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¿Por qué las proteínas desnaturalizadas tienden a ser menos solubles que la proteína nativa?

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¿Por qué las proteínas desnaturalizadas tienden a ser menos solubles que la proteína nativa? En términos de efectos hidrofóbicos, ¿alguien podría explicarme este fenómeno?


Información de contexto

Una proteína nativa tiene sus aminoácidos hidrofóbicos doblados hacia adentro, por lo que tiene un núcleo hidrofóbico. ¿Por qué? Porque se favorece termodinámicamente. Cuando se desnaturaliza una proteína, los aminoácidos hidrófobos no estarán más tiempo dentro del núcleo de la proteína, sino que estarán expuestos al ambiente hidrófilo (asumiendo que estás hablando de una proteína dentro de un organismo). Pero esto no se favorece termodinámicamente porque las partes hidrofóbicas no pueden formar enlaces H con el agua y, por lo tanto, no son muy solubles en agua:

Entonces, cuando esto sucede, muchas moléculas de proteínas se agregarán como micelas de jabón (porque se favorecen las interacciones hidrófobas). Esto reducirá el área de superficie total de los aminoácidos hidrófobos en contacto con el agua y, por lo tanto, reducirá la alteración de los enlaces de H en las moléculas de agua.

Aquí está mi descripción hecha por mí mismo del efecto de la molécula orgánica en la unión de H en el agua (es bastante tosca, así que no te preocupes por los detalles finos).

Resumido Los aminoácidos hidrofóbicos estarán expuestos al ambiente hidrofílico -> las proteínas se agregarán juntas -> placa insoluble.


Desnaturalización (bioquímica)

Desnaturalización es un proceso en el que las proteínas o ácidos nucleicos pierden la estructura cuaternaria, la estructura terciaria y la estructura secundaria que está presente en su estado nativo, mediante la aplicación de algún estrés externo o compuesto como un ácido o base fuerte, una sal inorgánica concentrada, un disolvente orgánico (por ejemplo, alcohol o cloroformo), radiación o calor. [3] Si las proteínas de una célula viva se desnaturalizan, esto da como resultado la interrupción de la actividad celular y posiblemente la muerte celular. La desnaturalización de proteínas también es una consecuencia de la muerte celular. [4] [5] Las proteínas desnaturalizadas pueden exhibir una amplia gama de características, desde el cambio conformacional y la pérdida de solubilidad hasta la agregación debido a la exposición de grupos hidrófobos. Las proteínas desnaturalizadas pierden su estructura tridimensional y, por lo tanto, no pueden funcionar.

Nota 1: Modificado de la definición dada en la ref. [1]

Nota 2: La desnaturalización puede ocurrir cuando las proteínas y los ácidos nucleicos se someten a temperaturas elevadas o pH extremos, oa concentraciones no fisiológicas de sal, disolventes orgánicos, urea u otros agentes químicos.

Nota 3: Un enzima pierde su actividad catalítica cuando se desnaturaliza. [2]

El plegamiento de proteínas es clave para saber si una proteína globular o de membrana puede hacer su trabajo correctamente; debe plegarse en la forma correcta para que funcione. Sin embargo, los enlaces de hidrógeno, que desempeñan un papel importante en el plegamiento, son bastante débiles y, por lo tanto, se ven afectados fácilmente por el calor, la acidez, las concentraciones variables de sal y otros factores estresantes que pueden desnaturalizar la proteína. Esta es una de las razones por las que la homeostasis es fisiológicamente necesaria en muchas formas de vida.

Este concepto no está relacionado con el alcohol desnaturalizado, que es el alcohol que se ha mezclado con aditivos para hacerlo inadecuado para el consumo humano.


La respuesta de la proteína desplegada y el estrés celular, Parte B

Daisuke Oikawa, Yukio Kimata, en Métodos en enzimología, 2011

4.3 In vitro ensayo de antiagregación

Como sustratos de proteína desnaturalizada modelo, se emplearon luciferasa (Promega) y citrato sintasa (Roche). Se dializó citrato sintasa frente a tampón stock (20 mlMETRO HEPES (pH 7,0), 150 mMETRO KCl, 2 mMETRO MgCl2y 10% (v / v) de glicerol) y se almacenan a -80 ° C. Para desnaturalizar, luciferasa (25 μMETRO concentración final) y citrato sintasa (50 μMETRO concentración final) se incubaron en solución desnaturalizante de guanidina HCl (guanidina-HCl (6 METRO para luciferasa o 4 METRO para citrato sintasa), 20 mMETRO HEPES (pH 7,2), 50 mMETRO KCl y 2 mMETRO MgCl2) durante 30 min a temperatura ambiente. Las mezclas de proteínas desnaturalizadas se diluyeron luego (dilución de 50 veces para luciferasa o dilución de 33 veces para citrato sintasa) con tampón de ensayo (20 mlMETRO HEPES (pH 7,2), 50 mMETRO KCl y 2 mMETRO MgCl2) en presencia o ausencia de las proteínas recombinantes de prueba. La agregación de proteínas después de la dilución se controló mediante absorbancia óptica a 320 nm con un espectrofotómetro (DU640 Beckman Coulter) a temperatura ambiente.


Ciencia de la desnaturalización de proteínas por calor

Los cambios importantes en las estructuras secundarias, terciarias y cuaternarias sin escisión de los enlaces peptídicos de la cadena principal se consideran como "Desnaturalización". Los cambios sutiles en la estructura, que no alteran drásticamente la arquitectura molecular de la proteína, generalmente se consideran como "Adaptabilidad conformacional". La ruptura de enlaces peptídicos de proteínas en péptidos o aminoácidos es "digestión"

La estructura de una proteína depende de varias interacciones atractivas y repulsivas que resultan de diversas fuerzas intramoleculares, así como de la interacción de varios grupos de proteínas con el agua solvente circundante. El estado nativo (de una sola molécula de proteína) es termodinámicamente el más estable con la menor energía libre factible en condiciones fisiológicas. Cualquier cambio en su entorno, como pH, fuerza iónica, temperatura, composición del disolvente, etc., obligará a la molécula a asumir una nueva estructura de equilibrio.

Comprender la estructura de las proteínas

¿Cómo medimos la desnaturalización de proteínas?

La desnaturalización implica la transformación de una estructura plegada bien definida de una proteína, formada en condiciones fisiológicas, a un estado desplegado en condiciones no fisiológicas. Como sabemos, no podemos medir la estructura directamente, es decir, la medición directa de las fracciones de proteína nativa y desnaturalizada en una solución no es posible. Pero los cambios conformacionales en las proteínas afectan invariablemente varias de sus propiedades químicas y físicas, como la absorbancia ultravioleta (UV), la fluorescencia, la viscosidad, el coeficiente de sedimentación, la rotación óptica, el dicroísmo circular, la reactividad de los grupos sulfhidrilo y la actividad enzimática. Por tanto, la desnaturalización de las proteínas se puede estudiar mediante el seguimiento de los cambios en estas propiedades físicas y químicas.

Calor como desnaturalizante

El calor es el agente más utilizado en el procesamiento y conservación de alimentos. Cuando una solución de proteína se calienta gradualmente por encima de una temperatura crítica, experimenta una transición brusca del estado nativo al estado desnaturalizado. La temperatura en el punto medio de transición, donde la relación de concentración de los estados nativos y desnaturalizados es 1, se conoce como temperatura de fusión Tm o temperatura de desnaturalización Td..

El mecanismo de desnaturalización inducida por la temperatura. es muy complejo e implica principalmente la desestabilización de las principales interacciones no covalentes. Los enlaces de hidrógeno, las interacciones electrostáticas y de van der Waals son de naturaleza exotérmica (impulsada por la entalpía). Por tanto, se desestabilizan a altas temperaturas y se estabilizan a bajas temperaturas. Sin embargo, dado que los enlaces de hidrógeno de los péptidos en las proteínas están en su mayoría enterrados en el interior, permanecen estables en un amplio rango de temperaturas. Por otro lado, las interacciones hidrofóbicas son endotérmicas (impulsadas por la entropía). Se estabilizan a altas temperaturas y se desestabilizan a bajas temperaturas. Por lo tanto, a medida que aumenta la temperatura, los cambios en la estabilidad de estos dos grupos de interacciones no covalentes se oponen entre sí. Sin embargo, la estabilidad de las interacciones hidrofóbicas no puede aumentar infinitamente con el aumento de la temperatura, porque por encima de cierta temperatura, la degradación gradual de la estructura del agua eventualmente desestabilizará también las interacciones hidrofóbicas. La fuerza de las interacciones hidrofóbicas alcanza un máximo a aproximadamente 60-70 ° C.

Otra fuerza importante que afecta la estabilidad conformacional de las proteínas es la entropía conformacional, & # 8211T DSConf, de la cadena polipeptídica. A medida que aumenta la temperatura, el aumento de la energía cinética térmica de la cadena polipeptídica facilita enormemente el despliegue de la cadena polipeptídica.

Desnaturalización de proteínas y composición de aminoácidos.
La desnaturalización de proteínas por calor también depende de la composición de aminoácidos de las proteínas. Las proteínas que contienen una mayor proporción de residuos de aminoácidos hidrófobos, especialmente Val, Ile, Leu y Phe, tienden a ser más estables que las proteínas más hidrófilas. Las proteínas de los organismos termófilos suelen contener grandes cantidades de residuos de aminoácidos hidrófobos.. También se dice que otros factores, como los enlaces disulfuro y la presencia de puentes salinos enterrados en hendiduras hidrófobas, también pueden contribuir a la termoestabilidad.

Desnaturalización de proteínas y contenido de agua.
El agua facilita enormemente la desnaturalización térmica de las proteínas [37,95]. Los polvos de proteína seca son extremadamente estables a la desnaturalización térmica. El valor de Td disminuye rápidamente a medida que aumenta el contenido de agua de 0 a 0,35 g de agua / g de proteína. El efecto de la hidratación sobre la termoestabilidad está fundamentalmente relacionado con la dinámica de las proteínas. En estado seco, las proteínas tienen una estructura estática, es decir, la movilidad de los segmentos polipeptídicos está restringida. A medida que aumenta el contenido de agua, la hidratación y la penetración parcial del agua en las cavidades superficiales provocan el hinchamiento de la proteína. El hinchamiento de la proteína aumenta la movilidad y flexibilidad de la cadena, y la molécula de proteína asume una estructura fundida más dinámica. Cuando se calienta, esta estructura dinámica y flexible proporciona un mayor acceso de agua a los puentes de sal y los enlaces de hidrógeno de péptidos de lo que es posible en estado seco, lo que resulta en una menor TD.

Desnaturalización inducida por frío
Se dice que cuanto menor sea la temperatura, mayor será la estabilidad de una proteína. Hay excepciones a esta regla. Aquellas proteínas en las que las interacciones polares dominan sobre las interacciones no polares son más estables a temperaturas de refrigeración o por debajo de ellas que a temperaturas más altas. Por otro lado, las proteínas que se estabilizan principalmente por interacciones hidrófobas son más estables aproximadamente a la temperatura ambiente que a la temperatura de refrigeración.

  • La estabilidad de la lisozima aumenta con la disminución de la temperatura, mientras que las de la mioglobina y una lisozima mutante del fago T4 muestran una estabilidad máxima a aproximadamente 30 ° C y 12,5 ° C, respectivamente. Por debajo y por encima de estas temperaturas, la mioglobina y la lisozima T4 son menos estables. Cuando se almacenan por debajo de 0 ° C, estas dos proteínas se someten a desnaturalización inducida por frío.
  • Cuando la leche desnatada se almacena a 4 ° C, la b-caseína se disocia de las micelas de caseína, y esto altera las propiedades fisicoquímicas y cuajantes de las micelas.

La desnaturalización de proteínas es reversible.
Cuando se elimina el desnaturalizante de la solución de proteína (o se enfría la muestra), la mayoría de las proteínas monoméricas (en ausencia de agregación) se replegan a su conformación nativa en condiciones de solución adecuadas, como pH, fuerza iónica, potencial redox y concentración de proteína .

  • La glicinina, una de las proteínas de almacenamiento de la soja, se agrega y precipita cuando se almacena a 2 ° C, luego se vuelve soluble cuando se devuelve a temperatura ambiente.
  • Varias enzimas oligoméricas, como lactato deshidrogenasa y gliceraldehído fosfato deshidrogenasa, pierden la mayor parte de su actividad enzimática cuando se almacenan a 4 ° C, y esto se ha atribuido a la disociación de las subunidades. Sin embargo, cuando se calientan y se mantienen a temperatura ambiente durante unas horas, se vuelven a asociar y recuperan por completo su actividad.
  • La desnaturalización térmica de las proteínas globulares monoméricas es mayoritariamente reversible. Por ejemplo, cuando muchas enzimas monoméricas se calientan por encima de sus temperaturas de desnaturalización, o incluso se mantienen brevemente a 100 ° C, y luego se enfrían inmediatamente a temperatura ambiente, recuperan completamente sus actividades. Sin embargo, la desnaturalización térmica puede volverse irreversible cuando la proteína se calienta a 90-100 ° C durante un período prolongado, incluso a pH neutro. Esta irreversibilidad se produce debido a varios cambios químicos en la proteína, como la desamidación de los residuos de Asn, la escisión de los enlaces peptídicos en los residuos de Asp, la destrucción de los residuos de Cys y cistina y la agregación.

Conferencia sugerida sobre desnaturalización de proteínas

Referencia: Química de los alimentos l1996 l 3a edición l Por O R Fennema l Marcel Dekker


¿Por qué las proteínas desnaturalizadas tienden a ser menos solubles que la proteína nativa? - biología

Las proteínas son polímeros de aminoácidos. Veinte tipos diferentes de aminoácidos se encuentran naturalmente en las proteínas. Las proteínas se diferencian entre sí según el tipo, número y secuencia de aminoácidos que componen la estructura polipeptídica. Como resultado, tienen diferentes estructuras moleculares, atributos nutricionales y propiedades fisicoquímicas. Las proteínas son componentes importantes de los alimentos por varias razones diferentes. Son una fuente importante de energía, además de contener aminoácidos esenciales, como lisina, triptófano, metionina, leucina, isoleucina y valina, que son esenciales para la salud humana, pero que el cuerpo no puede sintetizar. Las proteínas también son los principales componentes estructurales de muchos alimentos naturales, y a menudo determinan su textura general, por ejemplo, la ternura de los productos cárnicos o pesqueros. Las proteínas aisladas se utilizan a menudo en alimentos como ingredientes debido a sus propiedades funcionales únicas, es decir, su capacidad para proporcionar una apariencia, textura o estabilidad deseables. Normalmente, las proteínas se utilizan como agentes gelificantes, emulsionantes, agentes espumantes y espesantes. Muchas proteínas alimentarias son enzimas capaces de aumentar la velocidad de ciertas reacciones bioquímicas. Estas reacciones pueden tener un efecto favorable o perjudicial sobre las propiedades generales de los alimentos. Los analistas de alimentos están interesados ​​en conocer la concentración total, el tipo, la estructura molecular y las propiedades funcionales de las proteínas en los alimentos.

6.2. Determinación de la concentración total de proteínas

El método Kjeldahl fue desarrollado en 1883 por un cervecero llamado Johann Kjeldahl. Un alimento se digiere con un ácido fuerte para que libere nitrógeno, que puede determinarse mediante una técnica de titulación adecuada. A continuación, se calcula la cantidad de proteína presente a partir de la concentración de nitrógeno del alimento. El mismo enfoque básico todavía se utiliza hoy en día, aunque se han realizado una serie de mejoras para acelerar el proceso y obtener mediciones más precisas. Por lo general, se considera el método estándar para determinar la concentración de proteínas. Debido a que el método Kjeldahl no mide el contenido de proteína directamente, se necesita un factor de conversión (F) para convertir la concentración de nitrógeno medida en una concentración de proteína. Un factor de conversión de 6.25 (equivalente a 0.16 g de nitrógeno por gramo de proteína) se usa para muchas aplicaciones, sin embargo, este es solo un valor promedio, y cada proteína tiene un factor de conversión diferente dependiendo de su composición de aminoácidos. El método Kjeldahl se puede dividir convenientemente en tres pasos: digestión, neutralización y titulación.

La muestra de alimento a analizar se pesa en un matraz de digestión y luego se digiere calentándola en presencia de ácido sulfúrico (un agente oxidante que digiere el alimento), sulfato de sodio anhidro (para acelerar la reacción aumentando el punto de ebullición) y un catalizador, como cobre, selenio, titanio o mercurio (para acelerar la reacción). La digestión convierte el nitrógeno de los alimentos (que no sea en forma de nitratos o nitritos) en amoníaco y otras materias orgánicas en C0 2 y H 2 0. El gas amoníaco no se libera en una solución ácida porque el amoníaco está en la forma del ion amonio (NH 4 +) que se une al ion sulfato (SO 4 2-) y así permanece en solución:

Una vez completada la digestión, el matraz de digestión se conecta a un matraz receptor mediante un tubo. Luego, la solución en el matraz de digestión se alcaliniza mediante la adición de hidróxido de sodio, que convierte el sulfato de amonio en gas amoníaco:

& # 9 (NH 4) 2 SO 4 + 2 NaOH & reg 2NH 3 + 2H 2 O + Na 2 SO 4 & # 9 (2)

El gas amoniaco que se forma se libera de la solución y sale del matraz de digestión al matraz receptor, que contiene un exceso de ácido bórico. El bajo pH de la solución en el matraz receptor convierte el gas amoniaco en ión amonio y, simultáneamente, convierte el ácido bórico en ión borato:

& # 9NH 3 + H 3 BO 3 (ácido bórico) & reg NH 4 + + H 2 BO 3 - (ion borato) (3)

A continuación, se estima el contenido de nitrógeno por titulación del borato de amonio formado con ácido sulfúrico o clorhídrico estándar, utilizando un indicador adecuado para determinar el punto final de la reacción.

& # 9H 2 BO 3 - + H + & reg H 3 BO 3 (4)

La concentración de iones de hidrógeno (en moles) requerida para alcanzar el punto final es equivalente a la concentración de nitrógeno que estaba en el alimento original (Ecuación 3). La siguiente ecuación se puede usar para determinar la concentración de nitrógeno de una muestra que pesa m gramos usando una solución ácida de HCl x M para la titulación:

Donde vs y vb son los volúmenes de titulación de la muestra y el blanco, y 14g es el peso molecular del nitrógeno N. Por lo general, se procesa una muestra en blanco al mismo tiempo que el material que se analiza para tener en cuenta cualquier nitrógeno residual que pueda estar en los reactivos utilizados para realizar el análisis. Una vez que se ha determinado el contenido de nitrógeno, se convierte en un contenido de proteína utilizando el factor de conversión apropiado:% de proteína = F % N.

6.2.1.4. Ventajas y desventajas

& # 9Ventajas. El método Kjeldahl se utiliza ampliamente a nivel internacional y sigue siendo el método estándar de comparación con todos los demás métodos. Su universalidad, alta precisión y buena reproducibilidad lo han convertido en el principal método para la estimación de proteínas en los alimentos.

& # 9Desventajas. No da una medida de la proteína verdadera, ya que todo el nitrógeno en los alimentos no está en forma de proteína. Las diferentes proteínas necesitan diferentes factores de corrección porque tienen diferentes secuencias de aminoácidos. El uso de ácido sulfúrico concentrado a altas temperaturas presenta un riesgo considerable, al igual que el uso de algunos de los posibles catalizadores. La técnica requiere mucho tiempo para llevarla a cabo.

6.2.2. Método Dumas mejorado

Recientemente, se ha desarrollado una técnica instrumental automatizada que es capaz de medir rápidamente la concentración de proteínas de muestras de alimentos. Esta técnica se basa en un método descrito por primera vez por un científico llamado Dumas hace más de un siglo y medio. Está comenzando a competir con el método Kjeldahl como método estándar de análisis de proteínas para algunos alimentos debido a su rapidez.

Una muestra de masa conocida se quema en una cámara de alta temperatura (alrededor de 900 o C) en presencia de oxígeno. Esto conduce a la liberación de CO 2, H 2 O y N 2. El CO 2 y el H 2 O se eliminan pasando los gases por columnas especiales que los absorben. A continuación, se mide el contenido de nitrógeno pasando los gases restantes a través de una columna que tiene un detector de conductividad térmica al final. La columna ayuda a separar el nitrógeno de cualquier CO 2 y H 2 O residual que pueda haber quedado en la corriente de gas. El instrumento se calibra analizando un material que es puro y tiene una concentración de nitrógeno conocida, como EDTA (= 9,59% N). Por tanto, la señal del detector de conductividad térmica se puede convertir en un contenido de nitrógeno.Al igual que con el método Kjeldahl, es necesario convertir la concentración de nitrógeno en una muestra al contenido de proteína, utilizando factores de conversión adecuados que dependen de la secuencia precisa de aminoácidos de la proteína.

6.2.2.2. Ventajas y desventajas

& # 9Ventajas: Es mucho más rápido que el método Kjeldahl (menos de 4 minutos por medición, en comparación con 1-2 horas para Kjeldahl). No necesita catalizadores ni químicos tóxicos. Muchas muestras se pueden medir automáticamente. Es fácil de usar.

& # 9Desventajas: Alto costo inicial. No da una medida de la proteína verdadera, ya que todo el nitrógeno en los alimentos no está en forma de proteína. Las diferentes proteínas necesitan diferentes factores de corrección porque tienen diferentes secuencias de aminoácidos. El pequeño tamaño de la muestra dificulta la obtención de una muestra representativa.

6.2.3. Métodos que utilizan espectroscopia UV-visible

Se han ideado varios métodos para medir la concentración de proteínas, que se basan en espectroscopía UV-visible. Estos métodos utilizan la capacidad natural de las proteínas para absorber (o dispersar) la luz en la región UV visible del espectro electromagnético, o modifican química o físicamente las proteínas para hacerlas absorber (o dispersar) la luz en esta región. El principio básico detrás de cada una de estas pruebas es similar. En primer lugar, se prepara una curva de calibración de absorbancia (o turbidez) frente a la concentración de proteína utilizando una serie de soluciones de proteína de concentración conocida. La absorbancia (o turbidez) de la solución que se analiza se mide luego a la misma longitud de onda y se determina su concentración de proteína a partir de la curva de calibración. La principal diferencia entre las pruebas son los grupos químicos que son responsables de la absorción o dispersión de la radiación, por ejemplo, enlaces peptídicos, grupos laterales aromáticos, grupos básicos y proteínas agregadas.

& # 9 A continuación se destacan varios de los métodos UV-visible más utilizados para determinar el contenido de proteínas de los alimentos:

Medición directa a 280 nm

El triptófano y la tirosina absorben fuertemente la luz ultravioleta a 280 nm. El contenido de triptófano y tirosina de muchas proteínas permanece bastante constante, por lo que se puede utilizar la absorbancia de las soluciones de proteínas a 280 nm para determinar su concentración. Las ventajas de este método son que el procedimiento es sencillo de realizar, no es destructivo y no se requieren reactivos especiales. La principal desventaja es que los ácidos nucleicos también absorben fuertemente a 280 nm y, por lo tanto, podrían interferir con la medición de la proteína si están presentes en concentraciones suficientes. Aun así, se han desarrollado métodos para superar este problema, por ejemplo, midiendo la absorbancia en dos longitudes de onda diferentes.

Se produce un color violeta-violáceo cuando los iones cúpricos (Cu 2+) interactúan con los enlaces peptídicos en condiciones alcalinas. El reactivo de biuret, que contiene todos los productos químicos necesarios para realizar el análisis, se puede adquirir comercialmente. Se mezcla con una solución de proteína y luego se deja reposar durante 15-30 minutos antes de leer la absorbancia a 540 nm. La principal ventaja de esta técnica es que no hay interferencia de materiales que se adsorben en longitudes de onda más bajas, y la técnica es menos sensible al tipo de proteína porque utiliza la absorción que involucra enlaces peptídicos que son comunes a todas las proteínas, en lugar de grupos laterales específicos. Sin embargo, tiene una sensibilidad relativamente baja en comparación con otros métodos de UV visible.

El método de Lowry combina el reactivo de biuret con otro reactivo (el reactivo de fenol de Folin-Ciocalteau) que reacciona con residuos de tirosina y triptófano en las proteínas. Esto da un color azulado que se puede leer entre 500 y 750 nm, dependiendo de la sensibilidad requerida. Hay un pico pequeño alrededor de 500 nm que se puede usar para determinar concentraciones altas de proteína y un pico grande alrededor de 750 nm que se puede usar para determinar concentraciones bajas de proteína. Este método es más sensible a concentraciones bajas de proteínas que el método biuret.

Se añade un exceso conocido de un colorante cargado negativamente (aniónico) a una solución de proteína cuyo pH se ajusta para que las proteínas se carguen positivamente (es decir, & lt el punto isoeléctrico). Las proteínas forman un complejo insoluble con el tinte debido a la atracción electrostática entre las moléculas, pero el tinte no unido permanece soluble. El colorante aniónico se une a los grupos catiónicos de los residuos de aminoácidos básicos (histidina, arganina y lisina) y a los grupos amino terminales libres. La cantidad de tinte no unido que permanece en solución después de que se ha eliminado el complejo insoluble de proteína-tinte (por ejemplo, por centrifugación) se determina midiendo su absorbancia. La cantidad de proteína presente en la solución original es proporcional a la cantidad de tinte que se unió a ella: tinte unido = tinte inicial - sin tinte.

Las moléculas de proteína que normalmente son solubles en solución se pueden hacer precipitar mediante la adición de ciertos productos químicos, por ejemplo, ácido tricloroacético. La precipitación de proteínas hace que la solución se vuelva turbia. Por tanto, la concentración de proteína se puede determinar midiendo el grado de turbidez.

6.2.3.2. Ventajas y desventajas

& # 9Ventajas: Las técnicas de UV-visible son bastante rápidas y sencillas de realizar, y son sensibles a bajas concentraciones de proteínas.

& # 9Desventajas: Para la mayoría de las técnicas de UV-visible es necesario utilizar soluciones diluidas y transparentes, que no contienen sustancias contaminantes que absorben o dispersan la luz en la misma longitud de onda que la proteína que se analiza. La necesidad de soluciones transparentes significa que la mayoría de los alimentos deben someterse a cantidades significativas de preparación de muestras antes de que puedan ser analizados, por ejemplo, homogeneización, extracción con solvente, centrifugación, filtración, que pueden llevar mucho tiempo y ser laboriosos. Además, a veces es difícil extraer proteínas cuantitativamente de ciertos tipos de alimentos, especialmente después de que han sido procesados ​​para que las proteínas se agreguen o se unan covalentemente con otras sustancias. Además, la absorbancia depende del tipo de proteína analizada (diferentes proteínas tienen diferentes secuencias de aminoácidos).

6.2.4. Otras técnicas instrumentales

Existe una amplia variedad de diferentes métodos instrumentales disponibles para determinar el contenido total de proteínas de los materiales alimenticios. Estos se pueden dividir en tres categorías diferentes según sus principios fisicoquímicos: (i) medición de las propiedades físicas generales, (ii) medición de la adsorción de radiación y (iii) medición de la dispersión de la radiación. Cada método instrumental tiene sus propias ventajas y desventajas, y la variedad de alimentos a los que se puede aplicar.

Medición de propiedades físicas a granel

  • Densidad: la densidad de una proteína es mayor que la de la mayoría de los demás componentes de los alimentos, por lo que hay un aumento en la densidad de un alimento a medida que aumenta su contenido de proteínas. Por tanto, el contenido de proteínas de los alimentos se puede determinar midiendo su densidad.
  • Índice de refracción: el índice de refracción de una solución acuosa aumenta a medida que aumenta la concentración de proteína y, por lo tanto, las mediciones de RI pueden usarse para determinar el contenido de proteína.

Medición de la adsorción de radiación

  • UV-visible: la concentración de proteínas se puede determinar midiendo la absorbancia de la radiación ultravioleta-visible (ver arriba).
  • Infrarrojos: se pueden utilizar técnicas de infrarrojos para determinar la concentración de proteínas en muestras de alimentos. Las proteínas absorben los rayos infrarrojos de forma natural debido a las vibraciones características (estiramiento y flexión) de ciertos grupos químicos a lo largo de la columna vertebral del polipéptido. Las mediciones de la absorbancia de la radiación a determinadas longitudes de onda pueden, por tanto, utilizarse para cuantificar la concentración de proteína en la muestra. La IR es particularmente útil para el análisis rápido en línea del contenido de proteínas. También requiere poca preparación de muestras y no es destructivo. Sus principales desventajas son su alto costo inicial y la necesidad de una calibración extensa.
  • Resonancia Magnética Nuclear: La espectroscopia de RMN se puede utilizar para determinar la concentración de proteína total de los alimentos. El contenido de proteína se determina midiendo el área bajo un pico en un espectro de desplazamiento químico de RMN que corresponde a la fracción de proteína.

Medición de la dispersión de la radiación

  • Dispersión de luz: la concentración de agregados de proteína en solución acuosa se puede determinar usando técnicas de dispersión de luz porque la turbidez de una solución es directamente proporcional a la concentración de agregados presentes.
  • Dispersión ultrasónica: la concentración de agregados de proteínas también se puede determinar usando técnicas de dispersión ultrasónica porque la velocidad ultrasónica y la absorción de los ultrasonidos están relacionadas con la concentración de agregados de proteínas presentes.

6.2.4.2. Ventajas y desventajas

Varios de estos métodos instrumentales tienen ventajas importantes sobre las otras técnicas mencionadas anteriormente porque no son destructivas, requieren poca o ninguna preparación de la muestra y las mediciones son rápidas y precisas. Una de las principales desventajas de las técnicas que se basan en las mediciones de las propiedades físicas a granel de los alimentos es que se debe preparar una curva de calibración entre la propiedad física de interés y el contenido total de proteína, y esto puede depender del tipo de proteína presente y del alimento. matriz en la que está contenido. Además, las técnicas basadas en mediciones de propiedades fisicoquímicas a granel solo pueden usarse para analizar alimentos con composiciones relativamente simples. En un alimento que contiene muchos componentes diferentes cuya concentración puede variar, es difícil separar la contribución de la proteína a la medición general de la de los otros componentes.

6.2.5. Comparación de métodos

Como científicos de alimentos, a menudo podemos estar en una posición en la que tenemos que elegir una técnica particular para medir la concentración de proteínas de un alimento. ¿Cómo decidimos qué técnica es la más adecuada para nuestra aplicación particular? Lo primero que hay que determinar es para qué se utilizará la información. Si el análisis se va a realizar con fines oficiales, por ejemplo, requisitos legales o de etiquetado, es importante utilizar un método reconocido oficialmente. El método Kjeldahl, y cada vez más el método Dumas, han sido oficialmente aprobados para una amplia gama de aplicaciones alimentarias. Por el contrario, solo se han reconocido oficialmente un pequeño número de aplicaciones de la espectroscopia UV-visible.

& # 9 Para propósitos de control de calidad, a menudo es más útil tener mediciones rápidas y simples del contenido de proteína y, por lo tanto, las técnicas de IR son las más adecuadas. Para estudios fundamentales en el laboratorio, donde a menudo se analizan proteínas puras, a menudo se prefieren las técnicas espectroscópicas UV-visible porque dan mediciones rápidas y confiables y son sensibles a bajas concentraciones de proteína.

& # 9 Otros factores que pueden tener que considerarse son la cantidad de preparación de la muestra requerida, su sensibilidad y su velocidad. Los métodos Kjeldahl, Dumas e IR requieren muy poca preparación de la muestra. Una vez que se ha seleccionado una muestra representativa del alimento, normalmente se puede analizar directamente. Por otro lado, los diversos métodos de UV-visible requieren una preparación extensa de la muestra antes del análisis. La proteína debe extraerse del alimento en una solución transparente diluida, lo que generalmente implica procedimientos de homogeneización, extracción con solvente, filtración y centrifugación que requieren mucho tiempo. Además, puede resultar difícil aislar completamente algunas proteínas de los alimentos porque están fuertemente unidas a otros componentes. Las diversas técnicas también tienen diferentes sensibilidades, es decir, la concentración más baja de proteína que pueden detectar. Los métodos UV-visible son los más sensibles, pudiendo detectar concentraciones de proteínas tan bajas como 0,001% en peso. La sensibilidad de los métodos de Dumas, Kjeldahl e IR es de alrededor de 0,1% en peso. El tiempo requerido por análisis y el número de muestras que se pueden analizar simultáneamente también son factores importantes a considerar al decidir qué técnica analítica utilizar. Las técnicas de IR son capaces de un análisis rápido (& lt 1 minuto) de la concentración de proteínas una vez que se han calibrado. El moderno método instrumental Dumas está totalmente automatizado y puede medir la concentración de proteína de una muestra en menos de 5 minutos, en comparación con el método Kjeldahl, que tarda entre 30 minutos y 2 horas en realizarse. Los diversos métodos de UV-visible oscilan entre un par de minutos y una hora (dependiendo del tipo de tinte que se use y cuánto tiempo tarde en reaccionar), aunque tiene la ventaja de que se pueden analizar muchas muestras simultáneamente. No obstante, suele ser necesario realizar una preparación exhaustiva de la muestra antes del análisis para obtener una solución transparente. Otros factores que pueden ser importantes al seleccionar una técnica adecuada son: el equipo disponible, la facilidad de operación, la precisión deseada y si la técnica no es destructiva o no.

6.3. Separación y caracterización de proteínas

En la conferencia anterior, se discutieron las técnicas utilizadas para determinar la concentración total de proteína en un alimento. Los analistas de alimentos también suelen estar interesados ​​en el tipo de proteínas presentes en un alimento porque cada proteína tiene propiedades nutricionales y fisicoquímicas únicas. El tipo de proteína generalmente se determina separando y aislando las proteínas individuales de una mezcla compleja de proteínas, de modo que puedan identificarse y caracterizarse posteriormente. Las proteínas se separan sobre la base de diferencias en sus propiedades fisicoquímicas, tales como tamaño, carga, características de adsorción, solubilidad y estabilidad térmica. La elección de una técnica de separación adecuada depende de una serie de factores, incluidos los motivos para realizar el análisis, la cantidad de muestra disponible, la pureza deseada, el equipo disponible, el tipo de proteínas presentes y el coste. Los métodos a gran escala están disponibles para aislamientos crudos de grandes cantidades de proteínas, mientras que los métodos a pequeña escala están disponibles para proteínas que son caras o solo están disponibles en pequeñas cantidades. Uno de los factores que deben tenerse en cuenta durante el procedimiento de separación es la posibilidad de que se altere la estructura tridimensional nativa de las moléculas de proteína.

Un conocimiento previo de los efectos de las condiciones ambientales sobre la estructura y las interacciones de las proteínas es de gran utilidad a la hora de seleccionar la técnica de separación más adecuada. En primer lugar, porque ayuda a determinar las condiciones más adecuadas para aislar una proteína en particular de una mezcla de proteínas (p. Ej., PH, fuerza iónica, disolvente, temperatura, etc.) y, en segundo lugar, porque puede ser importante elegir las condiciones que no afectar negativamente a la estructura molecular de las proteínas.

6.3.1. Métodos basados ​​en diferentes características de solubilidad

Las proteínas se pueden separar aprovechando las diferencias en su solubilidad en soluciones acuosas. La solubilidad de una molécula de proteína está determinada por su secuencia de aminoácidos porque esta determina su tamaño, forma, hidrofobicidad y carga eléctrica. Las proteínas se pueden precipitar o solubilizar selectivamente alterando el pH, la fuerza iónica, la constante dieléctrica o la temperatura de una solución. Estas técnicas de separación son las más sencillas de usar cuando se trata de grandes cantidades de muestra, porque son relativamente rápidas, económicas y no están particularmente influenciadas por otros componentes alimentarios. A menudo se utilizan como primer paso en cualquier procedimiento de separación porque la mayoría de los materiales contaminantes se pueden eliminar fácilmente.

Las proteínas se precipitan a partir de soluciones acuosas cuando la concentración de sal excede un nivel crítico, lo que se conoce como salificación, porque toda el agua está "unida" a las sales y, por lo tanto, no está disponible para hidratar las proteínas. El sulfato de amonio [(NH 4) 2 SO 4] se usa comúnmente porque tiene una alta solubilidad en agua, aunque también se pueden usar otras sales neutras, por ejemplo, NaCl o KCl. Generalmente se usa un procedimiento de dos pasos para maximizar la eficiencia de la separación. En el primer paso, la sal se agrega a una concentración justo por debajo de la necesaria para precipitar la proteína de interés. Luego, la solución se centrifuga para eliminar cualquier proteína que sea menos soluble que la proteína de interés. Luego, la concentración de sal se aumenta hasta un punto justo por encima del requerido para provocar la precipitación de la proteína. Esto precipita la proteína de interés (que puede separarse mediante centrifugación), pero deja proteínas más solubles en solución. El principal problema de este método es que grandes concentraciones de sal contaminan la solución, que debe eliminarse antes de que la proteína pueda resolubilizarse, por ejemplo, mediante diálisis o ultrafiltración.

El punto isoeléctrico (pI) de una proteína es el pH donde la carga neta de la proteína es cero. Las proteínas tienden a agregarse y precipitarse en su pI porque no hay repulsión electrostática que las separe. Las proteínas tienen diferentes puntos isoeléctricos debido a sus diferentes secuencias de aminoácidos (es decir, números relativos de grupos aniónicos y catiónicos) y, por lo tanto, pueden separarse ajustando el pH de una solución. Cuando el pH se ajusta al pI de una proteína en particular, precipita dejando las otras proteínas en solución.

La solubilidad de una proteína depende de la constante dieléctrica de la solución que la rodea porque esta altera la magnitud de las interacciones electrostáticas entre grupos cargados. A medida que disminuye la constante dieléctrica de una solución, aumenta la magnitud de las interacciones electrostáticas entre especies cargadas. Esto tiende a disminuir la solubilidad de las proteínas en solución porque están menos ionizadas y, por lo tanto, la repulsión electrostática entre ellas no es suficiente para evitar que se agreguen. La constante dieléctrica de las soluciones acuosas se puede reducir añadiendo disolventes orgánicos solubles en agua, como etanol o acetona. La cantidad de disolvente orgánico necesaria para provocar la precipitación depende de la proteína y, por tanto, las proteínas se pueden separar sobre esta base. La cantidad óptima de disolvente orgánico necesaria para precipitar una proteína varía de aproximadamente un 5 a un 60%. El fraccionamiento de solventes generalmente se realiza a 0 o C o menos para evitar la desnaturalización de las proteínas causada por los aumentos de temperatura que ocurren cuando los solventes orgánicos se mezclan con agua.

Desnaturalización de proteínas contaminantes

Muchas proteínas se desnaturalizan y precipitan de la solución cuando se calientan por encima de una cierta temperatura o al ajustar una solución a pH muy ácidos o básicos. Las proteínas que son estables a alta temperatura o en extremos de pH se separan más fácilmente mediante esta técnica porque las proteínas contaminantes pueden precipitarse mientras la proteína de interés permanece en solución.

6.3.2. Separación debido a diferentes características de adsorción

La cromatografía de adsorción implica la separación de compuestos mediante adsorción-desorción selectiva en una matriz sólida que está contenida dentro de una columna a través de la cual pasa la mezcla. La separación se basa en las diferentes afinidades de diferentes proteínas por la matriz sólida. La cromatografía de afinidad y de intercambio iónico son los dos tipos principales de cromatografía de adsorción que se utilizan habitualmente para la separación de proteínas. La separación se puede llevar a cabo utilizando una columna abierta o cromatografía líquida de alta presión.

Cromatografía de intercambio de iones

La cromatografía de intercambio iónico se basa en la adsorción-desorción reversible de iones en solución a una matriz sólida cargada o red polimérica. Esta técnica es la técnica cromatográfica más utilizada para la separación de proteínas. Una matriz cargada positivamente se llama intercambiador de aniones porque se une a iones cargados negativamente (aniones). Una matriz cargada negativamente se llama intercambiador de iones cat porque se une a iones cargados positivamente (cationes). Las condiciones del tampón (pH y fuerza iónica) se ajustan para favorecer la unión máxima de la proteína de interés a la columna de intercambio iónico. Las proteínas contaminantes se unen con menos fuerza y, por lo tanto, pasan más rápidamente a través de la columna. A continuación, la proteína de interés se eluye utilizando otra solución tampón que favorezca su desorción de la columna (por ejemplo, diferente pH o fuerza iónica).

La cromatografía de afinidad utiliza una fase estacionaria que consiste en un ligando unido covalentemente a un soporte sólido. El ligando es una molécula que tiene una afinidad reversible única y muy específica por una proteína en particular. La muestra a analizar se pasa por la columna y la proteína de interés se une al ligando, mientras que las proteínas contaminantes la atraviesan directamente. A continuación, se eluye la proteína de interés mediante una solución tampón que favorece su desorción de la columna. Esta técnica es el medio más eficaz de separar una proteína individual de una mezcla de proteínas, pero es la más cara, debido a la necesidad de tener columnas con ligandos específicos unidos a ellas.

Tanto la cromatografía de intercambio iónico como la de afinidad se utilizan comúnmente para separar proteínas y aminoácidos en el laboratorio. Se utilizan con menos frecuencia para separaciones comerciales porque no son adecuados para separar rápidamente grandes volúmenes y son relativamente caros.

6.3.3. Separación debido a diferencias de tamaño

Las proteínas también se pueden separar según su tamaño. Normalmente, los pesos moleculares de las proteínas varían de aproximadamente 10.000 a 1.000.000 de dalton. En la práctica, la separación depende del radio de Stokes de una proteína, más que directamente de su peso molecular. El radio de Stokes es el radio promedio que tiene una proteína en solución y depende de su estructura molecular tridimensional. Para proteínas con el mismo peso molecular, el radio de Stokes aumenta en el siguiente orden: proteína globular compacta & lt flexible de espiral aleatoria & lt proteína en forma de varilla.

La diálisis se utiliza para separar moléculas en solución mediante el uso de membranas semipermeables que permiten el paso de moléculas más pequeñas que un cierto tamaño, pero impiden el paso de moléculas más grandes. Se coloca una solución de proteína en un tubo de diálisis que se sella y se coloca en un gran volumen de agua o tampón que se agita lentamente. Los solutos de bajo peso molecular fluyen a través de la bolsa, pero las moléculas de proteína de gran peso molecular permanecen en la bolsa. La diálisis es un método relativamente lento, que tarda hasta 12 horas en completarse. Por tanto, se utiliza con mayor frecuencia en el laboratorio. La diálisis se usa a menudo para eliminar la sal de las soluciones de proteínas después de que se han separado mediante la salazón y para cambiar los tampones.

Se coloca una solución de proteína en una celda que contiene una membrana semipermeable y se aplica presión. Las moléculas más pequeñas pasan a través de la membrana, mientras que las moléculas más grandes permanecen en la solución. El principio de separación de esta técnica es, por tanto, similar a la diálisis, pero debido a que se aplica presión, la separación es mucho más rápida. Se encuentran disponibles membranas semipermeables con puntos de corte entre aproximadamente 500 y 300.000. La parte de la solución que retiene la célula (moléculas grandes) se denomina retenido, mientras que la parte que atraviesa la membrana (moléculas pequeñas) forma parte del ultrafiltrado. La ultrafiltración se puede utilizar para concentrar una solución de proteína, eliminar sales, intercambiar tampones o fraccionar proteínas en función de su tamaño. Las unidades de ultrafiltración se utilizan en el laboratorio y a escala comercial.

Cromatografía de exclusión por tamaño

Esta técnica, a veces conocida como filtración en gel, también separa las proteínas según su tamaño. Se vierte una solución de proteína en una columna que se empaqueta con perlas porosas hechas de un material polimérico reticulado (como dextrano o agarosa). Las moléculas más grandes que los poros de las perlas se excluyen y se mueven rápidamente a través de la columna, mientras que el movimiento de las moléculas que entran en los poros se retarda. Por tanto, las moléculas se eluyen de la columna en orden de tamaño decreciente. Se encuentran disponibles perlas de diferente tamaño medio de poro para separar proteínas de diferentes pesos moleculares. Los fabricantes de estas perlas proporcionan información sobre el rango de peso molecular que son más adecuados para separar. Los pesos moleculares de proteínas desconocidas pueden determinarse comparando sus volúmenes de elución Vo, con los determinados utilizando proteínas de peso molecular conocido: una gráfica del volumen de elución frente al log (peso molecular) debería dar una línea recta. Un problema con este método es que el peso molecular no está directamente relacionado con el radio de Stokes para proteínas de diferentes formas.

6.3.4. Separación por electroforesis

La electroforesis se basa en las diferencias en la migración de moléculas cargadas en una solución cuando se aplica un campo eléctrico a través de ella. Se puede utilizar para separar proteínas en función de su tamaño, forma o carga.

En la electroforesis no desnaturalizante, se vierte una solución tamponada de proteínas nativas sobre un gel poroso (generalmente poliacrilamida, almidón o agarosa) y se aplica un voltaje a través del gel. Las proteínas se mueven a través del gel en una dirección que depende del signo de su carga, y a una velocidad que depende de la magnitud de la carga y la fricción de su movimiento:

Las proteínas pueden estar cargadas positiva o negativamente en solución dependiendo de sus puntos isoeleécticos (pI) y el pH de la solución. Una proteína se carga negativamente si el pH está por encima del pI y se carga positivamente si el pH está por debajo del pI. La magnitud de la carga y el voltaje aplicado determinarán qué tan lejos migran las proteínas en un tiempo determinado. Cuanto mayor sea el voltaje o la carga de la proteína, más se moverá. La fricción de una molécula es una medida de su resistencia al movimiento a través del gel y está determinada en gran medida por la relación entre el tamaño efectivo de la molécula y el tamaño de los poros del gel. Cuanto menor sea el tamaño de la molécula, o mayor sea el tamaño de los poros en el gel, menor será la resistencia y, por lo tanto, más rápido se moverá una molécula a través del gel. Los geles con diferentes porosidades se pueden comprar a proveedores de productos químicos o se pueden preparar en el laboratorio. Los tamaños de poros más pequeños se obtienen utilizando una mayor concentración de reactivo de reticulación para formar el gel. Los geles pueden estar contenidos entre dos placas paralelas o en tubos cilíndricos. En la electroforesis no desnaturalizante, las proteínas nativas se separan basándose en una combinación de su carga, tamaño y forma.

En la electroforesis desnaturalizante, las proteínas se separan principalmente por su peso molecular. Las proteínas se desnaturalizan antes del análisis mezclándolas con mercaptoetanol, que rompe los enlaces disulfuro, y dodecil sulfato de sodio (SDS), que es un surfactante aniónico que se une hidrofóbicamente a las moléculas de proteína y hace que se desplieguen debido a la repulsión entre el surfactante cargado negativamente. grupos de cabeza. Cada molécula de proteína se une aproximadamente a la misma cantidad de SDS por unidad de longitud. Por tanto, la carga por unidad de longitud y la conformación molecular es aproximadamente similar para todas las proteínas. A medida que las proteínas viajan a través de una red de gel, se separan principalmente en función de su peso molecular porque su movimiento depende del tamaño de la molécula de proteína en relación con el tamaño de los poros del gel: las proteínas más pequeñas se mueven más rápidamente a través de la matriz que las más grandes. moléculas. Este tipo de electroforesis se denomina comúnmente electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato de sodio, o SDS-PAGE.

Para determinar qué tan lejos se han movido las proteínas, se agrega un tinte de seguimiento a la solución de proteína, por ejemplo, azul de bromofenol. Este tinte es una pequeña molécula cargada que migra por delante de las proteínas. Una vez completada la electroforesis, las proteínas se hacen visibles tratando el gel con un tinte proteico como Coomassie Brilliant Blue o tinción plateada. Se calcula la movilidad relativa de cada banda de proteína:

La electroforesis se utiliza a menudo para determinar la composición proteica de los productos alimenticios. La proteína se extrae de los alimentos en una solución, que luego se separa mediante electroforesis. SDS-PAGE se utiliza para determinar el peso molecular de una proteína midiendo R m, y luego comparándolo con una curva de calibración producida usando proteínas de peso molecular conocido: un gráfico de log (peso molecular) contra la movilidad relativa suele ser lineal. La electroforesis desnaturalizante es más útil para determinar los pesos moleculares que la electroforesis no desnaturalizante, porque la fricción con el movimiento no depende de la forma o carga original de las moléculas de proteína.

Electroforesis de enfoque isoeléctrico

Esta técnica es una modificación de la electroforesis, en la que las proteínas se separan mediante carga en una matriz de gel que tiene un gradiente de pH a través de ella. Las proteínas migran a la ubicación donde el pH es igual a su punto isoeléctrico y luego dejan de moverse porque ya no están cargadas. Este método tiene una de las resoluciones más altas de todas las técnicas utilizadas para separar proteínas. Hay geles disponibles que cubren un rango de pH estrecho (2-3 unidades) o un rango de pH amplio (3-10 unidades) y, por lo tanto, se debe seleccionar el gel que sea más adecuado para las proteínas que se separan.

Electroforesis bidimensional

El enfoque isoeléctrico y SDS-PAGE se pueden usar juntos para mejorar la resolución de mezclas de proteínas complejas. Las proteínas se separan en una dirección sobre la base de la carga usando enfoque isoeléctrico, y luego en una dirección perpendicular sobre la base del tamaño usando SDS-PAGE.


F4. Interacciones hidrofóbicas: Introducción

  • Contribuido por Henry Jakubowski
  • Profesor (Química) en College of St. Benedict / St. Universidad de San Juan

Hemos estudiado el papel del efecto hidrófobo (que implica la liberación entrópica favorable de las moléculas de agua enjauladas sobre los grupos hidrófobos expuestos al disolvente) en la conducción de la formación de micelas y bicapas. ¿Esto también impulsa el plegamiento de proteínas? Para explorar estas preguntas, estudiaremos la termodinámica de pequeñas moléculas no polares, especialmente benceno, con agua y preguntaremos si los parámetros termodinámicos asociados con la solubilidad del benceno son similares a los asociados con la estabilidad de las proteínas. Si esta analogía se mantiene, cualquier cosa que promueva la solubilidad del benceno conducirá a una mayor exposición de la cadena lateral de aminoácidos hidrófobos al agua y, por lo tanto, a la desnaturalización de las proteínas. ¿Cuál es la evidencia para apoyar esto?

una. Estructuras cristalinas: estas estructuras muestran que la mayoría de las cadenas laterales no polares están enterradas dentro de una proteína, que está compactada y excluye el agua. Los estudios muestran que a medida que aumenta el área de superficie de las cadenas laterales de aminoácidos, la energía libre de transferencia de aminoácidos del agua al etanol se vuelve más negativa.

Figura: Transferencia de aminoácidos del agua.

(Repase las energías libres de transferencia de grupos hidrófobos en el Capítulo 1D: Lípidos en el agua - Termodinámica)

B. desnaturalización de proteínas a baja temperatura: se ha observado que las proteínas pueden desnaturalizarse a bajas temperaturas (menos de 0oC), lo que sugiere que los residuos no polares se vuelven más solubles en agua a bajas temperaturas (es decir, se mueven desde el interior más hidrofóbico de una proteína al más polar exterior). Compare la solubilidad de gases no polares como CO2 o N2, que son más solubles a baja temperatura. A medida que calienta soluciones de gases no polares en agua, los gases se vuelven menos solubles como lo demuestra la formación de burbujas (es decir, separación de fases de los gases disueltos a medida que se vuelven más insolubles). Si el comportamiento de las proteínas se rige por este mismo comportamiento (mayor solubilidad de los grupos apolares a bajas temperaturas), sugeriría que las proteínas podrían desnaturalizarse a bajas temperaturas (lo que lleva a una mayor exposición al agua de las cadenas laterales no polares). Este fenómeno se ha observado.

C. estabilidad de la proteína afectada por diferentes especies de sal - Hace más de 100 años, Hofmeister determinó la efectividad de diferentes cationes y aniones de sales para precipitar proteínas del suero sanguíneo en los rangos de concentración de 0.01 - 1 M. La serie se muestra a continuación:

NH4 + & gt K + & gt Na + & gt Li + & gt Mg2 + & gt Ca2 + & gt guanidinio

SO42- & gt HPO42- & gt acetato & gt citrato & gt Cl- & gt NO3- & gt ClO3- & gt I- & gt ClO4- & gt SCN-

  • Una sal de pares de los primeros iones de esta serie (por ejemplo, (NH4) 2SO4), cuando se agrega a soluciones acuosas de proteínas, precipita la forma nativa de la proteína. Debemos tener en cuenta el hecho de que precipita la proteína y que la proteína se precipita en el estado nativo, no desnaturalizado. Más sobre por qué precipita proteínas en un momento. El primer ion de cada serie aumenta la tensión superficial del agua (lo que dificulta la creación de una cavidad en el agua para que se ajuste a la molécula apolar). Esto disminuye la solubilidad de las moléculas apolares. Estas moléculas no polares eliminan la sal y no promueven la disolución en agua sino la agregación seguida de una separación de fases. Por analogía, estabilizarán el estado nativo ya que las cadenas laterales hidrófobas enterradas tendrían una menor propensión a moverse hacia el entorno acuoso.
  • Los últimos iones de la serie tienen menos efecto sobre la tensión superficial y, por lo tanto, aumentan la solubilidad de las moléculas no polares (& quotsalt-in & quot). Por analogía, desestabilizarán el estado nativo ya que las cadenas laterales hidrófobas enterradas tendrían una mayor propensión a moverse hacia el entorno acuoso.
  • Serie Hofmeister

La solubilidad del benceno en soluciones salinas acuosas de esta serie aumenta de izquierda a derecha, al igual que la estabilidad de la proteína nativa disminuye de izquierda a derecha (es decir, los residuos del núcleo no polar de la proteína se vuelven más solubles en agua, lo que lleva a su desnaturalización).

D. conservación de los residuos del núcleo hidrófobo: estos residuos están muy conservados y se correlacionan con la estructura.

mi. La urea desnaturaliza las proteínas. Otro aditivo, la urea, se utiliza a menudo en altas concentraciones para desnaturalizar las proteínas. La gente solía pensar que la urea competía con los enlaces H intracadena y, por lo tanto, desenredaba la proteína. Los argumentos anteriores con los enlaces H cuestionan esta afirmación, ya que el agua debería desnaturalizar las proteínas. ¿Cómo desnaturaliza la urea las proteínas? Se ha demostrado que la energía libre de transferencia de los aminoácidos no polares en urea 8M aumenta negativamente a medida que las cadenas laterales se hacen más grandes y menos polares.

Figura: Energía libre de transferencia de los aminoácidos apolares en urea 8 M

Esto también es válido para la desnaturalización por hidrocloruro de guanidina. La urea también aumenta la solubilidad de las moléculas apolares de manera proporcional a su área superficial.


Características físicas del detergente

La concentración a la que comienzan a formarse las micelas es la concentración crítica de micelas (CMC). La CMC es la concentración máxima de monómeros y constituye una medida de la energía libre de formación de micelas. Cuanto menor es la CMC, más estable es la micela y más lentamente se incorporan o eliminan las moléculas de la micela. La estructura de la región hidrófoba del detergente puede afectar la estructura de la micela. Un aumento en la longitud de la cadena de hidrocarburos hidrófobos de los detergentes iónicos da como resultado un mayor tamaño de las micelas y una menor CMC, ya que se necesitan menos moléculas para construir una micela.

El número medio de monómeros en una micela es el número de agregación. Los valores de CMC y del número de agregación dependen en gran medida de factores como la temperatura, el pH, la fuerza iónica y la homogeneidad y pureza del detergente. Las discrepancias leves en los valores informados para CMC y el número de agregación pueden ser el resultado de variaciones en los métodos analíticos utilizados para determinar los valores. Los valores del número de agregación también se modifican según la concentración, ya que el número de moléculas de detergente por micela puede aumentar si la concentración está por encima de la CMC.

La facilidad de remoción o cambio es un factor importante en la selección de un detergente. Algunos de los métodos de eliminación de detergente más comunes incluyen:

  • Diálisis
  • Cromatografía de filtración en gel
  • Cromatografía de adsorción hidrofóbica
  • Precipitación de proteínas

El valor de CMC asociado con el detergente es una guía útil para determinar la fuerza de unión hidrófoba. Los detergentes con valores de CMC más altos tienen una unión más débil y, posteriormente, son más fáciles de eliminar mediante diálisis o métodos de desplazamiento. Los detergentes con valores bajos de CMC requieren menos detergente para formar micelas y solubilizar proteínas o lípidos.

Otro parámetro útil a la hora de evaluar detergentes para su eliminación aguas abajo es el peso molecular de la micela, que indica el tamaño relativo de las micelas. Las micelas más pequeñas se eliminan más fácilmente y normalmente son deseables cuando los complejos proteína-detergente deben separarse basándose en el tamaño molecular de la proteína. El peso molecular de la micela se puede calcular multiplicando el número de agregación por el peso molecular del monómero.

los Punto de nube es la temperatura a la que la solución de detergente cerca o por encima de su CMC se separa en dos fases. Las micelas se agregan, formando típicamente una fase turbia con alta concentración de detergente, mientras que el resto de la solución se agota en detergente. La solución de dos fases resultante se puede separar, con la proteína extraída ubicada en la fase rica en detergente. Detergentes con temperaturas de punto de enturbiamiento bajas, como TRITON ® X-114 (punto de enturbiamiento

23 ° C) se recomiendan para su uso con proteínas, ya que las temperaturas elevadas del punto de enturbiamiento pueden desnaturalizar las proteínas solubilizadas. El punto de enturbiamiento puede verse afectado por cambios en la concentración de detergente, la temperatura y la adición de sal o polímeros como dextrano y polietilenglicol. Tenga en cuenta que la fase rica en detergente también depende del detergente (s) específico (s) y la concentración de sal. En algunas condiciones, la fase puede ser transparente en lugar de turbia y estar ubicada como la fase superior o inferior de la solución. En detergentes no iónicos, este comportamiento se ha aplicado en la separación de fases y purificación de proteínas de membrana. 2


Coexpresión de chaperones y / o foldases.

Dos clases de proteínas juegan un papel importante en en vivo plegamiento de proteínas.

  • Chaperones moleculares promover la isomerización adecuada y el direccionamiento celular mediante la interacción transitoria con intermedios de plegamiento. El mejor caracterizado E. coli los sistemas son:
    • GroES-GroEL
    • DnaK-DnaJ-GrpE
    • ClpB
    • peptidil prolilo cis / trans isomerasasPPI's)
    • disulfuro oxidorreductasaDsbA) y disulfuro isomerasa (DsbC)
    • proteína disulfuro isomerasa (PDI) - una proteína eucariota que cataliza tanto la oxidación de la cisteína de la proteína como la isomerización del enlace disulfuro. También exhibe actividad de acompañante.

    La coexpresión de una o más de estas proteínas con la proteína diana podría conducir a niveles más altos de proteína soluble. Los niveles de coexpresión de las diferentes acompañantes / foldasas deben optimizarse para cada caso individual. DsbA y DsbC también han mostrado efectos positivos sobre los niveles de expresión cuando se utilizan como socios de fusión.


    El efecto hidrofóbico y su papel en la desnaturalización en frío ☆

    El efecto hidrofóbico se considera la principal fuerza impulsora del plegamiento de proteínas y juega un papel importante en la estabilidad de esas biomoléculas. La desnaturalización en frío, en la que el estado nativo de la proteína pierde su estabilidad al enfriarse, también se atribuye a este efecto. Por lo tanto, no es de extrañar que se haya realizado un gran esfuerzo para comprender este fenómeno. A pesar de estos esfuerzos, quedan muchos aspectos fundamentales sin resolver. En este artículo revisamos y resumimos la termodinámica de las proteínas, el efecto hidrofóbico y la desnaturalización en frío. Comenzamos por dar cuenta de estos fenómenos macroscópicamente y luego pasamos a su descripción a nivel atómico. Esperamos que esta revisión ayude al lector a comprender el papel que desempeña el efecto hidrofóbico en la desnaturalización en frío.


    Contenido

    Muchos dispositivos y productos médicos entran en contacto con las superficies internas del cuerpo, como implantes y herramientas quirúrgicas. Cuando un material no nativo ingresa al cuerpo, tiene lugar el primer paso de la respuesta inmune y la matriz extracelular del huésped y las proteínas plasmáticas se agregan al material en un intento de contener, neutralizar o aislar el agente dañino. [1] Estas proteínas pueden facilitar la unión de varios tipos de células, como osteoblastos y fibroblastos, que pueden estimular la reparación de tejidos. [2] Llevando esto un paso más allá, los dispositivos implantables pueden recubrirse con un material bioactivo para estimular la adsorción de proteínas específicas, la formación de cápsulas fibrosas y la cicatrización de heridas. Esto reduciría el riesgo de rechazo del implante y aceleraría la recuperación al seleccionar las proteínas y células necesarias para la endotelización. Después de la formación del endotelio, el cuerpo ya no estará expuesto al material extraño y detendrá la respuesta inmune.

    Las proteínas como el colágeno o la fibrina a menudo sirven como andamios para la adhesión celular y el crecimiento celular. Esta es una parte integral de la integridad estructural de las hojas de células y su diferenciación en estructuras de órganos y tejidos más complejas. Las propiedades de adhesión de las proteínas a superficies no biológicas influyen en gran medida en si las células pueden unirse indirectamente a ellas a través de andamios. Un implante como un reemplazo de vástago de cadera necesita integración con los tejidos del huésped, y la adsorción de proteínas facilita esta integración.

    Las herramientas quirúrgicas pueden diseñarse para esterilizarse más fácilmente, de modo que las proteínas no queden adsorbidas en una superficie, con riesgo de contaminación cruzada. Algunas enfermedades como la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob y el kuru (ambas relacionadas con la enfermedad de las vacas locas) son causadas por la transmisión de priones, que son formas errantes o mal plegadas de una proteína normalmente nativa. Las herramientas quirúrgicas contaminadas con priones requieren un método especial de esterilización para erradicar por completo todos los oligoelementos de la proteína mal plegada, ya que son resistentes a muchos de los métodos de limpieza normalmente utilizados.

    Sin embargo, en algunos casos, la adsorción de proteínas a biomateriales puede ser un evento extremadamente desfavorable. La adhesión de factores de coagulación puede inducir trombosis, lo que puede provocar un accidente cerebrovascular u otros bloqueos. [3] Algunos dispositivos están destinados a interactuar con el entorno interno del cuerpo, como sensores o vehículos de administración de fármacos, y la adsorción de proteínas obstaculizaría su eficacia.

    Las proteínas son biomoléculas compuestas por subunidades de aminoácidos. Cada aminoácido tiene una cadena lateral que gana o pierde carga según el pH del entorno circundante, así como sus propias cualidades polares / no polares individuales. [4]

    Las regiones cargadas pueden contribuir en gran medida a cómo esa proteína interactúa con otras moléculas y superficies, así como con su propia estructura terciaria (plegamiento de proteínas). Como resultado de su hidrofilia, los aminoácidos cargados tienden a ubicarse en el exterior de las proteínas, donde pueden interactuar con las superficies. [5] Es la combinación única de aminoácidos que le da a una proteína sus propiedades. En términos de química de superficie, la adsorción de proteínas es un fenómeno crítico que describe la agregación de estas moléculas en el exterior de un material. La tendencia de las proteínas a permanecer adheridas a una superficie depende en gran medida de las propiedades del material, como la energía superficial, la textura y la distribución de carga relativa. Es más probable que las proteínas más grandes se adsorban y permanezcan unidas a una superficie debido al mayor número de sitios de contacto entre los aminoácidos y la superficie (Figura 1).

    Energía de la adsorción de proteínas Editar

    La idea fundamental detrás de la adsorción espontánea de proteínas es que la adsorción ocurre cuando se libera más energía de la que se gana según la ley de Gibbs de energía libre.

    Esto se ve en la ecuación:

    • anuncios es el cambio neto de los parámetros
    • GRAMO es la energía libre de Gibbs
    • T es la temperatura (unidad SI: kelvin)
    • S es la entropía (unidad SI: julio por kelvin)
    • H es la entalpía (unidad SI: julio)

    Para que la adsorción de proteínas se produzca de forma espontánea, anunciosGRAMO debe ser un número negativo.

    Efecto Vroman Editar

    Las proteínas y otras moléculas compiten constantemente entre sí por los sitios de unión en una superficie. El efecto Vroman, desarrollado por Leo Vroman, postula que las moléculas pequeñas y abundantes serán las primeras en revestir una superficie. Sin embargo, con el tiempo, las moléculas con mayor afinidad por esa superficie en particular las reemplazarán. Esto se ve a menudo en materiales que entran en contacto con la sangre donde la fibrina, que generalmente es abundante, se unirá primero a la superficie y, con el tiempo, será reemplazada por proteínas más grandes. [6]

    Tasa de adsorción Editar

    Para que las proteínas se adsorban, primero deben entrar en contacto con la superficie a través de uno o más de estos principales mecanismos de transporte: difusión, convección térmica, flujo masivo o una combinación de los mismos. Al considerar el transporte de proteínas, está claro cómo los gradientes de concentración, la temperatura, el tamaño de la proteína y la velocidad de flujo influirán en la llegada de las proteínas a una superficie sólida. En condiciones de flujo bajo y gradientes de temperatura mínimos, la tasa de adsorción se puede modelar a partir de la ecuación de la tasa de difusión. [5]

    Ecuación de la tasa de difusión Editar

    • D es el coeficiente de difusión
    • norte es la concentración superficial de proteína
    • Co es la concentración mayoritaria de proteínas
    • t es hora

    Una concentración de volumen más alta y / o un coeficiente de difusión más alto (inversamente proporcional al tamaño molecular) dan como resultado un mayor número de moléculas que llegan a la superficie. Las consiguientes interacciones de la superficie de la proteína dan como resultado altas concentraciones locales de proteína adsorbida, alcanzando concentraciones de hasta 1000 veces más altas que en la solución a granel. [5] Sin embargo, el cuerpo es mucho más complejo, contiene flujo y difusión convectiva, y estos deben ser considerados en la tasa de adsorción de proteínas.

    Fluir en un canal delgado Editar

    • C es la concentración
    • D es el coeficiente de difusión
    • V es la velocidad del flujo
    • X es la distancia por el canal
    • γ es la tasa de corte de la pared
    • B es la altura del canal

    Esta ecuación [5] es especialmente aplicable para analizar la adsorción de proteínas a dispositivos biomédicos en arterias, p. Ej. stents.

    Las cuatro clases fundamentales de fuerzas e interacción en la adsorción de proteínas son: 1) interacción iónica o electrostática, 2) enlace de hidrógeno, 3) interacción hidrofóbica (principalmente impulsada por entropía), y 4) interacciones de transferencia de carga o tipo donante / aceptor de electrones de partículas . [7]

    Interacciones iónicas o electrostáticas Editar

    La carga de las proteínas está determinada por el pKa de sus cadenas laterales de aminoácidos y el aminoácido terminal y el ácido carboxílico. Las proteínas con punto isoeléctrico (pI) por encima de las condiciones fisiológicas tienen una carga positiva y las proteínas con pI por debajo de las condiciones fisiológicas tienen una carga negativa. La carga neta de la proteína, determinada por la carga total de sus constituyentes, da como resultado una migración electroforética en un campo eléctrico fisiológico. Estos efectos son de corto alcance debido a la alta constante dieléctrica del agua; sin embargo, una vez que la proteína está cerca de una superficie cargada, el acoplamiento electrostático se convierte en la fuerza dominante. [8]

    Enlace de hidrógeno Editar

    El agua tiene tanta propensión a formar enlaces de hidrógeno como cualquier grupo en un polipéptido. Durante un proceso de plegamiento y asociación, los grupos de péptidos y aminoácidos intercambian enlaces de hidrógeno con agua. Por tanto, el enlace de hidrógeno no tiene un fuerte efecto estabilizador sobre la adsorción de proteínas en un medio acuoso. [9]

    Ilustración de dos moléculas de agua que interactúan para formar un enlace de hidrógeno

    Interacciones hidrofóbicas Editar

    Las interacciones hidrofóbicas son esencialmente interacciones entrópicas debido básicamente a fenómenos de orden / desorden en un medio acuoso. La energía libre asociada con la minimización de las áreas interfaciales es responsable de minimizar la superficie de las gotas de agua y las burbujas de aire en el agua. Este mismo principio es la razón por la que las cadenas laterales de aminoácidos hidrófobos se orientan lejos del agua, minimizando su interacción con el agua. Los grupos hidrófilos en el exterior de la molécula dan como resultado la solubilidad en agua de las proteínas. La caracterización de este fenómeno se puede realizar tratando estas relaciones hidrófobas con conceptos de energía libre interfacial. En consecuencia, se puede pensar en la fuerza impulsora de estas interacciones como la minimización de la energía libre interfacial total, es decir, la minimización del área de superficie. [10]

    Interacciones de carga y transferencia Editar

    Las interacciones carga-transferencia también son importantes en la estabilización de proteínas y la interacción de la superficie. En los procesos generales de donante-aceptor, se puede pensar en la presencia de un exceso de densidad de electrones que se puede donar a una especie electrófila. En medios acuosos, estas interacciones de solutos se deben principalmente a los efectos de los electrones orbitales pi. [11]

    Editar temperatura

    La temperatura tiene un efecto tanto en el estado de equilibrio como en la cinética de la adsorción de proteínas. La cantidad de proteína adsorbida a alta temperatura suele ser más alta que a temperatura ambiente. La variación de temperatura provoca cambios conformacionales en la proteína que influyen en la adsorción. Estos reordenamientos conformacionales en las proteínas dan como resultado una ganancia de entropía que actúa como una fuerza impulsora principal para la adsorción de proteínas. El efecto de la temperatura sobre la adsorción de proteínas se puede ver en los procesos de fabricación de alimentos, especialmente en alimentos líquidos como la leche, lo que provoca un fuerte ensuciamiento en las superficies de las paredes de los equipos donde se realiza el tratamiento térmico. [12] [13]

    Fuerza iónica Editar

    La fuerza iónica determina la longitud de Debye que se correlaciona con la distancia de amortiguación del potencial eléctrico de una carga fija en un electrolito. Entonces, cuanto mayor es la fuerza iónica, más cortas son las interacciones electrostáticas entre entidades cargadas. Como resultado, se dificulta la adsorción de proteínas cargadas a sustratos cargados de manera opuesta, mientras que se mejora la adsorción a sustratos cargados similares, lo que influye en la cinética de adsorción. Además, la alta fuerza iónica aumenta la tendencia de las proteínas a agregarse. [12]

    Sistema de proteínas múltiples Editar

    Cuando una superficie se expone a una solución de múltiples proteínas, la adsorción de ciertas moléculas de proteínas se favorece sobre las otras. Las moléculas de proteína que se acercan a la superficie compiten por los sitios de unión. En el sistema de múltiples proteínas, la atracción entre moléculas puede ocurrir, mientras que en las soluciones de una sola proteína dominan las interacciones repulsivas intermoleculares. Además, existe una propagación de proteínas dependiente del tiempo, en la que las moléculas de proteína entran en contacto inicialmente con sitios de unión mínimos en la superficie. Con el aumento del tiempo de residencia de la proteína en la superficie, la proteína puede desplegarse para interactuar con sitios de unión adicionales. Esto da como resultado un aumento dependiente del tiempo en los puntos de contacto entre la proteína y la superficie. Esto además hace que la desorción sea menos probable. [5]

    Técnica de agotamiento de la solución Editar

    Esta técnica mide un cambio de concentración de proteínas en la solución a granel antes y después de la adsorción, Δcpag. Cualquier cambio en la concentración de proteínas se atribuye a la capa adsorbida, Γpag.

    Este método también requiere un material de gran área superficial, como adsorbentes de partículas y perlas. [14]

    Elipsometría Editar

    La elipsometría se ha utilizado ampliamente para medir la cinética de adsorción de proteínas, así como la estructura de la capa de proteína adsorbida. Es una técnica óptica que mide el cambio de polarización de la luz después de la reflexión de una superficie. Esta técnica requiere superficies planas y reflectantes, preferiblemente cuarzo, silicio o sílice, y un fuerte cambio en el índice de refracción tras la adsorción de proteínas. [12]

    Microscopía de fuerza atómica Editar

    La microscopía de fuerza atómica (AFM) es una poderosa técnica de microscopía que se usa para estudiar muestras a nanoescala y, a menudo, se usa para obtener imágenes de la distribución de proteínas en una superficie. Consiste en un voladizo con punta para escanear sobre la superficie. Es una herramienta valiosa para medir la interacción proteína-proteína y proteína-superficie. Sin embargo, el factor limitante de muchos estudios de AFM es que la formación de imágenes a menudo se realiza después de secar la superficie, lo que podría afectar el plegamiento de proteínas y la estructura de la capa de proteínas. Además, la punta en voladizo puede desalojar una proteína o corrugar la capa de proteína. [12] [15]

    Resonancia de plasmón superficial Editar

    La resonancia de plasmón de superficie (SPR) se ha utilizado ampliamente para medir la adsorción de proteínas con alta sensibilidad. Esta técnica se basa en la excitación de plasmones superficiales, ondas electromagnéticas longitudinales originadas en la interfaz entre metales y dieléctricos. La deposición en la superficie conductora de moléculas y capas delgadas dentro de los 200 nm modifica las propiedades dieléctricas del sistema y, por lo tanto, la respuesta SPR, lo que indica la presencia de moléculas en una superficie metálica. [dieciséis]

    Microbalanza de cristal de cuarzo Editar

    La microbalanza de cristal de cuarzo (QCM) es un sensor acústico construido alrededor de un cristal de cuarzo en forma de disco. Hace uso del efecto piezoeléctrico inverso. QCM, y versiones extendidas como QCM-D, se han utilizado ampliamente para estudios de adsorción de proteínas, especialmente, monitoreo en tiempo real de adsorción de proteínas sin etiquetas. Además de los estudios de adsorción, QCM-D también proporciona información sobre los módulos elásticos, la viscosidad y los cambios conformacionales [17].

    Espectroscopia de modo de luz con guía de ondas ópticas Editar

    La espectroscopia de modo de luz de guía de ondas ópticas (OWLS) es un dispositivo que se basa en una guía de ondas óptica de película delgada, que encierra un número discreto de ondas electromagnéticas guiadas. El guiado se logra mediante un acoplador de rejilla. Se basa en las mediciones del índice de refracción efectivo de una capa de película delgada por encima de la guía de ondas. Esta técnica solo funciona en superficies muy transparentes. [17]

    Otros métodos ampliamente utilizados para medir la cantidad de proteína adsorbida en las superficies incluyen el radiomarcado, el ensayo de Lowry, la reflectometría del ángulo de barrido, la fluorescencia de reflexión interna total, el ensayo del ácido bicinconínico, etc.

    Composición química Editar

    El enlace metálico se refiere al enlace específico entre los iones metálicos positivos y las nubes de electrones de valencia circundantes. [18] Esta fuerza intermolecular es relativamente fuerte y da lugar a la orientación cristalina repetida de los átomos, también conocida como su sistema de red. Hay varios tipos de formaciones reticulares comunes, y cada una tiene su propia densidad de empaquetamiento y cercanía atómica únicas. Las nubes de electrones cargados negativamente de los iones metálicos obstaculizarán estéricamente la adhesión de regiones proteicas cargadas negativamente debido a la repulsión de carga, limitando así los sitios de unión disponibles de una proteína a una superficie metálica.

    La formación de la red puede conducir a la conexión con sitios de adhesión dependientes de iones metálicos potenciales expuestos (MIDAS) que son sitios de unión para el colágeno y otras proteínas. [19] La superficie del metal tiene propiedades diferentes a las de la masa, ya que las subunidades repetitivas cristalinas normales terminan en la superficie. Esto deja a los átomos de la superficie sin un átomo vecino en un lado, lo que altera inherentemente la distribución de electrones. Este fenómeno también explica por qué los átomos de la superficie tienen una energía más alta que la masa, a menudo denominada simplemente energía superficial. Este estado de mayor energía es desfavorable y los átomos de la superficie intentarán reducirlo uniéndose a las moléculas reactivas disponibles. [20]

    Esto a menudo se logra mediante la adsorción de proteínas, donde los átomos de la superficie se reducen a un estado energético más ventajoso.

    El ambiente interno del cuerpo a menudo se modela para ser un ambiente acuoso a 37 ° C a pH 7.3 con mucho oxígeno disuelto, electrolitos, proteínas y células. [5] Cuando se exponen al oxígeno durante un período prolongado de tiempo, muchos metales pueden oxidarse y aumentar su estado de oxidación superficial al perder electrones. [21] Este nuevo estado catiónico deja la superficie con una carga neta positiva y una mayor afinidad por los grupos laterales de proteínas con carga negativa. Dentro de la gran diversidad de metales y aleaciones de metales, muchos son susceptibles a la corrosión cuando se implantan en el cuerpo. Los elementos que son más electronegativos se corroen más rápidamente cuando se exponen a un ambiente acuoso rico en electrolitos como el cuerpo humano. [22] Tanto la oxidación como la corrosión reducirán la energía libre, afectando así la adsorción de proteínas como se ve en la Ec. 1. [23]

    Efectos de la topografía Editar

    La rugosidad y la textura de la superficie tienen una influencia innegable en la adsorción de proteínas en todos los materiales, pero con la ubicuidad de los procesos de mecanizado de metales, es útil abordar cómo estos afectan el comportamiento de las proteínas. La adsorción inicial es importante, así como mantener la adherencia y la integridad. La investigación ha demostrado que la rugosidad de la superficie puede estimular la adhesión de las proteínas del andamio y los osteoblastos, y da como resultado un aumento de la mineralización de la superficie. [24] Las superficies con más características topográficas y rugosidad tendrán un área de superficie más expuesta para que las proteínas interactúen. [5] En términos de aplicaciones de ingeniería biomédica, las técnicas de micromecanizado se utilizan a menudo para aumentar la adhesión de proteínas a los implantes con la esperanza de acortar el tiempo de recuperación. La técnica de modelado por láser introduce surcos y rugosidad en la superficie que influirán en la adhesión, migración y alineación. El granallado, un método análogo al granallado, y el grabado químico han demostrado ser técnicas exitosas de pulido de superficies que promueven la estabilidad a largo plazo de los implantes de titanio. [25] El aumento de la estabilidad es un resultado directo del aumento observado en la matriz extracelular y la unión del colágeno, que da como resultado una mayor unión y mineralización de los osteoblastos en comparación con las superficies no rugosas. [26] Sin embargo, la adsorción no siempre es deseable. La maquinaria puede verse afectada negativamente por la adsorción, particularmente con la adsorción de proteínas en la industria alimentaria.

    Los polímeros son de gran importancia cuando se considera la adsorción de proteínas en el ámbito biomédico. Los polímeros se componen de uno o más tipos de "meros" unidos entre sí repetidamente, típicamente mediante enlaces covalentes direccionales. A medida que la cadena crece por la adición de meros, las propiedades químicas y físicas del material vienen dictadas por la estructura molecular del monómero.Al seleccionar cuidadosamente el tipo o tipos de meros en un polímero y su proceso de fabricación, las propiedades químicas y físicas de un polímero se pueden adaptar en gran medida para adsorber proteínas y células específicas para una aplicación particular.

    Efectos de conformación Editar

    La adsorción de proteínas a menudo da como resultado cambios conformacionales significativos, que se refieren a cambios en las estructuras secundarias, terciarias y cuartarias de las proteínas. Además de las velocidades y cantidades de adsorción, la orientación y la conformación son de importancia crítica. Estos cambios conformacionales pueden afectar la interacción de la proteína con ligandos, sustratos y antígenos que dependen de la orientación del sitio de unión de interés. Estos cambios conformacionales, como resultado de la adsorción de proteínas, también pueden desnaturalizar la proteína y cambiar sus propiedades nativas.

    Adsorción a andamios de polímero Editar

    La ingeniería de tejidos es un campo relativamente nuevo que utiliza un andamiaje como plataforma sobre la que proliferan las células deseadas. No está claro qué define un andamio ideal para un tipo de tejido específico. Las consideraciones son complejas y la adsorción de proteínas solo aumenta la complejidad. Aunque la arquitectura, la mecánica estructural y las propiedades de la superficie juegan un papel clave, comprender la degradación y la velocidad de adsorción de proteínas también es clave. Además de lo esencial de la mecánica y la geometría, una estructura de andamio adecuada poseerá propiedades superficiales optimizadas para la unión y migración de los tipos de células de interés particular.

    Generalmente, se ha encontrado que los andamios que se asemejan mucho a los entornos naturales del tejido que se está manipulando son los más exitosos. Como resultado, se ha realizado mucha investigación en la investigación de polímeros naturales que se pueden adaptar, a través de la metodología de procesamiento, a criterios de diseño específicos. El quitosano es actualmente uno de los polímeros más utilizados, ya que es muy similar al glicosaminoglicano (GAG) de origen natural y es degradable por las enzimas humanas. [28]

    Quitosano Editar

    El quitosano es un polisacárido lineal que contiene residuos ligados derivados de la quitina y se estudia ampliamente como biomaterial debido a su alta compatibilidad con numerosas proteínas del organismo. El quitosano es catiónico y, por tanto, reacciona electrostáticamente con numerosos proteoglicanos, GAG aniónicos y otras moléculas que poseen carga negativa. Dado que muchas citocinas y factores de crecimiento están vinculados a GAG, los andamios con los complejos de quitosano-GAG pueden retener estas proteínas secretadas por las células adheridas. Otra cualidad del quitosano que le confiere un buen potencial biomaterial es su alta densidad de carga en soluciones. Esto permite que el quitosano forme complejos iónicos con muchos polímeros aniónicos solubles en agua, ampliando la gama de proteínas que pueden unirse a él y ampliando así sus posibles usos. [29]

    Polímero Estructura de andamio Tejido objetivo Tipo de celda de aplicación Árbitro
    Quitosano Bloques porosos 3D Hueso ROS similares a osteoblastos [30]
    Quitosano-poliéster Mallas de fibra 3D Hueso MSC humana [31]
    Alginato de quitosano Gel inyectable Hueso MG63 similar a osteoblastos [32]
    Gelatina de quitosano Cilindros porosos 3D Cartílago Condrocitos [33]
    Quitosano-GP Gel inyectable Cartílago Condrocitos [34]
    Quitosano-colágeno Membranas porosas Piel Cocultivo de fibroblasto y queratinocitos [35]
    tabla 1: Estructuras, tejidos diana y tipos de células de aplicación de andamios basados ​​en quitosano

    La adsorción de proteínas es fundamental para muchas aplicaciones industriales y biomédicas. La predicción precisa de la adsorción de proteínas permitirá avanzar en estas áreas.

    Base de datos de adsorción biomolecular Editar

    La base de datos de adsorción biomolecular (BAD) es una base de datos en línea disponible gratuitamente con datos experimentales de adsorción de proteínas recopilados de la literatura. La base de datos se puede utilizar para la selección de materiales para la fabricación de dispositivos de microfluidos y para la selección de las condiciones óptimas de funcionamiento de los dispositivos de laboratorio en un chip. La cantidad de proteína adsorbida a la superficie se puede predecir utilizando la predicción basada en redes neuronales disponible en BAD. Se ha validado que esta predicción está por debajo del 5% de error para los datos generales disponibles en el BAD. También se pueden estimar otros parámetros, como el grosor de las capas de proteínas y la tensión superficial de las superficies cubiertas de proteínas. [ cita necesaria ]


    Ver el vídeo: TestLab: Qué es la desnaturalización de las proteínas? (Junio 2022).