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¿Cuántos glóbulos rojos de ratones debo diluir antes de contar?

¿Cuántos glóbulos rojos de ratones debo diluir antes de contar?


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Me pregunto cuántos glóbulos rojos debo diluir con cuánto PBS antes de contar con el hemocitómetro con azul tripán.


Recomendamos agregar 0.1 mL de solución madre de azul tripán a 1 mL de células (concentración final 0.04% p / v). Las concentraciones finales pueden variar de 0.0.04% a 0.2% (p / v) dependiendo de la muestra y la instrumentación.

Sí, puede encontrar el protocolo en el siguiente enlace.

El azul tripán tiñe las células que tienen una membrana comprometida. No puede diferenciar entre membranas comprometidas causadas por apoptosis o necrosis.

Depende del tipo de tinción fluorescente que se utilice en las células. El azul tripán es un cromóforo impermeable a las células que puede apagar la fluorescencia. Puede apagar la tinción fluorescente en la superficie de las células vivas o la tinción fluorescente interna en las células muertas.

El azul tripán se unirá a las proteínas del suero, así como a las proteínas celulares, lo que puede resultar en un alto nivel de tinción de fondo. Si el fondo es demasiado oscuro, las células deben sedimentarse y resuspenderse en medio sin proteínas, tampón o solución salina normal antes del recuento.

El azul tripán es una tinción celular impermeable que se utiliza para estimar el número de células muertas en una población viable. Su utilidad se basa en el hecho de que es un tinte cargado y no ingresa a las células a menos que la membrana esté comprometida. Las células vivas (viables) excluyen el colorante, pero las células muertas (no viables) o las células con una membrana comprometida se tiñen de azul intenso.

Los contadores de células automáticos Countess ™ II y Countess ™ II FL incluyen enfoque automático, una pantalla táctil, recuento de campo claro y pruebas de viabilidad con azul tripán, y utilizan portaobjetos desechables. El contador de células automático Countess ™ II FL también puede acomodar un portaobjetos de vidrio reutilizable y detección de fluorescencia utilizando cubos de luz LED EVOS ™.

Sí, el instrumento Countess ™ II FL utiliza los mismos cubos de luz que los sistemas de imágenes EVOS ™. El instrumento Countess ™ II no utiliza cubos de luz. El instrumento Countess ™ II FL sin cubos de luz instalados funcionará exactamente como el instrumento Countess ™ II: como un contador de células de campo claro.

Sí, el instrumento Countess ™ II FL no requiere cubos de luz y puede usarse sin ellos si no se requiere fluorescencia.

No, los instrumentos Countess ™ II y Countess ™ II FL no requieren una computadora.

No hay ningún software de computadora disponible ya que los datos no requieren ningún software especial para abrirse. Los archivos se pueden guardar en el USB como archivos de imagen estándar (JPEG, PNG, TIFF o BMP) para ser abiertos por cualquier programa de imágenes externo, o los datos se pueden guardar en el USB en un archivo CSV para ser abiertos por un programa de hoja de cálculo. El software de los instrumentos se puede descargar aquí.

No. Puede usar una unidad USB para transferir sus datos desde el instrumento a una computadora que use un sistema operativo Windows ™.

Los instrumentos Countess ™ II y Countess ™ II FL no tienen memoria interna, por lo que no hay archivos que deban borrarse. Los archivos se pueden guardar en el USB como archivos de imagen estándar (JPEG, PNG, TIFF o BMP) para ser abiertos por cualquier programa de imágenes externo, o los datos se pueden guardar en el USB en un archivo CSV para ser abiertos por un programa de hoja de cálculo.

Los puertos USB son idénticos; sin embargo, si se conecta un USB o una unidad externa a ambos puertos al mismo tiempo, solo se reconocerá el primer dispositivo de almacenamiento conectado. También se puede utilizar un mouse USB en cualquiera de los puertos USB.

Los instrumentos Countess ™ II y Countess ™ II FL tienen un tamaño muy pequeño (23 cm (ancho) x 14 cm (largo) x 23 cm (alto)) y pesan alrededor de 3.6 kg (sin cubos de luz instalados). Los cubos de luz no se incluyen con el instrumento Countess ™ II FL, deben comprarse por separado.

Limpiar la superficie del instrumento con un paño húmedo. Para limpiar la pantalla LCD, apague el instrumento, desconecte el cable de alimentación y limpie la pantalla LCD con un paño suave ligeramente humedecido con detergente limpiador para LCD. Limpiar la pantalla con fuerza excesiva puede dañar la pantalla LCD. Seque la pantalla de inmediato. Los instrumentos Countess ™ II y Countess ™ II FL no tienen partes móviles que mantener, tubos que limpiar ni tampones que reemplazar.

Los instrumentos Countess ™ II y Countess ™ II FL vienen precalibrados. No es necesario calibrar los instrumentos.

No. El instrumento Countess ™ II no tiene los componentes eléctricos para aceptar cubos de luz para la detección basada en fluorescencia. Solo se puede utilizar para la detección de campo claro.

No, solo el instrumento Countess ™ II FL aceptará el portaobjetos reutilizable. El instrumento Countess ™ II solo puede aceptar portaobjetos desechables.

Sí, los portaobjetos tienen diferentes grosores, por lo que el enfoque nominal debe establecerse tanto para los portaobjetos reutilizables como para los desechables. Una vez configurado, el instrumento Countess ™ II FL puede detectar qué diapositiva se está utilizando y aplicar el valor de enfoque nominal apropiado.

Se cuenta un campo de visión de 2,2 mm x 1,6 mm, lo que produce un

3,5 mm cuadrados en total. Los instrumentos Countess ™ II y Countess ™ II FL solo cuentan un único campo de visión que corresponde directamente al campo de visión visible en la pantalla sin zoom aplicado.

Actualmente, solo suministramos los portaobjetos desechables envueltos individualmente.

No. El software de imágenes de los instrumentos Countess ™ II Countess ™ II FL no puede detectar células móviles. Las células deben inmovilizarse o fijarse antes del análisis.

1 x 10E5 a 4 x 10E6 células / ml es el rango de confianza central que proporcionará la mejor exactitud y precisión. Se ha realizado el recuento de muestras de 1 x 10E4 a 1 x 10E7 células / ml, pero con una mayor variabilidad de recuento a recuento.

Los instrumentos Countess ™ II y Countess ™ II FL pueden detectar partículas / células de 4 a 60 μm. Es posible realizar una evaluación precisa de la viabilidad con células que oscilan entre 7 y 60 μm.

Un sofisticado algoritmo de análisis de imágenes identifica objetos y clasifica partículas o células por redondez y tamaño, y luego distingue las células vivas de las muertas por su patrón de tinción.

Se basa en la exclusión del tinte utilizando un tinte azul tripán al 0,2%. Las células vivas excluyen el tinte. Las células muertas muestran una intensa tinción de las proteínas intracelulares.

No, desafortunadamente no se puede acceder a los datos de celda por tamaño de celda y fluorescentes utilizados para preparar el histograma.

Sí, el paquete de Procedimientos de prueba realizados por el usuario IQ⁄OQ (Calificación de instalación / Calificación operativa) se puede comprar por separado a través de su representante de ventas (Cat. No. A28154). Si necesita que un ingeniero realice el protocolo IQ⁄OQ, el Cat. El número es 4479677 para una prueba única, o 4479671 para procedimientos de prueba reiterativos.

No vendemos ensayos específicos para el instrumento Countess ™ II FL, sin embargo, hemos validado algunos de nuestros ensayos de viabilidad fluorescente y apoptosis existentes para el instrumento Countess ™ II FL. Las notas de aplicación para ensayos de viabilidad fluorescente y apoptosis se pueden encontrar aquí.

Sí, el recuento y la concentración de viabilidad de campo claro tienen en cuenta la dilución, por lo que los valores que se muestran son para la muestra de células original antes de la dilución en azul tripán.

No. La preparación de la muestra de azul tripán se simplificó para mezclar, cargar, leer 1: 1 y el resultado dado solo tiene en cuenta esa dilución doble. Cualquier dilución adicional para una respuesta final debe ser calculada por el usuario.

Se han probado las siguientes líneas celulares y células primarias:

  • Líneas celulares: HEK 293, A431, CHO-M1, CHSE, COLO-205, COS-7, HeLa, HepG2, HL-60, J774 (MMM), Jurkat, K-562, MCF-7, MRC-5, NIH / 3T3, PC-12, SF-21, U266 y U2OS
  • Células primarias: células madre derivadas del tejido adiposo humano, HASMC, HPAEC, HPASMC, HUVEC, C2C12, RBC y PMBC

Cuando probamos los Contadores Celulares Automatizados Countess ™ II y Countess ™ II FL junto con el Contador Celular Automatizado Countess ™ original usando las mismas celdas y portaobjetos, la variabilidad de conteo a conteo entre instrumentos fue & lt10%.

Al contar en modo de campo claro, los instrumentos Countess ™ II y Countess ™ II FL asumen automáticamente que se ha hecho una dilución 1: 1 con azul tripán. No se hace la misma suposición en el modo de fluorescencia.

Cuando un trabajador experimentado cuenta células manualmente usando un hemocitómetro de vidrio junto con un microscopio, la variabilidad de conteo a conteo de una sola muestra es comúnmente del 10% o más.

Los usuarios de los instrumentos Countess ™ II y Countess ™ II FL normalmente deben observar & lt5% de variabilidad de recuento a recuento.

No, para obtener información de fluorescencia y viabilidad de campo claro, se deben realizar dos recuentos separados.

Sí, el instrumento puede contar tanto en el modo de fluorescencia como en el de campo claro, lo que permite un cálculo simple de la eficiencia de transfección que se muestra en la pantalla de resultados como "% positivo" para el cubo de luz de interés.

No, las bacterias son demasiado pequeñas para distinguirlas de los restos no celulares.

Sí, pero es posible que deba experimentar con varias configuraciones de circularidad hasta que encuentre la que sea mejor para su tipo de celda.

Los algoritmos de recuento avanzados de los instrumentos Countess ™ II y Countess ™ II FL pueden identificar claramente los límites de las células dentro de grupos de células, lo que generalmente resulta en recuentos de células precisos.

Sí, los instrumentos Countess ™ II y Countess ™ II FL pueden contar PBMC. Sin embargo, no pueden diferenciar entre los tipos de glóbulos blancos.

Sí, los instrumentos Countess ™ II y Countess ™ II FL pueden contar glóbulos rojos. Sin embargo, recomendamos diluir la muestra de sangre aproximadamente 1: 10,000. El instrumento no puede evaluar la viabilidad de los glóbulos rojos debido a su pigmentación y patrón de tinción con azul tripán.

Los instrumentos Countess ™ II y Countess ™ II FL no cuentan los espermatozoides vivos ni otras células de movimiento rápido como los protozoos.

Si hay dos celdas unidas entre sí con suficiente definición circular para cada una, el firmware de análisis de imágenes las distinguirá como dos objetos diferentes.

Hemos probado más de 20 tipos de células de uso común, incluidas células primarias, PBMC, células de insectos y células de peces, utilizando la configuración predeterminada. Los tipos de celda específicos pueden requerir algunos ajustes de configuración de parámetros, y el usuario puede optimizarlos.

Los instrumentos Countess ™ II y Countess ™ II FL se optimizaron para el recuento de células de mamíferos, sin embargo, puede ser posible contar otros tipos de células.

Hasta ahora, no hemos encontrado tintes alternativos para las mediciones de viabilidad en campo claro que se puedan usar con los instrumentos Countess ™ II y Countess ™ II FL. Sin embargo, se pueden visualizar muchas manchas fluorescentes o proteínas en el instrumento Countess ™ II FL, siempre que se instale el cubo de luz correcto.

El instrumento Countess ™ II FL puede trabajar con tintes que quizás ya esté usando para medir la viabilidad. En la siguiente tabla se incluyen algunos tintes populares que se han validado en el instrumento Countess ™ II FL:

Kit de imágenes de viabilidad celular ReadyProbes ™, azul / verde

Kit de imágenes de viabilidad celular ReadyProbes ™, azul / rojo

Tinte DAPI RFP o Texas Red ™

Kit de viabilidad / citotoxicidad LIVE / DEAD ™

Reactivo ReadyProbes ™ de yoduro de propidio

Tinción de ácido nucleico verde SYTOX ™

Tinción de células muertas rojas SYTOX ™

El instrumento Countess ™ II FL puede trabajar con tintes que quizás ya esté usando para medir la apoptosis. En la siguiente tabla se incluyen algunos tintes populares que se han validado en el instrumento Countess ™ II FL:

Reactivo de detección verde CellEvent ™ Caspase-3/7

Tinción de células muertas rojas SYTOX ™

Depende del tipo de tinción fluorescente que se utilice en las células. Trypan Clue es un tinte de color que no permea a las células y que puede apagar la fluorescencia, por lo que puede apagar la tinción fluorescente en la superficie de las células vivas o la tinción fluorescente interna en las células muertas.

No, los instrumentos Countess ™ II y Countess ™ II FL se suministran con una caja de portaobjetos, pero no se suministran con tinción de pista de tripán, por lo que deberán comprarse por separado (n.º de cat. T10282). Si compra una caja de portaobjetos por separado, los portaobjetos vendrán con tinte azul tripán.

Dado que la fluorescencia se mide en una escala relativa, esto depende demasiado del medio ambiente para ofrecer una respuesta cuantitativa. En resumen, el instrumento Countess ™ II FL ofrece una sensibilidad de fluorescencia similar a la de un microscopio de epifluorescencia de bajo aumento.

El azul tripán es necesario para la discriminación de vivo / muerto y proporciona contraste para las células; sin embargo, si no se requiere información de viabilidad, algunas células pueden tener suficiente contraste por sí mismas para ser contadas en campo claro sin azul tripán. El valor de concentración celular obtenido en campo claro asume que las células están diluidas 1: 1 en azul tripán, por lo que si las células no están diluidas, deberá dividir la concentración por 2 para obtener una concentración precisa para las células que no están mezcladas con azul tripán. .

El contador celular automático Countess ™ original se ha descontinuado. Sin embargo, todavía ofrecemos consumibles para el instrumento. El software y firmware más recientes para el contador de células automatizado Countess ™ original todavía están disponibles aquí en la parte inferior de la página en "Descarga del software original Countess". El software también se proporciona en la unidad USB que viene gratis con el instrumento. Este software le permite manipular sus datos de recuento de células y guardar sus datos en un formato de informe pdf para imprimir o archivar.

Nota: Como alternativa al contador de células automatizado Countess ™ original, ofrecemos los contadores de células automatizados Countess ™ II y Countess ™ II FL.


Introducción

La transfusión de glóbulos rojos es una práctica común en la atención médica moderna, con aproximadamente 90 millones de unidades transfundidas cada año en todo el mundo [1]. Evidentemente, los glóbulos rojos experimentan cambios metabólicos y estructurales durante el almacenamiento de líquidos, lo que se conoce como lesión de almacenamiento [2]. Aunque la relación con el resultado clínico sigue siendo objeto de debate, la lesión por almacenamiento puede alterar la función de los glóbulos rojos y acelerar su eliminación a corto y largo plazo [3, 4]. El almacenamiento prolongado puede resultar en una eliminación rápida de hasta el 25-30% de los glóbulos rojos transfundidos por el sistema retículo-endotelial dentro de las 24 h, [5] probablemente causando una disminución correspondiente en la respuesta clínica anticipada del receptor. En ratones, la fagocitosis rápida mediada por macrófagos de los glóbulos rojos almacenados se ha relacionado con una profunda tormenta de citocinas proinflamatorias debido a la sobrecarga de hierro [6, 7]. Hasta ahora, no se ha presentado ninguna evidencia clara de tal respuesta en humanos, excepto por un informe en niños prematuros [8]. El mecanismo detrás de esta rápida fagocitosis mediada por macrófagos no se comprende bien, pero probablemente se deba a una combinación de cambios metabólicos y estructurales relacionados con el almacenamiento dentro de la población de glóbulos rojos. In vitro De hecho, los estudios han identificado una serie de cambios dependientes del tiempo de los glóbulos rojos almacenados en líquido, incluida una reducción del ATP intracelular, aumento del estrés oxidativo y cambio de forma de la membrana, lo que podría disminuir la deformabilidad de la membrana y aumentar la vesiculación, donde este último da como resultado la acumulación de MP. en el medio de almacenamiento [9, 10]. En vivo El envejecimiento de los glóbulos rojos comparte varias características con las descritas para la lesión por almacenamiento, incluida la reducción de la actividad metabólica, el daño oxidativo y la pérdida de membrana a través de la formación de vesículas [11].

Se ha demostrado que el uso de un sistema de modelo murino se asemeja a varias de las características de los eritrocitos almacenados en humanos, tanto en lo que respecta a la lesión por almacenamiento como a la recuperación postransfusional [12] y podría ofrecer la posibilidad de estudiar aspectos mecanicistas que no es posible estudiar en humanos debido a consideraciones éticas. Se ha demostrado que los eritrocitos oxidados experimentalmente pueden ser fagocitados por macrófagos de una manera dependiente del suero y que tal captación podría inhibirse bloqueando SR-A [13]. Esto plantea la cuestión de si este mecanismo de captación también podría ser relevante para los glóbulos rojos almacenados, ya que el estrés oxidativo es una característica de la lesión por almacenamiento [10].

Por lo tanto, los objetivos del presente estudio fueron caracterizar un modelo de almacenamiento de glóbulos rojos murinos, que debería parecerse al de los glóbulos rojos humanos almacenados, e investigar la posibilidad de que SR-A pudiera estar involucrado en el reconocimiento de macrófagos de glóbulos rojos almacenados.


Áreas de recuento celular en la cámara de Neubauer

El recuento se puede realizar en el cuadrado grande central o en los cuadrados de las esquinas, dependiendo del tamaño de las celdas en estudio.

Área de recuento de leucocitos
Los cuatro grandes cuadrados colocados en las esquinas se utilizan para el recuento de glóbulos blancos. Dado que su concentración es menor que la de los glóbulos rojos, se requiere un área más grande para realizar el recuento de células.

Área de recuento de glóbulos rojos
El cuadrado central grande se usa para conteos de glóbulos rojos. Como ya se dijo, esta área se subdivide en 25 cuadrados medianos, que a su vez se dividen cada uno en 16 cuadrados.

De los 25 cuadrados medianos, solo los cuatro cuadrados de las esquinas y el cuadrado central dentro del cuadrado central grande se utilizan para realizar recuentos de glóbulos rojos.

Área de recuento de plaquetas
El cuadrado central grande se usa para contar plaquetas. Se cuentan las plaquetas en los 25 cuadrados dentro del cuadrado central grande.


Aplicaciones del hemocitómetro

Estimar el tamaño de la celda

Debido a que la cuadrícula tiene una dimensión específica, algunas líneas tienen 0,25 mm entre algunas líneas y 0,05 mm entre ellas (consulte la imagen a continuación). Por lo tanto, puede estimar fácilmente el tamaño de las celdas. Si desea determinar el tamaño de la celda con mayor precisión, puede tomar una fotografía de la imagen bajo el microscopio. Luego, use software como la imagen J, donde puede decirle al software que “una longitud fija es igual a 1 mm”. Convertirá y calculará el tamaño de la celda por usted.

Realizar un recuento de células sanguíneas

El hemocitómetro inicialmente fue diseñado para el hemograma. Nuestra sangre se compone de glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas. El número de células y la composición de cada tipo de células pueden indicarle al médico el estado de salud de su cuerpo. Por ejemplo, un recuento bajo de glóbulos rojos provoca sensación de fatiga y debilidad (anemia). Un aumento en la cantidad de glóbulos blancos puede indicar infección, alergia, inflamación u otras enfermedades. Por lo tanto, un hemocitómetro es una herramienta muy importante en el laboratorio de pruebas médicas debido a su capacidad para contar el número de células y la composición de cada tipo de célula.

Realizar recuento celular para cultivo celular

Cuando cultivo células en el laboratorio, necesito cambiar el medio celular cada dos días (depende de qué tan rápido crezcan las células). Después de que las células adherentes crecen para ocupar el 95% de la superficie de un plato, es el momento de "pasar" las células a otro plato. Lo que hacemos es separar células, hacer una suspensión homogénea y contar el número de células. La cantidad de células es muy importante para el cultivo celular. Es posible que las células no crezcan muy bien o mueran si tiene muy pocas células en un plato. Por lo tanto, la capacidad de contar el número de células es una habilidad fundamental para el cultivo celular.


Médula ósea

Esto generalmente se aísla de los huesos largos & # 8211 fémur (pata trasera) y húmero (pata delantera).

Pele la piel de la espalda para exponer los huesos largos

Con un par de tijeras curvas, corte la mayor parte del músculo del hueso

Sujetando el hueso adyacente (tibia o radio) con unas pinzas, refleje la articulación (rodilla o codo) y corte a través de la articulación superior e inferior para extraer el hueso requerido.

Coloque el hueso en PBS estéril en una placa de Petri para almacenarlo hasta que se hayan recolectado todos los huesos necesarios.

La médula ósea se extrae de los huesos enjuagando con una jeringa y una aguja. Es mejor usar una jeringa que contenga el volumen total de médula generada durante el lavado para el paso de aspiración al final de la preparación en todas las etapas para evitar la formación de espuma.

Llene una jeringa de 2 ml con PBS y coloque una aguja naranja de 25 g.

Sujetando hueso con fórceps, use tijeras para quitar las epífisis (extremos) del hueso

Inserte la aguja en un extremo del hueso y enjuague a través del tubo universal con PBS

Repita el procedimiento a través del otro extremo del hueso

En este punto, la médula extraída será una mezcla de células individuales, grupos y & # 8216tubes & # 8217, para producir una suspensión de células individuales, la médula extraída debe aspirarse a través de una serie de agujas de calibre creciente.

Dibujar a través de una aguja de 19 g (blanca)

Expulsar a través de una aguja de 21g (verde)

Dibujar a través de una aguja de 23 g (azul)

Expulsar a través de una aguja de 21 g (naranja)

La suspensión unicelular ya está preparada.

Hacer células de hasta 25 ml en PBS

Centrifugar a 400 g durante 5 minutos (aproximadamente 1600 rpm en una centrífuga de mesa)

Afloje el pellet moviendo la base del tubo

Cuente las células & # 8211 ya que la médula ósea es rica en glóbulos rojos y es necesario contar la cantidad de glóbulos blancos, es mejor diluir la alícuota para el recuento en líquido de recuento de glóbulos blancos (WCF 3% ácido acético en agua destilada más una punta de cuchillo de genciana o violeta cristal). Por lo general, 10 ul en 40 ul de WCF dan un recuento razonable en un hemocitómetro. El recuento debe realizarse lo antes posible después de la dilución, ya que si los glóbulos rojos se destruyen de inmediato, eventualmente los glóbulos blancos también se destruirán.

Resuspenda las células a 5 x 10 7 / ml en PBS para inyección. Para la tinción de células para citometría de flujo, las células deben resuspenderse a 1 x 10 7 / ml en FACS-PBS.

Bazo

Habiendo pelado la piel para remover la médula ósea y recolectado PEC

Con unas pinzas, levante la membrana peritoneal cerca de la línea media, justo debajo del esternón y haga una incisión. Luego, corte por debajo del diafragma y luego hacia la cola para permitir que la membrana peritoneal se retire para revelar el contenido abdominal. El bazo está en el lado izquierdo del ratón escondido debajo del hígado.

Agarre el extremo del bazo y levántelo hacia arriba, luego libere el bazo de la grasa y el tejido conectivo con unas tijeras. Mantenga el bazo en PBS hasta que esté listo para preparar una suspensión de células individuales.

Antes de procesar, recuerde pesar el bazo.

Hay varias formas de preparar una suspensión unicelular de bazo; la más rápida y sencilla es utilizar un homogeneizador de vidrio de ajuste holgado de 5 ml.

Utilice pinzas para transferir el bazo al homogeneizador

Inserte la varilla de vidrio en el homogeneizador, ejerza una fuerza suave hacia abajo y gire la varilla 3 veces & # 8211 esto debería ser suficiente para liberar la pulpa de la cápsula del bazo

Agregue 4ml de PBS al homogeneizador y mezcle por aspiración suave, evitando la formación de espuma.

Los residuos y los grumos se pueden eliminar dejando que la suspensión celular repose durante 2-3 minutos y decantando las células suspendidas en un tubo nuevo pipeteando o pasando la suspensión celular a través de una malla de nailon.

Hacer células de hasta 25 ml en PBS

Centrifugar a 400 g durante 5 minutos (aproximadamente 1600 rpm en una centrífuga de mesa)

Afloje el pellet moviendo la base del tubo

Cuente las células & # 8211 ya que el bazo es rico en glóbulos rojos y es necesario contar el número de glóbulos blancos, es mejor diluir la alícuota para el recuento en el líquido de recuento de glóbulos blancos (WCF 3% de ácido acético en agua destilada más un @ punta de cuchillo de genciana o violeta cristal). Por lo general, 10 ul en 40 ul de WCF dan un recuento razonable en un hemocitómetro. El recuento debe realizarse lo antes posible después de la dilución, ya que si los glóbulos rojos se destruyen de inmediato, eventualmente los glóbulos blancos también se destruirán.

Para la tinción de células para citometría de flujo, las células deben resuspenderse a 1 x 10 7 / ml en FACS-PBS.

Timo

Habiendo pelado la piel

Use fórceps para agarrar el esternón xifoides y use tijeras para cortar a lo largo y por encima del diafragma para ingresar al tórax

Use tijeras para cortar ambos lados de la caja torácica.

Agarre el esternón xifoides con unas pinzas y levántelo y refleje por encima de la cabeza.

El timo recubre el corazón.

Use fórceps para liberar el timo del corazón

Luego use un par de pinzas curvas para agarrar el timo en su origen y use un segundo par de pinzas colocadas justo debajo del primer par para separar el tejido.

Mantener en PBS hasta que esté listo para preparar una suspensión unicelular.

Use pinzas para transferir el timo al homogeneizador

Inserte la varilla de vidrio en el homogeneizador, ejerza una fuerza suave hacia abajo y gire la varilla 3 veces & # 8211 esto debería ser suficiente para liberar las células de la cápsula

Agregue 4ml de PBS al homogeneizador y mezcle por aspiración suave, evitando la formación de espuma.

Los residuos y los grumos se pueden eliminar dejando que la suspensión celular repose durante 2-3 minutos y decantando las células suspendidas a un tubo nuevo pipeteando o pasando la suspensión celular a través de una malla de nailon.

Hacer células de hasta 25 ml en PBS

Centrifugar a 400 g durante 5 minutos (aproximadamente 1600 rpm en una centrífuga de mesa)

Afloje el pellet moviendo la base del tubo

Contar las células & # 8211 a menos que haya sangrado en el tórax, no es necesario utilizar WCF, las células se pueden contar sin diluir

Para la tinción de células para citometría de flujo, las células deben resuspenderse a 1 x 10 7 / ml en FACS-PBS.


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Protocolo de citometría de flujo para marcadores de superficie celular

La inmunofenotipificación de células en suspensión basada en antígenos presentes en la superficie celular es uno de los usos más comunes de la citometría de flujo. Dado que las proteínas de la superficie celular son fácilmente accesibles para el anticuerpo, no se requiere una etapa de permeabilización. Al teñir marcadores de superficie celular, los investigadores pueden identificar poblaciones celulares específicas y realizar la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).

El siguiente protocolo de tinción por citometría de flujo ha sido desarrollado y optimizado por el laboratorio de citometría de flujo de R & ampD Systems. Este protocolo está diseñado para la tinción de proteínas de la superficie celular. Se recomienda que las condiciones experimentales, como la concentración de anticuerpos, el tiempo de incubación y la temperatura, se optimicen para cada experimento de citometría de flujo.

Lea el siguiente protocolo de tinción por citometría de flujo en su totalidad antes de comenzar.

Contenido

Protocolo de video de citometría de flujo

Reactivos necesarios

  • Reactivos de bloqueo del receptor Fc (estos incluyen anticuerpos bloqueadores del receptor Fc o soluciones de IgG) o tampón de lisis de ratón para citometría de flujo (10X Catalog # FC003) o equivalente o una solución equivalente que contenga BSA y azida de sodio adecuada para su uso en citometría de flujo

Materiales necesarios

  • Tubos FACS ™ (tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 ml)
  • Puntas de pipeta y pipetas
  • Centrífugo
  • Vórtice

Preparación de la muestra:

Para teñir los glóbulos periféricos, se debe recolectar sangre completa en tubos de vacío que contengan EDTA o heparina como anticoagulante. Los componentes del suero contaminante deben eliminarse lavando las células tres veces en un tampón de fosfato isotónico (suplementado con BSA al 0,5%) mediante centrifugación a 1250-1500 rpm / 350-500 x g durante 5 minutos.

Para teñir líneas celulares o células de cultivos celulares activados, las células deben centrifugarse a 1250-1500 rpm / 350-500 xg durante 5 minutos y lavarse tres veces en un tampón PBS isotónico (suplementado con BSA al 0,5%) para eliminar cualquier crecimiento residual. factores que pueden estar presentes en el medio de cultivo.

Las líneas celulares adherentes pueden requerir un tratamiento previo con EDTA 0,5 mM para facilitar la eliminación de sus sustratos. Las células que requieren tripsinización para permitir la eliminación de sus sustratos deben incubarse adicionalmente en medio durante 6-10 horas en una plataforma basculante para permitir la regeneración de los receptores. El uso de la plataforma basculante evitará que se vuelva a unir al sustrato.

Procedimiento

  1. Coseche las células y alícuotas de hasta 1 x 10 6 células / 100 μL en tubos FACS. Células de bloqueo Fc con IgG de bloqueo (1 μg de IgG / 106 células) durante 15 minutos a temperatura ambiente.
    Nota: No lave el exceso de IgG bloqueante de esta reacción.
  2. Agregue el anticuerpo primario conjugado (5-10 μL / 10 6 células, o una cantidad titulada previamente) y agite en el vórtex. Incubar las células durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
  3. Elimine cualquier anticuerpo no unido lavando las células en 2 ml de tampón de tinción para citometría de flujo (n.º de catálogo FC001). Centrifugar las células suspendidas a 1250-1500 rpm / 350-300 x g durante 5 minutos y decantar el tampón. Resuspenda las células agregando 2 ml de tampón de tinción para citometría de flujo. Repite este paso de lavado dos veces.
    Nota: Si usa sangre completa, las muestras deben pasar por un paso de lisis de glóbulos rojos en este punto. Para lisar los glóbulos rojos, agregue 2 ml de tampón de lisis humano de citometría de flujo 1X (nº de catálogo FC002) o tampón de lisis de ratón de citometría de flujo 1X (nº de catálogo FC003) a cada tubo. Agitar en vórtex e incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 minutos. Centrifugar y lavar las células en tampón de tinción de citometría de flujo como se describe en el paso 3 anterior.
    Nota: Si se usa un anticuerpo primario no conjugado, ahora debe realizarse la incubación con un anticuerpo secundario apropiado. Diluya el anticuerpo secundario en tampón de tinción para citometría de flujo (catálogo n.o FC001) comenzando con la concentración sugerida en la hoja de datos del producto. Incubar durante 20-30 minutos en la oscuridad y realizar el lavado como se describe en el paso 3.
  4. Resuspenda las células en 200 - 400 μL de tampón de tinción para citometría de flujo (catálogo n.o FC001) para el análisis citométrico de flujo final.

Se recomienda realizar un control negativo. Se debe teñir un conjunto separado de células con un anticuerpo de control de isotipo siguiendo los pasos descritos anteriormente.


Métodos

Preparación de muestras de ratón Bm-Infección de glóbulos rojos y determinación de parasitemia

El protocolo de cuidado y uso de animales se adhiere a la Ley de animales de laboratorio de Corea (Ley núm. 902 y 93). Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética de Experimentos con Animales de los Centros Coreanos para el Control y la Prevención de Enfermedades (número de permiso KCDC-035-13-2A). El uso de animales de experimentación se mantuvo y manipuló en estricta conformidad con las directrices institucionales del Comité de Ética de Experimentos con Animales de los Centros Coreanos para el Control y la Prevención de Enfermedades. El procedimiento de B. microti La infección en ratones se cumplió con las pautas y regulaciones institucionales, con el mejor esfuerzo para minimizar el número de animales utilizados. B. microti, cepa: Peabody mjr (ATCC PRA-99, EE.UU.) se mantuvo en ratones Balb / c (KOATECH, Gyeonggi-do, Corea) antes de la infección para este estudio. Para pasar la cepa, el B. microti La sangre infectada se extrajo del ratón infectado mediante punción cardíaca con una jeringa y se transfirió rápidamente a un tubo con EDTA. Para la infección, 100 μL de sangre infectada (20

Se inyectó una suspensión de parasitemia al 30% por vía intraperitoneal en ratones Balb / c. A los ratones de control se les inyectó un número total igual de células no infectadas. Total de tres ratones sanos como control y tres B. microti se utilizaron ratones infectados. Parasitemia después B. microti la infección se identificó mediante visualización microscópica de frotis de sangre delgados de sangre de la cola teñidos con una solución de Giemsa al 5% (Merck, Darmstadt, Alemania). El porcentaje de parasitemia se determinó contando el número de glóbulos rojos infectados (glóbulos rojos) frente al número total de glóbulos rojos:% de parasitemia = (glóbulos rojos infectados / glóbulos rojos totales) × 100. Se contaron un mínimo de 500 glóbulos rojos y un glóbulo rojo infectado con se contaron múltiples parásitos como una sola célula infectada. Para medición óptica, control y B. microti la sangre infectada se diluyó 300 veces en tampón DPBS. Además, se realizaron análisis de sangre de CBC para sangre sana e infectada utilizando un analizador hematológico automático (MEK-6450, NIHON JOHDEN, Japón). Se utilizaron MCV, MCHC y MCH entre los parámetros de los resultados de CBC.

Tomografía óptica de difracción de camino común (cDOT)

Para la tomografía 3D RI, el campo óptico se midió en base a la microscopía láser-interferométrica de camino común y la tomografía de difracción óptica 13. Brevemente, un rayo láser de un láser de estado sólido bombeado por diodos (DPSS) (λ = 532 nm, 50 mW, Cobolt, Solna, Suecia) se iluminó con varios ángulos de iluminación a una muestra La muestra, sangre diluida intercalada entre dos tapas glasses, is placed between the condenser lens [UPLSAPO 60×, numerical aperture (NA) = 0.9, Olympus, Japan] and objective lens (UPLSAPO 60×, NA = 1.42, Olympus, Japan). The angle of incident beam was controlled by rotating a two-axis galvanometer mirror (GM1) (GVS012/M, Thorlabs, USA). The diffracted beam from a sample was also passing through second galvanometer (GM2), which was located at the conjugated plane of sample and synchronized with GM1 that the reflected beams have same optical path regardless of illumination angle. After GM2, the diffraction phase microscopy based on common-path interferometry was used to collect the diffraction beam from sample. Using a diffraction grating (70 grooves mm −1 , #46-067, Edmund Optics Inc., NJ, USA), the 1 st order beam as a sample beam was interfered with spatially filtered 0 th order beam that serves as a reference. Then, this spatially modulated interferograms were recorded on high-speed sCMOS camera (Neo sCMOS, ANDOR Inc., Northern Ireland, UK) having 528 × 512 resolution with a frame rate of 125 Hz while the incident beam was scanning spirally with 600 different angles. The total magnification of cDOT was 240 by an additional 4-F sistema. From measured hologram images, 3-D RI distribution of sample was reconstructed via optical diffraction tomography algorithm, found elsewhere 15 . For the measurements of 2-D height profile and membrane fluctuation dynamics, the fixed normal incident angle was used to generate a hologram and it was recorded by the camera with a frame rate of 125 Hz for 2 sec. Alternately, quantitative phase imaging unit can also be used 44,45 an existing optical microscope can be converted into a 3-D holographic microscope to investigate Bm-RBCs.

Analysis of the red cell indices

The six of red cell indices are comprised of morphological (surface area, volume and sphericity), chemical (Hb concentration and content) and mechanical (membrane fluctuation) parameters.

To measure the morphological parameters, we used the reconstructed 3-D RI maps by the diffraction optical tomography algorithm from measured multiple optical phase maps corresponding to various illumination angles on the sample. The whole volume of host Bm-RBCs were calculated by integrating all voxels inside individual Bm-RBCs. The space corresponding to cytoplasm of a RBC was selected by RI with a higher value than threshold. The threshold was defined by 50% of RI difference between the maximum RI of the cell nortecell_max and surrounding medium nortemetro for determine the cell boundary, i.e. nortethresh = nortemetro + 0.5 (nortecell_maxnortemetro). Para el Bm-RBCs with apparent PVs, voxels of inclusion PVs inside cytoplasm were also counted. Then, the total number of voxels was multiplied by the magnification of the optical system to translate in a length scale. Next, for surface area measurements, the isosurfaces of individual RBCs were reconstructed from volume data of 3-D RI maps using MATLAB. Surface area of isosurface is measured through the sum of the areas of all the patch faces, which are broken down into small triangular pieces. In addition, the sphericity index SI, a dimensionless quantity ranging from 0 to 1, was obtained by calculating SI = π 1/3 (6V) 2 / 3 /A donde el V is the volume and A is the surface area 14,46,47 .

For measurement of the cellular dry mass, the measured 2-D phase at the normal angle was used. The total dry mass of a RBC was obtained from the integrating 2-D optical phase over entire cell area with RI increment of proteins 47 ,

dónde CM is the cellular dry mass, λ is the wavelength of laser light (532 nm), α is RI increment (0.2 mL/g) 24,25,26 and Δφ(x,y) is 2-D optical phase. In addition, the total mass concentration in a RBC was obtained from the total dry mass divided by the cellular volume. The total dry mass quantifies all non-aqueous materials in RBC cytoplasm including Hb and non-Hb proteins.

To measure the mechanical parameter, we calculated the dynamic membrane fluctuation from the successively measured the instantaneous height map h(x,yt), given as:

The values for the membrane fluctuation were calculated by averaging the root-mean-square of height displacement over the cell area and given as:

dónde hmetro is the time averaged height at the cell surface.

Light measurement assay for ATP amount in RBCs

30% parasitemia of B. microti infected blood and non-infected blood was collected from Balb/c mouse. RBCs were isolated using Histopaque-1077 from 200 μL blood (Sigma-aldrich, Saint Louis, USA). Briefly, anti-coagulated blood is layered onto Histopaque-1077 and centrifuge at 400 gramo for precisely 30 minutes at room temperature. During centrifugation, erythrocytes are aggregated by polysucrose and speedily sediment. Each RBCs were counted to 8 × 10 6 cells/mL and sonicated shortly. All samples were measured using ATP bioluminescent somatic cell assay kit (Sigma-aldrich, Saint Louis, USA). 100 μL of ATP Assay Mix Working Solution was added to a reaction vial at room temperature for 3 minutes. During this period any endogenous ATP will be hydrolyzed. To a separate vial containing 100 μL of 1× Somatic Cell ATP Releasing Reagent, 50 μL of ultrapure water was added and then 50 μL of the cell sample to be assayed was added and immediately measure the light to be emitted IS. The amount of ATP released was determined by following. Both 50 μL of an appropriate ATP Standard (0.5–10 × 10 −10 mole) and 50 μL of the cell sample to be assayed IS&I were added to a 100 μL of 1× Somatic Cell ATP Releasing Reagent. For light measurement, only 100 μL samples were transferred to the reaction vial and instantly measured the amount of light emitted with a luminometer (MicroLumat Plus LB 96V, Berthold technologies, USA). The amount of ATP released was determined by running an internal standard. The ATP concentration in each sample was calculated according to the following formula: where norteS and are the number of ATP in the cell sample and a sample with an internal standard (in moles), respectively.


Using a Hemacytometer to Count Cells

Many biomedical experiments require manipulation of a known quantity of cells, in order to achieve accurate, reproducible, and statistically-relevant data. Therefore, learning how to count cells is a particularly essential technique for any successful biomedical scientist. The most common way to count cells is by using a hemacytometer - an instrument that bears two laser-etched grids, which aid in the enumeration of an aliquot cells under a simple light microscope. This data can then be used to extrapolate the number of cells in experimental sample.

This video will show how to: adjust the experimental sample concentration so that you are not trying to count too many – or too few – cells how to use a hemacytometer to count a small (

10 μl) aliquot of cells how to determine which quadrant of the hemacytometer laser grid to use for counting how to calculate the total number of cells in your experimental sample, depending upon which quadrant was used and how to determine the viability of your experimental cell population using trypan blue exclusion. Further, various experimental situations for which reliable and accurate determination of cell numbers is necessary, including an example using an automated cell counter, are also discussed.

Procedimiento

Cell counting is an important step in many cell-based assays for determining cell number and viability. In general, the goal of counting is to understand how much a sample of an unknown cell concentration should be diluted for further use. The most common laboratory tool for counting cells is the hemacytometer.

The hemacytometer is a counting tool that was originally created for counting blood cells. At the center of the hemacytometer are two counting chambers, upon which a laser etched grid can be found.

The grid is made up of 9 major quadrants. The four corner quadrants are further divided into 16 smaller quadrants. The central quadrant is divided into 25 of these smaller quadrants, each of which is yet further divided into 16 micro-quadrants.

At the far end of each chamber are sample introduction ports, into which the cell sample to be counted is dispensed.

On either side of the counting chambers are the cover slip mounting supports, upon which the quartz coverslip rests, usually about 0.1 mm above the counting chamber.

Since the area of each large square is 1 mm2, the volume contained by each large square is 0.1 mm3 or 1/10,000th of a ml.

Before counting, always take a moment to use ethanol and a kimwipe to clean and dry away any lint, fingerprints, or watermarks from the coverslip and the counting chamber.

Then carefully add a small amount of water to each of the coverslip mounting supports, the surface tension of the water will hold the coverslip in place.

Now gently triturate the cell suspension, or pipette it up and down, to dislodge any cell clumps. Use a micropipette to aspirate about 10 μl of the suspension and then load one of the introduction ports with the sample. The solution will be drawn into the counting chamber by capillary action and should cover the entire grid.

While the cells are settling, select the objective. Then load the hemacytometer onto the stage.

Next view the cells under the microscope. If there are fewer than 5 cells in each of the large quadrants, you may need to spin your sample down again and resuspend the pellet in a smaller volume. If the cells are overlapping each other or are simply too dense to easily distinguish from one another, you may need to dilute your sample in a higher volume of solution. Be sure to keep track of the factor with which you are diluting your cells. You will need it in a later calculation.

Now it&rsquos time to count the cells!

As we talked about earlier, the counting chamber is covered in a laser-etched grid. The lines of the quadrants make it easier to keep track of the cells you are counting. Choose the size quadrant for counting depending on the density of the cells in your sample. For example, if there are a low number of cells, count all the cells in one of the corner quadrants. For samples with a medium amount of cells, choose one of the 16 smaller quadrants. If there is a very high density of cells, count the cells in one of the 25 central quadrants. No matter which quadrant you choose or the density of the cell sample, count at least 20-50 cells per quandrant.

Not all of the cells will fall neatly within the quadrants. You can count the cells that touch the top and left lines, but disregard the ones touching the bottom or right ones. To get the most accurate count, use a cell counter to keep track of the cells and take the average of the number of cells in 4 quadrants of the same size.

To calculate the number of cells in a 1 ml volume, multiply the number of cells counted by 10,000, because, as we mentioned before, each large square on the grid is 1/10,000th of a ml. If you counted one of these larger quadrants, simply multiply this number 1. If you counted one of the smaller squares in one of the corner quadrants, multiply this number by 16. If you counted all of the cells in one of the 25 central quadrants, multiply this number by 25. If you happened to dilute your cell suspension before loading the hemacyotmeter, you will also need to multiply by the dilution factor.

Then, to calculate the number of cells in 1 ml of this sample, we would multiply the 20 cells in this central quadrant by 104 and 25 to get a total of 5 x 106 cells in 1 ml of the sample.

Now that we know the total number of cells in 1 ml of the sample, we need to multiply this number by the total volume of our solution. So for example, if we have 5 x 106 cells in 1 ml, then in 2 ml, we will have a total of 1 x 107 cells.

Then, to avoid errors from miscounting, uneven distribution of cells, or pipetting errors, load the other side of the chamber and count your cell sample a second time.

Counting the cells under the microscope is also a great time to evaluate the viability of the cells in your sample. Trypan blue, a vital stain, is often mixed with the sample prior to being loaded into the hemacytometer for this purpose.

Live cells exclude this dye, because living cells are very selective about what they allow through their membranes. A dead cell, however, does not have an intact membrane, which allows the trypan blue to pass through and stain the cytoplasm.

To check the viability of your cell sample, dilute an aliquot of your cell suspension in trypan blue, and then load the trypan blue stained sample just like the regular cell sample. Under the phase contrast, the live cells will appear bright and golden and should be counted do not count any of the dull, dead, blue cells.

Calculate the number of cells as before, this time multiplying the final number by the trypan blue dilution factor. So if our original representative sample had first been diluted in trypan blue, we then would have multiplied our total number of cells by our 1:10 trypan blue dilution, for a total of 1x108 cells in our sample.

When you&rsquore finished counting, remember to clean the coverslip and counting chamber!

Now that you are a cell counting pro, let’s talk about some of the reasons you might need to know how many cells you have in a particular experiment.

After isolating cells from a normal or experimental tissue, it&rsquos important to know how many cells you’ve recovered. Here the investigators will want to know how many splenocytes, or spleen cells, they have isolated from this mouse spleen.

When you are performing an experiment to see how two different cell populations react, it&rsquos important to know how many of each cell type you are mixing together, like in this co-culture experiment with B and T cells.

You will want to know how many cells you have for many other types of cell-based assays. Here an ELISPOT assay is being set up to determine the number of cells in a sample that will secrete IFNγ, an inflammatory protein, in response to the human papilloma virus.

When performing an experiment in which mRNA needs to be extracted, or isolated, from your cells of interest, it&rsquos important to know how many calls you&rsquore starting with, in order to acquire a sufficient amount of mRNA for the experiment.

The hemacytometer is an inexpensive and relatively easy to use tool for counting cells, but it can be tedious and has the potential for human error.

The Scepter Handheld Automatic Counter is, as the name implies, a hand held counting device that has an improved counting accuracy compared to the hemacytometer and that can discriminate both the size and volume of the cells in a cell sample.

The TC10 automated cell counter evaluates both cell number and viability, automatically calculates the total cell number in your sample, and allows the cells to be viewed on its readout screen as well.

You&rsquove just watched JoVE&rsquos introduction to cell counting. In this video we reviewed: what a hemacytometer is, how to count cells and determine cell viability, and some different reasons you may need to count cells. Thanks for watching and remember not to count the blue cells!


Ver el vídeo: globulos rojos (Junio 2022).