009) demostraron que en este proceso se perdía ocasionalmente la conexión (y el ajuste) con los datos de origen.

Smith y Crampin (2004) adoptaron un enfoque muy sistemático para crear un modelo de la bomba de Na / K. Partiendo de un esquema cinético detallado (pero difícil de parametrizar) de 15 estados (el modelo Post-Albers), explotaron las grandes diferencias en las tasas de reacción (estimadas) del modelo para realizar una reducción significativa del modelo, lo que llevó a un modelo simplificado de cuatro estados. con 14 parámetros. Las suposiciones iniciales para cada parámetro se realizaron utilizando una variedad de resultados experimentales publicados, después de lo cual se utilizó la optimización para ajustar el modelo a un estudio publicado de tasas de ciclo versus voltaje. Curiosamente, algunas de las tasas finales que se muestran en el artículo son iguales a los valores iniciales, lo que puede indicar problemas de identificabilidad si no se encontró que la calidad de ajuste varió al cambiar estos parámetros. Terkildsen, Crampin y Smith (2007) realizaron un refinamiento del modelo utilizando el mismo enfoque pero ajustándolo a un conjunto de datos experimentales extendido. Luego, el mismo grupo creó un modelo de la bomba SERCA, esta vez reduciendo un esquema cinético de 12 estados a un modelo de 3 estados, y nuevamente ajustándose a un conjunto de datos combinados de varias fuentes (Tran, Smith, Loiselle y Crampin, 2009). Una publicación reciente de Pan, Gawthrop, Tran, Cursons y Crampin (2019) presenta una extensión de este enfoque, que utiliza gráficos de enlace Para derivar modelos reducidos que obedezcan automáticamente las leyes de la termodinámica, esto hace que sea más probable que den predicciones realistas al extrapolar (ver Sección 2.2).

Si bien las grabaciones actuales de bombas cardíacas (humanas) (especialmente a temperaturas fisiológicas) son raras, los datos de la estructura cristalina están disponibles. Una revisión de Gadsby (2009) los utiliza para argumentar que los principios detrás del transporte activo son más similares al transporte pasivo por canales iónicos de lo que se pensaba anteriormente. Si es así, las técnicas utilizadas en el análisis de canales controlados por ligandos pueden ser aplicables: mientras que la corriente a través de una sola bomba es demasiado pequeña para medirse aisladamente, los estudios han investigado la extensión de los métodos de análisis de un solo canal para ajustarlos a datos macroscópicos (Celentano y Hawkes, 2004 Milescu, Akk y Sachs, 2005).


Policondensación

5.10.2.3.2 Polimerización oxidativa de compuestos de anilina

La polianilina (PANI) se conoce desde hace más de un siglo. Actualmente, PANI es uno de los polímeros conductores más populares debido a su estabilidad y buenas propiedades eléctricas y ópticas, que son atractivos para aplicaciones tecnológicas en baterías livianas, microelectrónica, pantallas electrocrómicas, diodos emisores de luz, blindaje electromagnético, sensores, etc. . Los métodos bien conocidos para la síntesis de PANI son la polimerización por oxidación química o electroquímica del monómero de anilina. Sin embargo, las condiciones de reacción son duras e involucran pH extremo, alta temperatura, oxidantes fuertes y solventes altamente tóxicos.

Por el contrario, la polimerización enzimática de anilina, sus derivados y otros compuestos aromáticos proporciona un método alternativo de un "proceso verde" hacia la formación de polímeros conductores solubles y procesables. Estas reacciones se llevan a cabo habitualmente a temperatura ambiente y en disolventes orgánicos acuosos a pH neutro. La condición de reacción se mejora enormemente y el proceso de purificación de los productos finales se simplifica en comparación con los métodos tradicionales ( Esquema 28 ). 54

Esquema 28. Polimerización oxidativa de anilina catalizada por HRP.

El PANI conductor soluble en agua se obtuvo mediante polimerización de anilina catalizada por HRP usando H2O2 oxidante, en presencia de poliestireno sulfonado (SPS), que actuó como plantilla polianiónica. El polímero resultante se complementó con el SPS y exhibió electroactividad. Se midió que la conductividad del complejo PANI / SPS era 0,005 S cm -1. Los valores aumentaron a 0,15 S cm -1 después del dopaje con HCl y podrían incrementarse aún más con un aumento en la relación molar de anilina a SPS. Se afirma que el enfoque enzimático ofrece una facilidad de síntesis, procesabilidad, estabilidad (eléctrica y química) y compatibilidad medioambiental insuperables. 55

La polimerización enzimática de anilina en presencia de una plantilla como SPS produjo PANI que tenía una estructura lineal, debido a la alineación electrostática del monómero y SPS para promover un acoplamiento dirigido en dirección para. Sin la plantilla, la estructura PANI se ramificó, lo que no es una propiedad deseable de los materiales conductores. 56 El PANI sintetizado enzimáticamente se encuentra normalmente en forma protonada, que puede convertirse en la forma de base no protonada mediante tratamiento con una solución acuosa de amoníaco u otras bases adecuadas. La forma de base no protonada de PANI consiste en unidades de base reducidas "A" y unidades de base oxidadas "B" como unidades repetidas, donde el estado de oxidación del polímero aumenta con valores decrecientes de y (0 ≤ y ≤ 1). Las tres posibilidades extremas para los valores de y son 1, 0.5 y 0, correspondientes a PANI completamente reducido (leucoemeraldina), PANI semi-oxidado (esmeralda) y PANI completamente oxidado (pernigranilina), respectivamente ( Esquema 29 ). 57

Esquema 29. Tres posibilidades extremas del estado de oxidación de la polianilina.

Las partículas coloidales de PANI se prepararon mediante polimerización oxidativa de anilina catalizada por HRP o SBP en un medio disperso junto con ácido toluenosulfónico utilizando poli (alcohol vinílico), poli (norte-isopropilacrilamida) o quitosano como estabilizador estérico. Las partículas coloidales son termosensibles y al pH, y se afirma que tienen aplicaciones potenciales en dispositivos inteligentes como ventanas termocrómicas, fluidos electrorreológicos sensibles a la temperatura, actuadores y coloides para tecnologías de separación. 58


Introducción

Las células intersticiales de Cajal (ICC), identificadas mediante la inmunorreactividad de c-Kit, se distribuyen por los tractos gastrointestinales (GI). Se cree que estas células desempeñan un papel esencial en la motilidad gastrointestinal, como el marcapasos (p. Ej., Thuneberg, 1982 Suzuki, 2000 Hirst y Ward, 2003 Takaki, 2003). En la actualidad, existe un conjunto de pruebas acumuladas de que algunas gastroenteropatías implican un deterioro de los CPI. Por ejemplo, se ha demostrado que el número de CCI disminuye en pacientes con diabetes mellitus, que con frecuencia se complica por alteraciones de la motilidad del tubo digestivo y, en consecuencia, dificulta el control de la concentración de glucosa en sangre posprandial (Koch, 2001 Camilleri, pág. 2002).

Los potenciales de marcapasos subyacen a la actividad mecánica espontánea en el tracto GI. Hay varios estudios que informan que los canales iónicos plasmalemmales dependientes de Ca 2+ se activan periódicamente en los ICC (Tokutomi et al., 1995 Huizinga et al., 2002 Walker et al., 2002). Por tanto, se deduce que las oscilaciones de la concentración intracelular (citosólica) de Ca 2+ ([Ca 2+]I) en estas células son el mecanismo principal que genera potenciales de marcapasos. De hecho, hemos demostrado previamente que la actividad eléctrica espontánea ocurre en sincronía con [Ca 2+]I oscilaciones en regiones ricas en células inmunopositivas de c-Kit (Torihashi et al., 2002).

Se ha demostrado ampliamente en numerosas regiones del tracto GI que las actividades mecánicas y eléctricas espontáneas dependen en gran medida de la temperatura y son sensibles a los inhibidores metabólicos (por ejemplo, Tomita, 1981 Conner et al., 1974 Nakayama et al., 1997). Si marcapasos [Ca 2+]I Las oscilaciones en los ICC se generan a través de mecanismos que involucran y / o se ven afectados por señales relacionadas con el nivel de energía, tales mecanismos podrían ser responsables de esta característica ritmicidad espontánea del intestino.

A partir de las capas musculares del tracto gastrointestinal, hemos desarrollado recientemente una preparación de racimo de células cultivadas que contiene miembros celulares mínimos esenciales para investigar la motilidad gastrointestinal: músculo liso, neuronas entéricas e ICC (c-Kit-células intersticiales inmunopositivas). Esta preparación muestra contracciones espontáneas y conserva varios rasgos característicos observados en experimentos a nivel de tejido (Nakayama y Torihashi, 2002 Torihashi et al., 2002). Se plantea la hipótesis de que el vínculo entre la actividad del marcapasos intestinal y el metabolismo energético podría estar mediado por KATP canales y receptores de sulfonilurea (SUR). En el presente estudio, examinamos los efectos de KATP abridores de canal en marcapasos [Ca 2+]I oscilaciones en ICC y contracciones del músculo liso, utilizando preparaciones de grupos de células del íleon de ratón. También llevamos a cabo nuestros exámenes de RT-PCR e inmunotinción, y encontramos que SUR2 ocurre en células de músculo liso, mientras que, sorprendentemente, SUR1 es predominante en ICC. En consecuencia, observamos modulaciones de marcapasos [Ca 2+]I actividad y contracción, lo que refleja estas isoformas SUR distintas en ICC y músculo liso. Nuestros hallazgos pueden proporcionar una nueva visión de los mecanismos de control de la glucosa en sangre y también un vínculo entre la motilidad gastrointestinal y las enfermedades metabólicas.


Resonancia de membrana

Las oscilaciones del potencial de membrana por debajo del umbral en las neuronas a menudo se asocian con la resonancia de la membrana, la capacidad de amplificar la entrada a una frecuencia específica. En general, las oscilaciones de potencial de membrana y las resonancias de membrana en las neuronas son similares en mecanismo (Lampl y Yarom 1997 Moca et al. 2014 Tseng y Nadim 2010 Wu et al. 2001), lo que sugiere que la combinación de CaV1, CaV2.2, y los CaCC podrían explicar la resonancia de la membrana en las interneuronas LTS.

Los canales de calcio activados por voltaje son necesarios para la resonancia de la membrana.

La resonancia de la membrana se midió usando un estímulo chirrido en una pinza de voltaje (ver materiales y métodos). Como la oscilación del potencial de membrana (Fig.6A), la resonancia de la membrana dependía del voltaje (Fig.6B) y fue bloqueado por cadmio 400 μM (Fig.6C). La resonancia se mide como una reducción dependiente de la frecuencia en la amplitud de la corriente generada por la celda durante el comando de voltaje de amplitud constante. Además de su efecto sobre la resonancia, el cadmio aumentó la corriente de retención necesaria para mantener el potencial de membrana en −30 mV (de 9,0 ± 5,4 pA en TTX a 41,2 ± 6,2 pA en cadmio t = −5,62, df = 8, PAG & lt 0,001 Figura 6D). Esto refleja el cambio de potencial de membrana negativo causado por el cadmio en la pinza amperimétrica (Fig.2D). La resistencia de entrada (medida desde un paso de voltaje) no cambió con la aplicación de cadmio (TTX = 217 ± 58 MΩ vs.Cd 2+ = 215 ± 24 MΩ), como se muestra en la Fig.6mi, impedancia de frecuencia cero.

Figura 6.La resonancia de membrana en las interneuronas LTS requiere corrientes de calcio. Comparación de la sensibilidad al voltaje de la oscilación del potencial de membrana (A) con la resonancia de membrana (B). Las curvas de impedancia muestran la impedancia relativa, normalizada por la resistencia de entrada medida en cada potencial de retención. C: un ejemplo de la respuesta de la membrana a un protocolo chirp que se muestra antes y después de la aplicación de cadmio 400 μM. D: la corriente de retención para mantener el potencial de membrana a -30 mV aumentó significativamente después de la aplicación de cadmio. mi: los datos de la muestra representan el cambio en las curvas de impedancia cuando se bloquearon los canales de calcio dependientes de voltaje. La impedancia de frecuencia 0 indica la resistencia de entrada. F: la fase de la respuesta de la membrana perdió el cambio de fase positivo después de la aplicación de cadmio. Las barras de error son SE ***PAG & lt 0,005.

El cadmio bloqueó completamente la resonancia de la membrana. Las curvas de impedancia de membrana promedio para la muestra antes y después de la aplicación de cadmio se muestran en la Fig.6.mi. Hubo una reducción estadísticamente significativa en la impedancia entre 1 y 5 Hz, medida por un ANOVA de diseño mixto (F = 11,8, gl = 1, 17, PAG & lt 0,005).

Los cambios en la fase de la respuesta de la membrana fueron consistentes con la abolición de la resonancia (Fig.6F). Las resonancias están asociadas con fases positivas (voltaje que lidera la corriente) por debajo de la frecuencia de resonancia, y estas se perdieron después de la aplicación de cadmio.

El papel de los canales de calcio específicos dependientes de voltaje en la resonancia de membrana.

Al igual que la oscilación del potencial de membrana, la resonancia no se vio afectada por el bloqueo de CaV2.1 corrientes con ω-agatoxina 100 nM (Fig.7A1). Tampoco hubo cambios en la corriente de mantenimiento (TTX = 34,2 ± 5,1, ω-agatoxina = 39,6 ± 5,4 Fig.7A2) o resistencias de entrada (TTX = 166 ± 24 MΩ, ω-agatoxina = 172 ± 28 MΩ Fig.7A1, Impedancia de frecuencia 0). Asimismo, la fase de la respuesta de la membrana con respecto a la frecuencia de entrada no se vio afectada por la aplicación de ω-agatoxina (Fig.7A2).

Figura 7.Las corrientes de tipo L, no las corrientes de tipo P / Q, son necesarias para la resonancia de la membrana. A1: las curvas de impedancia de la muestra y la resistencia de entrada no mostraron ningún efecto de bloqueo de las corrientes de tipo P / Q. La impedancia de frecuencia 0 indica la resistencia de entrada. A2: la fase de la respuesta de la membrana tampoco se vio afectada por la ω-agatoxina recuadro: la corriente de mantenimiento (corriente H.) no se modificó mediante la aplicación de ω-agatoxina (A). T, TTX. B1: por el contrario, la aplicación de isradipina 5 μM redujo significativamente la impedancia en todas las frecuencias pero no cambió significativamente la resistencia de entrada. B2: el cambio de fase positivo en la respuesta de la membrana se redujo después de la aplicación de isradipina recuadro: isradipina (I) aumentó significativamente la corriente de mantenimiento requerida. Las barras de error son SE *PAG & lt 0,05.

CaliforniaV1 el antagonismo con isradipina 5 μM fue eficaz para bloquear la resonancia de la membrana (Fig.7B1). Debido a que la isradipina actúa lentamente, no comparamos los datos de las células individuales antes y durante la aplicación de isradipina, sino que, en cambio, se incubaron rodajas en isradipina durante todo el experimento y se utilizaron grupos separados de células para los tratamientos de control y de fármacos. Isradipino aumentó significativamente la corriente necesaria para mantener las neuronas a -30 mV después de la aplicación de isradipino (TTX = 28,5 ± 7,0 pA, isradipino = 53,5 ± 6,9 pA, t = -2,28, df = 7, PAG & lt 0.05, sin emparejar t-prueba). La corriente de retención en la isradipina fue similar a la observada en el cadmio (comparar las Fig.7B2 con 6C, respectivamente). No hubo cambios significativos en la resistencia de entrada en estado estable (TTX = 196 ± 21 MΩ, isradipina = 171 ± 14 MΩ), como se muestra en la Fig.7B1, impedancia de frecuencia cero.

Isradipino redujo significativamente la impedancia medida en interneuronas LTS (F = 4.14, df = 1, 37, PAG & lt 0.05 Figura 7B1). Antagonismo de Cav1 canales también resultaron en una reducción en el tamaño de la resonancia de la membrana, medida como una diferencia en las pendientes de la curva de frecuencia-impedancia entre 1 y 5 Hz (F = 3.07, df = 9, 342, PAG & lt 0,005), pero persistió una resonancia de membrana residual (F = 4,16, gl = 9, 342, PAG & lt 0,05). El efecto de CavEl antagonismo de 1 canal en la fase de la respuesta de la membrana se ve en la Fig.7B2. El cambio de fase positivo en la respuesta de la membrana a bajas frecuencias se redujo en gran medida después de la aplicación de isradipina, de acuerdo con la reducción del tamaño de resonancia de la membrana.

Bloqueo de CaV2.2 también alteró en gran medida la resonancia de la membrana de las neuronas. La aplicación de 1 μM de ω-conotoxina GVIA abolió la resonancia de la membrana (F = 3.93, df = 8, 162, PAG & lt 0,005 Figura 8A1). La impedancia se incrementó a bajas frecuencias, incluido un aumento significativo en la resistencia de entrada de estado estable de 206 ± 29 a 313 ± 59 MΩ (t = −2.67, df = 8, PAG & lt 0.05 Figura 8A1, Impedancia de frecuencia 0). A diferencia de la isradipina, la ω-conotoxina GVIA no cambió la corriente de mantenimiento requerida en estos voltajes (Fig.8A2). De acuerdo con su efecto sobre la resonancia de la membrana, la ω-conotoxina GVIA cambió la fase de la impedancia de una derivación a un retraso a bajas frecuencias (Fig.8A2).

Figura 8.Las corrientes de calcio de tipo N y los canales de cloruro activados por calcio son necesarios para la resonancia de la membrana. A1: la curva de impedancia de la muestra muestra un bloqueo de la resonancia de la membrana después de la aplicación de 1 μM de ω-conotoxina GVIA. La resistencia de entrada (impedancia de frecuencia 0) aumentó significativamente. A2: se evitó el avance de fase en la respuesta de la membrana después de la aplicación de ω-conotoxina GVIA recuadro: la corriente de mantenimiento no cambió después de bloquear las corrientes de calcio tipo N (C). B1: el bloqueo de CaCC con ácido niflúmico 100 μM impidió la expresión de resonancia de membrana, reduciendo el pico en el perfil de impedancia. La resistencia de entrada (impedancia de frecuencia 0) no cambió después de la aplicación de ácido niflúmico. B1: el ácido niflúmico impidió el avance de fase en la respuesta de la membrana recuadro: la corriente de mantenimiento no se alteró significativamente después de la aplicación de ácido niflúmico (N). Las barras de error son SE.

Tanto la isradipina como la ω-conotoxina GVIA inhibieron la resonancia de la membrana, pero lo hicieron de diferentes formas. Los efectos de la isradipina sobre la resonancia de la membrana y la corriente de retención fueron similares a los efectos del cadmio. La isradipina y el cadmio bloquearon la resonancia reduciendo la impedancia en un amplio rango de frecuencias sin afectar la resistencia de entrada. Por el contrario, la ω-conotoxina GVIA aumentó la impedancia a bajas frecuencias y la resistencia de entrada a niveles cercanos a las mediciones de impedancia máxima en TTX.

Los CaCC son necesarios para la resonancia de la membrana.

El bloqueo de CaCC con 100 μM NFA abolió la resonancia de membrana (Fig.8B1). No hubo cambios significativos en la corriente de mantenimiento (Fig.8B2) o resistencia de entrada (Fig.8B1, Impedancia de frecuencia 0). El cambio en las curvas de impedancia se asemeja al efecto de la aplicación de cadmio o isradipina. Después de bloquear los CaCC, la resonancia de la membrana se redujo significativamente (F = 4,42, gl = 13, 208, PAG & lt 0.005), aunque todavía había un pequeño pico en la curva de impedancia (F = 8.05, df = 13, 208, PAG & lt 0,01). La fase de la respuesta de la membrana cambió de un avance de fase por debajo de la frecuencia de resonancia a ningún avance de fase después de la aplicación de NFA (Fig.8B2).


Abstracto : La interacción entre un oscilador de membrana generado por canales iónicos dependientes de voltaje y un oscilador de señal de calcio intracelular estuvo presente en los primeros modelos (1984 a 1985) utilizando representaciones del retículo sarcoplásmico. La liberación oscilatoria de calcio es inherente al proceso de liberación de calcio inducido por calcio. Estos resultados históricos apoyan plenamente la síntesis propuesta en los artículos de esta serie de revisión. Los mecanismos del oscilador no compiten principalmente entre sí. Sin embargo, existe cierta asimetría: el oscilador de membrana puede continuar indefinidamente en ausencia del oscilador de calcio. Lo contrario parece ser cierto solo en condiciones patológicas. Los estudios del trabajo a nivel de tejido y sobre el desarrollo del corazón también proporcionan información valiosa sobre la acción integradora del marcapasos cardíaco.

Los primeros modelos de ritmo cardíaco, comenzando con el de Noble, 1 se restringieron a las interacciones entre los canales iónicos de la membrana de la superficie. El primer modelo de células cardíacas que incorporó el sistema de señalización de calcio intracelular involucrado en el acoplamiento de excitación-contracción fue el de DiFrancesco y Noble. 2 Ese modelo fue desarrollado para fibras de Purkinje de oveja, y fue el primero en predecir un papel importante para la corriente de intercambio de sodio / calcio durante el potencial de acción. De hecho, identificó los componentes más lentos de la corriente de entrada que previamente se habían atribuido a la corriente del canal de calcio como atribuibles en su lugar al intercambiador. La actividad del marcapasos en ese modelo se atribuyó casi en su totalidad a la lenta aparición de la corriente catiónica inespecífica, iF, activado por hiperpolarización. En ese caso, no se predijo que la corriente de intercambio desempeñara ningún papel en el ritmo del marcapasos.

Sin embargo, el modelo de fibra DiFrancesco-Noble Purkinje se desarrolló casi de inmediato para crear el primer modelo matemático para reproducir formas de onda de voltaje similares a las observadas en las células del nodo sinoauricular (SAN) de conejo. 3 También se desarrolló posteriormente para crear los primeros modelos de células auriculares de conejo. 4,5 Para los mecanismos de señalización del calcio intracelular, los modelos de la década de 1980 se basaron en el trabajo de Fabiato sobre la liberación de calcio inducida por calcio. 6

La base experimental del modelo SAN fue el trabajo de Brown et al, 7,8 que reveló la presencia de componentes muy lentos de la corriente de entrada similar a la predicha para la corriente de intercambio sodio / calcio durante el potencial de acción. De hecho, el modelado dio confianza en que estas grabaciones experimentales no eran artefactos de sujeción de voltaje.

Uno de los colaboradores en ese trabajo experimental, Junko Kimura, colaboró ​​posteriormente con Akinori Noma para medir la dependencia del voltaje y la concentración de iones de la corriente de intercambio sodio / calcio en condiciones altamente controladas. 9,10 Los resultados coincidieron notablemente con las ecuaciones utilizadas en los modelos. Se puede ver que todos los desarrollos posteriores de modelos de señalización de calcio y de intercambio de sodio / calcio en el corazón derivan de los modelos de la década de 1980.

Entre los resultados experimentales sobre la SAN de conejo, hubo 2 hallazgos importantes que se relacionan con las controversias actuales. La primera fue que, al investigar las corrientes de entrada durante las despolarizaciones de pinza de voltaje, a menudo se observaron 2 componentes claros. Basado en el trabajo de modelado, el primero de estos se atribuyó a la activación de la corriente de calcio tipo L (llamada Isi en trabajos iniciales), mientras que el segundo componente, mucho más lento, se atribuyó a la activación del intercambio sodio / calcio durante la liberación de calcio después de la aparición del potencial de acción.

El modelo de computadora reprodujo correctamente estos 2 componentes (ver Figura 9 en Brown et al 8). Esos cálculos originales se realizaron utilizando OXSOFT HEART. Hemos repetido los cálculos para este artículo utilizando el software COR (www.cor.physiol.ox.ac.uk) disponible públicamente y la versión codificada CellML del modelo descargado del repositorio de modelos CellML (www.cellml.org). Los resultados se muestran en la Figura 1. Son muy similares a la figura original pero la amplían al revelar las contribuciones separadas de ICalifornia y INaCa. El trabajo experimental posterior 11 confirmó completamente las predicciones de los modelos con respecto a la corriente de intercambio de sodio / calcio durante el potencial de acción.

Figura 1. Corrientes de intercambio de sodio / calcio en el modelo de DiFrancesco-Noble (1985). 2 Arriba (A), Resultados experimentales obtenidos por Kimura et al 1987 utilizando células ventriculares de cobaya. 10 Corriente de intercambio en el modo de entrada (correspondiente a la entrada de sodio y la salida de calcio) en función del potencial de membrana a diferentes concentraciones de iones de sodio extracelulares. Arriba (B), Curvas correspondientes calculadas a partir de las ecuaciones utilizadas para la corriente de intercambio sodio / calcio en el modelo (tenga en cuenta que estos resultados se obtuvieron antes que los experimentales). Fondo, Variaciones de corrientes iónicas (IK, ICoste y flete [ahora ICalifornia], IF, y INaCa) durante la acción calculada y los potenciales de marcapasos. Nótese la importante corriente de intercambio hacia adentro predicha durante la meseta del potencial de acción. Este cálculo se realizó para este artículo utilizando COR y es exactamente el mismo que el publicado en 1985.

Habiendo establecido el rendimiento de esos modelos en lo que respecta al potencial de acción, pasamos ahora a la despolarización del marcapasos. Ésta es la pregunta crítica. Durante las despolarizaciones por pinzamiento de voltaje, la corriente de intercambio de sodio / calcio, que refleja el curso temporal del calcio intracelular transitorio, siguió invariablemente el inicio y la inactivación de la corriente del canal de calcio. Por el contrario, esta relación temporal a menudo se invirtió durante la despolarización del marcapasos. La Figura 2 muestra el protocolo experimental utilizado para revelar esto en el trabajo de 1984. La despolarización natural del marcapasos se interrumpió en varios momentos fijando el voltaje al alcanzado en el momento del inicio de la pinza. Si este tiempo fue lo suficientemente tarde (aproximadamente, durante el último tercio de la despolarización del marcapasos), se registró una corriente de entrada lenta cuyo curso de tiempo se asemejaba al componente lento registrado durante las despolarizaciones estándar de pinza de voltaje. Sin embargo, no hubo una activación anterior visible de la corriente de calcio. Se interpretó que esto indicaba la posibilidad de que la liberación de calcio durante la actividad del marcapasos del nódulo sinusal pudiera preceder a la activación de la corriente de calcio, como lo observaron Lakatta et al. 12 La Figura 2 muestra nuevos cálculos de este fenómeno utilizando COR y el archivo CellML descargado para el modelo SAN de 1984.

Figura 2. Liberación de calcio que precede a la activación de ICaL. Arriba a la izquierda, Uno de los registros experimentales realizados en el nódulo sinoauricular de conejo por Brown et al (Figura 9 en el artículo, 8 traza a -44 mV). Se permitió que el potencial de membrana cambiara espontáneamente durante un potencial de acción y durante la mayor parte de la despolarización posterior del marcapasos. Cerca del final de esta despolarización, pero claramente antes de la subida del potencial de acción, el potencial de membrana estaba sujeto al potencial alcanzado.Se registró una corriente interna transitoria lenta, cuyo inicio es mucho más lento que el de la corriente de calcio tipo L. Requiere ≈100 ms para alcanzar su pico. Abajo a la izquierda, Protocolo de voltaje utilizado para repetir la simulación de 1984 de estos resultados utilizando el modelo SAN desarrollado a partir del modelo DiFrancesco-Noble. La escala vertical está en milivoltios. La escala horizontal está en segundos. Parte superior derecha, Corrientes iónicas netas calculadas correspondientes a los tres niveles del potencial de pinza en el protocolo de abajo a la izquierda. La sujeción en el medio de la despolarización del marcapasos simplemente genera un desarrollo suave de la corriente interna neta correspondiente a la desintegración de IK y comienzo de IF. La curva media (interrumpida) genera una corriente interna transitoria lenta similar a la de la traza experimental (arriba a la izquierda). los curva punteada genera un pico doble cuando la corriente de calcio tipo L. comienza a activarse. La escala vertical está en nA escala horizontal en segundos. Abajo a la derecha, Variaciones calculadas en la corriente de intercambio de sodio / calcio durante los tres protocolos de voltaje.

Por tanto, la esencia de la hipótesis de Lakatta estuvo presente en las primeras simulaciones de la señalización del calcio en las células cardíacas.

¿Por qué Brown et al no atribuyeron la despolarización del marcapasos en sí a este mecanismo? La razón principal fue que, aunque en los experimentos se registraron a menudo corrientes iónicas de entrada lentas de este tipo, casi siempre se extinguieron después de 1 o 2 oscilaciones. Por tanto, el mantenimiento del oscilador de señal de calcio no era independiente del oscilador de corriente iónica dependiente del voltaje.

Tabla 2. Abreviaturas y acrónimos no estándar

¿Cómo interactúan los diferentes osciladores?

Para investigar la contribución de las diversas corrientes de iones, comparamos los resultados de simulación de los 6 modelos matemáticos de células SAN disponibles en el repositorio CellML: Demir et al, 12a Dokos et al, 12b Kurata et al, 12c Maltsev y Lakatta, 12d Noble y Noble, 12e y Zhang et al. 12f Para mayor claridad de las figuras, mostramos solo los resultados de los últimos 4 modelos en las figuras, pero incluimos los resultados de todos los modelos en el texto.

La Figura 3 muestra el potencial de membrana, la concentración de calcio intracelular y las corrientes de entrada que los modelos tienen en común: Corriente de tipo L de Ca 2+ (ICalifornia), Intercambiador de Na + / Ca 2+ (INaCa), corriente divertida (IF), y la corriente de sodio de fondo (IbNa).

Figura 3. Resumen de modelos, oscilaciones y corrientes subyacentes. Tenga en cuenta que IF(línea continua en los gráficos inferiores) es siempre la más pequeña de las corrientes de entrada (ICalifornia, INaCa, IbNa, y IF).

los ICalifornia muestra la mayor amplitud de las corrientes en todos los modelos, y la máxima INaCa la corriente es mayor que IF y IbNa, excepto en el modelo de Zhang, que tiene una concentración de calcio intracelular constante para simplificar el modelo. IF es en todos los modelos más pequeño que el IbNa.

Cuando ahora bloqueamos las diversas corrientes, una a la vez (ver Figura 4), ¿qué sucede con las oscilaciones del potencial de membrana (y del calcio) en los modelos de células SAN? Todos los modelos (Demir, Zhang, Maltsev, Dokos, Noble, Kurata) coinciden en la importancia de ICalifornia: sin activación de esta corriente de calcio, las oscilaciones SAN no se producen. Los modelos están de acuerdo con la observación experimental de que sin absorción o liberación de calcio del retículo sarcoplásmico (SR), las oscilaciones no se detienen (y un aumento del 2% en la corriente de sodio de fondo conduce a que no falten latidos en el modelo de Maltsev). Además, bloque completo de IF no detiene las oscilaciones en ninguno de los modelos.

Figura 4. El voltaje se rastrea cuando una o varias corrientes del modelo están completamente bloqueadas en t = 2 segundos. Las filas denotan bloque de ICalifornia y IGato, de INaCa, de las corrientes de fondo (ver más abajo), de IF, y de Ihasta. Los latidos que faltan en el modelo de Maltsev en el bloque de SERCA desaparecen cuando IbNa se incrementa en un 2%. "Corrientes de fondo" bloqueadas en los modelos respectivos: Maltsev (IbCa y IbNa), Kurata (IbNa y IS tN / A), Zhang (IbCa y IbNa), Dokos (IbNa y IN / A).

Entonces, es solo ICalifornia necesario para las oscilaciones? ¿Qué está causando realmente las oscilaciones en los modelos? En todos los modelos, existe una serie de corrientes internas de fondo o sostenidas (IbNa, IbCa, IS t), y ponerlos a cero suprime o disminuye las oscilaciones en 4 de los modelos (Kurata, Maltsev, Noble, Demir) ¿significa eso que las corrientes de fondo pueden ser más importantes que IF y el ciclo de Ca 2+ intracelular? Claramente, estamos tratando aquí con un sistema multifactorial en el que incluso corrientes iónicas que no muestran propiedades dinámicas intrínsecas (que es la definición de una corriente de "fondo") o corrientes que aún no se han caracterizado completamente (como IS t) juegan un papel cuantitativo importante. IS t Guo et al (1995) lo caracterizaron por primera vez como una corriente de entrada sostenida de Na +, que está activa durante la fase de despolarización, pero debido a la falta de disponibilidad de un bloqueador específico, ha sido imposible investigar la importancia de esta corriente en células SAN completas. .

La eliminación de INaCa también suprime las oscilaciones (en todos los modelos, excepto en el modelo de Zhang, que tiene concentraciones de iones fijas). INaCa la mayor parte del tiempo es una corriente de entrada que expulsa Ca 2+ de la celda (ver Figura 4). Al establecer adicionalmente la concentración de SR Ca 2+ para constante el bloqueo de INaCa solo cambia la frecuencia, pero no elimina las oscilaciones por completo. Por lo tanto, es la sobrecarga de Ca 2+ resultante con total INaCa bloque que conduce a la terminación de las oscilaciones. Como también existen otras bombas e intercambiadores en las celdas SAN para extruir Ca 2+ de la celda (evitando la sobrecarga de Ca 2+), que no están presentes en los modelos matemáticos, no está claro si el bloque completo de INaCa aboliría las oscilaciones en las células reales.

El análisis de sensibilidad del período SAN con respecto al bloqueo de corrientes de iones y bombas se realizó en el estado estacionario del modelo (300 segundos después del cambio). La Tabla muestra que los modelos muestran consistentemente un aumento en el período de 0,7 a 1,87%, 0,77 a 4,82%, 0,14 a 0,83% y 0,83 a 1,34% con un bloque de 10% IGato, IbNa, IF, y IS t, respectivamente. Las corrientes y bombas relacionadas con el sistema de calcio intracelular muestran resultados bastante diversos para los diferentes modelos (bloque de ICalifornia, INaCa, y Ihasta condujo a una disminución en el período en Demir versus un aumento en Maltsev). Suponemos que esta falta de consistencia es atribuible a las diferencias en el manejo del calcio en los modelos.

Tabla 1. Análisis de sensibilidad del período SAN

En general, se pueden observar las mayores sensibilidades para IbNa/IS t y viene el segundo IGato (ignorando los valores inconsistentes para ICalifornia). El modelo de Maltsev proporciona una excepción, con Ihasta inducir el mayor cambio en el período (seguido de IbNa y IGato).

Un análisis de bifurcación podría proporcionar más información sobre el comportamiento dinámico de los modelos, pero estaría más allá del alcance de este artículo. Tenga en cuenta también que todos los resultados detallados deben interpretarse con precaución porque los modelos no se han ajustado y construido para este tipo de investigaciones, es decir, el análisis podría estar fuera del rango predictivo de los modelos.

Los modelos sugerirían 3 características importantes de acción concertada que conducen y mantienen las oscilaciones en las células SAN: la fase de despolarización lenta a través de corrientes de entrada (IF, IS t, [IbNa]), activación de las corrientes de calcio hacia el interior (ICalifornia, IGato), extrusión de calcio (INaCa, IpCa?). La importancia de la liberación de SR podría residir en la estabilización de las oscilaciones a través de frecuencias como lo indicaron Maltsev y Lakatta, 12d, pero en su artículo, también muestran que la liberación de SR no está realmente impulsando las oscilaciones (ver Figura 5C en su artículo).

Perspectivas de los estudios de tejidos y del desarrollo del corazón

Los estudios que hemos comentado hasta ahora se centran en el nivel de los canales iónicos y la integración de su actividad en el nivel de las células individuales. Las otras contribuciones a este tema hacen valiosas contribuciones al debate a nivel tisular, particularmente en lo que respecta al uso de imágenes con indicadores sensibles al voltaje o al calcio 13 y los conocimientos que surgen del estudio del desarrollo de los tejidos del marcapasos. 14

Estos estudios muestran que la fisiología integradora de la actividad del marcapasos no termina con el análisis de la actividad celular. De hecho, ha sido evidente desde el primer trabajo de mapeo electrofisiológico que el nodo sinusal actúa como algo más que unos pocos miles de células que laten en sincronía. Dependiendo de las condiciones fisiológicas precisas, el origen aparente de la actividad del marcapasos puede cambiar de una región del nodo a otra. 15-17 Nos referimos al “origen aparente” porque sería una simplificación excesiva suponer que el área que conduce la despolarización determina de manera única lo que sucede (ver también en otra parte 18). La corriente eléctrica fluye entre dos celdas conectadas que se encuentran a diferentes potenciales, y esta corriente debe influir en las celdas principales (ralentizándolas) tanto como influye en las celdas seguidoras (acelerándolas). Los primeros cálculos de la interacción de célula a célula en el nodo sinusal utilizando computadoras paralelas mostraron que incluso una conectividad muy baja (solo unos pocos canales de conexina entre cada célula) podría sincronizar las células con ritmos inherentemente diferentes. 19-21 Estos cálculos también revelaron que las células con un ritmo intrínsecamente rápido, ubicadas en la periferia del nodo, y que por lo tanto 'conducirían' la despolarización en un nodo aislado, se convierten en las células seguidoras cuando el nodo está conectado a la aurícula. . Boyett y sus colegas demostraron experimental y computacionalmente 22 que aislar el nodo sinusal altera la dirección de propagación, con las células principales cambiando del centro a la periferia, y un trabajo más reciente de Boyett y sus colegas ha enfatizado aún más cómo la arquitectura del nodo influye en su función. 23 La anatomía y la fisiología interactúan necesariamente a nivel de los tejidos. Un valioso conjunto de ideas del debate entre Efimov y Federov versus Joung y Lin en Investigación de circulación 13 es que el origen del impulso es multicéntrico y que las células individuales y el nódulo intacto reaccionan de manera diferente a los fármacos y a los cambios genéticos.

¿El trabajo a nivel de tejido arroja algo de luz sobre las funciones relativas de la membrana y las oscilaciones generadas por el calcio? Este es el foco central del debate entre Efimov y Federov versus Joung y Lin. En principio, el uso de marcadores sensibles al voltaje para buscar múltiples formas de onda podría ser una contribución importante. Y, de hecho, los tintes sensibles al voltaje dan resultados que difieren de los registros de microelectrodos. Efimov y Federov atribuyen esto al hecho de que los tintes registran desde una región extendida que puede incluir células y tejidos de diferentes tipos y, por lo tanto, necesariamente dan resultados compuestos. En contra de esto, Joung y Lin señalan el hecho de que las imágenes de calcio confocal a veces pueden mostrar cambios de calcio que conducen a cambios de voltaje hacia el final de la despolarización del marcapasos, particularmente en presencia de isoproterenol. Será difícil analizar un conjunto tan complicado de interrelaciones. Coincidimos con la observación de que el trabajo futuro “requerirá una estrecha colaboración entre los modeladores matemáticos y los experimentadores para diseccionar el papel de los componentes individuales” 13, pero agregaríamos que “diseccionar” ya sesga el análisis. En los sistemas interactivos no lineales, atribuir roles relativos a diferentes componentes puede ser engañoso. Lo que importa es la función "integradora". Como también se señaló en ese estudio, los diferentes mecanismos funcionan de manera sinérgica. Debido a la no linealidad, esto significa necesariamente que la atribución de las contribuciones cuantitativas de los componentes individuales depende del contexto fisiológico y patológico. Este contexto incluye el hecho de que el flujo de información entre el genoma y el fenotipo no es unidireccional. El fenotipo no es un producto estático de sus genes (revisado en otra parte 24,25). Hay retroalimentación descendente del fenotipo para controlar la expresión génica. En esta serie de reseñas hay disponibles buenos ejemplos, que incluyen, en particular, la regulación a la baja de 2 corrientes importantes de marcapasos, IF y IKs, durante las taquiarritmias auriculares. Por lo tanto, la actividad en la aurícula puede remodelar el perfil de expresión génica en el nódulo sinusal.

La remodelación de la expresión génica nos lleva naturalmente a considerar la otra contribución importante a este número específico de la revista porque, como muestran Christoffels et al 14, el desarrollo del corazón depende de la supresión de la expresión génica a medida que el embrión se convierte en adulto. Todos los miocitos cardíacos en el embrión temprano muestran ritmo de marcapasos. El cambio a las formas adultas se produce mediante la represión de los patrones de expresión génica que se desarrollan para permitir que las células miocárdicas adultas en funcionamiento se diferencien. Como consecuencia, las células marcapasos adultas se parecen a las del embrión temprano. Por tanto, la identificación de los represores transcripcionales implicados es un objetivo importante. Como muestran Christoffels et al, esta es un área de rápido desarrollo y contiene la promesa de que eventualmente conoceremos la base molecular del desarrollo embrionario del corazón. Estos conocimientos también serán importantes para comprender la función adulta porque hay un recambio continuo de la expresión génica. Ponard et al 18 han demostrado recientemente que las variaciones en los niveles de expresión durante la renovación de los canales iónicos desempeñan un papel en la variabilidad de la frecuencia cardíaca utilizando una combinación de cultivos de miocitos y modelos informáticos.

Conclusiones

Los datos experimentales y el trabajo de modelado in silico muestran la complejidad del sistema multifactorial de excitación SAN. La contribución de IF y su importancia como objetivo farmacéutico ha sido probada por el desarrollo exitoso de la ivabradina y se describe con más detalle en el artículo de revisión de DiFrancesco 26 en esta serie de revisión. Otras corrientes parecen estar involucradas en la fase de despolarización (IS t, corrientes mecanosensibles 27 y otros) cuyas contribuciones relativas aún están por determinar.

Parece casi obvio que también la aceleración rápida al final de la fase de despolarización tiene un gran impacto en la frecuencia de despolarización mediante el ajuste del umbral de activación. La evidencia presentada por Lakatta et al 12 en esta serie de revisión subraya también la influencia de la liberación de SR Ca 2+ en la generación de la carrera ascendente (además de IGato y ICalifornia), mostrando en extremo similitudes con las posdespolarizaciones tardías.

Ya, el trabajo experimental y de modelado más temprano mostró (consistente con los hallazgos actuales) que ninguno de los dos IF ni la liberación espontánea de Ca 2+ del SR por sí sola es o puede estar impulsando la actividad de marcapasos. Siempre es necesaria una acción concertada e interacción entre los diversos canales iónicos. Además, la regulación de la frecuencia cardíaca a través de cAMP está influenciada e influye en múltiples canales de iones, bombas e intercambiadores, creando así un sistema robusto y estable, pero aún flexible, que mantiene los miles de millones de latidos cardíacos en una vida normal.

El trabajo futuro probablemente descubrirá incluso más mecanismos que influyen en la frecuencia cardíaca que podrían ser objetivos aún más relevantes en enfermedades y patologías específicas que las vías conocidas actualmente.

Original recibido el 12 de febrero de 2010 revisión recibida el 27 de abril de 2010 aceptado el 28 de abril de 2010.

Recursos de fondos

El trabajo en el laboratorio de los autores está financiado por la Unión Europea (Framework 6, BioSim y Framework 7, VPH-PreDiCT) y la British Heart Foundation.


Ver el vídeo: Canales iónicos, estructura y función (Junio 2022).