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Potencial de membrana después de la exposición al glutamato

Potencial de membrana después de la exposición al glutamato


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Las neuronas se mantuvieron en una solución fisiológica. Durante la fase de reposo, el potencial de membrana en el axoplasma de las neuronas fue negativo en comparación con el espacio extracelular y se observó una diferencia de potencial de -70 mV en esta fase. Luego, las neuronas se trataron en dos experimentos diferentes con ácido gamma-amino butírico (GABA; un neurotransmisor inhibidor) o glutamato (un neurotransmisor excitador) y se registraron los potenciales de membrana. Elija las declaraciones correctas:

(A) El potencial de membrana en reposo de -70 mV no cambiaría con los tratamientos con GABA o glutamato.

(B) El potencial de membrana sería incluso más negativo que la fase de reposo con el tratamiento con GABA.

(C) El potencial de membrana sería positivo cuando la neurona estuviera expuesta al glutamato.

(D) El potencial de membrana sería más negativo que el potencial de reposo después del tratamiento con glutamato.

Desde entonces, siento que el glutamato es excitador, por lo que el potencial de reposo debería disminuir cuando se expone al glutamato y aumentar cuando se expone al GABA. Entonces (A) y (D) se eliminan automáticamente y (B) es la respuesta correcta. Estoy confundido en (C)


Es más correcto llamarlo "diferencia de potencial en reposo" (como su pregunta), porque el potencial eléctrico es relativo, no absoluto.

Esa redacción expone un punto crucial: la diferencia de qué? Los citoplasmas celulares están cargados negativamente (para recordar esto, es útil recordar que los protones generalmente se bombean fuera del citosol hacia el periplasma, las vesículas, el espacio intermemberano mitocondrial o fuera de la célula). Si resta el potencial del exterior del interior, obtendrá +70. Si lo hace al revés, obtendrá -70. Por convención, la sonda (+) del voltímetro está pegada dentro de la celda y la (-) está pegada afuera, por lo que terminamos con la cifra "oficial" de -70 mV.

Obviamente, a la naturaleza no le gusta esta diferencia de potencial y quiere neutralizarla empujando la corriente a través de la membrana. Afortunadamente, la membrana no es muy conductora y la célula puede gastar energía para deshacer los efectos de cualquier fuga y evitar que la [diferencia] de potencial se desvíe hacia 0 (en realidad, se desviaría hacia un número superior a 0 porque la diferencia de potencial no es la única factor, también existe la diferencia de concentración).

Entonces, la celda es como una batería que se mantiene cargada. También tiene un umbral, y solo se vaciará si se ha descargado al menos hasta cierto punto. Ese punto depende de la celda, pero un valor típico es -55 mV (más cerca del punto de equilibrio que el -70 mV en reposo).

¿Qué hará una sustancia química inhibidora como GABA? Alejará más la celda del umbral, por lo que será más difícil superarlo. Llevar -70 mV a -90 mV lo estaría bajando (porque el número baja).

¿Qué hará una sustancia química excitadora como el glutamato? Acercará la celda al umbral, por lo que será más fácil superarlo. Llevar -70 mV a -55 mV lo elevaría (porque el número aumenta).

La pregunta, desafortunadamente, no especifica si el potencial de acción se dispara. Normalmente, el pico del AP es +40 mV. En teoría, podría tener un umbral, digamos, a +20 mV, y luego tal vez el potencial podría volverse positivo (por ejemplo, +10 mv) y permanecer allí. Pero realmente, realmente dudo que puedas encontrar una celda con un umbral superior a 0. Si el umbral está por debajo de cero, entonces la celda voluntad alcanzar una diferencia de potencial positiva (si usa suficiente glutamato para provocar el AP), pero solo permanecerá allí momentáneamente antes de colapsar de nuevo a -80 mV (el estado refractario).


Creo que C también tiene razón. Los neurotransmisores excitadores abren canales $ ce {Na} $ lo que hace que la membrana celular sea más permeable al sodio en comparación con el potasio y, por lo tanto, el potencial de equilibrio de la membrana estaría mucho más cerca del potencial nervioso del sodio. Ahora, dado que la concentración de sodio en el exterior es mucho mayor que en el interior, el potencial nernst del sodio es positivo con respecto al interior de la membrana. Esto hace que el potencial general también sea positivo.

Si desea obtener más aclaraciones sobre el cálculo del equilibrio y el potencial nervioso a través de la membrana, no dude en preguntar.

APÉNDICE

Las concentraciones aproximadas de sodio y potasio dentro y fuera de una célula son: -
$$ ce {Na + _ {in}} = 10 text {mmoll} ^ {- 1} $$ $$ ce {K + _ {in}} = 105 text {mmoll} ^ {- 1} $$ $$ ce {Na + _ {out}} = 140 text {mmoll} ^ {- 1} $$ $$ ce {K + _ {out}} = 5 text {mmoll} ^ {- 1} $$

El potencial de Nernst viene dado por $ E = - frac {RT} {nF} ln frac { text {in}} { text {out}} $

Lo que para las concentraciones dadas resulta ser $ + 67.7mV $ para sodio y $ -78.1mV $ para potasio. Durante un potencial de acción suficientemente fuerte, la permeabilidad relativa del sodio con respecto al potasio se convierte en $ 10 $. El uso de la ecuación GHK (ignorando la contribución de cloro) nos da un potencial neto de $ + 47.5mV $.

El gráfico del potencial de acción indica claramente que en el pico del AP, el potencial de membrana es positivo. Fuente: Gráfico de potencial de acción


No creo que ninguna de las respuestas aquí sea del todo correcta, así que intentaré:

(A) El potencial de membrana en reposo de -70 mV no cambiaría con los tratamientos con GABA o glutamato.

La respuesta aquí es: "Depende".

Para el glutamato, si la neurona solo tuviera receptores de NMDA que no estuvieran "abiertos" a -70 mV, no habría cambios en el potencial de membrana en reposo. Sin embargo, si hubiera al menos algunos receptores AMPA, el potencial de membrana cambiaría a más positivo.

Para GABA, si la célula tiene solo receptores GABAa, entonces el potencial de membrana en reposo no cambiaría, porque el potencial de inversión de GABAa está ahí a -70 mV. Pero si la célula tuviera al menos algunos receptores GABAb, su potencial de reversión es de alrededor de -100 mV, por lo que provocaría un cambio en el potencial de membrana en reposo a algo más negativo que -70 mV.

(B) El potencial de membrana sería incluso más negativo que la fase de reposo con el tratamiento con GABA.

Una vez más, si solo hay receptores GABAa, entonces no, no sería más negativo y, de hecho, permanecería igual a -70 mV. Si hay receptores GABAb, entonces sí, el potencial de membrana en reposo sería aún más negativo.

(C) El potencial de membrana sería positivo cuando la neurona estuviera expuesta al glutamato.

Tal vez, depende de si se permite que la neurona tenga un potencial de acción. Los receptores de glutamato generalmente se invierten alrededor de 0 mV. 0 mV no es ni positivo ni negativo. Si no hubiera potencial de acción en esta neurona, por lo tanto, no deberíamos decir que la membrana sería "positiva" (aunque supongo que se trata de una división de cabello). Sin embargo, podría decirse que es "más positivo que -70 mV". Sin embargo, si se permitiera que la célula tuviera un potencial de acción, entonces sí, el potencial de membrana se dispararía hasta aproximadamente +20 mV, por lo que podría decirse que es positivo.

(D) El potencial de membrana sería más negativo que el potencial de reposo después del tratamiento con glutamato.

No. Nuevamente, el potencial de inversión de los receptores de glutamato es de aproximadamente 0 mV, por lo que solo movería el potencial de membrana a valores más positivos, cerca o justo a 0 mV.


El mecanismo de retención del potencial de la membrana mitocondrial después de la liberación del citocromo C en células neurales apoptóticas GT1-7

Se investiga la relación entre el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨMETRO), respiración y citocromo C (cyt C) lanzamiento en un solo neural bcl-2 células transfectadas (GT1-7bcl-2) o GT1-7puro células durante la apoptosis inducida por estaurosporina (STS). Bcl-2 inhibió la liberación mitocondrial de cyt C y apoptosis. Se identificaron tres respuestas celulares diferentes a STS en GT1-7puro celdas: (i) ni ΔΨMETRO ni cyt C se vieron significativamente afectados (ii) una disminución en ΔΨMETRO fue acompañado por una liberación completa de cyt C o (iii) cyt C la liberación ocurrió independientemente de una pérdida de ΔΨMETRO. La fuga de protones de la membrana interna endógena del en el lugar mitocondrias, monitoreadas por la respiración en presencia de oligomicina, fue incrementada por STS en un 92% en puro células, pero sólo el 23% en bcl-2 células. STS disminuyó la capacidad respiratoria, en presencia de protonóforo, en un 31% en puro células y en un 20% en bcl-2 células. En ausencia de STS, oligomicina hiperpolarizó las mitocondrias dentro de ambos puro y bcl-2-células transfectadas, lo que indica que los orgánulos eran generadores netos de ATP. Sin embargo, después de 15 h de exposición a la oligomicina STS colapsó rápidamente la polarización mitocondrial residual en el puro celdas, lo que indica que ΔΨMETRO se había mantenido mediante la reversión de la ATP sintasa. bcl-2 células en contraste, mantenido ΔΨMETRO hasta que se añadió el protonóforo. Estos resultados indican que el mantenimiento de ΔΨMETRO después de la liberación de cyt C puede ser una consecuencia de la inversión de ATP sintasa y la hidrólisis citoplásmica de ATP en células GT1-7 tratadas con STS. Diferenciación y muerte celular (2001) 8, 995–1003


Abstracto

El glutamato despolariza o hiperpolariza las neuronas de la retina. Esos son los efectos iniciales y primarios. Usando una sonda de voltaje (oxonol, DiBaC4 (5)) para estudiar las neuronas de la retina del pez cebra disociadas, encontramos un efecto secundario a más largo plazo: una restauración post-excitadora del potencial de membrana, denominada post-hiperpolarización (AHP). La AHP ocurre solo en neuronas que son despolarizadas por glutamato y típicamente alcanza su pico alrededor de 5 min después de la aplicación de glutamato. La AHP se observa en células horizontales disociadas (HC) y en células bipolares (HBC) hiperpolarizantes o de tipo OFF. Estas células responden comúnmente con solo un componente AHP. La AHP nunca ocurre en células bipolares (DBC) despolarizantes o de tipo ON, que son tipos de células hiperpolarizadas por glutamato. AHP está bloqueado por 6-ciano-7-nitroquinoxalina-2,3-diona (CNQX). Es evocado por kainato, AMPA y el agonista selectivo de AMPA (S) -5-fluorowillardiina, pero no por NMDA, d-aspartato, el agonista selectivo de cainato SYM 2081 o por ácido dl -2-amino-4-fosfonobutírico (dl -AP4). Las células con respuestas exclusivamente AHP se despolarizan tónicamente. La nifedipina puede restaurar los potenciales en reposo, lo que sugiere una acción tónica y despolarizante de los canales de Ca 2+ de tipo L. Sin embargo, la nifedipina no bloquea la AHP y es insensible a [Cl -]o. AHP está bloqueado por Li + o sustitución de Na + o y por ouabain. Se propone un mecanismo en el que el Na + que ingresa a través de los canales ionotrópicos AMPA estimula la Na +, K + -ATPasa, la cual, por acción electrogénica, restaura el potencial de membrana generando la respuesta AHP. Los patrones de inmunorreactividad de ATPasa apoyan la localización en la capa plexiforme externa (OPL) a medida que los pedículos de los conos, los HC y los BC se marcaron positivamente. El etiquetado fue más débil en la capa plexiforme interna (IPL) que en las capas nucleares, aunque se pudieron distinguir dos bandas IPL de terminales BC inmunorreactivas, una en la sublamina a y el otro en sublamina B. La estimulación persistente de la retina distal por el glutamato fotorreceptor puede inducir un aumento de la expresión y actividad de Na +, K + -ATPasa, con el consiguiente impacto en las respuestas de glutamato distal.

La Na +, K + -ATPasa se expresa en gran medida en la capa plexiforme externa de la retina (OPL) (McGrail & Sweadner, 1986 Yazulla & Studholme, 1987 Wetzel et al. 1999), y la actividad de Na +, K + -ATPasa se mide fácilmente en las neuronas retinianas distales (Shimura et al. 1998 Zushi et al. 1998). Se ha estudiado poco el papel que desempeña la Na +, K + -ATPasa en el procesamiento de la información visual por las interneuronas de la retina. En este informe, examinamos la distribución de Na +, K + -ATPasa en la retina del pez cebra, describimos su activación en las neuronas de la retina excitadas por el glutamato y argumentamos que esta activación proporciona una fuerza impulsora significativa para el potencial de membrana en reposo en las células horizontales (HC). y células bipolares (HBC) hiperpolarizantes o fuera del centro.

Estudiamos las respuestas glutamatérgicas de neuronas retinianas adultas de pez cebra, agudamente disociadas (Connaughton y Dowling, 1998), utilizando colorante oxonol como sonda para los cambios inducidos por neurotransmisores en el potencial de membrana (Wagoner, 1976 Walton et al. 1993 Nelson et al. 1999). La sonda permite medir dichos cambios sin alterar el Na + intracelular, un activador de Na +, K + -ATPasa. Cuando se investigaron las respuestas al glutamato con este método, nos sorprendió encontrar un grupo de células en el que el efecto de mayor amplitud fue una pérdida de varios minutos de fluorescencia de la sonda (FL) después de la eliminación del glutamato. Esta pérdida, que indica hiperpolarización de la membrana, la denominamos post-hiperpolarización (AHP). Los objetivos de este estudio son examinar el mecanismo de la respuesta AHP, que parece estar impulsada por la activación de Na +, K + -ATPasa, e identificar los tipos de células con las que está asociada.

Las disociaciones retinianas del pez cebra producen una mezcla de HC tipo A (estrellado redondo) y tipo B (alargado), células bipolares (BC) de axón largo y corto, así como otros tipos de neuronas retinianas (Connaughton & Dowling, 1998 Nelson et al. 2001). La capacidad de reconocer varios tipos de células en disociación hace que la retina del pez cebra sea una buena fuente de tejido para correlacionar los mecanismos fisiológicos con los tipos de células identificados morfológicamente. Se encontraron respuestas de AHP en HC de tipo A y B, en una subpoblación de HBC, pero no en células bipolares (DBC) despolarizantes o de tipo ON. Los resultados sugieren un modelo de dos componentes para las neuronas de la retina excitadas por el glutamato: un componente directo sensible al potencial de membrana proporcionado por los canales del receptor ionotrópico de glutamato (IgluR) que activan las permeabilidades de Na + y K +, y una membrana hiperpolarizante indirecta a largo plazo. -componente insensible al potencial proporcionado a través de la estimulación de una ATPasa sensible a ouabaína y Na +. Mientras que la actividad retiniana de Na +, K + -ATPasa generalmente se asocia con las altas necesidades metabólicas de los fotorreceptores para mantener la corriente oscura (Hagins et al. 1970), el presente estudio proporciona un papel potencial para la Na +, K + -ATPasa en las interneuronas retinianas distales excitadas por el glutamato.


Contenido

El potencial de membrana en una célula se deriva en última instancia de dos factores: fuerza eléctrica y difusión. La fuerza eléctrica surge de la atracción mutua entre partículas con cargas eléctricas opuestas (positivas y negativas) y la repulsión mutua entre partículas con el mismo tipo de carga (ambas positivas o ambas negativas). La difusión surge de la tendencia estadística de las partículas a redistribuirse desde regiones donde están altamente concentradas a regiones donde la concentración es baja.

Editar voltaje

Voltaje, que es sinónimo de diferencia de potencial eléctrico, es la capacidad de conducir una corriente eléctrica a través de una resistencia. De hecho, la definición más simple de voltaje viene dada por la ley de Ohm: V = IR, donde V es voltaje, I es corriente y R es resistencia. Si una fuente de voltaje, como una batería, se coloca en un circuito eléctrico, cuanto mayor sea el voltaje de la fuente, mayor será la cantidad de corriente que conducirá a través de la resistencia disponible. La importancia funcional de la tensión reside solo en el potencial diferencias entre dos puntos en un circuito. La idea de un voltaje en un solo punto no tiene sentido. Es convencional en electrónica asignar un voltaje de cero a algún elemento del circuito elegido arbitrariamente, y luego asignar voltajes para otros elementos medidos en relación con ese punto cero. No tiene importancia qué elemento se elige como punto cero; la función de un circuito depende solo de las diferencias, no de los voltajes per se. Sin embargo, en la mayoría de los casos y por convención, el nivel cero se asigna con mayor frecuencia a la parte de un circuito que está en contacto con tierra.

El mismo principio se aplica al voltaje en biología celular. En tejido eléctricamente activo, la diferencia de potencial entre dos puntos cualesquiera se puede medir insertando un electrodo en cada punto, por ejemplo uno dentro y otro fuera de la celda, y conectando ambos electrodos a los cables de lo que es en esencia un voltímetro especializado. Por convención, el valor de potencial cero se asigna al exterior de la celda y el signo de la diferencia de potencial entre el exterior y el interior está determinado por el potencial del interior en relación con el cero exterior.

En términos matemáticos, la definición de voltaje comienza con el concepto de campo eléctrico. mi , un campo vectorial que asigna una magnitud y dirección a cada punto en el espacio. En muchas situaciones, el campo eléctrico es un campo conservador, lo que significa que se puede expresar como el gradiente de una función escalar V, es decir, mi = –∇ V. Este campo escalar V se denomina distribución de voltaje. Tenga en cuenta que la definición permite una constante de integración arbitraria; es por eso que los valores absolutos de voltaje no son significativos. En general, los campos eléctricos pueden tratarse como conservadores solo si los campos magnéticos no los influyen significativamente, pero esta condición generalmente se aplica bien al tejido biológico.

Debido a que el campo eléctrico es el gradiente de la distribución de voltaje, los cambios rápidos de voltaje dentro de una región pequeña implican un campo eléctrico fuerte a la inversa, si el voltaje permanece aproximadamente igual en una región grande, los campos eléctricos en esa región deben ser débiles. . Un campo eléctrico fuerte, equivalente a un gradiente de voltaje fuerte, implica que se ejerce una fuerza fuerte sobre cualquier partícula cargada que se encuentre dentro de la región.

Los iones y las fuerzas que impulsan su movimiento Editar

Las señales eléctricas dentro de los organismos biológicos son, en general, impulsadas por iones. [4] Los cationes más importantes para el potencial de acción son el sodio (Na +) y el potasio (K +). [5] Ambos son monovalente cationes que llevan una sola carga positiva. Los potenciales de acción también pueden involucrar calcio (Ca 2+), [6] que es un bivalente catión que lleva una doble carga positiva. El anión cloruro (Cl -) juega un papel importante en los potenciales de acción de algunas algas, [7] pero juega un papel insignificante en los potenciales de acción de la mayoría de los animales. [8]

Los iones atraviesan la membrana celular bajo dos influencias: difusión y campos eléctricos. Un ejemplo simple en el que dos soluciones, A y B, están separadas por una barrera porosa, ilustra que la difusión asegurará que eventualmente se mezclen en soluciones iguales. Esta mezcla se produce debido a la diferencia en sus concentraciones. La región con alta concentración se difundirá hacia la región con baja concentración. Para ampliar el ejemplo, deje que la solución A tenga 30 iones de sodio y 30 iones de cloruro.Además, deje que la solución B tenga solo 20 iones de sodio y 20 iones de cloruro. Suponiendo que la barrera permite que ambos tipos de iones viajen a través de ella, entonces se alcanzará un estado estable en el que ambas soluciones tienen 25 iones de sodio y 25 iones de cloruro. Sin embargo, si la barrera porosa es selectiva para los iones que pasan, la difusión por sí sola no determinará la solución resultante. Volviendo al ejemplo anterior, construyamos ahora una barrera que sea permeable solo a los iones de sodio. Ahora, solo se permite que el sodio se difunda cruzando la barrera desde su concentración más alta en la solución A hasta la concentración más baja en la solución B. Esto dará como resultado una mayor acumulación de iones de sodio que los iones de cloruro en la solución B y un número menor de iones de sodio que iones cloruro en la solución A.

Esto significa que hay una carga neta positiva en la solución B debido a la mayor concentración de iones de sodio con carga positiva que de iones de cloruro con carga negativa. Asimismo, hay una carga negativa neta en la solución A debido a la mayor concentración de iones cloruro negativos que de iones sodio positivos. Dado que las cargas opuestas se atraen y las cargas similares se repelen, los iones ahora también están influenciados por los campos eléctricos y las fuerzas de difusión. Por lo tanto, será menos probable que los iones de sodio positivos viajen a la solución B ahora más positiva y permanezcan en la solución A ahora más negativa. El punto en el que las fuerzas de los campos eléctricos contrarrestan completamente la fuerza debida a la difusión se denomina potencial de equilibrio. En este punto, el flujo neto del ión específico (en este caso sodio) es cero.

Membranas de plasma Editar

Cada célula está encerrada en una membrana plasmática, que tiene la estructura de una bicapa lipídica con muchos tipos de moléculas grandes incrustadas en ella. Debido a que está hecha de moléculas de lípidos, la membrana plasmática tiene intrínsecamente una alta resistividad eléctrica, en otras palabras, una baja permeabilidad intrínseca a los iones. Sin embargo, algunas de las moléculas incrustadas en la membrana son capaces de transportar activamente iones de un lado de la membrana al otro o de proporcionar canales a través de los cuales pueden moverse. [9]

En terminología eléctrica, la membrana plasmática funciona como una resistencia y un condensador combinados. La resistencia surge del hecho de que la membrana impide el movimiento de cargas a través de ella. La capacitancia surge del hecho de que la bicapa lipídica es tan delgada que una acumulación de partículas cargadas en un lado da lugar a una fuerza eléctrica que atrae partículas cargadas opuestamente hacia el otro lado. La capacitancia de la membrana no se ve relativamente afectada por las moléculas que están incrustadas en ella, por lo que tiene un valor más o menos invariante estimado en aproximadamente 2 μF / cm 2 (la capacitancia total de un parche de membrana es proporcional a su área). La conductancia de una bicapa de lípidos puros es tan baja, por otro lado, que en situaciones biológicas siempre está dominada por la conductancia de vías alternativas proporcionadas por moléculas incrustadas. Por tanto, la capacitancia de la membrana es más o menos fija, pero la resistencia es muy variable.

Se estima que el grosor de una membrana plasmática es de unos 7-8 nanómetros. Debido a que la membrana es tan delgada, no se necesita un voltaje transmembrana muy grande para crear un campo eléctrico fuerte dentro de ella. Los potenciales de membrana típicos en las células animales son del orden de 100 milivoltios (es decir, una décima de voltio), pero los cálculos muestran que esto genera un campo eléctrico cercano al máximo que la membrana puede sostener; se ha calculado que un voltaje una diferencia mucho mayor que 200 milivoltios podría causar una ruptura dieléctrica, es decir, un arco a través de la membrana.

Difusión y transporte facilitados Editar

La resistencia de una bicapa de lípidos puros al paso de iones a través de ella es muy alta, pero las estructuras incrustadas en la membrana pueden mejorar en gran medida el movimiento iónico, ya sea de forma activa o pasiva, a través de mecanismos llamados transporte facilitado y difusión facilitada. Los dos tipos de estructura que desempeñan las funciones más importantes son los canales de iones y las bombas de iones, ambos generalmente formados a partir de ensamblajes de moléculas de proteínas. Los canales de iones proporcionan pasajes a través de los cuales pueden moverse los iones. En la mayoría de los casos, un canal de iones es permeable solo a tipos específicos de iones (por ejemplo, sodio y potasio, pero no cloruro o calcio) y, a veces, la permeabilidad varía según la dirección del movimiento de los iones. Las bombas de iones, también conocidas como transportadores de iones o proteínas portadoras, transportan activamente tipos específicos de iones de un lado de la membrana al otro, a veces utilizando energía derivada de los procesos metabólicos para hacerlo.

Bombas de iones Editar

Las bombas de iones son proteínas integrales de membrana que realizan transporte activo, es decir, utilizan energía celular (ATP) para "bombear" los iones contra su gradiente de concentración. [10] Estas bombas de iones toman iones de un lado de la membrana (disminuyendo su concentración allí) y los liberan en el otro lado (aumentando su concentración allí).

La bomba de iones más relevante para el potencial de acción es la bomba de sodio-potasio, que transporta tres iones de sodio fuera de la célula y dos iones de potasio hacia adentro. [11] Como consecuencia, la concentración de iones de potasio K + dentro de la neurona es aproximadamente 20 veces mayor que la concentración exterior, mientras que la concentración de sodio exterior es aproximadamente nueve veces mayor que la interior. [12] [13] De manera similar, otros iones tienen diferentes concentraciones dentro y fuera de la neurona, como calcio, cloruro y magnesio. [13]

Si los números de cada tipo de ion fueran iguales, la bomba de sodio-potasio sería eléctricamente neutra, pero, debido al intercambio de tres por dos, da un movimiento neto de una carga positiva de intracelular a extracelular para cada ciclo, contribuyendo así a una diferencia de voltaje positiva. La bomba tiene tres efectos: (1) hace que la concentración de sodio sea alta en el espacio extracelular y baja en el espacio intracelular (2) hace que la concentración de potasio sea alta en el espacio intracelular y baja en el espacio extracelular (3) da la espacio intracelular un voltaje negativo con respecto al espacio extracelular.

La bomba de sodio-potasio tiene un funcionamiento relativamente lento. Si una celda se inicializara con concentraciones iguales de sodio y potasio en todas partes, la bomba tardaría horas en establecer el equilibrio. La bomba funciona constantemente, pero se vuelve cada vez menos eficiente a medida que se reducen las concentraciones de sodio y potasio disponibles para el bombeo.

Las bombas de iones influyen en el potencial de acción solo al establecer la proporción relativa de concentraciones de iones intracelulares y extracelulares. El potencial de acción implica principalmente la apertura y cierre de canales de iones, no bombas de iones. Si las bombas de iones se apagan eliminando su fuente de energía o agregando un inhibidor como la ouabaína, el axón aún puede disparar cientos de miles de potenciales de acción antes de que sus amplitudes comiencen a decaer significativamente. [10] En particular, las bombas de iones no juegan un papel significativo en la repolarización de la membrana después de un potencial de acción. [5]

Otra bomba de iones funcionalmente importante es el intercambiador de sodio-calcio. Esta bomba funciona de una manera conceptualmente similar a la bomba de sodio-potasio, excepto que en cada ciclo intercambia tres Na + del espacio extracelular por un Ca ++ del espacio intracelular. Debido a que el flujo neto de carga es hacia adentro, esta bomba funciona "cuesta abajo", de hecho, y por lo tanto no requiere ninguna fuente de energía excepto el voltaje de la membrana. Su efecto más importante es bombear calcio hacia afuera; también permite un flujo de sodio hacia adentro, contrarrestando así la bomba de sodio-potasio, pero debido a que las concentraciones generales de sodio y potasio son mucho más altas que las concentraciones de calcio, este efecto es relativamente poco importante. El resultado neto del intercambiador de sodio-calcio es que en el estado de reposo, las concentraciones de calcio intracelular se vuelven muy bajas.

Canales de iones Editar

Los canales de iones son proteínas integrales de membrana con un poro a través del cual los iones pueden viajar entre el espacio extracelular y el interior de la célula. La mayoría de los canales son específicos (selectivos) para un ion, por ejemplo, la mayoría de los canales de potasio se caracterizan por una relación de selectividad de 1000: 1 para el potasio sobre el sodio, aunque los iones potasio y sodio tienen la misma carga y difieren solo ligeramente en su radio. El poro del canal es típicamente tan pequeño que los iones deben pasar a través de él en el orden de una sola fila. [15] Los poros de los canales pueden estar abiertos o cerrados para el paso de iones, aunque varios canales demuestran varios niveles de subconductancia. Cuando un canal está abierto, los iones penetran a través del canal a través del gradiente de concentración transmembrana para ese ion en particular. La tasa de flujo iónico a través del canal, es decir, la amplitud de la corriente de un solo canal, está determinada por la conductancia máxima del canal y la fuerza impulsora electroquímica para ese ion, que es la diferencia entre el valor instantáneo del potencial de membrana y el valor del potencial de inversión. [dieciséis]

Un canal puede tener varios estados diferentes (correspondientes a diferentes conformaciones de la proteína), pero cada uno de esos estados es abierto o cerrado. En general, los estados cerrados corresponden a una contracción del poro, haciéndolo intransitable para el ion, o a una parte separada de la proteína, que tapa el poro. Por ejemplo, el canal de sodio dependiente del voltaje sufre inactivacion, en el que una porción de la proteína se balancea hacia el poro, sellándolo. [17] Esta inactivación corta la corriente de sodio y juega un papel crítico en el potencial de acción.

Los canales de iones se pueden clasificar según cómo responden a su entorno. [18] Por ejemplo, los canales iónicos implicados en el potencial de acción son canales sensibles al voltaje se abren y cierran en respuesta al voltaje a través de la membrana. Canales activados por ligando forman otra clase importante: estos canales iónicos se abren y cierran en respuesta a la unión de una molécula de ligando, como un neurotransmisor. Otros canales de iones se abren y cierran con fuerzas mecánicas. Otros canales iónicos, como los de las neuronas sensoriales, se abren y cierran en respuesta a otros estímulos, como la luz, la temperatura o la presión.

Canales de fuga Editar

Los canales de fuga son el tipo más simple de canal iónico, ya que su permeabilidad es más o menos constante. Los tipos de canales de fuga que tienen mayor importancia en las neuronas son los canales de potasio y cloruro. Incluso estos no son perfectamente constantes en sus propiedades: primero, la mayoría de ellos son dependientes del voltaje en el sentido de que se conducen mejor en una dirección que en la otra (en otras palabras, son rectificadores) segundo, algunos de ellos son capaces de ser apagados por ligandos químicos aunque no requieran ligandos para funcionar.

Canales controlados por ligando Editar

Los canales iónicos activados por ligando son canales cuya permeabilidad aumenta en gran medida cuando algún tipo de ligando químico se une a la estructura de la proteína. Las células animales contienen cientos, si no miles, de tipos de estos. Un gran subconjunto funciona como receptores de neurotransmisores: ocurren en sitios postsinápticos y el ligando químico que los abre es liberado por el axón terminal presináptico. Un ejemplo de este tipo es el receptor AMPA, un receptor del neurotransmisor glutamato que cuando se activa permite el paso de iones de sodio y potasio. Otro ejemplo es el GABAA receptor, un receptor para el neurotransmisor GABA que cuando se activa permite el paso de iones cloruro.

Los receptores de neurotransmisores son activados por ligandos que aparecen en el área extracelular, pero existen otros tipos de canales activados por ligandos que están controlados por interacciones en el lado intracelular.

Canales dependientes del voltaje Editar

Canales iónicos activados por voltaje, también conocidos como canales iónicos dependientes del voltaje, son canales cuya permeabilidad está influenciada por el potencial de membrana. Forman otro grupo muy grande, y cada miembro tiene una selectividad iónica particular y una dependencia de voltaje particular. Muchos también dependen del tiempo; en otras palabras, no responden inmediatamente a un cambio de voltaje, sino solo después de un retraso.

Uno de los miembros más importantes de este grupo es un tipo de canal de sodio dependiente de voltaje que subyace a los potenciales de acción; a veces se les llama Canales de sodio de Hodgkin-Huxley porque inicialmente fueron caracterizados por Alan Lloyd Hodgkin y Andrew Huxley en sus estudios ganadores del Premio Nobel sobre la fisiología del potencial de acción. El canal se cierra al nivel de voltaje en reposo, pero se abre abruptamente cuando el voltaje excede un cierto umbral, permitiendo una gran afluencia de iones sodio que produce un cambio muy rápido en el potencial de membrana. La recuperación de un potencial de acción depende en parte de un tipo de canal de potasio dependiente de voltaje que está cerrado en el nivel de voltaje en reposo pero que se abre como consecuencia del gran cambio de voltaje producido durante el potencial de acción.

Potencial de reversión Editar

El potencial de reversión (o potencial de equilibrio) de un ion es el valor del voltaje transmembrana al que se contrarrestan las fuerzas eléctricas y de difusión, de modo que no hay un flujo neto de iones a través de la membrana. Esto significa que el voltaje transmembrana se opone exactamente a la fuerza de difusión del ion, de modo que la corriente neta del ion a través de la membrana es cero e invariable. El potencial de inversión es importante porque proporciona el voltaje que actúa en los canales permeables a ese ion; en otras palabras, proporciona el voltaje que genera el gradiente de concentración de iones cuando actúa como batería.

El potencial de equilibrio de un ion en particular generalmente se designa con la notación miionEl potencial de equilibrio de cualquier ion se puede calcular mediante la ecuación de Nernst. [19] Por ejemplo, el potencial de reversión de los iones de potasio será el siguiente:

  • mieq, K + es el potencial de equilibrio del potasio, medido en voltios
  • R es la constante universal de los gases, igual a 8,314 julios · K −1 · mol −1
  • T es la temperatura absoluta, medida en kelvin (= K = grados Celsius + 273,15)
  • z es el número de cargas elementales del ion en cuestión involucradas en la reacción
  • F es la constante de Faraday, igual a 96,485 culombios · mol −1 o J · V −1 · mol −1
  • [K +]o es la concentración extracelular de potasio, medida en mol · m −3 o mmol·l −1
  • [K +]I es la concentración intracelular de potasio

Incluso si dos iones diferentes tienen la misma carga (es decir, K + y Na +), aún pueden tener potenciales de equilibrio muy diferentes, siempre que sus concentraciones externas y / o internas difieran. Tomemos, por ejemplo, los potenciales de equilibrio del potasio y el sodio en las neuronas. El potencial de equilibrio de potasio miK es -84 mV con 5 mM de potasio en el exterior y 140 mM en el interior. Por otro lado, el potencial de equilibrio del sodio, miN / A, es de aproximadamente +66 mV con aproximadamente 12 mM de sodio en el interior y 140 mM en el exterior. [nota 1]

Cambios en el potencial de membrana durante el desarrollo Editar

El potencial de membrana en reposo de una neurona en realidad cambia durante el desarrollo de un organismo. Para que una neurona adopte finalmente su función adulta completa, su potencial debe estar estrictamente regulado durante el desarrollo. A medida que un organismo avanza en el desarrollo, el potencial de membrana en reposo se vuelve más negativo. [20] Las células gliales también se están diferenciando y proliferando a medida que avanza el desarrollo en el cerebro. [21] La adición de estas células gliales aumenta la capacidad del organismo para regular el potasio extracelular. La caída del potasio extracelular puede provocar una disminución del potencial de membrana de 35 mV. [22]

Excitabilidad celular Editar

La excitabilidad celular es el cambio en el potencial de membrana que es necesario para las respuestas celulares en varios tejidos. La excitabilidad celular es una propiedad que se induce durante la embriogénesis temprana. [23] La excitabilidad de una célula también se ha definido como la facilidad con la que se puede desencadenar una respuesta. [24] Los potenciales de reposo y umbral forman la base de la excitabilidad celular y estos procesos son fundamentales para la generación de potenciales graduados y de acción.

Los reguladores más importantes de la excitabilidad celular son las concentraciones de electrolitos extracelulares (es decir, Na +, K +, Ca 2+, Cl -, Mg 2+) y proteínas asociadas. Las proteínas importantes que regulan la excitabilidad celular son los canales iónicos activados por voltaje, los transportadores iónicos (p. Ej., Na + / K + -ATPasa, transportadores de magnesio, transportadores ácido-base), receptores de membrana y canales activados por nucleótidos cíclicos activados por hiperpolarización. [25] Por ejemplo, los canales de potasio y los receptores sensibles al calcio son importantes reguladores de la excitabilidad en neuronas, miocitos cardíacos y muchas otras células excitables como los astrocitos. [26] El ion calcio es también el segundo mensajero más importante en la señalización celular excitable. La activación de los receptores sinápticos inicia cambios duraderos en la excitabilidad neuronal. [27] Las hormonas tiroideas, suprarrenales y otras también regulan la excitabilidad celular, por ejemplo, la progesterona y el estrógeno modulan la excitabilidad de las células del músculo liso miometrial.

Se considera que muchos tipos de células tienen una membrana excitable. Las células excitables son neuronas, miocitos (cardíacos, esqueléticos, lisos), células endoteliales vasculares, células yuxtaglomerulares, células intersticiales de Cajal, muchos tipos de células epiteliales (p. Ej., Células beta, células alfa, células delta, células enteroendocrinas), células gliales (p. Ej. astrocitos), células mecanorreceptoras (por ejemplo, células ciliadas y células de Merkel), células quimiorreceptoras (por ejemplo, células glómicas, receptores del gusto), algunas células vegetales y posiblemente células inmunitarias. [28] Los astrocitos muestran una forma de excitabilidad no eléctrica basada en variaciones de calcio intracelular relacionadas con la expresión de varios receptores a través de los cuales pueden detectar la señal sináptica. En las neuronas, existen diferentes propiedades de la membrana en algunas partes de la célula, por ejemplo, la excitabilidad dendrítica confiere a las neuronas la capacidad de detección por coincidencia de entradas espacialmente separadas. [29]

Circuito equivalente Editar

Los electrofisiólogos modelan los efectos de las diferencias de concentración iónica, los canales iónicos y la capacitancia de la membrana en términos de un circuito equivalente, que pretende representar las propiedades eléctricas de un pequeño parche de membrana. El circuito equivalente consta de un condensador en paralelo con cuatro vías, cada una de las cuales consta de una batería en serie con una conductancia variable. La capacitancia está determinada por las propiedades de la bicapa lipídica y se considera fija. Cada una de las cuatro vías paralelas proviene de uno de los iones principales, sodio, potasio, cloruro y calcio.El voltaje de cada vía iónica está determinado por las concentraciones del ión en cada lado de la membrana; consulte la sección de potencial de inversión anterior. La conductancia de cada vía iónica en cualquier momento está determinada por los estados de todos los canales iónicos que son potencialmente permeables a ese ión, incluidos los canales de fuga, los canales activados por ligandos y los canales iónicos activados por voltaje.

Para concentraciones de iones fijas y valores fijos de conductancia del canal de iones, el circuito equivalente se puede reducir aún más, utilizando la ecuación de Goldman como se describe a continuación, a un circuito que contiene una capacitancia en paralelo con una batería y conductancia. En términos eléctricos, este es un tipo de circuito RC (circuito de resistencia-capacitancia), y sus propiedades eléctricas son muy simples. A partir de cualquier estado inicial, la corriente que fluye a través de la conductancia o la capacitancia decae con un curso de tiempo exponencial, con una constante de tiempo de τ = RC, donde C es la capacitancia del parche de membrana y R = 1 / gneto es la resistencia neta. Para situaciones realistas, la constante de tiempo generalmente se encuentra en el rango de 1 a 100 milisegundos. En la mayoría de los casos, los cambios en la conductancia de los canales iónicos ocurren en una escala de tiempo más rápida, por lo que un circuito RC no es una buena aproximación; sin embargo, la ecuación diferencial utilizada para modelar un parche de membrana es comúnmente una versión modificada de la ecuación del circuito RC.

Cuando el potencial de membrana de una célula dura un largo período de tiempo sin cambiar significativamente, se denomina potencial de reposo o voltaje de reposo. Este término se usa para el potencial de membrana de células no excitables, pero también para el potencial de membrana de células excitables en ausencia de excitación. En las células excitables, los otros estados posibles son potenciales de membrana graduados (de amplitud variable) y potenciales de acción, que son grandes aumentos de todo o nada en el potencial de membrana que generalmente siguen un curso de tiempo fijo. Las células excitables incluyen neuronas, células musculares y algunas células secretoras en las glándulas. Sin embargo, incluso en otros tipos de células, el voltaje de la membrana puede sufrir cambios en respuesta a estímulos ambientales o intracelulares. Por ejemplo, la despolarización de la membrana plasmática parece ser un paso importante en la muerte celular programada. [30]

Las interacciones que generan el potencial de reposo se modelan mediante la ecuación de Goldman. [31] Es similar en forma a la ecuación de Nernst que se muestra arriba, ya que se basa en las cargas de los iones en cuestión, así como en la diferencia entre sus concentraciones internas y externas. Sin embargo, también tiene en cuenta la permeabilidad relativa de la membrana plasmática a cada ión en cuestión.

Los tres iones que aparecen en esta ecuación son potasio (K +), sodio (Na +) y cloruro (Cl -). Se omite el calcio, pero se puede agregar para hacer frente a situaciones en las que juega un papel importante. [32] Al ser un anión, los términos de cloruro se tratan de manera diferente a los términos de cationes, la concentración intracelular está en el numerador y la concentración extracelular en el denominador, que se invierte de los términos de cationes. PAGI representa la permeabilidad relativa del tipo de iones i.

En esencia, la fórmula de Goldman expresa el potencial de membrana como un promedio ponderado de los potenciales de inversión para los tipos de iones individuales, ponderado por la permeabilidad. (Aunque el potencial de membrana cambia alrededor de 100 mV durante un potencial de acción, las concentraciones de iones dentro y fuera de la célula no cambian significativamente. Permanecen cerca de sus concentraciones respectivas cuando la membrana está en potencial de reposo). la permeabilidad al potasio es mucho mayor en estado de reposo que la permeabilidad al sodio. Como consecuencia, el potencial de reposo suele estar cerca del potencial de reversión del potasio. [33] [34] La permeabilidad al cloruro puede ser lo suficientemente alta como para ser significativa, pero, a diferencia de los otros iones, el cloruro no se bombea activamente y, por lo tanto, se equilibra con un potencial de inversión muy cercano al potencial de reposo determinado por los otros iones.

Los valores del potencial de membrana en reposo en la mayoría de las células animales suelen variar entre el potencial de reversión del potasio (normalmente alrededor de -80 mV) y alrededor de -40 mV. El potencial de reposo en las células excitables (capaces de producir potenciales de acción) suele estar cerca de -60 mV; más voltajes despolarizados conducirían a la generación espontánea de potenciales de acción. Las células inmaduras o indiferenciadas muestran valores muy variables de voltaje en reposo, generalmente significativamente más positivos que en las células diferenciadas. [35] En tales células, el valor del potencial de reposo se correlaciona con el grado de diferenciación: las células indiferenciadas en algunos casos pueden no mostrar ninguna diferencia de voltaje transmembrana en absoluto.

El mantenimiento del potencial de reposo puede ser metabólicamente costoso para una célula debido a su requisito de bombeo activo de iones para contrarrestar las pérdidas debidas a los canales de fuga. El costo es más alto cuando la función de la celda requiere un valor especialmente despolarizado de voltaje de membrana. Por ejemplo, el potencial de reposo en mosca azul adaptada a la luz del día (Calliphora vicina) los fotorreceptores pueden alcanzar hasta -30 mV. [36] Este potencial de membrana elevado permite que las células respondan muy rápidamente a los estímulos visuales. El costo es que el mantenimiento del potencial de reposo puede consumir más del 20% del ATP celular total. [37]

Por otro lado, el alto potencial de reposo en células indiferenciadas puede ser una ventaja metabólica. Esta aparente paradoja se resuelve examinando el origen de ese potencial de reposo. Las células poco diferenciadas se caracterizan por una resistencia de entrada extremadamente alta, [35] lo que implica que hay pocos canales de fuga presentes en esta etapa de la vida de la célula. Como resultado aparente, la permeabilidad del potasio se vuelve similar a la de los iones de sodio, lo que coloca el potencial de reposo entre los potenciales de inversión del sodio y el potasio, como se discutió anteriormente. Las corrientes de fuga reducidas también significan que hay poca necesidad de bombeo activo para compensar, por lo tanto, un bajo costo metabólico.

Como se explicó anteriormente, el potencial en cualquier punto de la membrana celular está determinado por las diferencias de concentración de iones entre las áreas intracelular y extracelular y por la permeabilidad de la membrana a cada tipo de ión. Las concentraciones de iones normalmente no cambian muy rápidamente (con la excepción de Ca 2+, donde la concentración intracelular inicial es tan baja que incluso una pequeña afluencia puede aumentarla en órdenes de magnitud), pero las permeabilidades de los iones pueden cambiar en una fracción de milisegundo, como resultado de la activación de canales iónicos activados por ligando. El cambio en el potencial de membrana puede ser grande o pequeño, dependiendo de cuántos canales iónicos estén activados y de qué tipo sean, y puede ser largo o corto, dependiendo de la cantidad de tiempo que los canales permanezcan abiertos. Los cambios de este tipo se denominan potenciales graduados, a diferencia de los potenciales de acción, que tienen una amplitud y un curso temporal fijos.

Como se puede derivar de la ecuación de Goldman que se muestra arriba, el efecto de aumentar la permeabilidad de una membrana a un tipo particular de ion desplaza el potencial de membrana hacia el potencial de inversión de ese ion. Por tanto, la apertura de los canales de Na + desplaza el potencial de membrana hacia el potencial de inversión de Na +, que suele ser de alrededor de +100 mV. Asimismo, la apertura de los canales de K + desplaza el potencial de membrana hacia aproximadamente –90 mV, y la apertura de los canales de Cl - lo desplaza hacia aproximadamente –70 mV (potencial de reposo de la mayoría de las membranas). Por lo tanto, los canales de Na + desplazan el potencial de membrana en una dirección positiva, los canales de K + lo desplazan en una dirección negativa (excepto cuando la membrana está hiperpolarizada a un valor más negativo que el potencial de inversión de K +) y los canales de Cl - tienden a desplazarse hacia el potencial de reposo.

Los potenciales de membrana graduados son particularmente importantes en las neuronas, donde son producidos por sinapsis; un cambio temporal en el potencial de membrana producido por la activación de una sinapsis por un potencial de acción simple o graduado se denomina potencial postsináptico. Los neurotransmisores que actúan para abrir los canales de Na + normalmente hacen que el potencial de membrana se vuelva más positivo, mientras que los neurotransmisores que activan los canales de K + normalmente hacen que se vuelva más negativo, los que inhiben estos canales tienden a tener el efecto contrario.

El hecho de que un potencial postsináptico se considere excitador o inhibitorio depende del potencial de inversión de los iones de esa corriente y del umbral para que la célula dispare un potencial de acción (alrededor de –50 mV). Una corriente postsináptica con un potencial de inversión por encima del umbral, como una corriente típica de Na +, se considera excitadora. Una corriente con un potencial de inversión por debajo del umbral, como una corriente típica de K +, se considera inhibitoria. Una corriente con un potencial de inversión por encima del potencial de reposo, pero por debajo del umbral, no provocará por sí misma potenciales de acción, pero producirá oscilaciones de potencial de membrana por debajo del umbral. Por tanto, los neurotransmisores que actúan para abrir los canales de Na + producen potenciales postsinápticos excitadores, o EPSP, mientras que los neurotransmisores que actúan para abrir los canales de K + o Cl - típicamente producen potenciales postsinápticos inhibidores o IPSP. Cuando se abren varios tipos de canales dentro del mismo período de tiempo, sus potenciales postsinápticos se suman (se suman).

Desde el punto de vista de la biofísica, el descansando El potencial de membrana es simplemente el potencial de membrana que resulta de las permeabilidades de la membrana que predominan cuando la célula está en reposo. La ecuación anterior de promedios ponderados siempre se aplica, pero el siguiente enfoque puede visualizarse más fácilmente. En un momento dado, hay dos factores para un ion que determinan cuánta influencia tendrá ese ion sobre el potencial de membrana de una célula:

Si la fuerza impulsora es alta, entonces el ión está siendo "empujado" a través de la membrana. Si la permeabilidad es alta, será más fácil que el ion se difunda a través de la membrana.

  • Fuerza impulsora es la fuerza eléctrica neta disponible para mover ese ion a través de la membrana. Se calcula como la diferencia entre el voltaje en el que el ion "quiere" estar (su potencial de equilibrio) y el potencial de membrana real (mimetro). Entonces, en términos formales, la fuerza impulsora de un ion = mimetro - miion
  • Por ejemplo, en nuestro potencial de reposo calculado anteriormente de −73 mV, la fuerza impulsora sobre el potasio es 7 mV: (−73 mV) - (−80 mV) = 7 mV. La fuerza impulsora del sodio sería (−73 mV) - (60 mV) = −133 mV.
  • Permeabilidad es una medida de la facilidad con la que un ion puede atravesar la membrana. Normalmente se mide como la conductancia (eléctrica) y la unidad, siemens, corresponde a 1 C · s −1 · V −1, es decir, un culombio por segundo por voltio de potencial.

Entonces, en una membrana en reposo, mientras que la fuerza impulsora del potasio es baja, su permeabilidad es muy alta. El sodio tiene una gran fuerza impulsora pero casi ninguna permeabilidad en reposo. En este caso, el potasio transporta aproximadamente 20 veces más corriente que el sodio y, por lo tanto, tiene 20 veces más influencia sobre mimetro que el sodio.

Sin embargo, considere otro caso: el pico del potencial de acción. Aquí, la permeabilidad al Na es alta y la permeabilidad al K es relativamente baja. Por lo tanto, la membrana se mueve hasta cerca miN / A y lejos de miK.

Cuantos más iones penetran, más complicado se vuelve predecir el potencial de membrana. Sin embargo, esto se puede hacer usando la ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz o la ecuación de medias ponderadas. Al conectar los gradientes de concentración y las permeabilidades de los iones en cualquier momento, se puede determinar el potencial de membrana en ese momento. Lo que significan las ecuaciones de GHK es que, en cualquier momento, el valor del potencial de membrana será un promedio ponderado de los potenciales de equilibrio de todos los iones permeantes. El "peso" es la permeabilidad relativa de los iones a través de la membrana.

Si bien las células gastan energía para transportar iones y establecer un potencial transmembrana, utilizan este potencial a su vez para transportar otros iones y metabolitos como el azúcar. El potencial transmembrana de las mitocondrias impulsa la producción de ATP, que es la moneda común de la energía biológica.

Las células pueden aprovechar la energía que almacenan en el potencial de reposo para impulsar los potenciales de acción u otras formas de excitación. Estos cambios en el potencial de membrana permiten la comunicación con otras células (como ocurre con los potenciales de acción) o inician cambios dentro de la célula, lo que ocurre en un óvulo cuando es fertilizado por un espermatozoide.

En las células neuronales, un potencial de acción comienza con una ráfaga de iones de sodio hacia la célula a través de los canales de sodio, lo que resulta en la despolarización, mientras que la recuperación implica una ráfaga de potasio hacia el exterior a través de los canales de potasio. Ambos flujos ocurren por difusión pasiva.


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El potencial de la membrana mitocondrial atrae potasio⁈

Pero, ¿por qué se encuentran concentraciones más altas de K⁺ dentro de la célula? y por qué Na⁺ parece estar excluido. ¿Por qué se invierte este llamado & transporte cuotactivo después de la muerte de la célula? Esto se ha explicado de varias formas, pero creo que el potencial de la membrana mitocondrial (ψ m) es el responsable directo de esto. Se ha demostrado que este potencial atrae iones con carga positiva.

Podrías pensar que atraería tan fácilmente a Na⁺ como a K⁺ ya que ambos tienen la misma carga. Gilbert Ling explica esto en parte por el hecho de que Na⁺ es en realidad más grande si se consideran los radios hidratados, teniendo en cuenta la capa de agua ordenada que lo rodea. Teniendo en cuenta el agua asociada, esto le daría al hidrato de K⁺ una relación carga / masa más alta y una relación carga / volumen más alta.

Los teóricos de la "bomba de membrana" plantean la hipótesis de una serie de enfoques de Rube Goldberg en los que el ATP, con la ayuda de un enlace fosfato de alta energía (un nombre inapropiado), transfiere energía para "bombear" el sodio fuera de la célula. La razón por la que introducen ATP en esto es porque se ha demostrado que aumenta el K⁺ / Na⁺ intracelular, pero esto podría explicarse de otras maneras. Además, ATPPlaza bursátil norteamericana Se ha demostrado actividad en la membrana celular, pero esta no es una reacción muy selectiva y el ATP se disocia espontáneamente incluso en agua pura. El equilibrio ATP / ADP depende del pH.

Entonces, con un potencial de membrana mitocondrial negativo (- ψ m), ¿cuál se esperaría que se sintiera más atraído por las mitocondrias: el sodio o el potasio? Cuál podría ser esperado ¿acumular?

El potasio tiene un tiempo de migración electroforético más rápido:

Comigra con amoniaco. Este es un hallazgo constante. Otro estudio muestra lo mismo:

Siempre es el más rápido para migrar hacia una carga negativa, incluso entre una serie de quince cationes. Incluso con una difusión constante, se puede esperar una mayor concentración de K⁺ dentro de la célula basándose únicamente en este principio. El potencial de membrana negativo enriquecería constantemente la célula con K⁺ hasta que la cadena de transporte de electrones se detenga. Esta es la muerte celular solo entonces el Na⁺ se equilibra.

El azul triptano es probablemente la forma más común de medir la muerte celular. Cuando una célula está viva, "excluye" activamente el azul tripán. En la muerte celular, lo absorbe dentro. Esto se puede visualizar. Antes de ver la estructura, planteé la hipótesis de que estaba cargada negativamente. Esto resulta ser cierto. Aunque tiene algunos grupos amino, tiene suficientes grupos sulfónicos para compensar, lo que resulta en una carga neta negativa.

Las moléculas de azul tripán cargadas negativamente (y quizás la mayoría, si no todos, los aniones) son repelidas durante el metabolismo normal por el potencial negativo de la membrana mitocondrial. Puedo asegurarles que esto no es una falla de una bomba de exclusión de membrana azul tripán impulsada por ATP. (Tripán-ATPasa⁈).

Jens Skou había ganado un premio Nobel por aislar una enzima que hidroliza ATP. Se encontró en la membrana celular. En realidad, esta enzima fue nombrada antes de que se hubiera encontrado en función de su supuesta función, como verbo. Se convirtió en sustantivo solo más tarde, después del aislamiento. Pero un unicornio también es un sustantivo y solo tener enzimas purificadas no significa necesariamente que hagan lo que les da crédito dentro de la célula. Los ensayos enzimáticos estándar no pueden funcionar con Na⁺ / K⁺-ATPasa porque necesita una membrana para funcionar. No puede probar que esta enzima en particular funcione de manera estándar.

Aquí hay algunas citas de su conferencia Nobel: †

Y el cianuro hace lo mismo al adherirse al centro de hierro del hemo, inhibiendo la reducción eléctrica de oxígeno y el metabolismo subsiguiente.

La azida es un inhibidor de la cadena de transporte de electrones:

Tenga en cuenta que el único que aumenta el potencial de la membrana mitocondrial también aumenta la entrada de tinte. En este caso, se utilizaron colorantes con carga positiva. Esto es lo contrario de la exclusión del azul de tripán aniónico.

Ouabain es un fármaco muy antiguo y sus efectos probablemente se puedan explicar mejor como un antagonista de los mineralescorticoides. Es muy similar a la aldosterona y no se parece en nada al ATP, el sustrato del Na⁺ / K⁺-ATP.Plaza bursátil norteamericana.

En los primeros intentos de describir cómo la ouabaína influye en la compartimentación del sodio, algunas personas han considerado sus efectos sobre el Na⁺ / K⁺-ATPPlaza bursátil norteamericana. En realidad, esto se hizo a pesar de su obvia similitud con la aldosterona.

El I₅₀ para ouabain en Na⁺ / K⁺-ATPPlaza bursátil norteamericana se determinó en alrededor de 10⁻⁷ (Erdmann ↑). Esto varió ligeramente según la especie. CConsiderando que se ha inducido un aumento del 841% de la retención renal de Na⁺ (en una oveja) mediante una infusión de sólo 4 (10⁻⁸) M ouabaína por hora¶, parecería que la oubaína tiene efectos hormonales de alta afinidad que no pueden ser explicado por su ATP débilPlaza bursátil norteamericana inhibición.

El enriquecimiento de K⁺ sobre Na⁺ en la célula puede explicarse satisfactoriamente mediante dos observaciones simples: el potencial de membrana mitocondrial cargado negativamente y la rápida velocidad de migración electroforética de K⁺.

Todos los demás cambios en el potencial de la membrana mitocondrial conducen a cambios de concentración de otras moléculas cargadas y más grandes en su interior. Esto se determina fácilmente cuando los solutos son colorantes o sondas fluorescentes. Es solo una cuestión de natural pensar que sucedería lo mismo con los iones de potasio.

* Weston, Andrea y col. "Factores que afectan la separación de cationes metálicos inorgánicos por electroforesis capilar". Revista de cromatografía A 593.1-2 (1992): 289-295.
† Skou, Jens C. & quot; La identificación de la bomba de sodio-potasio & quot. Química 1 (1998): 997.
Chen, Lan Bo. "Potencial de membrana mitocondrial en células vivas". Revisión anual de biología celular 4.1 (1988): 155-181.
§Piwnica, David, James F. Kronauge y Mary L. Chiu. “Captación y retención de hexakis (2-metoxiisobutil isonitrilo) tecnecio (I) en células de miocardio de pollo cultivadas. Dependencia del potencial mitocondrial y de la membrana plasmática. Circulación 82.5 (1990): 1826-1838.
¶Yates, N. A. y J. G. McDougall. "Interacción de ouabaína exógena y tratamiento crónico con mineralocorticoides en el riñón de la oveja consciente". Farmacología y fisiología clínica y experimental 24.1 (1997): 57-63.

Matty B

Miembro

Muy buena lectura y extremadamente interesante. Bien hecho.

Pero me queda una pregunta. Digamos que el Na + entra en la célula en una concentración demasiado alta por alguna razón: ¿cómo expulsa la célula selectivamente el exceso de Na + si su tamaño de clatrato es demasiado grande para disociarse fácilmente a través de la membrana?

¿Existe la posibilidad de que la ATPasa todavía funcione parcialmente como se teorizó, pero debido a sus demandas energéticas excesivas de esta enzima para controlar las proporciones de Na / K, simplemente se usa como un método de expulsión para reducir el Na intracelular, y que la proporción general sigue siendo en última instancia? controlado por la propia selectividad innata de la membrana (basada en el tamaño del clatrato, no en la actividad de la ATPasa).

Travis

Miembro

No creo que la membrana pueda diferenciar entre estos dos. Moléculas mucho más grandes fluyen a través de la membrana celular. Gilbert Ling, en el libro que tengo, usó los radios hidratados para explicar ciertos efectos intracelulares. Lo usó para explicar cómo los residuos de glutamato y aspartato tienen una mayor afinidad por el K⁺ que por el Na⁺, y esta afinidad explica la mayor concentración de potasio dentro de la célula. En los años 60, estaba escribiendo que las proteínas de la célula eran como un "sistema de carga fija", como un adsorbente o una columna de cromatografía de afinidad diseñada para K⁺.

Quitaría las citas, pero mi libro no tiene un botón Ctrl + F. . ..pero tiene un índice y escribo rápido. Dejame revisar . .

Él dice que K⁺ tiene un radio hidratado de 2.0Å y Na⁺ tiene uno de 2.8Å. Tiene una referencia de 1939 para la persona que originalmente había hecho estos cálculos.

Esto puede explicar por qué viaja más rápido que el Na⁺ hacia una carga negativa durante la electroforesis capilar.

Matty B

Miembro

Entonces, ¿estás diciendo que los iones pueden disociarse libremente a través de la membrana celular? (Ignorando todos los demás factores). ¿Puede indicarme algo de literatura sobre este tema, porque no puedo encontrar mucho más que sus libros de texto estándar, cosas justas que repiten constantemente que los iones no se pueden difundir libremente?

La razón por la que las moléculas más grandes (por ejemplo, las hormonas esteroides) pueden difundirse pasivamente es diferente y no se aplica necesariamente a los iones.

Matty B

Miembro

Encontré un estudio que trata de alguna manera sobre el tema de las interacciones membrana-ión, pero creo que afirma que los iones se incorporan e interactúan con la bicapa lipídica (y que las bicapas pueden actuar como amortiguadores), pero no tocaron mucho la difusión. .

Travis

Miembro

Creo que es solo una cuestión de semántica. Escucharás hablar de & quot; acumulación selectiva & quot; pero en realidad es solo & quot; exclusión selectiva & quot; por parte de las cuentas oficiales. Si lee la Conferencia Nobel de Skou, verá que la idea del libro de texto es que tanto Na⁺ como K⁺ se difunden en la célula. La explicación se centra en el bombeo de Na⁺. Entonces, cuando hablan de "exclusión selectiva", realmente están hablando de esto.

Moléculas mucho más grandes cruzan rutinariamente la membrana celular.

La bicapa lipídica es interesante y casi impermeable, pero no puede ser continua. Debe haber poros en la pared celular: Porin (proteína) - Wikipedia

Tiene un diámetro de poro interno de 7Å en su punto más estrecho. Debería poder acomodar dos iones de Na⁺ hidratados uno al lado del otro.

Estas son interrupciones en la bicapa lipídica.

Las cadenas laterales de aminoácidos están numeradas en el poro interno:

Parece que tenemos argininas, tirosinas y lisinas en el centro mismo del poro, un interior ligeramente cargado positivamente, pero aún así: generalmente se piensa que admite rutinariamente muchas cosas en la célula que son más grandes y están más cargadas. que el sodio.

Archivos adjuntos

Matty B

Miembro

5A (longitud media del enlace Na-O de 2,5 A). No sé cuán confiable es el

2Una figura ya es. No sé qué tan confiables son las técnicas de la década de 1930 en comparación con la espectroscopia moderna, necesitaría hablar con un químico viejo para saber cómo han mejorado o empeorado las técnicas. Y creo que el sodio hidratado generalmente viene en pares, ¿correcto? Otros iones como el calcio hidratado son incluso más grandes que el sodio y demasiado anchos para la porina, entonces, ¿qué pasa con ellos?

No estoy convencido de que tengamos suficiente evidencia para decir que el Na + se difundiría a través de la porina en este punto. Los residuos positivos en el interior de la porina tampoco ayudan a esta teoría. Sin embargo, hay otros canales iónicos a considerar, por supuesto. Pero la existencia de otros canales iónicos me hace creer que es un poco más probable que exista ATPasa y que pueda tener alguna funcionalidad en el intercambio de Na / K (aunque todavía creo que su papel en la homeostasis de Na / K está sobreestimado).

Todavía no creo que repetir el mantra de que las moléculas más grandes se abren paso sea prueba de algo. Son diferentes, así que mantengamos nuestro enfoque en los iones.

Uno de los artículos que he leído en el pasado afirmaba que el potasio tiene una estructura de hidratación menos estable, lo que significa que puede difundirse más fácilmente que otras moléculas; cuando la estructura de hidratación se rompe (sucede en picosegundos), puede haber una oportunidad para que el potasio se difunda rápidamente en la célula antes de recuperar una estructura de hidratación estable. Puede haber algo que explorar en esta idea, ya que la estructura de hidratación del sodio es supuestamente más estable que el potasio. Entonces, ¿posiblemente la concentración intracelular de Na / K pueda estar relacionada con la estabilidad de sus estructuras de hidratación? Esto posiblemente podría complementar la teoría de que los cationes son atraídos por membranas celulares cargadas negativamente (con K que tiene un tránsito más rápido) como un medio para facilitar la difusión.

De esta manera pude ver la membrana cargada negativamente facilitando tanto la entrada como la salida de cationes, mientras que la estabilidad de la hidratación y los residuos intracelulares cargados negativamente actúan como absorbentes (y posiblemente incluso contribuciones menores del transporte facilitado a través de cosas como ATPasa y canales iónicos) determinando qué iones son es más probable que se difundan y cuáles se quedan quietos.


Acumulación excesiva de glutamato

El proceso clave que desencadena toda la cascada excitotóxica es la acumulación excesiva de glutamato en el espacio sináptico. Esto se puede lograr alterando el ciclo normal del glutamato intracraneal (Fig. 13) para aumentar la liberación de glutamato en el espacio extracelular o para disminuir la captación / transporte de glutamato desde el espacio sináptico, o mediante un franco derrame de glutamato de las neuronas lesionadas.

El glutamato neuronal que se libera en el espacio sináptico normalmente se elimina del espacio sináptico por las células gliales adyacentes, en las que el glutamato se convierte en la glutamina estrechamente relacionada, que luego puede difundirse fácilmente de regreso a la neurona. La glutamina se convierte nuevamente en glutamato en la neurona.

Fig. 14. El diagrama muestra la secuencia de eventos que ocurren en la isquemia cerebral que conducen a la muerte neuronal. (La formación de radicales libres y la activación de la lipasa también están relacionadas con el aumento de calcio intracelular, aunque los dos procesos no están directamente conectados con el aumento de calcio mediante flechas en este esquema).

El trauma es un mecanismo contundente que eleva enormemente los niveles extracelulares de glutamato. La concentración normal de glutamato extracelular es de aproximadamente 0,6 μmol / L. Se produce una lesión neuronal excitotóxica sustancial con concentraciones de glutamato de 2 a 5 μmol / L. La lesión traumática de las neuronas puede producir resultados desastrosos con la exposición de las concentraciones de glutamato intracelular normales de aproximadamente 10 μmol / L al espacio extracelular. La lesión mecánica de una sola neurona, por lo tanto, pone en riesgo a todas las neuronas vecinas. Se produce una lesión colateral significativa en las neuronas circundantes debido a este tipo de liberación de glutamato. Una estrategia terapéutica reciente consiste en tratar de inmediato a las personas con lesiones en la cabeza o la columna vertebral con bloqueadores de los receptores de glutamato para minimizar la propagación de la muerte neuronal más allá de las neuronas inmediatamente afectadas físicamente.

Es probable que en la isquemia intervengan varios mecanismos de acumulación excesiva de glutamato (Fig. 14). La liberación anormal de glutamato de sus sitios de almacenamiento en vesículas neuronales es al menos un factor. Se genera un circuito de retroalimentación ya que este glutamato liberado estimula la liberación de glutamato adicional. La isquemia también provoca un fallo energético que dificulta la recaptación por los transportadores de glutamato. Estos transportadores se comportan como simportadores, que dependen del gradiente de sodio a través de las membranas celulares para mover el glutamato contra sus gradientes de concentración hacia el interior de la célula. Sin embargo, el gradiente de sodio se mantiene mediante una bomba dependiente de la energía que falla en la isquemia. Tal falla no solo afecta el transporte de glutamato fuera del espacio sináptico, sino que también hace que los transportadores retrocedan, convirtiéndose en una fuente de glutamato extracelular en lugar de un sumidero para él. La isquemia priva a las neuronas de oxígeno y glucosa, lo que provoca un fallo energético; sin embargo, el fallo energético en sí no es particularmente tóxico para las neuronas. La toxicidad neuronal ocurre con la activación resultante de la cascada de mecanismos dependientes del receptor de glutamato. Si estos receptores son bloqueados por antagonistas apropiados, las neuronas pueden sobrevivir a un período de privación de oxígeno y sustrato metabólico. Este es el fundamento del reciente desarrollo y ensayo de bloqueadores de los receptores de glutamato para tratar los episodios isquémicos agudos (55-66). Si bien una zona infartada no se puede salvar, la esperanza es evitar daños circundantes a la penumbra adyacente en riesgo.

Estos bloqueadores de receptores también pueden ser críticos en el campo en desarrollo de los intentos intervencionistas y farmacológicamente relacionados para restablecer la perfusión en áreas del cerebro con isquemia aguda. La reperfusión tisular y el aumento de las concentraciones de oxígeno en las áreas isquémicas sin la detención simultánea de la cascada excitotóxica, ya sea en el receptor o en los niveles intracelulares, pueden aumentar en lugar de disminuir el daño neuronal al proporcionar radicales libres adicionales en forma de aniones superóxido, así como al aumentar el citosol de calcio intracelular. niveles estimulando la liberación de depósitos de calcio mitocondrial.

La aceptación del papel significativo de las mitocondrias en la muerte neuronal y la excitotoxicidad se refleja en la literatura en rápida expansión sobre este tema durante la última década (26, 49, 67-81). Las investigaciones preliminares sobre los mecanismos de la homeostasis del calcio mitocondrial ya han inspirado varias estrategias terapéuticas neuroprotectoras.

Se han desarrollado y utilizado varios fármacos para intentar interrumpir, influir o detener temporalmente la cascada excitotóxica del glutamato hacia la lesión neuronal (82-88). Una estrategia es el intento "corriente arriba" de disminuir la liberación de glutamato. Esta categoría de medicamentos incluye riluzol, lamotrigina y lifarizina, que son bloqueadores de los canales de sodio. La nimodipina de uso común es un bloqueador del canal dependiente del voltaje (tipo L). También se han hecho intentos para afectar los diversos sitios del propio receptor de glutamato acoplado. Algunos de estos medicamentos incluyen felbamato, ifenprodil, magnesio, memantina y nitroglicerina. Estos fármacos "aguas abajo" intentan influir en eventos intracelulares como la formación de radicales libres, la formación de óxido nítrico, la proteólisis, la actividad endonucleasa y la formación de proteasas similares a ICE (un componente importante en el proceso que conduce a la muerte celular programada o apoptosis). La apoptosis ocurre como parte del complejo proceso de muerte neuronal, pero muchos investigadores creen que la excitotoxicidad y la apoptosis son mecanismos esencialmente diferentes que tienen influencias que se cruzan (27, 56, 89-106).


Materiales y métodos

Animales

El Centro de Animales de Laboratorio de Hebei (Shijiazhuang, China) proporcionó ratas macho y hembra Sprague-Dawley que pesaban de 300 a 350 g y se alojaron a una temperatura controlada (23 ± 1 ° C) y humedad (50 ± 5%) a una temperatura constante de 12 -h ciclo luz / oscuridad (luces encendidas de 08:00 a 20:00) con acceso gratuito a comida de laboratorio estándar y agua del grifo. Se permitió que todos los animales se habituaran a las instalaciones de mantenimiento de animales durante un período de al menos 3 días antes de la reproducción. El estudio actual fue aprobado por el Comité de Ética para Animales de la Universidad Médica de Hebei (Shijiazhuang, China). El cuidado de los animales y los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud.

Productos químicos principales

El medio neurobasal, el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), el suero bovino fetal al 10% (FBS), el éster de fura-2-acetoximetilo, el piruvato de sodio, la glucosa, B-27, la L-glutamina, HEPES e Hibernate-E se obtuvieron de Invitrogen (Estados Unidos). Vitaminas A y E, glutatión, ropivacaína, ácido ciclopiazónico (CPA), tetrodotoxina, kit ROS de fluorescencia intracelular, poli-D-lisina, sal monosódica del ácido L-glutámico, 5-fluoro-1,3-dimetiluracilo, NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2y la penicilina / estreptomicina se adquirieron de Sigma (EE.UU.). Ciclosporina A (CsA), JC-1, 1,2-Bis (2-aminofenoxi) etano-N, N, N ', N'-tetrakis (éster acetoximetílico) del ácido tetraacético (BAPTA-AM) xestospongina C y ácido dihidrocaínico (Dih) se obtuvieron de Abcam (EE. UU.). Se adquirieron bupivacaína, 2 ', 7'-diclorofluorescina-diacetato (DCFH-DA), EGTA, dantroleno y trifosfato de adenosina (ATP) de TCI (Japón), Beyotime (China), TaKaRa (Japón), Farmacopea de EE. UU. (EE. UU.) y SERVA (Alemania), respectivamente. Se disolvió bupivacaína en agua estéril a una concentración de 5,8 mM y se diluyó con tampón HEPES (ver Preparación de medio y tampón) hasta concentraciones finales de 0,3 a 300 μM.

Preparación de medio y tampón

El medio químicamente definido (CDM) contenía medio neurobasal, glucosa-HEPES, B27 al 2%, vitamina A 0,2 μM, vitamina E 3 μM, penicilina (50 U / ml) / estreptomicina (50 μg / ml), glutatión 4 μM, 5 L-glutamina mM y piruvato de sodio 1 mM. El tampón HEPES contenía (en mM) 145 NaCl, 3 KCl, 2 MgCl2, 2 CaCl2, 10 de glucosa y 10 de HEPES (ajustado a pH 7,4 con NaOH). La solución libre de Ca 2+ más EGTA 5 mM (solución libre de Ca 2+) contenía (en mM) 145 NaCl, 3 KCl, 4 MgCl2, 10 de glucosa, 10 de HEPES y 5 de EGTA (ajustado a pH 7,4 con NaOH).

Cultivo de células

Se prepararon cultivos mixtos de neuronas y astrocitos del hipocampo primario a partir de fetos de rata Sprague-Dawley en los días de gestación 18 a 20. La suspensión de células del hipocampo se preparó usando los métodos previamente descritos 31 y se sembró en placas de 24 pocillos recubiertas con poli-D-lisina a una densidad de 2,5 × 10 4 células / cm 2. Los cultivos se mantuvieron en DMEM suplementado con FBS al 10% a 37 ° C en una atmósfera humidificada de CO al 5%2. Cuatro horas después de la siembra inicial, el medio se reemplazó con CDM fresco y se renovó cada 3 días reemplazando la mitad del volumen del medio con un volumen igual de CDM fresco y precalentado.

En cultivos puros de neuronas del hipocampo primario, el medio se reemplazó con CDM fresco suplementado con 5-fluoro-1,3-dimetiluracilo 10 µM para inhibir la replicación de células no neuronales 3 días después de la siembra inicial. Posteriormente, el medio se reemplazó con CDM fresco y se renovó cada 3 días reemplazando la mitad del volumen del medio con un volumen igual de CDM fresco y precalentado. En cultivos puros de astrocitos del hipocampo primario, las células se cultivaron en DMEM suplementado con FBS al 10% durante los primeros 3 días después de la siembra en placa inicial, y luego el medio se reemplazó con DMEM puro.

Imágenes de calcio

Después de 7 a 10 días en cultivo, las células del hipocampo de rata se cargaron con fura-2-acetoximetilo (2 μM) en la oscuridad durante 20 min a 37 ° C. Después de la carga, los cultivos de células del hipocampo se lavaron dos veces con tampón HEPES para eliminar el tinte extracelular y se colocaron en una cámara de registro que se perfundió continuamente con tampón HEPES a un caudal de 2 ml / min a temperatura ambiente (23 ± 1 ° C). Las imágenes radiométricas de calcio se realizaron a temperatura ambiente utilizando los métodos descritos anteriormente. Se excitaron 31 señales de Ca 2+ a 340 y 380 nm. La relación de valores a 340/380 nm, la intensidad de fluorescencia a 340 nm dividida por la de 380 nm, se calculó mediante la ecuación [Ca 2+]I (340/380 nm) = <[P (340/380 nm) - B (340/380 nm)] / B (340/380 nm)> × 100%, donde P (340/380 nm) es la relación máxima después de la intervención y B (340/380 nm) es el cociente basal antes de la intervención. Aplicamos los marcadores positivos KCl y ATP a las células del hipocampo al final de cada experimento para distinguir neuronas (KCl) y astrocitos (ATP).

Medición del potencial de la membrana mitocondrial

Las neuronas del hipocampo y los astrocitos en cultivo se cargaron con colorante JC-1 (10 μg / ml, 20 min, 37 ° C), una sonda de fluorescencia catiónica lipofílica específica de mitocondrias, para controlar el mtΔΨ. Después de la carga, las células se lavaron con tampón HEPES y se perfundieron utilizando el mismo método que el método de formación de imágenes de calcio. Las imágenes del mtΔΨ se generaron y capturaron con un microscopio de barrido láser confocal de dos fotones Leica DMi8 (Leica Microsystems Inc., Alemania) a intervalos de 3 s. Las señales mtΔΨ se excitaron a 488 y 519 nm, y mtΔΨ (519/488 nm) representó la proporción de fluorescencia roja / verde de JC-1 que se usó como marcador para mostrar los cambios en mtΔΨ. Una disminución en mtΔΨ (519/488 nm) indicó un colapso de mtΔΨ y despolarización de la membrana mitocondrial.

Medición de la generación ROS

La generación de ROS intracelulares inducida por la intervención del fármaco se evaluó midiendo la intensidad de la fluorescencia usando DCFH-DA o un kit de ROS de fluorescencia intracelular. Las neuronas del hipocampo y los astrocitos en cultivo se cargaron con DCFH-DA o reactivos del kit ROS en la oscuridad a 37 ° C durante 20 min o 60 min. Después de cargar con DCFH-DA, los cultivos de células del hipocampo se lavaron y se perfundieron con tampón HEPES utilizando el mismo método que el método de formación de imágenes de calcio. Por el contrario, las células cargadas con el tinte fluorescente del kit ROS se colocaron directamente bajo el microscopio sin lavar. Las señales ROS se excitaron a 488 nm utilizando un microscopio Leica DMI3000B (Leica Microsystems Inc.) equipado con un sistema de imágenes radiométricas y se registraron a intervalos de 1 s utilizando una cámara de dispositivo acoplado de carga multiplicadora de electrones enfriada (Andor, Alemania). La generación de ROS, como lo indica la intensidad de fluorescencia a 488 nm, en células cargadas con DCFH-DA o el tinte fluorescente del kit ROS se calculó mediante la ecuación generación de ROS (488 nm) = [(P488 nm - B488 nm) / B488 nm] × 100%, donde P488 nm es la intensidad de fluorescencia máxima después de la intervención y B488 nm es la intensidad de fluorescencia de referencia antes de la intervención.

Administración de Drogas

Todos los agentes se disolvieron en tampón HEPES y se aplicaron localmente a las células del hipocampo a través de una micropipeta (con un diámetro de punta de 100 μm) conectada a un sistema de aplicación de fármacos de presión controlada de 8 canales (ALA Scientific, EE. UU.). En los cultivos de células primarias mixtas de astrocitos / neuronas del hipocampo o cultivos puros de un tipo celular particular, dos exposiciones a glutamato en la concentración que evoca la respuesta semimáxima (CE50 1 mM) durante 10 s indujeron aumentos reproducibles en [Ca 2+]I en el grupo de control de solvente, y el aumento de [Ca 2+]I se restauró al nivel de la línea de base después de un lavado del agente. Antes de la segunda exposición al glutamato en la misma célula, se administró un pretratamiento con bupivacaína, ropivacaína, tetrodotoxina, CPA o Dih mediante una perfusión de 5 min, según el plan de investigación.

Análisis estadístico

Los valores se presentan como medias ± DE. Se utilizó un ANOVA de una vía seguido de la prueba de Dunnett para analizar las curvas de concentración-respuesta de bupivacaína o ropivacaína, y un ANOVA de dos vías seguido de Bonferroni post hoc La prueba se utilizó para evaluar cualquier diferencia entre los dos conjuntos de curvas de concentración-respuesta. Las diferencias entre los valores previos y posteriores al tratamiento en la misma celda se determinaron mediante un t prueba, y las diferencias entre los dos grupos se determinaron utilizando una t prueba. La CE50 valores (concentración molar de agonista que produjo el 50% de la respuesta máxima) y Emax Los valores (la respuesta máxima) para bupivacaína o glutamato se calcularon con un análisis de regresión no lineal usando el software GraphPad Prism 5.00 (GraphPad Software Inc., EE. UU.) y se compararon usando un t prueba. A PAG un valor inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Los datos se analizaron utilizando el software GraphPad Prism y el software SPSS (v. 20.0 SPSS, EE. UU.). No a priori Se realizaron cálculos de potencia estadística para orientar las consideraciones sobre el tamaño de la muestra. Los tamaños de las muestras se basaron en la experiencia de investigación internacional previa y en artículos publicados. En este estudio no se utilizaron métodos de asignación al azar. Los experimentadores no estaban cegados a las condiciones en estudio. Nuestros experimentos no incluyeron datos faltantes, datos perdidos o datos excluidos.


35.2 Cómo se comunican las neuronas

Al final de esta sección, podrá hacer lo siguiente:

  • Describir la base del potencial de membrana en reposo.
  • Explicar las etapas de un potencial de acción y cómo se propagan los potenciales de acción.
  • Explicar las similitudes y diferencias entre las sinapsis químicas y eléctricas.
  • Describir la potenciación a largo plazo y la depresión a largo plazo.

Todas las funciones realizadas por el sistema nervioso, desde un simple reflejo motor hasta funciones más avanzadas como tomar una memoria o tomar una decisión, requieren neuronas para comunicarse entre sí. Mientras que los humanos usan palabras y lenguaje corporal para comunicarse, las neuronas usan señales eléctricas y químicas. Al igual que una persona en un comité, una neurona generalmente recibe y sintetiza mensajes de muchas otras neuronas antes de "tomar la decisión" de enviar el mensaje a otras neuronas.

Transmisión de impulsos nerviosos dentro de una neurona

Para que el sistema nervioso funcione, las neuronas deben poder enviar y recibir señales. Estas señales son posibles porque cada neurona tiene una membrana celular cargada (una diferencia de voltaje entre el interior y el exterior), y la carga de esta membrana puede cambiar en respuesta a las moléculas de neurotransmisores liberadas por otras neuronas y estímulos ambientales. Para comprender cómo se comunican las neuronas, primero se debe comprender la base de la línea de base o carga de la membrana "en reposo".

Membranas cargadas neuronales

La membrana de la bicapa lipídica que rodea a una neurona es impermeable a las moléculas o iones cargados. Para entrar o salir de la neurona, los iones deben pasar a través de proteínas especiales llamadas canales iónicos que atraviesan la membrana. Los canales de iones tienen diferentes configuraciones: abiertos, cerrados e inactivos, como se ilustra en la Figura 35.9. Algunos canales de iones deben activarse para que se abran y permitan que los iones entren o salgan de la celda. Estos canales iónicos son sensibles al medio ambiente y pueden cambiar su forma en consecuencia. Los canales de iones que cambian su estructura en respuesta a los cambios de voltaje se denominan canales de iones activados por voltaje. Los canales iónicos activados por voltaje regulan las concentraciones relativas de diferentes iones dentro y fuera de la celda. La diferencia en la carga total entre el interior y el exterior de la célula se denomina potencial de membrana.

Enlace al aprendizaje

Este video analiza la base del potencial de membrana en reposo.

Potencial de membrana en reposo

Una neurona en reposo está cargada negativamente: el interior de una célula es aproximadamente 70 milivoltios más negativo que el exterior (-70 mV, tenga en cuenta que este número varía según el tipo de neurona y la especie). Este voltaje se llama potencial de membrana en reposo y es causado por diferencias en las concentraciones de iones dentro y fuera de la célula. Si la membrana fuera igualmente permeable a todos los iones, cada tipo de ión fluiría a través de la membrana y el sistema alcanzaría el equilibrio. Debido a que los iones no pueden simplemente cruzar la membrana a voluntad, existen diferentes concentraciones de varios iones dentro y fuera de la célula, como se muestra en la tabla 35.1. La diferencia en el número de iones de potasio cargados positivamente (K +) dentro y fuera de la célula domina el potencial de membrana en reposo (Figura 35.10). Cuando la membrana está en reposo, los iones K + se acumulan dentro de la célula debido a un movimiento neto con el gradiente de concentración. El potencial de membrana en reposo negativo se crea y se mantiene aumentando la concentración de cationes fuera de la célula (en el líquido extracelular) en relación con el interior de la célula (en el citoplasma). La carga negativa dentro de la célula se crea porque la membrana celular es más permeable al movimiento del ión potasio que al movimiento del ión sodio. En las neuronas, los iones de potasio se mantienen en altas concentraciones dentro de la célula, mientras que los iones de sodio se mantienen en altas concentraciones fuera de la célula. La célula posee canales de fuga de potasio y sodio que permiten que los dos cationes se difundan en su gradiente de concentración. Sin embargo, las neuronas tienen muchos más canales de fuga de potasio que de sodio. Por lo tanto, el potasio se difunde fuera de la célula a un ritmo mucho más rápido que el sodio. Debido a que salen más cationes de la célula de los que entran, esto hace que el interior de la célula se cargue negativamente en relación con el exterior de la célula. Las acciones de la bomba de sodio y potasio ayudan a mantener el potencial de reposo, una vez establecido. Recuerde que las bombas de sodio y potasio aportan dos iones K + a la célula mientras eliminan tres iones Na + por cada ATP consumido. Como se expulsan más cationes de la célula de los que se ingieren, el interior de la célula permanece cargado negativamente en relación con el líquido extracelular. Cabe señalar que los iones cloruro (Cl -) tienden a acumularse fuera de la célula porque son repelidos por proteínas cargadas negativamente dentro del citoplasma.

Ion Concentración extracelular (mM) Concentración intracelular (mM) Relación exterior / interior
Na + 145 12 12
K + 4 155 0.026
Cl - 120 4 30
Aniones orgánicos (A−) 100

Potencial de acción

Una neurona puede recibir información de otras neuronas y, si esta entrada es lo suficientemente fuerte, enviar la señal a las neuronas posteriores. La transmisión de una señal entre neuronas generalmente se realiza mediante una sustancia química llamada neurotransmisor. La transmisión de una señal dentro de una neurona (desde la dendrita al axón terminal) se realiza mediante una breve inversión del potencial de membrana en reposo llamado potencial de acción. Cuando las moléculas de neurotransmisores se unen a los receptores ubicados en las dendritas de una neurona, los canales iónicos se abren. En las sinapsis excitadoras, esta apertura permite que los iones positivos entren en la neurona y da como resultado la despolarización de la membrana, una disminución en la diferencia de voltaje entre el interior y el exterior de la neurona. Un estímulo de una célula sensorial u otra neurona despolariza la neurona objetivo a su potencial umbral (-55 mV). Los canales de Na + en el montículo del axón se abren, permitiendo que los iones positivos entren en la célula (Figura 35.10 y Figura 35.11). Una vez que se abren los canales de sodio, la neurona se despolariza completamente a un potencial de membrana de aproximadamente +40 mV. Los potenciales de acción se consideran un evento de "todo o nada", en el sentido de que, una vez que se alcanza el potencial umbral, la neurona siempre se despolariza por completo. Una vez que se completa la despolarización, la célula debe ahora "restablecer" su voltaje de membrana al potencial de reposo. Para lograr esto, los canales de Na + se cierran y no se pueden abrir. Esto inicia el período refractario de la neurona, en el que no puede producir otro potencial de acción porque sus canales de sodio no se abren. Al mismo tiempo, los canales de K + activados por voltaje se abren, lo que permite que K + salga de la celda. A medida que los iones K + abandonan la célula, el potencial de membrana vuelve a ser negativo. La difusión de K + fuera de la célula en realidad hiperpolariza la célula, en el sentido de que el potencial de membrana se vuelve más negativo que el potencial de reposo normal de la célula. En este punto, los canales de sodio volverán a su estado de reposo, lo que significa que están listos para abrirse nuevamente si el potencial de membrana excede nuevamente el potencial umbral. Finalmente, los iones de K + adicionales se difunden fuera de la célula a través de los canales de fuga de potasio, lo que lleva a la célula de su estado hiperpolarizado a su potencial de membrana en reposo.

Conexión visual

Los bloqueadores de los canales de potasio, como la amiodarona y la procainamida, que se utilizan para tratar la actividad eléctrica anormal en el corazón, denominada arritmia cardíaca, impiden el movimiento de K + a través de los canales de K + activados por voltaje. ¿Qué parte del potencial de acción esperaría que afectaran los canales de potasio?

Enlace al aprendizaje

Este video presenta una descripción general del potencial de acción.

Mielina y la propagación del potencial de acción

Para que un potencial de acción comunique información a otra neurona, debe viajar a lo largo del axón y llegar a las terminales del axón, donde puede iniciar la liberación de neurotransmisores. La velocidad de conducción de un potencial de acción a lo largo de un axón está influenciada tanto por el diámetro del axón como por la resistencia del axón a la fuga de corriente. La mielina actúa como un aislante que evita que la corriente salga del axón, lo que aumenta la velocidad de conducción del potencial de acción.En enfermedades desmielinizantes como la esclerosis múltiple, la conducción del potencial de acción se ralentiza porque la corriente se escapa de áreas de axones previamente aisladas. Los ganglios de Ranvier, ilustrados en la figura 35.13, son espacios en la vaina de mielina a lo largo del axón. Estos espacios amielínicos tienen aproximadamente un micrómetro de largo y contienen canales de Na + y K + activados por voltaje. El flujo de iones a través de estos canales, en particular los canales de Na +, regenera el potencial de acción una y otra vez a lo largo del axón. Este "salto" del potencial de acción de un nodo al siguiente se denomina conducción saltatoria. Si los nodos de Ranvier no estuvieran presentes a lo largo de un axón, el potencial de acción se propagaría muy lentamente ya que los canales de Na + y K + tendrían que regenerar continuamente los potenciales de acción en cada punto a lo largo del axón en lugar de en puntos específicos. Los nodos de Ranvier también ahorran energía para la neurona, ya que los canales solo necesitan estar presentes en los nodos y no a lo largo de todo el axón.

Transmisión sinaptica

La sinapsis o "brecha" es el lugar donde se transmite la información de una neurona a otra. Las sinapsis generalmente se forman entre los terminales de los axones y las espinas dendríticas, pero esto no es universalmente cierto. También hay sinapsis de axón a axón, dendrita a dendrita y axón a cuerpo celular. La neurona que transmite la señal se llama neurona presináptica y la neurona que recibe la señal se llama neurona postsináptica. Tenga en cuenta que estas designaciones son relativas a una sinapsis en particular; la mayoría de las neuronas son presinápticas y postsinápticas. Hay dos tipos de sinapsis: química y eléctrica.

Sinapsis química

Cuando un potencial de acción alcanza el terminal del axón, despolariza la membrana y abre canales de Na + dependientes de voltaje. Los iones de Na + entran en la célula, despolarizando aún más la membrana presináptica. Esta despolarización hace que se abran los canales de Ca 2+ dependientes de voltaje. Los iones de calcio que ingresan a la célula inician una cascada de señalización que hace que pequeñas vesículas unidas a la membrana, llamadas vesículas sinápticas, que contienen moléculas de neurotransmisores se fusionen con la membrana presináptica. Las vesículas sinápticas se muestran en la figura 35.14, que es una imagen de un microscopio electrónico de barrido.

La fusión de una vesícula con la membrana presináptica hace que se libere un neurotransmisor en la hendidura sináptica, el espacio extracelular entre las membranas presináptica y postsináptica, como se ilustra en la figura 35.15. El neurotransmisor se difunde a través de la hendidura sináptica y se une a las proteínas receptoras en la membrana postsináptica.

La unión de un neurotransmisor específico hace que se abran canales iónicos particulares, en este caso canales controlados por ligandos, en la membrana postsináptica. Los neurotransmisores pueden tener efectos excitadores o inhibidores sobre la membrana postsináptica. Por ejemplo, cuando una neurona presináptica libera acetilcolina en la sinapsis entre un nervio y un músculo (llamada unión neuromuscular), se abren los canales postsinápticos de Na +. El Na + entra en la célula postsináptica y hace que la membrana postsináptica se despolarice. Esta despolarización se denomina potencial postsináptico excitador (EPSP) y hace que la neurona postsináptica sea más propensa a disparar un potencial de acción. La liberación de neurotransmisores en las sinapsis inhibitorias provoca potenciales postsinápticos inhibidores (IPSP), una hiperpolarización de la membrana presináptica. Por ejemplo, cuando el neurotransmisor GABA (ácido gamma-aminobutírico) se libera de una neurona presináptica, se une a los canales de Cl - y los abre. Los iones Cl - entran en la célula e hiperpolarizan la membrana, lo que hace que la neurona tenga menos probabilidades de disparar un potencial de acción.

Una vez que se ha producido la neurotransmisión, el neurotransmisor debe eliminarse de la hendidura sináptica para que la membrana postsináptica pueda "restablecerse" y esté lista para recibir otra señal. Esto se puede lograr de tres maneras: el neurotransmisor puede difundirse lejos de la hendidura sináptica, puede ser degradado por enzimas en la hendidura sináptica o puede ser reciclado (a veces llamado recaptación) por la neurona presináptica. Varios fármacos actúan en este paso de la neurotransmisión. Por ejemplo, algunos medicamentos que se administran a los pacientes con Alzheimer funcionan inhibiendo la acetilcolinesterasa, la enzima que degrada la acetilcolina. Esta inhibición de la enzima esencialmente aumenta la neurotransmisión en las sinapsis que liberan acetilcolina. Una vez liberada, la acetilcolina permanece en la hendidura y se puede unir y desvincular continuamente de los receptores postsinápticos.

Neurotransmisor Ejemplo Localización
Acetilcolina SNC y / o SNP
Amina biogénica Dopamina, serotonina, norepinefrina SNC y / o SNP
Aminoácidos Glicina, glutamato, aspartato, ácido gamma aminobutírico SNC
Neuropéptido Sustancia P, endorfinas SNC y / o SNP

Sinapsis eléctrica

Si bien las sinapsis eléctricas son menos numerosas que las sinapsis químicas, se encuentran en todos los sistemas nerviosos y desempeñan funciones importantes y únicas. El modo de neurotransmisión en las sinapsis eléctricas es bastante diferente al de las sinapsis químicas. En una sinapsis eléctrica, las membranas presinápticas y postsinápticas están muy juntas y en realidad están conectadas físicamente por proteínas de canal que forman uniones gap. Las uniones de separación permiten que la corriente pase directamente de una celda a la siguiente. Además de los iones que transportan esta corriente, otras moléculas, como el ATP, pueden difundirse a través de los grandes poros de la unión gap.

Existen diferencias clave entre las sinapsis químicas y eléctricas. Dado que las sinapsis químicas dependen de la liberación de moléculas de neurotransmisores de las vesículas sinápticas para transmitir su señal, existe un retraso de aproximadamente un milisegundo entre el momento en que el potencial del axón alcanza la terminal presináptica y el momento en que el neurotransmisor conduce a la apertura de los canales iónicos postsinápticos. Además, esta señalización es unidireccional. La señalización en las sinapsis eléctricas, por el contrario, es prácticamente instantánea (lo cual es importante para las sinapsis involucradas en los reflejos clave) y algunas sinapsis eléctricas son bidireccionales. Las sinapsis eléctricas también son más fiables, ya que es menos probable que se bloqueen y son importantes para sincronizar la actividad eléctrica de un grupo de neuronas. Por ejemplo, se cree que las sinapsis eléctricas en el tálamo regulan el sueño de ondas lentas y la interrupción de estas sinapsis puede causar convulsiones.

Suma de señales

A veces, un solo EPSP es lo suficientemente fuerte como para inducir un potencial de acción en la neurona postsináptica, pero a menudo múltiples entradas presinápticas deben crear EPSP aproximadamente al mismo tiempo para que la neurona postsináptica se despolarice lo suficiente como para disparar un potencial de acción. Este proceso se llama suma y ocurre en el montículo del axón, como se ilustra en la figura 35.16. Además, una neurona a menudo tiene entradas de muchas neuronas presinápticas, algunas excitadoras y otras inhibidoras, por lo que las IPSP pueden cancelar las EPSP y viceversa. Es el cambio neto en el voltaje de la membrana postsináptica lo que determina si la célula postsináptica ha alcanzado su umbral de excitación necesario para disparar un potencial de acción. Juntos, la suma sináptica y el umbral de excitación actúan como un filtro para que el "ruido" aleatorio en el sistema no se transmita como información importante.

Conexión diaria

Interfaz cerebro-computadora

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA, también llamada enfermedad de Lou Gehrig) es una enfermedad neurológica caracterizada por la degeneración de las neuronas motoras que controlan los movimientos voluntarios. La enfermedad comienza con el debilitamiento de los músculos y la falta de coordinación y, finalmente, destruye las neuronas que controlan el habla, la respiración y la deglución. Al final, la enfermedad puede provocar parálisis. En ese momento, los pacientes necesitan ayuda de máquinas para poder respirar y comunicarse. Se han desarrollado varias tecnologías especiales para permitir que los pacientes "encerrados" se comuniquen con el resto del mundo. Una tecnología, por ejemplo, permite a los pacientes escribir oraciones moviendo la mejilla. Estas oraciones se pueden leer en voz alta en una computadora.

Una línea de investigación relativamente nueva para ayudar a los pacientes paralizados, incluidos aquellos con ELA, a comunicarse y retener un grado de autosuficiencia se llama tecnología de interfaz cerebro-computadora (BCI) y se ilustra en la Figura 35.17. Esta tecnología suena como algo salido de la ciencia ficción: permite a los pacientes paralizados controlar una computadora usando solo sus pensamientos. Hay varias formas de BCI. Algunas formas usan registros de EEG de electrodos pegados al cráneo. Estas grabaciones contienen información de grandes poblaciones de neuronas que una computadora puede decodificar. Otras formas de BCI requieren la implantación de una serie de electrodos más pequeños que un sello postal en el área del brazo y la mano de la corteza motora. Esta forma de BCI, aunque más invasiva, es muy poderosa ya que cada electrodo puede registrar potenciales de acción reales de una o más neuronas. Luego, estas señales se envían a una computadora, que ha sido entrenada para decodificar la señal y enviarla a una herramienta, como un cursor en la pantalla de una computadora. Esto significa que un paciente con ELA puede usar el correo electrónico, leer Internet y comunicarse con otros pensando en mover la mano o el brazo (aunque el paciente paralizado no pueda realizar ese movimiento corporal). Los avances recientes han permitido a una paciente paralizada encerrada que sufrió un derrame cerebral hace 15 años controlar un brazo robótico e incluso alimentarse con café con la tecnología BCI.

A pesar de los asombrosos avances en la tecnología BCI, también tiene limitaciones. La tecnología puede requerir muchas horas de entrenamiento y largos períodos de intensa concentración para el paciente, también puede requerir cirugía cerebral para implantar los dispositivos.

Enlace al aprendizaje

Mire este video en el que una mujer paralizada usa un brazo robótico controlado por el cerebro para llevarse una bebida a la boca, entre otras imágenes de la tecnología de interfaz cerebro-computadora en acción.

Plasticidad sinaptica

Las sinapsis no son estructuras estáticas. Pueden debilitarse o fortalecerse. Se pueden romper y se pueden crear nuevas sinapsis. La plasticidad sináptica permite estos cambios, todos necesarios para el funcionamiento del sistema nervioso. De hecho, la plasticidad sináptica es la base del aprendizaje y la memoria. Dos procesos en particular, la potenciación a largo plazo (LTP) y la depresión a largo plazo (LTD) son formas importantes de plasticidad sináptica que se producen en las sinapsis del hipocampo, una región del cerebro que participa en el almacenamiento de recuerdos.

Potenciación a largo plazo (LTP)

La potenciación a largo plazo (LTP) es un fortalecimiento persistente de una conexión sináptica. LTP se basa en el principio de Hebbian: las células que disparan juntas se conectan entre sí. Hay varios mecanismos, ninguno completamente comprendido, detrás del fortalecimiento sináptico observado con LTP. Un mecanismo conocido implica un tipo de receptor de glutamato postsináptico, llamado receptores NMDA (N-metil-D-aspartato), que se muestra en la figura 35.18. Estos receptores normalmente están bloqueados por iones de magnesio; sin embargo, cuando la neurona postsináptica es despolarizada por múltiples entradas presinápticas en rápida sucesión (ya sea de una neurona o de múltiples neuronas), los iones de magnesio son expulsados ​​permitiendo que los iones de Ca pasen a la célula postsináptica. A continuación, los iones Ca 2+ que ingresan a la célula inician una cascada de señalización que provoca que un tipo diferente de receptor de glutamato, llamado AMPA (ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico), se inserte en los receptores postsinápticos. membrana, ya que los receptores AMPA activados permiten que los iones positivos entren en la célula. Entonces, la próxima vez que se libere glutamato de la membrana presináptica, tendrá un efecto excitador mayor (EPSP) en la célula postsináptica porque la unión del glutamato a estos receptores AMPA permitirá que ingresen más iones positivos en la célula. La inserción de receptores AMPA adicionales fortalece la sinapsis y significa que es más probable que la neurona postsináptica se dispare en respuesta a la liberación de neurotransmisores presinápticos. Algunas drogas de abuso cooptan la vía LTP, y este fortalecimiento sináptico puede conducir a la adicción.

Depresión a largo plazo (LTD)

La depresión a largo plazo (LTD) es esencialmente lo contrario de la LTP: es un debilitamiento a largo plazo de una conexión sináptica. Un mecanismo conocido por causar LTD también involucra a los receptores AMPA. En esta situación, el calcio que ingresa a través de los receptores NMDA inicia una cascada de señalización diferente, que da como resultado la eliminación de los receptores AMPA de la membrana postsináptica, como se ilustra en la figura 35.18. La disminución de los receptores AMPA en la membrana hace que la neurona postsináptica responda menos al glutamato liberado por la neurona presináptica. Si bien puede parecer contradictorio, LTD puede ser tan importante para el aprendizaje y la memoria como LTP. El debilitamiento y la poda de las sinapsis no utilizadas permite que se pierdan conexiones sin importancia y hace que las sinapsis que se han sometido a LTP sean mucho más fuertes en comparación.


Abstracto

La despolarización de la membrana plasmática puede desencadenar la proliferación celular, pero no se sabe con certeza cómo el potencial de membrana influye en la señalización mitogénica. Aquí, mostramos que la despolarización de la membrana plasmática induce la reorganización a nanoescala de fosfatidilserina y fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato, pero no otros fosfolípidos aniónicos. K-Ras, que se dirige a la membrana plasmática mediante interacciones electrostáticas con la fosfatidilserina, a su vez se somete a un nanoclustering mejorado. Los cambios inducidos por la despolarización en la organización de la membrana plasmática de fosfatidilserina y K-Ras ocurren en fibroblastos, células de neuroblastoma excitables y Drosophila neuronas in vivo y amplifican de forma robusta la señalización de la proteína quinasa activada por mitógenos dependiente de K-Ras (MAPK). Por el contrario, la repolarización de la membrana plasmática interrumpe el nanoclustering de K-Ras e inhibe la señalización de MAPK. Al responder a los cambios inducidos por voltaje en la dinámica espacio-temporal de la fosfatidilserina, los nanoclusters K-Ras configuran la membrana plasmática como un transistor de efecto de campo biológico, lo que permite que el potencial de membrana controle la ganancia en los circuitos de señalización mitogénica.

Potencial de membrana plasmática (PM) (Vmetro) se ha relacionado con la supervivencia y proliferación celular (1, 2). Las células en división están más despolarizadas que las células inactivas, y las células transformadas oncogénicamente están generalmente más despolarizadas que las células parentales normales, lo que indica que Vmetro puede estar inversamente acoplado a vías pro-proliferativas (2). Los mecanismos que pueden vincular Vmetro a la proliferación celular están pobremente caracterizados. Las proteínas Ras son proteínas de señalización unidas a la membrana que participan en la diferenciación, proliferación y supervivencia celular (3). Las tres isoformas Ras expresadas de manera ubicua, H-, N- y K-Ras, se ensamblan en nanoconjuntos espacialmente distintos en el PM llamados nanoclusters (4). La formación de nanocluster es esencial para la activación de la señalización de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) por Ras porque la activación de la proteína quinasa RAF en el PM está restringida a los nanoclusters Ras.GTP (GTP, guanosina trifosfato) (5). El ensamblaje de nanoclusores requiere interacciones complejas entre los lípidos PM y los anclajes de lípidos Ras, las regiones hipervariables C-terminales y los dominios G, siendo las interacciones entre los residuos básicos Ras y los lípidos PM cargados de particular relevancia (6). La difusión de lípidos en las membranas modelo y la separación de fases de las bicapas multicomponente responde a los campos eléctricos (7, 8). Por lo tanto, probamos si la distribución lateral de lípidos aniónicos en la PM responde a Vmetro y las posibles consecuencias en la organización espacial de Ras.

Manipulamos el Vmetro de células de riñón de cría de hámster (BHK), medidas por pinzamiento de parche de células enteras, cambiando la concentración extracelular de K + (Fig. 1A). Simultáneamente, cuantificamos la distribución a nanoescala de varias sondas de unión a lípidos marcadas con proteína verde fluorescente (GFP) en el PM interno mediante microscopía electrónica (EM) y mapeo espacial (4, 9, 10). Los análisis muestran que la nanoclusión de fosfatidilserina (PS) y fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP)2) se incrementó en la despolarización de PM, mientras que no hubo cambios detectables en la distribución lateral de ácido fosfatídico (PA) o fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato (PIP3) (Fig. 1, B y C, y fig. S1). La agrupación mejorada de PS fue rápida, siendo 80% completa en 30 s (el tiempo de ensayo más corto permitido por la técnica EM) (Fig. 1D). PEPITA2 la agrupación aumentó a un ritmo ligeramente más lento (Fig. 1D). Sobre la repolarización de la PM, cambiando de 100 mM [K +] de nuevo a 5 mM [K +], nanoclustering de PS y PIP2 volvió a los valores de control con una cinética casi idéntica (Fig. 1E). El contenido de PS del MP no se vio afectado por el cambio Vmetro (figura S2). La recuperación de fluorescencia después de ensayos de fotoblanqueo de la dinámica espacio-temporal de lípidos mostró que la fracción móvil de PS y PIP marcados con fluorescencia2 disminuyó significativamente con la despolarización de las partículas (fig. S3), de acuerdo con los datos de EM. El efecto diferencial de Vmetro sobre los lípidos PM aniónicos concuerda con las observaciones de que los lípidos cargados responden de manera diferente a los campos eléctricos aplicados (7, 8, 11).

(A) Pinzamiento de parche de células enteras de células BHK para medir Vmetro en tampones isotónicos que contienen diferentes [K +]. (B) Las funciones K de media ponderada se muestran como L(r) – r para una sonda de lípidos PS (norte ≥ 8) en control (CON) y células BHK despolarizadas. L(r) – r valores & gt99% intervalo de confianza (C.I.) para un patrón aleatorio indican agrupamiento. La despolarización (100 mM [K +]) aumentó significativamente la agrupación de PS (PAG & lt 0.001, prueba de arranque). (C) Cima L(r) – r valores, Lmax, derivado de curvas como en (B), cuantificar el grado de nanoagrupamiento de sondas lipídicas para PS, PIP2, PA o PIP3 en células BHK control y despolarizadas ([K +] 100 mM). (D) Evolución breve (& lt5 min) de cambios en Lmax valores para PS, PIP2y GFP-K-RasG12V (KG12V) en células BHK despolarizadas con [K +] 100 mM en t = 0 min. (mi) Evolución temporal de la despolarización (5 a 100 mM [K +] a t = 0 min) y repolarización (100 a 5 mM [K +] a t = 60 min), cambios en Lmax para PS, PIP2 y K-RasG12V. (F) Dependencia de la agrupación de GFP-K-RasG12V o GFP-tK, cuantificada como Lmax valores, en Vmetro variado como en (A). (GRAMO) Imágenes FLIM (GFP) de células que expresan pares GFP / RFP-K-RasG12V y GFP / RFP-tK FRET. (H) Vida útil de la fluorescencia de GFP-K-RasG12V o GFP-tK en células que expresan el par RFP-FRET afín representado contra Vmetro. Cada punto es la vida útil media (± SEM) de GFP medida en & gt60 células individuales. Diferencias significativas (*PAG & lt 0,001) se evaluaron mediante el análisis de varianza unidireccional (ANOVA). Las barras de error en todos los paneles representan SEM.

La localización y distribución lateral de K-Ras en el PM requiere interacciones electrostáticas entre un dominio polibásico C-terminal y PS (9, 10, 12, 13).El potencial electrostático del prospecto interno de PM es independiente de Vmetroy, concordantemente, la fluorescencia de reflexión interna total y la microscopía confocal mostraron que la localización de K-Ras PM era insensible a la despolarización de PM (fig. S5). Sin embargo, los experimentos de mapeo espacial EM de células BHK que expresan GFP-K-RasG12V (K-Ras unido constitutivamente a GTP marcado con GFP) mostraron que el pico de K-RasG12V L(r) – r (Lmax, dónde L representa una función K y r es el radio) valores fuertemente correlacionados con Vmetro, lo que indica que la despolarización de PM mejora el nanoclustering de K-Ras (Fig. 1F). La dinámica temporal de Vmetro-los cambios inducidos en el nanoclustering K-RasG12V coincidieron con los de PS en lugar de PIP2 (Fig. 1, D y E). Para visualizar cambios de nanocluster en células intactas, utilizamos microscopía de imágenes de fluorescencia de por vida combinada con transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FLIM-FRET). La vida útil de la fluorescencia de GFP-K-RasG12V en las células que coexpresan la proteína fluorescente roja (RFP) aceptora de FRET -K-RasG12V disminuyó en función de Vmetro (Fig. 1, G y H), lo que indica un aumento de FRET entre GFP-K-RasG12V y RFP-K-RasG12V y, por lo tanto, un aumento de nanoclustering de K-Ras. Por el contrario, la expresión del canal Kv2.1, que hiperpolariza el PM (14) (fig. S6C), FRET eliminado en gran medida entre GFP-K-RasG12V y RFP-K-RasG12V, lo que es coherente con la interrupción del nanoclustering de K-Ras (fig. S6). La expresión de un mutante de canal no conductor, Kv2.1W369CY384T (fig. S6C), no tuvo efecto sobre la vida útil de GFP-K-RasG12V en los experimentos de control FLIM (fig. S6B). La despolarización de PM no cambió las concentraciones de Ca 2+ intracelular en las células BHK (fig. S7). Concordantemente, obtuvimos resultados idénticos de EM y FLIM en tampones libres de Ca 2+ que contienen el quelante de Ca 2+ EGTA (fig. S8). La despolarización de PM también mejoró la nanoagrupación de GFP-tK pero no GFP-tH (GFP acoplada a los dominios de anclaje de membrana aislados de K-Ras y H-Ras, respectivamente) (Fig.1, F a H, y fig. S8, D y E). Por lo tanto, el nanoclustering de K-Ras es sensible a Vmetro a través de un mecanismo que requiere el dominio polibásico C-terminal.

En células de neuroblastoma de ratón diferenciadas excitables Neuro2A (N2A) (15), La despolarización de PM con alto [K +] también causó una disminución significativa en la vida útil de la fluorescencia de GFP en las células coexpresoras de GFP-tK y RFP-tK (Fig.2, A y B), lo que indica un aumento de GFP-RFP FRET a partir de un aumento de GFP-tK agrupamiento. Se observaron resultados similares con K-RasG12V de longitud completa (Fig. 2, A y B). Despolarización de PM inducida por el receptor de glutamato (15) también mejoró el agrupamiento de K-RasG12V (Fig. 2C). Este efecto pareció no estar relacionado con la activación de la fosfolipasa C (PLC), porque el pretratamiento con el inhibidor de PLC U73122 no anuló la agrupación de K-Ras estimulada por glutamato pero bloqueó eficazmente los aumentos en las concentraciones intracelulares de Ca 2+ (fig. S9). Por lo tanto, los cambios inducidos por el glutamato en el nanoclustering de K-Ras también están mediados por un cambio en el voltaje de PM.

(A) Imágenes FLIM de células N2A diferenciadas que expresan los pares FRET: RFP / GFP-tK o RFP / GFP-K-RasG12V (GFP-KG12V y despolarizadas con 100 mM [K +] o 50 a 100 μM de glutamato (Glu). (B y C) Cuantificación de la vida útil de la fluorescencia de GFP-K-RasG12V o GFP-tK en células N2A que expresan el par RFP-FRET afín tratado como en (A). Cada punto de datos es la vida útil media (± SEM) de GFP medida en & gt60 células individuales. Diferencias significativas (*PAG & lt 0,01) se evaluaron utilizando ANOVA de una vía.

Evaluamos la causalidad entre Vmetrocambios inducidos en PS o PIP2 distribución y agrupación de K-Ras mediante la cuantificación de su colocalización mediante el mapeo espacial EM y las funciones K bivariadas integradas (valores LBI) (9). La despolarización de PM mejoró de manera significativa y selectiva la asociación de K-Ras con PS pero no con PIP2 (Fig. 3A y fig. S10), de acuerdo con Vmetro- los cambios inducidos en la distribución de PM PS se asocian causalmente con un aumento de los nanoclustering de K-Ras. Por lo tanto, evaluamos la agrupación de K-Ras en células PS auxótrofas (PSA-3) (16), que, cuando se cultivan en ausencia de etanolamina, sintetizan

30% menos PS total (16) y se han agotado de PS en el prospecto interior de PM (9, 16). El mapeo espacial EM y las imágenes FLIM-FRET de células PSA-3 hambrientas de etanolamina mostraron que el agotamiento de PS hacía que la nanoagrupación de K-Ras fuera insensible a Vmetro (Fig. 3, B y C).

(A) Hojas de PM de células BHK que expresan RFP-K-RasG12V y una sonda de unión a lípidos etiquetada con GFP para PS o PIP2, se marcaron con oro anti-GFP-6nm y oro anti-RFP-2nm y se visualizaron mediante EM. Se utilizaron funciones K bivariadas (resumidas como valores de LBI) para cuantificar la colocalización de PS o PIP2 con nanoclusters GFP-K-RasG12V y GFP-tH. La significancia estadística se evaluó en las pruebas de Mann-Whitney (*PAG & lt 0,05). Los resultados adicionales de la reorganización de lípidos se muestran en la fig. S10E. (B) Mapeo espacial EM univariado de láminas de PM preparadas a partir de células PSA-3 que expresan GFP-K-RasG12V y cultivadas con o sin etanolamina (± Etn). (C) Imágenes FLIM de células PSA-3 que expresan GFP-K-RasG12V o coexpresan RFP-K-RasG12V y crecen ± Etn. (D) Activación de MAPK en células BHK transformadas con K-RasG12V (y células de tipo salvaje Fig. S11) medida por inmunotransferencia cuantitativa para ERK fosforilada (pERK) después de la despolarización de PM como en la Fig. 1A.

Mejorar el nanoclustering K-Ras.GTP aumenta la activación de la cascada RAF-MAPK (5). Por lo tanto, examinamos el efecto de Vmetro en la señalización MAPK específica de K-Ras. Reducir progresivamente Vmetro fosforilación mejorada de la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK) en células que expresan K-RasG12V (Fig. 3D y Figs. S11 y S12), de acuerdo con los resultados de EM y FLIM. La activación de ERK no dependía linealmente de Vmetro (Fig. 3D) a diferencia de Lmax (Figura 1F). Esto se espera porque la fracción agrupada de K-Ras (ϕ), que determina la salida de señalización de MAPK (5), es una función no lineal de Lmax (4) (fig. S13). La activación de MAPK aumentó rápidamente en respuesta a la despolarización de PM (& lt30 s), concordante con la escala de tiempo de agrupación mejorada de K-Ras, y se recuperó dentro de los 30 min de la repolarización de PM (fig. S14). Vmetro-inducida la activación de la señalización de MAPK en las células de PSA-3 que expresan K-RasG12V se abolió en condiciones de depleción de PS (fig. S11C). Por lo tanto, el agotamiento de los niveles celulares y de PM PS desacopla eficazmente Vmetro de la agrupación y la señalización de K-Ras. Debido a que las cantidades de K-Ras.GTP se fijan en las células K-RasG12V, Vmetro regula la ganancia de la señal en el circuito de señalización de K-Ras controlando la extensión del nanoclustering de K-Ras.

Por último, observamos resultados similares in vivo en Drosophila (Figura 4A) (17). La despolarización de cerebros de mosca intactos que expresan GFP-tK y RFP-tK dio como resultado un aumento de GFP-RFP FRET (Fig. 4, B y C), lo que indica un aumento de la agrupación de K-Ras. Concordantemente, la despolarización de embriones de mosca de tipo salvaje estimuló significativamente la activación de MAPK, mientras que la despolarización de atp8b embriones mutantes (fig. S15) que carecen de una flippasa PM PS (18, 19) no tuvo ningún efecto sobre la activación de MAPK (Fig. 4D y Fig. S16L). Falta de atp8b Disminuye el prospecto interno de PM de PS (18, 19) (fig. S16, A a K) y, por tanto, es una fenocopia parcial de células PSA-3 deficientes en PS (fig. S11).

(A) Imágenes confocales de moscas que expresan GFP-tK, o que coexpresan GFP-tK y RFP-tK, a partir de un promotor neuronal específico. (B) Imágenes FLIM de cerebros de moscas en (A) en tampón de control y después de la despolarización con alto [K +]. (C) Cuantificación de la vida útil de la fluorescencia de GFP-tK en cerebros de moscas que expresan el par RFP-FRET afín tratado como en (B) los resultados son la media (± SEM, norte = 9). El alto [K +] no tuvo ningún efecto sobre la vida útil de la fluorescencia de GFP-tH en cerebros de moscas que expresan GFP-tH y RFP-tH. (D) Embriones de mosca de tipo salvaje (WT) y mutante atp8b las moscas se incubaron en K + 5 o 90 mM durante 15 min y luego se inmunotransfirieron para pERK. Los resultados se cuantifican como media ± SEM (norte = 3).

Mostramos que la despolarización de PM induce cambios rápidos y sustanciales en la organización a nanoescala de los fosfolípidos aniónicos, PS y PIP2, en el prospecto interior del PM. Una consecuencia importante de la reorganización del PS es el aumento de la nanoagrupación de K-Ras, que mejora la señalización de MAPK dependiente de K-Ras en células no excitables y excitables, así como en el embrión de mosca intacto. PM reducido Vmetro se ha asociado durante mucho tiempo con la supervivencia, proliferación y diferenciación celular (1, 2). Sin embargo, no se ha propuesto ningún mecanismo convincente para explicar la entrada de señales eléctricas a las cascadas de señalización celular. Sugerimos que los nanoclusters K-Ras, respondiendo a VmetroLos cambios inducidos en la dinámica espaciotemporal de la PS permiten que la PM actúe como un transistor de efecto de campo para controlar la ganancia en los circuitos de señalización Ras. El desarrollo neuronal, incluida la plasticidad, la potenciación a largo plazo y la memoria, está fuertemente asociado con Vmetro y señalización MAPK (20, 21) Por tanto, es factible que los cambios en la segregación lateral de K-Ras mediada por PS jueguen potencialmente un papel importante en estos procesos.


Ver el vídeo: membrane potential of neurons (Mayo 2022).