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Cantidad de transcriptasa inversa en µg o mM para qRT-PCR

Cantidad de transcriptasa inversa en µg o mM para qRT-PCR



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Estoy tratando de calcular una cantidad de titulación para una molécula que me gustaría usar en mis muestras de PCR. Las diferentes moléculas tienen diferentes densidades, por lo que me gustaría calcular la densidad adecuada de la molécula titulada. ¿Cuántos microgramos o microMolares de transcriptasa inversa se utilizan en los kits qRT_PCR?


La transcriptasa inversa (y la mayoría de las otras enzimas comerciales en la actualidad) se fabrica de manera recombinante y luego se purifica en diversos grados, utilizando diferentes métodos, entre diferentes proveedores (y, a veces, entre diferentes lotes del mismo proveedor). Algunas enzimas en realidad tienen múltiples unidades funcionales combinadas en un complejo, otras pueden requerir un paso de activación posterior a la traducción como la fosforilación por una quinasa separada para que sean completamente funcionales. Todas estas variables pueden producir preparaciones de diferentes concentración molar, pero muy similar actividad. Por lo tanto, empresas como New England Biolabs tienen definiciones de unidades para sus diversos productos en función de la actividad.

Habiendo tratado con NEB en el pasado, sé que generalmente también tienen una concentración para sus productos, por lo que si está haciendo experimentos como un ensayo de inhibición enzimática, puede dosificar para concentración y actividad. Variará de una enzima a otra si su inhibidor se unirá a cualquier proteína inactiva que pueda estar presente, en cuyo caso la actividad sería el mejor atributo para usar en sus cálculos.


Evaluación de genes de referencia adecuados para la normalización de análisis cuantitativos de PCR de transcripción inversa en Clavibacter michiganensis

Laixin Luo, Departamento de Fitopatología, Facultad de Protección Vegetal, Universidad Agrícola de China, Beijing, China.

Departamento de Fitopatología, Facultad de Protección Vegetal, Universidad Agrícola de China, Beijing, China

Departamento de Fitopatología, Facultad de Protección Vegetal, Universidad Agrícola de China, Beijing, China

Departamento de Fitopatología, Facultad de Protección Vegetal, Universidad Agrícola de China, Beijing, China

Departamento de Fitopatología, Facultad de Protección Vegetal, Universidad Agrícola de China, Beijing, China

Departamento de Fitopatología, 4315 Miller Plant Sciences, Universidad de Georgia, Athens, GA, EE. UU.

Departamento de Fitopatología, Facultad de Protección Vegetal, Universidad Agrícola de China, Beijing, China

Departamento de Fitopatología, Facultad de Protección Vegetal, Universidad Agrícola de China, Beijing, China

Laixin Luo, Departamento de Fitopatología, Facultad de Protección Vegetal, Universidad Agrícola de China, Beijing, China.

Declaración de disponibilidad de datos: Todos los datos se incluyen en el manuscrito principal y en los apéndices. Los datos brutos y los materiales están disponibles a pedido.


Introducción

Los gliomas son los tumores cerebrales primarios heterogéneos más comunes que surgen de las células gliales. En 2007, la Organización Mundial de la Salud (OMS) clasificó los gliomas en cuatro grados diferentes según el tipo de célula y la gravedad (Louis et al. 2007). Entre estos, el glioblastoma (GB) es el tumor cerebral más frecuente y agresivo en adultos (Arvold y Reardon 2014). Las características distintivas de GB son la proliferación celular descontrolada, la invasión, la capacidad de formar nuevos vasos sanguíneos y la evasión de la apoptosis (Furnari et al. 2007). Incluso con el avance en el campo de la cirugía, la quimioterapia y la radioterapia, el pronóstico de los pacientes con GB sigue siendo malo debido a la presencia de células madre cancerosas que hacen que estos tumores sean resistentes a la quimioterapia y la radioterapia (Singh et al.2003 Yuan et al.2004) . En los gliomas se observan con frecuencia numerosas alteraciones moleculares y genéticas que mantienen los fenotipos moleculares de los tumores (Sathornsumetee et al. 2007 Zhang et al. 2012).

Los telómeros humanos son complejos únicos de proteína-ADN presentes en los extremos de todos los cromosomas eucariotas con repeticiones en tándem de secuencias TTAGGG. Protegen los cromosomas de las fusiones de un extremo a otro y mantienen la estabilidad genómica (Cong et al. 2002). Los telómeros también juegan un papel importante en el envejecimiento y el cáncer (Blasco 2005). La telomerasa es una ribonucleoproteína transcriptasa inversa especializada que mantiene las repeticiones teloméricas de TTAGGG añadiendo repeticiones de secuencias de ADN al extremo 3 & # x02032 de los cromosomas (Cong et al. 2002 Osterhage y Friedman 2009). La holoenzima de telomerasa consta de dos componentes principales: un componente de proteína catalítica transcriptasa inversa de telomerasa humana (hTERT) y un componente de ARN (hTR) que actúa como plantilla para agregar repeticiones de hexanucleótidos (Artandi y DePinho 2010 Wai 2004). La expresión y actividad de la telomerasa se ha observado en el 80 & # x0201390% de todas las células cancerosas e implica un aumento de la proliferación celular, la inmortalidad celular y la tumorigénesis (Kong et al. 2015). A diferencia de lo que ocurre en la mayoría de las células humanas normales, la expresión de hTERT y la actividad de la telomerasa son bajas o reprimidas (Counter et al. 1992 Harley et al. 1990). Por lo tanto, la diferencia en la expresión de hTERT y la actividad de la telomerasa en las células cancerosas frente a las células normales hace que la telomerasa sea un objetivo atractivo para el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer. La expresión y actividad de la telomerasa se correlacionó con la progresión del glioma maligno (Falchetti et al. 1999 Komata et al. 2002). Por tanto, la telomerasa es un objetivo fundamental para mejorar el pronóstico y el tratamiento de los gliomas.

En los últimos años se han evaluado varios enfoques terapéuticos para inhibir la actividad de la telomerasa y bloquear el crecimiento de las células cancerosas. Estudios anteriores demostraron que la inhibición de hTERT por interferencia de ARN y agentes farmacológicos reduce la actividad de la telomerasa y permite que las células experimenten apoptosis (Lavanya et al. 2016 Lu et al. 2012 Mergny et al. 2002). Además de eso, se han desarrollado numerosos inhibidores de la telomerasa que bloquean la actividad de la enzima o el reclutamiento de la telomerasa a los telómeros. Son análogos de nucleósidos, inhibidores catalíticos, oligonucleótidos antisentido de hTR, ribozimas y ligandos G-quadruplex (Seimiya et al. 2002). Los inhibidores como el imetelstat (GRN163L) han demostrado un perfil farmacocinético prometedor con menos efectos secundarios y actualmente se encuentran en ensayos clínicos de fase I y II (Asai et al. 2003 Marian et al. 2010).

Ácido 2 - [(E) -3-naftalen-2-il-pero-2-enoilamino] -benzoico BIBR1532, uno de los inhibidores más potentes y específicos de hTERT, se ha descubierto recientemente (Damm et al. 2001 Kong et al. .2015). BIBR1532 es un inhibidor de molécula pequeña no peptídico y no nucleósido que inhibe la actividad de la telomerasa al unirse específicamente al sitio activo de hTERT (Damm et al. 2001). Se ha observado que BIBR1532 tiene una gran capacidad para reducir el crecimiento en varias células cancerosas, incluidas mama, leucemia, pulmón, ovario, condrosarcoma y tumores de células germinales (Bashash et al. 2013 Damm et al. 2001 Meng et al. 2012 Mueller et al. 2007 Parsch et al.2008 Ruden y Puri 2013). En el presente estudio, nuestro objetivo es investigar el efecto de la caída de hTERT y la inhibición de la actividad de la telomerasa por BIBR1532 en células de glioblastoma.


Cifras

En un matadero de carne comercial, se tomaron muestras de las canales de 30 novillos sacrificados. Se tomaron hisopos de cadáveres utilizando una técnica de hisopado con esponja de cuatro sitios antes de enfriarlos, como se describe en la Directiva de la UE (2001/471 / EEC). Los hisopos se examinaron utilizando el método de la placa extendida, colocando una serie de diluciones en la superficie del agar de recuento en placa estándar A.P.H.A. (SPC) (Oxoid Ltd. Reino Unido) a 30 ° C durante 72 h para establecer el TVC, y en una gama de agares selectivos para examinar los hisopos en busca de muestras


Materiales y métodos

Generación e identificación de ratones transgénicos

Un fragmento de 319 pb de ADN genómico que contiene precursores de miR-335-5p con dos XhoLos sitios de la enzima de restricción I se amplificaron mediante PCR y se subclonaron aguas abajo del promotor Osterix específico de osteoblastos de 2,0 kb en un vector que contenía el gen indicador de luciferasa. Un fragmento de 4,3 kb que contiene el promotor Osx (2,0 kb, un generoso obsequio del Dr. Hicham Drissi, University of Connecticut Health Center, Farmington, CT, EE. UU.), Precursor de 25 miR-335-5p, gen indicador de luciferasa y señal poliA de SV40 se denominó Osx-335 / luc y se liberó del plásmido (pGL3-Osx-miR-335-5p-luc Fig.1 de apoyo) mediante digestión con dos enzimas de restricción Kpnyo y SalI. A continuación, se separó Osx-335 / luc mediante gel de agarosa al 1% y se purificó en gel utilizando un kit GENECLEAN II (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, EE. UU.) De acuerdo con las instrucciones del fabricante. La microinyección de transgén se realizó poco después de la fertilización de huevos de ratón B6D2F1 / J en la instalación transgénica de Tufts de acuerdo con técnicas estándar. 26 Los ratones fundadores y la descendencia se identificaron mediante análisis de transferencia Southern y PCR utilizando ADN genómico de cola de ratón. Para las transferencias Southern, se digirieron 10 μg de ADN de cada ratón con PosteriorIII y XbaSe separó en gel de agarosa al 1% y se hibridé con una sonda radiomarcada con 32P como se describe. 26 La sonda era el producto de PCR resultante de la amplificación del plásmido (pGL3-Osx-miR-335-5p-luc) con cebadores que amplificaban la luciferasa (Tabla complementaria 1). Después de la amplificación por PCR, el producto se separó en gel de agarosa al 1%, se purificó en gel y se marcó radiactivamente con 32 P. También se realizó un análisis de PCR para confirmar la presencia del transgén usando cebadores de luciferasa. A continuación, los ratones transgénicos se designaron como ratones Tg Osx-335. Los ratones se mantuvieron acoplando ratones Osx-335 Tg con ratones Osx-335 Tg y se identificaron mediante PCR. Al caracterizar el fenotipo de esta línea de ratones transgénicos, se utilizaron como controles sus compañeros de camada de tipo salvaje de la misma edad. Todos los ratones se utilizaron de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio preparada por el Instituto de Recursos de Animales de Laboratorio, el Consejo Nacional de Investigación (Publicación del Departamento de Salud y Servicios Humanos NIH 86-23, 1985) y las pautas establecido por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Tufts (Boston, MA, EE. UU.). Los ratones se mantuvieron en condiciones estandarizadas con un ciclo de 12 horas de luz / 12 horas de oscuridad y se les proporcionó comida (dieta estándar de laboratorio) y agua. ad libitum.

Preparación de tejidos

Se sacrificaron ratones Osx-335 Tg y sus compañeros de camada de tipo salvaje (WT) a las edades de 3 días, 2 semanas, 4 semanas y 8 semanas. Se recogieron sus calvarias y fémures. Las muestras de calvaria se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a –80 ° C para su posterior análisis, mientras que los fémures se fijaron en paraformaldehído al 4% y se sumergieron en etanol al 75%. Después del análisis de μCT, los fémures se descalcificaron en EDTA al 10%, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de tejido de 6 µm de espesor. Los tejidos blandos, como el pulmón, el hígado, los riñones y el tejido adiposo marrón, se aislaron de ratones, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a –80 ° C para su posterior análisis.

Análisis µCT

El hueso trabecular distal de la placa de crecimiento se aisló de fémures de ratones WT y Osx-335 Tg de 4 semanas de edad y se escaneó mediante µCT (Viva CT-40 Scanco Medical, Bassersdorf, Suiza) a una resolución de vóxel de 10,5 µm. Se adquirieron para su análisis ciento cincuenta cortes de µCT, correspondientes a una región de 1,575 mm distal de la placa de crecimiento. Se registraron y calcularon parámetros morfológicos tridimensionales, incluyendo volumen óseo / volumen tisular (BV / TV), número trabecular (Tb.N), espesor trabecular (Tb.Th) y separación trabecular (Tb.Sp).

Aislamiento de ARN y análisis de RT-PCR

Las muestras de huesos y tejidos blandos almacenados a –80 ° C después del aislamiento se trituraron hasta obtener un polvo fino en nitrógeno líquido utilizando un mortero. Luego se añadió el reactivo TRIzol (Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.). El ARN total, incluido el miARN, se preparó a partir de tejidos con modificaciones en las instrucciones del fabricante, es decir, después de la separación de fases, se agregaron dos volúmenes de isopropanol al 100% a la fase acuosa, que posteriormente se incubó a –20 ° C durante la noche para la precipitación completa del ARN. Las fases de interfase y fenol-cloroformo orgánico se guardaron para una posterior extracción de proteínas. Después del aislamiento de ARN, se realizaron ensayos de transcripción inversa y PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) respectivamente con M-MLV Reverse Transcriptase (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE. UU.) Y USB VeriQuest FastSYBR GreenqPCR Master Mix with Fluorescein (2 × ) (Affymetrix) utilizando un termociclador Bio-Rad iQ5 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.). Para la expresión de miRNA, los ensayos de colas de poli (A), síntesis de cDNA y qRT-PCR se realizaron con el kit de síntesis de cDNA de miRNA NCode VIVO y los kits de qRT-PCR de miRNA EXPRESS SYBR GreenER (Life Technologies), respectivamente, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los niveles de expresión de ARNm de genes se calcularon con el método de umbral de ciclo comparativo usando GAPDH como control, mientras que la expresión de miR-335-5p se calculó usando U6 como control. Los cebadores utilizados para la amplificación por PCR se enumeran en la Tabla complementaria 1.

Análisis de Western Blot

Se obtuvieron extractos de proteínas tisulares a partir de la interfase y la fase de fenol-cloroformo orgánico de acuerdo con las instrucciones del reactivo Trizol. Se realizaron SDS-PAGE y Western blots usando geles Novex de Tris-Glicina al 4-20% (Life Technologies) y membranas de fluoruro de polivinilideno de 0,45 µm (Millipore, Billerica, MA, EE. UU.). Los anticuerpos para Runx2 (1: 1000), Osterix (1: 1000), Satb2 (1: 1000) y β-catenina (1: 1000) se adquirieron en Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE. UU.). Los anticuerpos para β-actina (1: 10000) y Dkk1 (1: 400) fueron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EE. UU.) Y Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.), Respectivamente. Los anticuerpos secundarios fueron IgG de cabra anti-conejo unida a peroxidasa de rábano picante (Santa Cruz Biotechnology). Las transferencias se visualizaron usando el sustrato de duración extendida SuperSignal West Dura (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.).

Histomorfometría ósea y tinción inmunohistoquímica

Las secciones de tejido óseo femoral se sometieron a tinción con hematoxilina y eosina (H&E) y tinción con fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) usando un kit de fosfatasa ácida, leucocitos (TRAP) (Sigma-Aldrich) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las imágenes digitales se tomaron con un microscopio OLYMPUS BX53 (Olympus, Waltham, MA, EE. UU.) Y se analizaron mediante software. Se realizó histomorfometría ósea en la zona trabecular de las epífisis femorales como se describe. 27 El porcentaje de superficie ósea cubierta por osteoblasto cuboidal (Ob. S / BS,%) y la relación entre el número de osteoblastos y la superficie ósea (Ob.N / BS, N / mm) se obtuvieron a partir de secciones teñidas con H & E con un aumento de × 400 . El porcentaje de superficie de osteoclasto trabecular a superficie ósea (Oc.S / BS,%) y la relación entre el número de osteoclastos y la superficie ósea (Oc.N / BS, N / mm) se obtuvieron a partir de las mediciones de secciones teñidas con TRAP a × 200 aumentos.

La tinción inmunohistoquímica se realizó utilizando anticuerpos para luciferasa (Luc, 1: 200 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.), Osteocalcina (OCN, 1: 200 Santa Cruz Biotechnology, Inc, Dallas, TX, EE. UU.) Y sialoproteína ósea (BSP , 1: 200 EMD Millipore, Billerica, MA, EE. UU.) Y kits AEC (Life Technologies, Frederick, MD, EE. UU.) De acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se tomaron imágenes digitales con un aumento de × 100 en el área trabecular de las epífisis femorales. El citoplasma de las células positivas se tiñó de rojo. La densidad óptica integrada promedio de las células positivas se analizó mediante el software Image-Pro Plus.

Ensayo de proliferación y diferenciación in vivo de BMSC

Se recolectaron BMSC de ratones Osx-335 Tg de 6 semanas a 8 semanas de edad y sus compañeros de camada WT. Los fémures y tibias se aislaron inmediatamente después de la eutanasia y se extrajeron los tejidos blandos. Se extirparon ambos extremos de huesos largos. Se utilizó DMEM para lavar la médula ósea del eje con una aguja 27G. Se obtuvo una suspensión unicelular y se cultivó en medio de mantenimiento no diferenciador (DMEM suplementado con suero bovino fetal al 20% (FBS Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.), 100 UI / ml de penicilina y 100 µg / ml de estreptomicina). 28

Las BMSC se sembraron a 1 x 104 / pocillo en placas de cultivo de 96 pocillos y se incubaron a 37 ° C. El número de células viables se determinó mediante Cell Counting Kit-8 (ensayo CCK-8) de acuerdo con las instrucciones del fabricante a los 1, 2, 5, 8 y 12 días.

Para inducir la diferenciación osteogénica, se cultivaron BMSC confluentes en medio de inducción osteogénica (α-MEM suplementado con FBS al 10%, penicilina 100 UI / ml, estreptomicina 100 µg / ml, dexametasona 1 × 10 –8 M, 1 × 10 –2 M β -glicerofosfato y 50 µg / ml de ácido L-ascórbico) durante 7 y 14 días. Para inducir la condrogénesis, las células confluentes se incubaron en un medio de inducción condrogénico (DMEM con alto contenido de glucosa suplementado con FBS al 10%, 100 UI / ml de penicilina, 100 µg / ml de estreptomicina, 1 x 10-8 M dexametasona, 50 µg / ml de L-ascórbico ácido y 10 ng / ml de factor de crecimiento transformante β3 (TGF-β3 PeproTech, Rocky Hill, Nueva Jersey, EE. UU.) durante 14 días. Para inducir la adipogénesis, se cultivaron BMSC en medios de inducción adipogénica (α-MEM suplementado con FBS al 10%, 100 UI / ml de penicilina y 100 µg / ml de estreptomicina, 1 x 10 –8 M dexametasona y 6 ng / ml de insulina (SAFC Biosciences) durante 14 días. A continuación, se preparó el ARN total a partir de cultivos de BMSC con reactivo TRIzol. Transcripción inversa Se realizaron el ensayo y el ensayo de qRT-PCR Se prepararon lisados ​​de proteína completa con tampón de lisis RIPA (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se utilizaron para analizar la expresión de proteínas mediante análisis de transferencia Western.

La tinción in vitro con rojo de alizarina se realizó esencialmente como se describe 29, 30 después de que las BMSC se mantuvieran en medio inducido durante 4 semanas. Para la cuantificación de la mineralización, se extrajo Alizarin Red-S con cloruro de cetilpiridinio al 10% y se evaluó a 562 nm. La acumulación de matriz alcianofílica de apariencia condroide se utilizó como evidencia del potencial condrogénico de BMSC y se evaluó mediante tinción con azul Alcian. La acumulación intracelular de lípidos neutros se utilizó como indicador de adipogénesis in vitro y se detectó mediante tinción con Oil Red como se describe. 29

Preparación de andamios, cirugía animal y análisis de hueso recién formado.

El armazón de fibroína de seda (en forma de disco, 4 mm de diámetro, 2 mm de espesor) se preparó como se describe. Se aislaron 31 BMSC de ratones WT y Osx-335 Tg de 6 semanas de edad, respectivamente, y se cultivaron en un medio de mantenimiento no diferenciador. Después de alcanzar la confluencia, las células se recolectaron con tripsina / EDTA (tripsina al 0,25% p / vol, EDTA al 0,02%) y se concentraron en suspensiones celulares de 2 x 107 / ml. A continuación, las suspensiones de células se sembraron en el armazón y se incubaron durante la noche para permitir la unión de BMSC al armazón antes de la cirugía del animal.

Se asignaron aleatoriamente ratones C57BL / 6J macho de ocho semanas de edad (peso corporal 25 ± 2 g) a dos grupos. Bajo anestesia general, se crearon defectos calvariales de tamaño crítico de 4 mm de diámetro en cada lado del hueso calvario utilizando una fresa dental. Los defectos óseos del grupo de control se repararon utilizando un andamio con BMSC WT, y el grupo transgénico se implantó con BMSC transgénicas. Los ratones fueron sacrificados 12 semanas después de la cirugía.

Después de la eutanasia, se extrajeron los huesos de la calota y se fijaron en paraformaldehído al 4%. Luego, las muestras se sumergieron en etanol al 75% y se evaluaron mediante µCT. El análisis histomorfométrico tridimensional se realizó automáticamente y se registró el volumen óseo / volumen tisular (BV / TV).

Después del análisis de µCT, las muestras se descalcificaron en EDTA al 10%, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de tejido de 6 µm de espesor. La tinción H&E se realizó en secciones de tejido. Las imágenes digitales se tomaron con un microscopio OLYMPUS BX53. El hueso recién formado se cuantificó en tres secciones de cinco animales diferentes con un aumento de × 200 utilizando el software Image-Pro Plus. Se calculó la relación entre el hueso recién formado y el área total del defecto (BV / TV). Además, se realizó tinción inmunohistoquímica con anticuerpos para osteocalcina. Se tomaron imágenes digitales y se analizó la densidad óptica integrada promedio de las células OCN positivas mediante el software Image-Pro Plus como se describió anteriormente. 35

Análisis estadístico

Los resultados se muestran como la media ± DE. Los niveles de expresión de luciferasa en diferentes tejidos de ratones transgénicos se analizaron mediante ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Tukey. Las diferencias entre los ratones transgénicos y WT fueron analizadas por t prueba. Los datos se consideraron significativos en pag & lt 0,05.


Discusión

IFNα (Lucifora et al, 2014) e IFNγ (Xia et al, 2016) puede desencadenar una eliminación no citolítica del cccDNA del VHB del núcleo de los hepatocitos infectados en una forma dependiente de la desaminasa A3A. Sin embargo, se desconocía la nucleasa que sirvió para degradar el ADN desaminado. En el presente estudio, identificamos ISG20 como la nucleasa clave involucrada en la purga de cccDNA desencadenada por interferón. Demostramos que ISG20 se expresa en tratamientos con IFNα e IFNγ en hepatocitos diferenciados y en muestras de tejido hepático de pacientes con hepatitis B aguda autolimitada. respuestas, coinfecta el hígado. Tras la inducción de interferón, ISG20 se localizó en los nucléolos en lugar de en los cuerpos nucleares de PML, donde puede apuntar al ADNcc del VHB. La caída de ISG20 bloqueó la pérdida de cccDNA inducida por interferón, e ISG20 junto con la expresión de A3A fue suficiente para reducir el cccDNA transcripcionalmente activo cuando ambas enzimas eran catalíticamente activas. ISG20 se enriqueció en ADN monocatenario que contenía desoxiuridina que imitaba el ADN del VHB desaminado con A3A. Por lo tanto, proporcionamos pruebas sólidas de que ISG20 es la nucleasa clave aguas abajo, que finalmente escinde el cccDNA "dañado".

Se sabe desde hace mucho tiempo que ISG20 es inducida por respuestas celulares a la señalización del interferón (Gongora et al, 1997 Espert et al, 2006 Liu et al, 2017) y se encuentra en núcleos y citoplasma de hepatocitos en respuesta al tratamiento con IFNα (Lu et al, 2013). ISG20 es una exonucleasa de 3 ′ a 5 ′ que, como la desaminasa A3A, actúa principalmente sobre sustratos de ARN y ADN monocatenarios (Nguyen et al, 2001). Nuestro estudio muestra que, de manera similar a A3A, puede unirse al ADN monocatenario y degrada eficazmente el ARN ss y, en cierta medida, también al ADN monocatenario y bicatenario. in vitro. Cuando estaba presente todo el proteoma celular, ISG20 se enriqueció en ADN monocatenario que contenía desoxiuridina, que imitaba ADNccc desaminado por A3A en un estado transcripcionalmente activo. Durante la transcripción activa, el cccDNA necesita formar una burbuja de transcripción, lo que hace que el cccDNA sea parcialmente monocatenario (Liu et al, 2010 Nassal, 2015). Esto está en línea con la observación de que el tratamiento con IFNα y la expresión concertada de A3A e ISG20 solo son efectivos para reducir los niveles de cccDNA cuando se expresa la proteína HBx que permite la transcripción a partir de cccDNA (Lucifora et al, 2011). El hecho de que ISG20 sea una exonucleasa (Nguyen et al, 2001) implica que su sustrato de ADN del VHB se ha dañado previamente, es decir, se eliminaron los uracilos introducidos por las desaminasas APOBEC3 y se formaron roturas de la cadena de ADN. Por consiguiente, la expresión de ISG20 por sí sola no fue suficiente para afectar los niveles de cccDNA en nuestros experimentos. Sin embargo, una expresión concertada de ISG20 y A3A redujo el cccDNA. Este efecto solo se logró expresando A3A e ISG20 nativos, pero sin usar variantes catalíticamente inactivas (Nguyen et al, 2001 Stenglein et al, 2010), lo que demuestra que las actividades de desaminasa y nucleasa son necesarias para la purga de cccDNA. Dado que A3A solo desamina las citosinas en uracilos, parece razonable que los factores celulares expresados ​​de manera constitutiva eliminen los uracilos del ADN, lo que conduce a la formación de sitios apurínicos / apirimidínicos (AP) e introducen roturas de hebras. El cccDNA dañado resultante se convierte entonces en un sustrato para ISG20. De acuerdo con esto, se ha demostrado que los sitios AP se forman durante la purga de cccDNA inducida por el tratamiento con IFNα o la activación de LTβR (Lucifora et al, 2014). Se ha informado que los sitios AP son generados por la glicosilasa UNG en el ADN plasmídico que se degrada de una manera dependiente del interferón (Stenglein et al, 2010) y estar involucrado en la pérdida de cccDNA después de la desaminación por AICDA (Chowdhury et al, 2013 Qiao et al, 2016). Por lo tanto, parece razonable que la desaminación por las proteínas APOBEC3 sea seguida de más pasos enzimáticos que generen ADNcc dañado, que finalmente es degradado por ISG20.

Estudios recientes han descrito mecanismos adicionales de inhibición viral por ISG20. Weiss et al, (2018) describen que ISG20 ejerce una actividad antiviral indirecta que actúa como un regulador maestro de las proteínas de respuesta al interferón tipo I que previenen la traducción de ARN de alfavirus infectantes en el citoplasma. Wu et al, (2019) demuestran que ISG20 inhibe la traducción del ARN del virus de la estomatitis vesicular sin degradar el ARN. Descubrieron que ISG20 ejerce control sobre un gran panel de ARN no propios al tiempo que evita las transcripciones endógenas y, aparentemente, es capaz de discriminar el origen del ARN celular propio del no propio mediante la modulación de la traducción.

Además de estos efectos indirectos, la degradación de los ARN virales se ha descrito como el efecto antiviral más destacado de ISG20. La expresión de ISG20 inhibe la replicación del VHB al disminuir los ARN del VHB, por lo que se requiere la actividad exonucleasa de ISG20 (Leong et al, 2016 Ma et al, 2016 Liu et al, 2017). Recientemente, se ha demostrado que la degradación del ARN del VHB depende de la modificación con N6-metiladenosina del nucleótido A1907 presente dos veces en el ARN del VHB genómico terminalmente redundante (Imam et al, 2020). Por tanto, la unión de ISG20 al ARN del VHB está mediada por una proteína lectora de N6-metiladenosina. De acuerdo con estos hallazgos, los ARN del VHB, así como el ADN del VHB intracelular total, se redujeron en nuestros experimentos, cuando ISG20 se expresó en células infectadas por VHB. El ADN intracelular del VHB consta principalmente de ADNr citoplásmico, que se encuentra exclusivamente dentro de las cápsides y, por lo tanto, lo más probable es que esté protegido del ataque de nucleasas. Por lo tanto, la reducción del ADN del VHB citoplásmico también puede explicarse por la degradación directa del ARN pregenómico por ISG20 (Leong et al, 2016 Liu et al, 2017 imán et al, 2020) o inhibición estérica de la encapsidación de ARN pregenómico por ISG20 (Liu et al, 2017). Sin embargo, esto no es suficiente para explicar la reducción del ADNccc del VHB nuclear.

En nuestros experimentos, la eliminación de ISG20 mediada por ARNsi o ARNhc podría rescatar los niveles de ADNcc pero no influyó en la reducción del ADN del VHB o del HBeAg mediada por interferón. Esto indicó claramente que la actividad de ISG20 se dirige al ADNcc directamente y no indirectamente mediante la reducción del ARN pregenómico o la reimportación de las cápsides del VHB que contienen ADNrc en el núcleo. Además, las células dHepaRG carecen de amplificación de cccDNA por reimportación o reinfección de la cápside nuclear (Hantz et al, 2009). El efecto del interferón sobre el HBeAg y el rcDNA del HBV se explica por sus conocidos efectos antivirales adicionales, como el silenciamiento epigenético del cccDNA mediado por IFNα que da lugar a la inhibición de la transcripción (Belloni et al, 2012 Tropberger et al, 2015), la desestabilización del ARN del VHB inducida por citocinas (Heise et al, 1999), o la inhibición de la formación o la desintegración acelerada de las cápsides que contienen ácido nucleico del VHB por los interferones de tipo I o II (Wieland et al, 2005 Xu et al, 2010). En conjunto, esto indica que ISG20 inducido por interferón puede agotar directamente el conjunto de cccDNA nuclear, lo que refuerza aún más la noción de que la pérdida de cccDNA mediada por ISG20 bajo tratamiento con interferón no es un artefacto de niveles reducidos de rcDNA citoplásmico, sino una consecuencia de ISG20 inducido por interferón que se dirige a las células nucleares. ADNccc del VHB.

En nuestros experimentos, la caída de ISG20 mediada por shRNA abolió por completo la pérdida de cccDNA inducida por IFNγ, pero la reducción mediada por IFNα sólo se rescató parcialmente. El efecto de caída de ISG20 más débil bajo el tratamiento con IFNα podría reflejar una caída incompleta. Otra posible explicación es una compensación por otras nucleasas, que pueden ayudar a la función de ISG20. Stenglein et al (2010) plantearon la hipótesis de que la nucleasa APEX1 degrada el ADN extraño después de la desaminación por A3A (Stenglein et al, 2010), pero una caída de APEX1 no afectó la reducción de cccDNA mediada por IFNγ en nuestros experimentos (Xia et al, 2016). Los análisis de expresión génica mediante micromatrices mostraron la inducción de nucleasas inducidas por IFNα adicionales. Sin embargo, la adición de interferones a las células que expresaban tanto A3A como ISG20 no pudo mejorar el efecto sobre la disminución del cccDNA causado ya por A3A e ISG20.

Mediante el análisis de expresión génica de todo el genoma y el análisis de ontología genética, identificamos una serie de nucleasas inducidas por interferón que podrían afectar potencialmente la estabilidad del cccDNA. Sin embargo, su implicación es poco probable ya que se localizan en el compartimento celular incorrecto o no fueron inducidos o sólo mínimamente por el interferón en experimentos posteriores. RAD9A es una ADNasa con preferencia por cadenas simples sobre dobles (Bessho y Sancar, 2000) que se localizan en el núcleo (Yoshida et al, 2003), pero solo fue inducido débilmente en células dHepaRG por interferones. PNPT1 codifica la polinucleótido fosforilasa humana RNasa (hPNPasa) que se localiza en el espacio intermembrana mitocondrial (Chen et al, 2007), y la exoribonucleasa XRN1 es una RNasa citoplasmática (Nagarajan et al, 2013). PELO (homólogo de pelota de proteína) tiene una señal de localización nuclear (Shamsadin et al, 2000), también se localiza en el citoesqueleto y podría degradar los ARNm aberrantes (Burnicka-Turek et al, 2010), pero no pudimos confirmar su regulación positiva por interferones en células dHepaRG.

En estudios similares al nuestro, se informó que la sobreexpresión de la desaminasa AICDA era suficiente para reducir los niveles de cccDNA (Chowdhury et al, 2013 Qiao et al, 2016). No pudimos confirmar una inducción de AICDA y no detectar una disminución de los niveles de cccDNA cuando solo se sobreexpresaba A3A, lo que indica que A3A solo no es suficiente para permitir la degradación del cccDNA. Cuando se coexpresó ISG20, el cccDNA disminuyó en nuestros experimentos de cultivo celular en células dHepG2H1.3-A3A que se diferenciaron para estabilizar conjuntos de cccDNA (Protzer et al, 2007), así como en las células dHepaRG-TR-A3A, en las que el cccDNA solo se deriva del virus entrante (Hantz et al, 2009). Encontramos que la expresión combinada de A3A e ISG20 es suficiente para reducir los niveles de cccDNA a menos del 50% del control sin tratamiento adicional. Este hallazgo puede abrir la oportunidad para una intervención terapéutica al activar específicamente la expresión de A3A e ISG20 o la entrega directa de A3A e ISG20 a los hepatocitos y brinda la oportunidad de evitar los efectos secundarios de la terapia sistémica con IFNα (Janssen et al, 2005 ).

Los estudios con chimpancés mostraron que ISG20 se expresó en el hígado de animales con infección aguda durante la eliminación viral (Wieland et al, 2004), lo que sugiere que ISG20 estaría disponible para la eliminación del VHB. Confirmamos la regulación de ISG20 a través de en vivo examen histológico para la expresión de ISG20 en muestras de tejido hepático de pacientes con hepatitis B aguda autolimitada. En particular, durante la hepatitis B crónica, el nivel de expresión de ISG20 fue tan bajo como en las muestras de control. Durante la hepatitis B aguda se observa una fuerte respuesta polifuncional de las células T (Bertoletti y Ferrari, 2012 Said y Abdelwahab, 2015) que tiene efectos citolíticos, pero también no citolíticos, sobre el VHB (Murray et al, 2005). La simulación matemática del aclaramiento del VHB en chimpancés apoyó la idea de que durante la fase temprana del aclaramiento del VHB, los mecanismos efectores de células T no citopáticas inhiben la replicación viral y acortan en gran medida la vida media del ADNcc de larga duración, limitando así el grado en que Se requieren funciones efectoras de células T citopáticas y destrucción de tejidos para terminar con la infección aguda por VHB (Murray et al, 2005). De acuerdo con esta observación, en el lugar hybridization showed increased mRNA amounts of A3A and A3B in human liver tissue in acute but not in chronic hepatitis B (Xia et al, 2016 ) and T-cell cytokines IFNγ and tumor necrosis factor alpha (TNFα) (Xia et al, 2016 ) or T cell-mediated LTβR activation (Koh et al, 2018 ) lead to non-cytolytic cccDNA reduction, most likely via induction of A3 deaminases and ISG20.

During chronic HBV infection, in contrast, the T-cell response is weak. HBV-specific T cells are scarce and partially exhausted, and thus, there is little cytokine secretion (Gehring & Protzer, 2019 Rehermann & Thimme, 2019 ). Coinfection with HDV or HCV during chronic hepatitis B restored ISG20 expression in liver tissue samples. HDV (Giersch et al, 2015 ) and HCV (Su et al, 2002 Heim & Thimme, 2014 ) trigger innate immune responses and induce interferons. Accordingly, chronic hepatitis B patients responding to IFNα therapy showed increased ISG20 expression as compared to non-responders (Xiao et al, 2012 Lu et al, 2013). Taken together, clinical data strongly support the notion that ISG20 is critically involved in HBV elimination en vivo and acts as the DNase targeting the HBV persistence form cccDNA during viral clearance.

In summary, this study shows that ISG20 is the nuclease responsible for an interferon-induced decline of HBV cccDNA. Co-expression of catalytically active ISG20 and A3A is sufficient to reduce HBV cccDNA, opening new avenues for therapeutic targeting of the HBV persistence form, which remains a difficult target for antiviral therapies that aim at curing chronic hepatitis B.


D iscussion

This work was an investigation of gene expression at the single cell level during the early steps of differentiation of mESCs. The main focus was on differentiation towards the neuronal lineage. La expresión de Pou5f1 y Sox1 was chosen as marker of pluripotent cells and early neuronal precursors, respectively. The main findings are (a) the initial activation of Sox1 occurs in cells that contain varying amounts of Pou5f1 mRNA and protein (b) early differentiation appears to be characterized by the existence of a transient population of cells which simultaneously transcribe pluripotency and early lineage markers at the single cell level (c) the increase in Sox1 expression occurs through an increase both in the proportion of active alleles in the cell population and in the average transcriptional output at each of these alleles.

Pou5f1 is well known to be one of the pluripotency-associated genes with the broadest temporal and spatial patterns of expression, encompassing pluripotent cells in the inner cell mass, in the epiblast and in the primitive ectoderm of the embryo 41 . Several reports indicated that the expression of Pou5f1 was maintained during the earliest stages of differentiation, especially towards the neuronal lineage. In mouse, neural stem cells prepared from the whole cerebrum of E14 embryos were found to express Pou5f1, although at low levels 42 . Expresión de Pou5f1 was also detected by qRT-PCR in early populations of Sox1-expressing neural plate cells derived from epiblast stem cells 43 . Recently, the coexpression of pluripotent and early neuronal markers (POU5F1 y PAX6) in lineage-primed human ESCs was confirmed by single-cell qRT-PCR 11 . Genome-wide expression profiling of mESCs differentiating towards the neuronal lineage under conditions similar to the ones used here (low density plating in serum-free medium) revealed that cells convert from pluripotency to a primitive ectoderm-like state before becoming neuroepithelial progenitors 44 . The intermediate step is characterized by the expression of Fgf5 in a cell population that still expresses Pou5f1, reminiscent of what is observed in the E5.5–E6.5 epiblast of the mouse embryo 22, 45 . Interestingly, mESCs cultured at low densities in serum-free medium supplemented with LIF are able to generate spheres of cells which display these features 46 . As they will revert to pluripotency when transferred to mESC culture conditions, it has been suggested that these LIF-dependent primitive neural stem cells represent a reversible stage of neural commitment 47 .

In view of their similarity in terms of gene expression and of their early and transient appearance, it is probably safe to assume that the cells that were found in this study to coexpress Pou5f1 y Sox1 are phenotypically similar to the primitive neural stem cells described in the reports cited above. The quantitative analysis of gene expression that was performed here revealed a novel property of these cells, that is, a general lack of correlation between the expression levels of the pluripotency and the early differentiation markers in single cells. Thus, despite a approximately eightfold range in Pou5f1 protein levels and a approximately 25-fold range in mRNA counts, the expression levels of Sox1 varied equally and independently of those of Pou5f1 24 hours after the induction of differentiation. Obviously, cellular differentiation is not a synchronized process at the level of single cells 48 cells that expressed high levels of either Pou5f1 o Sox1 after only 1 day of differentiation could be found these presumably represented earlier or later stages of differentiation. The cells of interest here, however, are those that expressed intermediate levels of expression, in which the expression levels were found not to be correlated. The importance of rigorous quantification of gene expression in arriving at this conclusion has to be emphasized. In this regard, it should be noted that smRNA FISH offered a better approach than immunostaining because the signals are discrete and can be expressed as counts instead of as relative intensity levels 49 . In addition, by measuring RNA levels, smRNA FISH provided a more immediate read-out of the transcriptional changes that occurs early in differentiation. It is therefore significant that the Pou5f1 y Sox1 abundance were even less correlated at the mRNA level than at the protein level in coexpressing cells.

Previous reports have revealed an active role for Pou5f1 in neuronal differentiation 42, 50 . Recently, under culture conditions similar to the ones used here, that is, defined N2B27 medium, Pou5f1 was shown to be expressed for up to 3 days after exit of mESCs from ground state pluripotency and to cooperate with Otx2 in the activation of genes involved in neural development and Wnt signaling 51 . On the other hand, it was suggested that Pou5f1 specifically suppresses the neural ectodermal fate in cells engaged in mesendodermal differentiation 52 . Notwithstanding these divergent proposals, the present observation of uncorrelated expression between Pou5f1 y Sox1 would seem to suggest that Pou5f1 levels alone do not play an instructive role during the early differentiation process. In this context, it can be argued that artificial increases or decreases of Pou5f1 levels may instead exert their effects on cellular differentiation through selection of certain cell fates, as suggested by the fact that the altered Pouf51 expression levels have to be sustained for at least 5 days (or in stable cell lines) to influence cellular differentiation 33, 50 .

An important finding of the present study is undoubtedly that there can exist differentiating mESCs that actively transcribe both Pou5f1 y Sox1, as visualized by the cooccurrence of nascent transcription signals in individual cell nuclei. A similar observation was made for Pou5f1 y T-brachyury in the case of cells differentiating in untreated embryoid bodies towards the mesendodermal lineage, of which T-brachyury is an early marker. Taken together, these observations indicate that coexpression is the result of an active cellular process whereby the Pou5f1 gene continues to be transcribed during the early steps of differentiation as lineage-specific genes are being activated. This promiscuity may be a result of the epigenetic environment of the ESC genome. Indeed, it has been shown that in these cells the chromatin at promoters of numerous lineage markers, including Sox1, is characterized by histone modifications that are associated both with chromatin accessibility (methylated H3K4) and transcriptional repression (trimethylated H3K27) 53, 54 . It is tempting to speculate that these bivalent structures are inherently unstable and that they are dismantled at the beginning of differentiation more rapidly than repressive marks are added at the Pou5f1 lugar.

Transcription has been shown to be a discontinuous process, with pulses of activity interspersed with periods of inactivity 14 . A recent report described the pulsatile nature of Nanog transcription in living undifferentiated mESC 18 . By comparing transcriptional dynamics in cells grown in conditions that are known to influence the extent of cell-to-cell variability in Nanog expression (serum vs. MEK/GSK3 inhibition), the authors found that Nanog transcription was not regulated through changes in the number of transcripts per transcriptional event, but rather by the frequency of pulsing in individual cells. The data presented here are consistent with the transcription of both Pou5f1 y Sox1 displaying a pulsing behavior at each time point, many of the cells that contained mature mRNAs in the cytoplasm did not show any signal indicative of ongoing transcription in the nucleus. The changes that were observed in the proportion of cells that did show a nuclear signal suggest that the frequency of Pouf51 pulsing decreases during early differentiation and that, conversely, the pulsing frequency of Sox1 aumenta. Direct measurement of transcriptional output at the active alleles revealed no change for Pou5f1, but a approximately 30% increase for Sox1, suggesting that transcriptional pulse size also increases during differentiation for this gene. A recent work, which calculated the transcriptional parameters of transgenes integrated randomly across the entire genome, suggested that an increase in activity occurs first through increased pulsing frequency and, upon expression levels reaching a certain threshold, through increased size of the transcriptional bursts 55 . The data for Sox1 are in general agreement with this model, which may represent a general mode of transcriptional dynamics during ESC differentiation. As was performed for Nanog in pluripotent cells 18 , live cell imaging of gene transcription will be needed to analyze whether and how changes in the frequency, the duration, and the intensity of transcriptional pulses correlate with cell fate decisions in differentiating mESCs.

The picture that emerges from this study is one in which transcriptional activities appear uncoordinated within single cells at an early, transient stage of mESC differentiation. As pluripotent and early differentiation markers belong to transcriptional “programs” that are generally viewed as antagonistic, the finding that both can be transcribed in the same cell suggests a mechanistic uncoupling of gene regulation across the mESC genome upon exit from pluripotency. The molecular nature of this putative uncoupling remains unknown. Its clear consequence, however, is an increased stochasticity in gene expression at early steps of cellular differentiation. Although none extended the analysis to nascent transcription, as was done here, a number of recent studies have highlighted the stochastic nature of gene expression during early differentiation. Por ejemplo, Tbx21 y Gata3, which mark the mutually exclusive Th1 and Th2 fates, were found by smRNA FISH to be coexpressed in the same individual cells during the early stages of CD4 T cell differentiation 56 . Interestingly, the expression levels of these two transcription factors did not correlate with those of their target cytokines Ifng y Il4, respectively, further pointing to a general uncoupling of transcriptional regulation in the early steps of differentiation. Coexpression of transcription factors that subsequently become cell-type restricted was also reported in the preimplantation mouse embryo 57 . In another work on mouse embryo, single cell qRT-PCR analysis showed that the expression of lineage-specific markers in the inner cell mass was uncorrelated early in the lineage segregation process, and that evidence for hierarchy appeared only later through what the authors referred to as signal reinforcement, mainly of the Fgf4 type 58 . Finally, single cell analysis revealed an early stochastic phase during cellular reprogramming of mouse embryonic fibroblast into induced pluripotent stem cells, with no specific sequence or order of gene expression before the re-activation of Nanog 59 . In line with these results, current models postulate that early ESC differentiation is linked to increased stochasticity in gene expression and that multilineage priming at the single cell level is a pre-requisite step in the process 60-62 . The results presented here show for the first time that this priming can occur in cells that are actively transcribing a pluripotent marker. Furthermore, they suggest that the process is associated with changes in transcriptional dynamics, a likely source of gene expression noise in the cell population 63 . Additional work is needed to investigate how cellular lineage decisions are made in stochastic conditions.


Materiales y métodos

Plant material

los del mutant, line JI:8, is closely related to the wild-type line, JI:7. los incolorata I mutant, line Jl:569, was obtained from Professor Linnert, Frei University of Berlin in 1984 and outcrossed to JI:7. Segregation in the F2 allowed the selection of ivory inc I : del homocigotos. los mutabilis mutant was identified from several individuals segregating in an F2 population from a cross between a stock line carrying decipiens and JI:7 (Stubbe, 1966 ). Los orígenes de del rec (JI:602 JI22) and del 23 (JI:23) have been described by Goodrich et al. ( 1992 ) and Martin et al. () and lines JI:32, JI:33, JI:56, JI:520, and JI:522 have been described by Fincham & Harrison, ( 1967 ), Coen et al., ( 1986 ) and Almeida et al., ( 1989 ).

Construction of a cDNA library from RNA from lobes of del flowers

RNA was extracted from red petal lobes from a del line (Jl:8). cDNA was synthesised from polyA + RNA. EcoRl linkers were ligated to the cDNA ends and cloned into the EcoRl site of λgt10. The resultant library contained C. 6 × 10 6 PFU

Screening of the cDNA library

Approximately 5 × 10 5 PFU were screened using a 32 P-labelled fragment from a cDNA clone of An1 (Spelt et al., 2000 ) amplified from petals of line V26. Three positive plaques were identified. A 2.4 kb KpnI fragment from the largest cDNA insert was subcloned into the KpnI site of pBluescript (Stratagene) and named pJAM1494.

RNA preparation for RNA gel blots

RNA was extracted from petals and RNA gel blots were run as described by Martin et al. ( 1985 ). Probes for biosynthetic genes were prepared as described in Martin et al. ( 1991 ) and Schwinn et al. ( 2006 ).

Isolation of genomic clones

A library of genomic DNA from JI:522 was prepared in λEMBL4 (Martin et al., 1991 ) and screened with pJAM1494. DNA inserts from positive plaques were subcloned as EcoRI fragments into pBluescript. DNA was also isolated from inc I 1 : del y inc I 2 : del lines digested with EcoRI, size-fractionated and cloned into λNM1149. Inserts were screened with pJAM1494 and the positive EcoRI inserts were subcloned into pGEM-T (Promega) and sequenced.

Amplification of inc I, delila y Delila-like alleles from genomic DNA was performed with iProof polymerase (Bio-Rad) and gene-specific primers (Supporting Information Table S1). Sequences have been submitted to GenBank with the following accession numbers: del 23 , genomic DNA, MW027119: inc I 1 , genomic DNA, MW027120 Incolorata I, cDNA, MW027121 WDR1, cDNA, MW027122.

Árbol filogenético

Deduced amino acid sequences were aligned using M USCLE (Edgar, 2004 ) to generate a maximum likelihood phylogenetic tree using P hy ML (Guindon et al., 2010 ) with 1000 bootstrap replicates using G eneious (10.0.9) software. Amino acid sequence alignments are shown in Dataset S1.

Biolistic transformation of inc I pétalos

Complementation assays of inc I 1 : del petals were performed by biolistic transformation of petals (Albert et al., 2015). GFP-ER was used as an internal control for identifying transformed cells (Haselhoff et al., 1997 ).

Aislamiento de AmWDR1

WDR1 was isolated by 3′ Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) PCR (Frohman et al., 1988 ) from line JI:75 using degenerate oligonucleotides K112 and K113 for first and second amplification rounds, respectively. The 5′ end of the WDR1 gene was isolated using a Universal Genome Walker kit (Clontech) and gene-specific primers K127 and K128 for the first and second amplification rounds, respectively. El largo WDR1 cDNA was amplified from RNA from petals using primers K133 and K134 and cloned into pJAM1502. For all primers see Table S1.

RNA isolation and qRT-PCR

Whole petals of wild-type (JI:522), rosea dorsea y incolorata I flowers, or dissected wild-type (JI:522) and delila (JI:8) petals (tubes and lobes) were sampled. Total RNA was extracted using Plant RNeasy Isolation kits (Qiagen). For qRT-PCR analysis, cDNA was prepared from 1 µg total RNA using IScript™ gDNA clear cDNA synthesis kits (Bio-Rad), and diluted 20-fold for analysis. qRT-PCR using SsoAdvanced™ Universal SYBR ® Green Supermix (Bio-Rad), gene-specific primers (Table S1) were normalised to the geometric mean of Ciclofilina y EF1α (Albert et al., 2014). Means ± SEM of three biological replicates were calculated. Two-tailed Student’s t-tests between wild-type and the corresponding mutant samples were performed to determine significant differences. Data were transformed (log10) to account for unequal variance.

Full-length transcripts of Delila y Delila-like were amplified with gene-specific primers (Table S1) and 2GRobust polymerase (Kapa Biosciences), from cDNA synthesised using Superscript II™ reverse transcriptase (Life technologies) and oligo (dT)12–18.

Transient dual luciferase assays in Nicotiana benthamiana

The ability of different transcription factors to activate the promoter of the Pallida gene encoding dihydroflavonol-4-reductase (DFR) was assessed by combining transient expression via agroinfiltration of N. benthamiana leaves with a quantitative dual luciferase reporter system.

Effector plasmids encoding transcription factors were obtained by cloning coding sequences first into the pDONR207 entry clone (Thermo Fisher Scientific/Invitrogen) and subsequently transferred to the destination vectors pJAM1502 (Ros, Inc1, WDR1) or pMDC32 (Del) using Gateway cloning technology (Thermo Fisher Scientific/Invitrogen). Both vectors are Gateway-compatible binary plasmids that allow strong, constitutive expression of the genes of interest driven by double CaMV 35S promoters (Curtis & Grossniklaus, 2003 Luo et al., 2007 ).

The reporter constructs p2532, p2534 and p2536 were obtained by PCR amplification of the DFR promoter from different A. majus accessions followed by cloning into the pGreen II 0800-LUC vector as KpnI–NcoI fragments to control the expression of the firefly-derived luciferase reporter gene. This vector also contains a Renilla luciferase gene under the control of a CaMV 35S promoter as an internal control to normalise the values of the experimental reporter gene for variations caused by transfection efficiency (Hellens et al., 2005 ). The reporter constructs containing deletions in the DFR promoter (p2551, p2557, p2565 and p2571) were obtained using the Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit (New England Biolabs) using plasmid p2532 as a template and primers listed in Table S1.

Effector and reporter plasmids were transformed into Agrobacterium tumefaciens strain GV3101. Reporter plasmids were co-transformed with the helper plasmid pSoup (Hellens et al., 2005 ). Liquid cultures were grown overnight with selection (kanamycin 50 mg l −1 , rifampicin 25 mg l −1 ) and harvested by centrifugation. Cells were washed and resuspended in 10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5.6, 200 μM acetosyringone to A600 = 0.2. Agrobacterium suspensions were infiltrated into the abaxial surface of expanded leaves of 3-wk-old N. benthamiana plantas. For each combination, five injected areas were treated as biological replicates. Agroinfiltrated leaves were harvested after 3 d and luciferase activity was measured immediately using the Dual-Glo Luciferase Assay System kit (Promega). Leaf discs of 4 mm in diameter were collected in 1.5 ml white transparent tubes containing 100 μl of PBS. A volume of 75 μl of luciferase assay reagent was added and firefly luminescence was measured on a Glomax 20/20 single tube luminometer (Promega) after 10 min. Renilla luminescence was measured on the same instrument 10 min after the addition to the same sample of 75 μl of Stop & Glo reagent. Results were expressed as the ratio of firefly to Renilla luciferase activity (Luc/Ren).


Y.J.L.: Conception and design, collection and/or assembly of data, data analysis and interpretation, manuscript writing N.M. and A.C.T.: Collection and/or assembly of data, data analysis and interpretation T.M.L.: Conception and design, financial support, data analysis and interpretation, and manuscript writing T.M.: Conception and design, financial support, administrative support, data analysis and interpretation, manuscript writing, final approval of manuscript.

The authors indicate no potential conflicts of interest.

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