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4.11: 9. 11- Virus de ADN en eucariotas - Biología

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4.11: 9. 11- Virus de ADN en eucariotas

Expresión eficiente de un antígeno nuclear de Epstein-Barr en células de Drosophila transfectadas con ADN del virus de Epstein-Barr.

En una búsqueda de promotores exógenos que funcionen en células cultivadas de Drosophila, hemos cotransfectado una línea celular de D. melanogaster con un clon de cósmido del virus de Epstein-Barr (EBV) que codifica el antígeno nuclear de Epstein-Barr (EBNA-1). Aquí informamos que las células de Drosophila que contienen copias integradas de forma estable de ADN que codifica EBNA-1 sintetizan un polipéptido de mol. peso idéntico al del auténtico EBNA-1, que es detectable con suero humano EBNA positivo pero no EBNA negativo. Al igual que en las células linfoblastoides transformadas con EBV, este neoantígeno está asociado con el núcleo de las células transfectadas, lo que sugiere que las señales de localización celular que operan en células de mamíferos también se reconocen en células de insectos.


Fondo

Los retrovirus presentan desafíos persistentes y únicos para las especies de vertebrados que infectan. Los retrovirus exógenos evolucionan típicamente a tasas de hasta seis órdenes de magnitud más rápido que sus hospedadores y transfieren nuevos genes accesorios de forma horizontal desde otros vertebrados, sus parásitos u otros virus [1, 2, 3, 4]. Los retrovirus también afectan la evolución del genoma a largo plazo como retrovirus endógenos (ERV) después de la integración en la línea germinal. Los ERV representan un "registro fósil" de infecciones retrovirales previas y constituyen aproximadamente el 3% del genoma aviar [5, 6]. Los ERV aviares identificables incluyen loci evolutivos "recientes" específicos de linaje, integraciones encontradas en aves y sitios antiguos también observados en genomas de mamíferos [5, 6].

Los ERV se descomponen, o son silenciados epigenéticamente, a lo largo de escalas de tiempo evolutivas largas [2, 3, 7, 8]. Sin embargo, la infección recurrente y la retrotransposición intracelular pueden generar nuevos ERV estructuralmente intactos con el potencial de afectar la expresión génica, facilitar los reordenamientos cromosómicos y modular la respuesta del huésped a las infecciones retrovirales [4, 9,10,11,12,13,14]. Los ERV también pueden continuar expresando sus propios genes retrovirales (mordaza, pol, y env), impulsado por promotores con el potencial de efectos bidireccionales en las repeticiones terminales largas flanqueantes (LTR). Además, pueden volver a emerger del genoma mediante recombinación para plantear nuevas amenazas exógenas, como el subgrupo J del virus de la leucosis aviar (ALV) en pollos [1, 4, 11, 13, 15, 16].

ALV es un alfaretrovirus que infecta a las aves galliformes y es el único pollo conocido (Gallus gallus) retrovirus con actividad tanto exógena como endógena [13, 17]. Los ALV exógenos son generalmente virus de transformación lenta que inducen la formación de tumores linfoides (subgrupos A-D) o mieloides (subgrupo J) durante semanas o meses mediante mutagénesis insercional, y pueden diseminarse a través de bandadas a través de la diseminación viral [18, 19]. Los ALV endógenos también pueden infectar horizontalmente, pero tienen un rango específico de especie. Subgrupo E (los ALVE históricamente conocidos como ev genes) se encuentran en el pollo doméstico y su progenitor salvaje, el ave de la jungla roja (RJF), pero en ninguna otra especie de Gallus [15, 20].

Como integraciones evolutivamente recientes, las ALVE se encuentran típicamente en un número bajo de copias en el genoma, pero a menudo conservan una alta integridad estructural [21, 22, 23]. La presencia de ALVE con capacidad de replicación, y ALVE que expresan proteínas gag, se ha asociado con impactos en rasgos que incluyen reducciones en la tasa de crecimiento muscular, número de huevos, tamaño y grosor de la cáscara, y una mayor incidencia de diseminación viral [24,25,26 , 27,28]. En cambio, env La expresión puede mediar en la infección por ALV a través de la interferencia del receptor [29, 30, 31]. A medida que aumenta el contenido de ALVE genómico, su influencia acumulativa se vuelve cada vez más compleja, particularmente cuando las líneas se cruzan. Además, un trabajo reciente ha demostrado interacciones entre los ALVE y el virus de la enfermedad de Marek (MDV), cada vez más virulento, un alfaherpesvirus específico del pollo. El MDV puede inducir la expresión de ALVE, incluso de elementos normalmente silenciados como ALVE1 [32, 33], y las vacunas contra el MDV pueden inducir una mayor incidencia de tumores linfoides espontáneos en las líneas que contienen ALVE21 [34,35,36].

A pesar de estos efectos y de la creación de líneas "libres de ALVE" [37, 38], la comunidad de cría de aves de corral comercial no ha podido eliminar por completo todos los ALVE de las reproductoras. Esto ha sido una combinación de la incapacidad para detectar todas las inserciones de ALVE, la asociación entre algunas ALVE y rasgos comercialmente deseables (como ALVE21 con plumaje lento [39,40,41,42,43] y ALVE-TYR con plumaje blanco [ 44, 45]) y la gestión de programas de selección para múltiples rasgos de desempeño. Fundamentalmente, el ganado reproductor comercial debe ser negativo para ALV exógeno antes del envío. Esto requiere pruebas continuas para el antígeno p27 específico de ALV, que genera un falso positivo efectivo cuando se detecta expresión endógena. Los ensayos de PCR basados ​​en gel se desarrollaron para detectar ALVE comunes en las capas [21], pero estos ensayos no son económicos a escala comercial y se limitaron a sitios conocidos. Los métodos tradicionales de identificación de ALVE utilizaron polimorfismos característicos de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP), pero estos patrones se conservaron poco entre razas y pueden ser difíciles de interpretar cuando hay un alto número de ALVE por ave [46,47,48]. Por lo tanto, la identificación y caracterización completas de ALVE dentro de las líneas comerciales es esencial para mejorar tanto la productividad como el control de la salud, pero cualquier ensayo debe ser rentable a escala comercial.

Más allá de los pollos comerciales, se sabe poco sobre la diversidad de ALVE en otras poblaciones de pollos domésticos o salvajes. El conjunto de RJF de referencia contiene dos ALVE, uno de los cuales se comparte comúnmente con ponedoras comerciales y pollos de engorde [21, 49, 50]. Se han generado conjuntos de datos de secuenciación del genoma completo (WGS) de lectura corta para muchas líneas, razas y poblaciones de pollos diferentes (incluido el RJF capturado en la naturaleza) durante la última década, y presentan una oportunidad para la identificación de ALVE. Sin embargo, la identificación de tales variantes estructurales se ha visto obstaculizada por el mapeo de lectura complejo, los ensamblajes del genoma de referencia incompletos y la cobertura de secuencia limitada en los sitios de unión de inserción. Un trabajo reciente ha utilizado la secuenciación de captura de objetivos para enriquecer el ADN repetitivo, incluidos los ALVE [23, 51], para promover la identificación de integraciones novedosas. Sin embargo, estos conjuntos de datos tienen aplicaciones futuras limitadas, y la mayoría de los datos de WGS no se han extraído por completo para las variantes estructurales, incluidos los ERV.

Aquí, describimos obsERVer, una tubería bioinformática desarrollada para la detección de integraciones ERV específicas y determinadas por el usuario en conjuntos de datos de WGS. Validamos las predicciones bioinformáticas en ocho líneas de capa de élite con nuevos ensayos de diagnóstico de alto rendimiento para cada ALVE identificado, que luego usamos para genotipar las aves originalmente secuenciadas y más de 9000 muestras de ADN archivadas de las mismas líneas de capa de élite. También utilizamos obsERVer para identificar ALVE en cincuenta y siete conjuntos de datos de pollos diversos que abarcan pollos y pollos de engorde comerciales, experimentales y patrimoniales, razas nativas y poblaciones silvestres, incluido el RJF. Este trabajo ha permitido una mejor comprensión de los ALVE en líneas de pollos comerciales y más diversas, incluida la identificación de más de 260 nuevos loci ALVE. Además, estos métodos brindan nuevas oportunidades para examinar los efectos biológicos de las ALVE en diversas poblaciones de pollos domésticos y salvajes.


Purificación de RIP60 y RIP100, proteínas de mamíferos con actividades de unión a ADN específicas de origen y ADN helicasa dependiente de ATP.

La replicación del gen de la dihidrofolato reductasa del hámster chino (dhfr) se inicia cerca de un fragmento de ADN doblado de manera estable que se une a múltiples factores celulares. La investigación de las interacciones de las proteínas con las secuencias de ADN dobladas con dhfr reveló una nueva proteína nuclear que también se une al dominio B del origen de replicación de la levadura, la secuencia de replicación autónoma ARS1. La actividad de unión al ADN específica del origen se purificó 9.000 veces a partir del extracto nuclear de células HeLa en cinco pasos cromatográficos. Los experimentos de entrecruzamiento de proteína-ADN mostraron que un polipéptido de 60 kDa, que llamamos RIP60, contenía la actividad de unión al ADN específica de origen. Los ensayos de desplazamiento de oligonucleótidos mostraron que las fracciones altamente purificadas de RIP60 también contenían una actividad ADN helicasa dependiente de ATP. El radiomarcaje covalente con ATP indicó que la actividad de la ADN helicasa residía en un polipéptido de 100 kDa, RIP100. El cofraccionamiento de una helicasa de ADN dependiente de ATP con una actividad de unión a ADN específica de origen sugiere que RIP60 y RIP100 pueden estar implicados en el inicio de la síntesis de ADN cromosómico en células de mamífero.


La expresión génica fotorregulada puede implicar proteínas de unión a ADN ubicuas.

Se ha demostrado previamente que varios elementos promotores influyen en la expresión del gen cab-E en Nicotiana plumbaginifolia. Aquí demostramos, mediante ensayos de interferencia de metilación y cambio de movilidad electroforética, que un patrón complejo de interacciones proteína-ADN caracteriza a este promotor. Entre las múltiples proteínas identificadas, nos centramos en cinco factores diferentes que o bien ocupaban elementos reguladores importantes y / o estaban presentes en cantidades relativamente grandes en extractos nucleares. Todas estas proteínas se distinguieron sobre la base de su secuencia de reconocimiento y otros parámetros bioquímicos. Uno, GBF, interactuó con una sola secuencia dentro del promotor cab-E homólogo a la caja G que se encuentra en muchos promotores de plantas fotorregulados y otros. Un segundo factor, GA-1, unido al elemento GATA que se encuentra entre las cajas CAAT y TATA del cab-E y todos los demás promotores LHCII Tipo I CAB. GA-1 también interactuó in vitro con las cajas I del promotor Arabidopsis rbcS-1A y el sitio as-2 del promotor CaMV 35S. Otros dos factores, GC-1 y AT-1, se unieron a múltiples sitios de reconocimiento localizados dentro de los elementos ricos en GC y ricos en AT, respectivamente. GT-1, una proteína que interactúa con los promotores de otros genes regulados por luz, se une a siete sitios distintos distribuidos por todo el promotor cab-E.


Contenido

Las células de todos los organismos regulan la expresión génica mediante el recambio de transcripciones de genes (ARN monocatenario): la cantidad de un gen expresado en una célula se puede medir por el número de copias de una transcripción de ARN de ese gen presente en una muestra. Para detectar y cuantificar de manera robusta la expresión génica a partir de pequeñas cantidades de ARN, es necesaria la amplificación de la transcripción del gen. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método común para amplificar el ADN para la PCR basada en ARN. La muestra de ARN se transcribe en primer lugar a ADN complementario (ADNc) con transcriptasa inversa.

Para amplificar pequeñas cantidades de ADN, se usa la misma metodología que en la PCR convencional usando una plantilla de ADN, al menos un par de cebadores específicos, desoxirribonucleótidos, una solución tampón adecuada y una ADN polimerasa termoestable. Una sustancia marcada con un fluoróforo se agrega a esta mezcla en un termociclador que contiene sensores para medir la fluorescencia del fluoróforo después de que se haya excitado a la longitud de onda requerida, lo que permite medir la tasa de generación de uno o más productos específicos. Esto permite medir la velocidad de generación del producto amplificado en cada ciclo de PCR. Los datos así generados pueden ser analizados por software de computadora para calcular expresión génica relativa (o número de copia de ARNm) en varias muestras. La PCR cuantitativa también se puede aplicar a la detección y cuantificación de ADN en muestras para determinar la presencia y abundancia de una secuencia de ADN particular en estas muestras. [3] Esta medida se realiza después de cada ciclo de amplificación, por lo que este método se denomina PCR en tiempo real (es decir, PCR inmediata o simultánea). En el caso de la cuantificación de ARN, la plantilla es ADN complementario (ADNc), que se obtiene por transcripción inversa de ácido ribonucleico (ARN). En este caso, la técnica utilizada es RT-PCR cuantitativa o Q-RT-PCR.

La PCR cuantitativa y la micromatriz de ADN son metodologías modernas para estudiar la expresión génica. Se utilizaron métodos más antiguos para medir la abundancia de ARNm: presentación diferencial, ensayo de protección de ARNasa y transferencia Northern. La transferencia Northern se usa a menudo para estimar el nivel de expresión de un gen visualizando la abundancia de su transcrito de ARNm en una muestra. En este método, el ARN purificado se separa mediante electroforesis en gel de agarosa, se transfiere a una matriz sólida (como una membrana de nailon) y se prueba con una sonda de ADN o ARN específica que es complementaria al gen de interés. Aunque esta técnica todavía se utiliza para evaluar la expresión génica, requiere cantidades relativamente grandes de ARN y proporciona solo información cualitativa o semicuantitativa de los niveles de ARNm. [4] Los errores de estimación que surgen de variaciones en el método de cuantificación pueden ser el resultado de la integridad del ADN, la eficiencia de la enzima y muchos otros factores. Por esta razón, se han desarrollado varios sistemas de normalización (a menudo denominados métodos de normalización). Algunos se han desarrollado para cuantificar la expresión génica total, pero los más comunes tienen como objetivo cuantificar el gen específico que se está estudiando en relación con otro gen llamado gen normalizador, que se selecciona por su nivel de expresión casi constante. Estos genes a menudo se seleccionan de genes domésticos, ya que sus funciones relacionadas con la supervivencia celular básica normalmente implican una expresión genética constitutiva. [5] [6] Esto permite a los investigadores informar una proporción para la expresión de los genes de interés dividida por la expresión del normalizador seleccionado, lo que permite la comparación del primero sin conocer realmente su nivel absoluto de expresión.

Los genes normalizadores más utilizados son los que codifican las siguientes moléculas: tubulina, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, albúmina, ciclofilina y ARN ribosómico. [4]

La PCR en tiempo real se realiza en un termociclador con capacidad para iluminar cada muestra con un haz de luz de al menos una longitud de onda especificada y detectar la fluorescencia emitida por el fluoróforo excitado. El termociclador también puede calentar y enfriar rápidamente muestras, aprovechando así las propiedades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos y la ADN polimerasa.

El proceso de PCR generalmente consiste en una serie de cambios de temperatura que se repiten entre 25 y 50 veces. Estos ciclos normalmente constan de tres etapas: la primera, a unos 95 ° C, permite la separación de la doble cadena del ácido nucleico; la segunda, a una temperatura de unos 50-60 ° C, permite la unión de los cebadores con la plantilla de ADN. [7] el tercero, entre 68 y 72 ° C, facilita la polimerización realizada por la ADN polimerasa. Debido al pequeño tamaño de los fragmentos, el último paso generalmente se omite en este tipo de PCR ya que la enzima es capaz de replicar el amplicón de ADN durante el cambio entre la etapa de alineación y la etapa de desnaturalización. Además, en la PCR de cuatro pasos se mide la fluorescencia durante fases cortas de temperatura que duran solo unos segundos en cada ciclo, con una temperatura de, por ejemplo, 80 ° C, con el fin de reducir la señal provocada por la presencia de dímeros de cebadores. cuando se usa un tinte no específico. [8] Las temperaturas y los tiempos utilizados para cada ciclo dependen de una amplia variedad de parámetros, tales como: la enzima utilizada para sintetizar el ADN, la concentración de iones divalentes y desoxirribonucleótidos (dNTP) en la reacción y la temperatura de enlace del imprimaciones. [9]

La técnica de PCR en tiempo real se puede clasificar por la química utilizada para detectar el producto de PCR, fluorocromos específicos o inespecíficos.

Detección no específica: PCR en tiempo real con tintes de unión al ADN de doble hebra como reporteros Editar

Un tinte de unión al ADN se une a todo el ADN de doble hebra (ds) en la PCR, lo que aumenta el rendimiento cuántico de fluorescencia del tinte. Por tanto, un aumento del producto de ADN durante la PCR conduce a un aumento de la intensidad de la fluorescencia medida en cada ciclo. Sin embargo, los tintes de dsDNA como SYBR Green se unirán a todos los productos de PCR de dsDNA, incluidos los productos de PCR no específicos (como el dímero de cebador). Esto puede interferir potencialmente con, o prevenir, la monitorización precisa de la secuencia objetivo deseada.

En la PCR en tiempo real con tintes de dsDNA, la reacción se prepara como de costumbre, con la adición de un tinte fluorescente de dsDNA. Luego, la reacción se ejecuta en un instrumento de PCR en tiempo real y, después de cada ciclo, se mide la intensidad de la fluorescencia con un detector; el tinte solo emite fluorescencia cuando se une al ADN de doble cadena (es decir, el producto de PCR). Este método tiene la ventaja de que solo necesita un par de cebadores para llevar a cabo la amplificación, lo que mantiene bajos los costos. Se pueden monitorear múltiples secuencias diana en un tubo usando diferentes tipos de colorantes.

Detección específica: método de sonda de reportero fluorescente Editar

Las sondas indicadoras fluorescentes detectan solo el ADN que contiene la secuencia complementaria a la sonda, por lo tanto, el uso de la sonda indicadora aumenta significativamente la especificidad y permite realizar la técnica incluso en presencia de otro dsDNA. Usando etiquetas de diferentes colores, se pueden usar sondas fluorescentes en ensayos multiplex para monitorear varias secuencias diana en el mismo tubo. La especificidad de las sondas indicadoras fluorescentes también evita la interferencia de las mediciones causada por los dímeros de los cebadores, que son subproductos potenciales indeseables en la PCR. Sin embargo, las sondas indicadoras fluorescentes no evitan el efecto inhibidor de los dímeros de los cebadores, que pueden deprimir la acumulación de los productos deseados en la reacción.

El método se basa en una sonda basada en ADN con un indicador fluorescente en un extremo y un atenuador de fluorescencia en el extremo opuesto de la sonda. La estrecha proximidad del informador al extintor evita la detección de su ruptura de fluorescencia de la sonda por la actividad exonucleasa 5 'a 3' de la polimerasa Taq rompe la proximidad informador-extintor y, por lo tanto, permite la emisión de fluorescencia sin apagar, que puede detectarse después excitación con láser. Por lo tanto, un aumento en el producto objetivo de la sonda indicadora en cada ciclo de PCR provoca un aumento proporcional de la fluorescencia debido a la ruptura de la sonda y la liberación del informador.

  1. La PCR se prepara como de costumbre (ver PCR) y se agrega la sonda informadora.
  2. A medida que comienza la reacción, durante la etapa de hibridación de la PCR, tanto la sonda como los cebadores se hibridan con el ADN diana.
  3. La polimerización de una nueva hebra de ADN se inicia a partir de los cebadores, y una vez que la polimerasa llega a la sonda, su 5'-3'-exonucleasa degrada la sonda, separando físicamente el informador fluorescente del extintor, lo que da como resultado un aumento de la fluorescencia.
  4. La fluorescencia se detecta y mide en una máquina de PCR en tiempo real, y su aumento geométrico correspondiente al aumento exponencial del producto se utiliza para determinar el ciclo de cuantificación (Cq) en cada reacción.

La PCR en tiempo real permite la identificación de fragmentos de ADN amplificados específicos mediante el análisis de su temperatura de fusión (también llamada Tmetro valor, de melting ttemperatura). El método utilizado suele ser la PCR con tintes de unión al ADN de doble hebra como indicadores y el tinte utilizado suele ser SYBR Green. La temperatura de fusión del ADN es específica del fragmento amplificado. Los resultados de esta técnica se obtienen comparando las curvas de disociación de las muestras de ADN analizadas. [11]

A diferencia de la PCR convencional, este método evita el uso previo de técnicas de electroforesis para demostrar los resultados de todas las muestras. Esto se debe a que, a pesar de ser una técnica cinética, la PCR cuantitativa generalmente se evalúa en un punto final distinto. Por lo tanto, la técnica generalmente proporciona resultados más rápidos y / o usa menos reactivos que la electroforesis. Si se requiere una electroforesis posterior, solo es necesario analizar aquellas muestras que la PCR en tiempo real ha demostrado ser dudosas y / o ratificar los resultados de las muestras que han dado positivo para un determinante específico.

Modelado Editar

A diferencia de la PCR de punto final (PCR convencional), la PCR en tiempo real permite monitorear el producto deseado en cualquier punto del proceso de amplificación midiendo la fluorescencia (en un marco de tiempo real, la medición se realiza a partir de un umbral determinado). Un método comúnmente empleado de cuantificación de ADN mediante PCR en tiempo real se basa en graficar la fluorescencia frente al número de ciclos en una escala logarítmica. Se establece un umbral para la detección de fluorescencia basada en ADN de 3 a 5 veces la desviación estándar del ruido de la señal por encima del fondo. El número de ciclos en los que la fluorescencia supera el umbral se denomina ciclo umbral (Ct) o, según las directrices del MIQE, ciclo de cuantificación (Cq). [12]

Durante la fase de amplificación exponencial, la cantidad de la plantilla de ADN diana (amplicón) se duplica en cada ciclo. Por ejemplo, una muestra de ADN cuya Cq precede al de otra muestra en 3 ciclos que contiene 2 3 = 8 veces más plantilla. Sin embargo, la eficacia de la amplificación a menudo varía entre los cebadores y las plantillas. Por lo tanto, la eficiencia de una combinación de cebador y plantilla se evalúa en un experimento de titulación con diluciones en serie de la plantilla de ADN para crear una curva estándar del cambio en (Cq) con cada dilución. La pendiente de la regresión lineal se usa luego para determinar la eficiencia de la amplificación, que es del 100% si una dilución de 1: 2 da como resultado una (Cq) diferencia de 1. El método de umbral de ciclo hace varios supuestos del mecanismo de reacción y se basa en datos de regiones de baja señal a ruido del perfil de amplificación que pueden introducir una variación sustancial durante el análisis de datos. [13]

Para cuantificar la expresión génica, el (Cq) para un ARN o ADN del gen de interés se resta del (Cq) de ARN / ADN de un gen interno en la misma muestra para normalizar la variación en la cantidad y calidad de ARN entre diferentes muestras. Este procedimiento de normalización se denomina comúnmente ΔCt-método [14] y permite comparar la expresión de un gen de interés entre diferentes muestras. Sin embargo, para tal comparación, la expresión del gen de referencia normalizador debe ser muy similar en todas las muestras. La elección de un gen de referencia que cumpla este criterio es, por lo tanto, de gran importancia y, a menudo, desafiante, porque solo muy pocos genes muestran niveles iguales de expresión en una variedad de condiciones o tejidos diferentes. [15] [16] Aunque el análisis de umbral de ciclo está integrado con muchos sistemas de software comerciales, existen métodos más precisos y confiables para analizar los datos del perfil de amplificación que deben considerarse en los casos en que la reproducibilidad es una preocupación. [13]

También se han sugerido métodos de cuantificación de qPCR basados ​​en mecanismos, y tienen la ventaja de que no requieren una curva estándar para la cuantificación. Se ha demostrado que métodos como MAK2 [17] tienen un rendimiento cuantitativo igual o mejor que los métodos de curva estándar. Estos métodos basados ​​en mecanismos utilizan el conocimiento sobre el proceso de amplificación de la polimerasa para generar estimaciones de la concentración de la muestra original. Una extensión de este enfoque incluye un modelo preciso de todo el perfil de reacción de PCR, que permite el uso de datos de alta relación señal-ruido y la capacidad de validar la calidad de los datos antes del análisis. [13]

Según la investigación de Ruijter et al. [18] MAK2 asume una eficiencia de amplificación constante durante la reacción de PCR. Sin embargo, el análisis teórico de la reacción en cadena de la polimerasa, de la que se derivó MAK2, ha revelado que la eficacia de la amplificación no es constante a lo largo de la PCR. Si bien la cuantificación de MAK2 proporciona estimaciones fiables de la concentración de ADN objetivo en una muestra en condiciones normales de qPCR, MAK2 no cuantifica de forma fiable la concentración objetivo para los ensayos de qPCR con competímetros.

Existen numerosas aplicaciones para la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en el laboratorio. Se utiliza comúnmente tanto para diagnóstico como para investigación básica. Los usos de la técnica en la industria incluyen la cuantificación de la carga microbiana en alimentos o en materia vegetal, la detección de OGM (organismos genéticamente modificados) y la cuantificación y genotipificación de patógenos virales humanos.

Cuantificación de la expresión génica Editar

La cuantificación de la expresión génica mediante métodos tradicionales de detección de ADN no es fiable. La detección de ARNm en una transferencia Northern o productos de PCR en un gel o transferencia Southern no permite una cuantificación precisa. [19] Por ejemplo, durante los 20 a 40 ciclos de una PCR típica, la cantidad de producto de ADN alcanza una meseta que no está directamente correlacionada con la cantidad de ADN diana en la PCR inicial. [20]

La PCR en tiempo real se puede utilizar para cuantificar ácidos nucleicos mediante dos métodos comunes: cuantificación relativa y cuantificación absoluta. [21] La cuantificación absoluta proporciona el número exacto de moléculas de ADN diana en comparación con los estándares de ADN utilizando una curva de calibración. Por tanto, es fundamental que la PCR de la muestra y el estándar tengan la misma eficacia de amplificación. [22] La cuantificación relativa se basa en genes de referencia internos para determinar las diferencias en la expresión del gen diana. La cuantificación se expresa como el cambio en los niveles de expresión de ARNm interpretado como ADN complementario (ADNc, generado por transcripción inversa de ARNm). La cuantificación relativa es más fácil de realizar ya que no requiere una curva de calibración ya que la cantidad del gen estudiado se compara con la cantidad de un gen de referencia de control.

Dado que las unidades utilizadas para expresar los resultados de la cuantificación relativa no son importantes, los resultados se pueden comparar entre varios RTqPCR diferentes. La razón para utilizar uno o más genes internos es corregir variaciones inespecíficas, como las diferencias en la cantidad y calidad del ARN utilizado, que pueden afectar la eficiencia de la transcripción inversa y, por lo tanto, la de todo el proceso de PCR. Sin embargo, el aspecto más crucial del proceso es que el gen de referencia debe ser estable. [23]

La selección de estos genes de referencia se realizaba tradicionalmente en biología molecular mediante estudios cualitativos o semicuantitativos como el examen visual de geles de ARN, densitometría de transferencia Northern o PCR semicuantitativa (imitadores de PCR). Ahora, en la era del genoma, es posible realizar una estimación más detallada para muchos organismos utilizando tecnologías transcriptómicas. [24] Sin embargo, la investigación ha demostrado que la amplificación de la mayoría de los genes de referencia utilizados para cuantificar la expresión del ARNm varía según las condiciones experimentales. [25] [26] [27] Por tanto, es necesario realizar un estudio metodológico inicial estadísticamente sólido para seleccionar el gen de referencia más adecuado.

Se han desarrollado varios algoritmos estadísticos que pueden detectar qué gen o genes son los más adecuados para su uso en determinadas condiciones. Aquellos como geNORM o BestKeeper pueden comparar pares o medias geométricas para una matriz de diferentes genes y tejidos de referencia. [28] [29]

Usos diagnósticos Editar

La PCR cualitativa de diagnóstico se aplica para detectar rápidamente ácidos nucleicos que son diagnósticos de, por ejemplo, enfermedades infecciosas, cáncer y anomalías genéticas. La introducción de ensayos de PCR cualitativos en el laboratorio de microbiología clínica ha mejorado significativamente el diagnóstico de enfermedades infecciosas, [30] y se utiliza como una herramienta para detectar enfermedades emergentes, como nuevas cepas de gripe y coronavirus, [31] en pruebas de diagnóstico. . [32] [33]

Usos microbiológicos Editar

La PCR cuantitativa también la utilizan los microbiólogos que trabajan en los campos de la seguridad alimentaria, el deterioro y la fermentación de los alimentos y para la evaluación del riesgo microbiano de la calidad del agua (aguas potables y recreativas) y en la protección de la salud pública. [34]

La qPCR también puede usarse para amplificar marcadores taxonómicos o funcionales de genes en ADN tomado de muestras ambientales. [35] Los marcadores están representados por fragmentos genéticos de ADN o ADN complementario. [35] Al amplificar un determinado elemento genético, se puede cuantificar la cantidad del elemento en la muestra antes de la amplificación. [35] El uso de marcadores taxonómicos (genes ribosómicos) y qPCR puede ayudar a determinar la cantidad de microorganismos en una muestra y puede identificar diferentes familias, géneros o especies según la especificidad del marcador. [35] El uso de marcadores funcionales (genes que codifican proteínas) puede mostrar la expresión génica dentro de una comunidad, lo que puede revelar información sobre el medio ambiente. [35]

Detección de fitopatógenos Editar

La industria agrícola se esfuerza constantemente por producir propágulos de plantas o plántulas libres de patógenos para evitar pérdidas económicas y salvaguardar la salud. Se han desarrollado sistemas que permiten la detección de pequeñas cantidades de ADN de Phytophthora ramorum, un oomiceto que mata a los robles y otras especies, mezclado con el ADN de la planta huésped. La discriminación entre el ADN del patógeno y la planta se basa en la amplificación de las secuencias ITS, espaciadores ubicados en el área codificante del gen del ARN ribosómico, que son característicos de cada taxón. [36] También se han desarrollado versiones de campo de esta técnica para identificar el mismo patógeno. [37]

Detección de organismos modificados genéticamente Editar

La qPCR que usa transcripción inversa (RT-qPCR) se puede usar para detectar OGM dada su sensibilidad y rango dinámico en la detección de ADN. Las alternativas como el análisis de ADN o de proteínas suelen ser menos sensibles. Se utilizan cebadores específicos que amplifican no el transgén sino el promotor, terminador o incluso secuencias intermedias utilizadas durante el proceso de ingeniería del vector. Como el proceso de creación de una planta transgénica normalmente conduce a la inserción de más de una copia del transgén, su cantidad también se evalúa comúnmente. Esto a menudo se lleva a cabo mediante cuantificación relativa utilizando un gen de control de la especie tratada que solo está presente como una única copia. [38] [39]

Cuantificación clínica y genotipado Editar

Los virus pueden estar presentes en humanos debido a infecciones directas o coinfecciones, lo que dificulta el diagnóstico mediante técnicas clásicas y puede resultar en un pronóstico y tratamiento incorrectos. El uso de qPCR permite tanto la cuantificación como el genotipado (caracterización de la cepa, realizada mediante curvas de fusión) de un virus como el virus de la Hepatitis B. [40] El grado de infección, cuantificado como las copias del genoma viral por unidad de tejido del paciente, es relevante en muchos casos, por ejemplo, la probabilidad de que el virus del herpes simple tipo 1 se reactive está relacionada con el número de neuronas infectadas en los ganglios. [41] Esta cuantificación se realiza con transcripción inversa o sin ella, como ocurre si el virus se integra en el genoma humano en cualquier punto de su ciclo, como ocurre en el caso del VPH (virus del papiloma humano), donde algunos de sus variantes están asociadas a la aparición de cáncer de cuello uterino. [42] La PCR en tiempo real también ha permitido cuantificar el citomegalovirus humano (CMV) que se observa en pacientes inmunosuprimidos después de un trasplante de órganos sólidos o de médula ósea. [43]


Contenido

El ADN ambiental o eDNA describe el material genético presente en muestras ambientales como sedimentos, agua y aire, incluidas células completas, ADN extracelular y organismos potencialmente completos. [12] [13] eDNA can be captured from environmental samples and preserved, extracted, amplified, sequenced, and categorized based on its sequence. [14] From this information, detection and classification of species is possible. eDNA may come from skin, mucous, saliva, sperm, secretions, eggs, feces, urine, blood, roots, leaves, fruit, pollen, and rotting bodies of larger organisms, while microorganisms may be obtained in their entirety. [15] [16] [13] eDNA production is dependent on biomass, age and feeding activity of the organism as well as physiology, life history, and space use. [3] [17] [13] [18] [19] [7]

Despite being a relatively new method of surveying, eDNA has already proven to have enormous potential in biological monitoring. Conventional methods for surveying richness and abundance are limited by taxonomic identification, may cause disturbance or destruction of habitat, and may rely on methods in which it is difficult to detect small or elusive species, thus making estimates for entire communities impossible. eDNA can complement these methods by targeting different species, sampling greater diversity, and increasing taxonomic resolution. [20] Additionally, eDNA is capable of detecting rare species, [21] [17] but not of determining population quality information such as sex ratios and body conditions, so it is ideal for supplementing traditional studies. [18] [20] Regardless, it has useful applications in detecting the first occurrences of invasive species, the continued presence of native species thought to be extinct or otherwise threatened, and other elusive species occurring in low densities that would be difficult to detect by traditional means. [7]

Degradation of eDNA in the environment limits the scope of eDNA studies, as often only small segments of genetic material remain, particularly in warm, tropical regions. Additionally, the varying lengths of time to degradation based on environmental conditions and the potential of DNA to travel throughout media such as water can affect inference of fine-scale spatiotemporal trends of species and communities. [17] [22] [15] [23] [18] [20] [19] Despite these drawbacks, eDNA still has the potential to determine relative or rank abundance as some studies have found it to correspond with biomass, though the variation inherent in environmental samples makes it difficult to quantify. [16] [13] While eDNA has numerous applications in conservation, monitoring, and ecosystem assessment, as well as others yet to be described, the highly variable concentrations of eDNA and potential heterogeneity through the water body makes it essential that the procedure is optimized, ideally with a pilot study for each new application to ensure that the sampling design is appropriate to detect the target. [24] [18] [20] [7]

Community DNA Edit

While the definition of eDNA seems straightforward, the lines between different forms of DNA become blurred, particularly in comparison to community DNA, which is described as bulk organismal samples. [20] A question arises regarding whole microorganisms captured in eDNA samples: do these organisms alter the classification of the sample to a community DNA sample? Additionally, the classification of genetic material from feces is problematic and often referred to as eDNA. [20] Differentiation between the two is important as community DNA indicates organismal presence at a particular time and place, while eDNA may have come from a different location, from predator feces, or from past presence, however this differentiation is often impossible. [25] [20] However, eDNA can be loosely classified as including many sectors of DNA biodiversity research, including fecal analysis and bulk samples when they are applicable to biodiversity research and ecosystem analysis. [7]

By 2019 methods in eDNA research had been expanded to be able to assess whole communities from a single sample. This process involves metabarcoding, which can be precisely defined as the use of general or universal polymerase chain reaction (PCR) primers on mixed DNA samples from any origin followed by high-throughput next-generation sequencing (NGS) to determine the species composition of the sample. This method has been common in microbiology for years, but is only just finding its footing in assessment of macroorganisms. [26] [22] [25] [20] Ecosystem-wide applications of eDNA metabarcoding have the potential to not only describe communities and biodiversity, but also to detect interactions and functional ecology over large spatial scales, though it may be limited by false readings due to contamination or other errors. [26] [16] [27] [25] [19] Altogether, eDNA metabarcoding increases speed, accuracy, and identification over traditional barcoding and decreases cost, but needs to be standardized and unified, integrating taxonomy and molecular methods for full ecological study. [22] [28] [29] [30] [19] [7]

eDNA metabarcoding has applications to diversity monitoring across all habitats and taxonomic groups, ancient ecosystem reconstruction, plant-pollinator interactions, diet analysis, invasive species detection, pollution responses, and air quality monitoring. eDNA metabarcoding is a unique method still in development and will likely remain in flux for some time as technology advances and procedures become standardized. However, as metabarcoding is optimized and its use becomes more widespread, it is likely to become an essential tool for ecological monitoring and global conservation study. [7]

Extracellular DNA, sometimes called relic DNA, is DNA from dead microbes. Naked extracellular DNA (eDNA), most of it released by cell death, is nearly ubiquitous in the environment. Its concentration in soil may be as high as 2 μg/L, and its concentration in natural aquatic environments may be as high at 88 μg/L. [32] Various possible functions have been proposed for eDNA: it may be involved in horizontal gene transfer [33] it may provide nutrients [34] and it may act as a buffer to recruit or titrate ions or antibiotics. [35] Extracellular DNA acts as a functional extracellular matrix component in the biofilms of several bacterial species. It may act as a recognition factor to regulate the attachment and dispersal of specific cell types in the biofilm [36] it may contribute to biofilm formation [37] and it may contribute to the biofilm's physical strength and resistance to biological stress. [38]

Under the name of environmental DNA, eDNA has seen increased use in the natural sciences as a survey tool for ecology, monitoring the movements and presence of species in water, air, or on land, and assessing an area's biodiversity. [39] [40]

In the diagram on the right, the amount of relic DNA in a microbial environment is determined by inputs associated with the mortality of viable individuals with intact DNA and by losses associated with the degradation of relic DNA. If the diversity of sequences contained in the relic DNA pool is sufficiently different from that in the intact DNA pool, then relic DNA may bias estimates of microbial biodiversity (as indicated by different colored boxes) when sampling from the total (intact + relic) DNA pool. [31] Standardised Data on Initiatives (STARDIT) has been proposed as one way of standardising both data about sampling and analysis methods, and taxonomic and ontological relationships. [41]

Terrestrial sediments Edit

The importance of eDNA analysis stemmed from the recognition of the limitations presented by culture-based studies. [8] Organisms have adapted to thrive in the specific conditions of their natural environments. Although scientists work to mimic these environments, many microbial organisms can not be removed and cultured in a laboratory setting. [10] The earliest version of this analysis began with ribosomal RNA (rRNA) in microbes to better understand microbes that live in hostile environments. [43] The genetic makeup of some microbes is then only accessible through eDNA analysis. Analytical techniques of eDNA were first applied to terrestrial sediments yielding DNA from both extinct and extant mammals, birds, insects and plants. [44] Samples extracted from these terrestrial sediments are commonly referenced as 'sedimentary ancient DNA' (sedaDNA or dirtADN). [45] The eDNA analysis can also be used to study current forest communities including everything from birds and mammals to fungi and worms. [10] Samples can be obtained from soil, faeces, 'bite DNA' from where leaves have been bitten, plants and leaves where animals have been, and from the blood meals of captured mosquitos which may have eaten blood from any animals in the area. [46] Some methods can also attempt to capture cells with hair traps and sandpaper in areas commonly transversed by target species.

Aquatic sediments Edit

The sedaDNA was subsequently used to study ancient animal diversity and verified using known fossil records in aquatic sediments. [10] The aquatic sediments are deprived of oxygen and are thus protect the DNA from degrading. [10] Other than ancient studies, this approach can be used to understand current animal diversity with relatively high sensitivity. While typical water samples can have the DNA degrade relatively quickly, the aquatic sediment samples can have useful DNA two months after the species was present. [47] One problem with aquatic sediments is that it is unknown where the organism deposited the eDNA as it could have moved in the water column.

Aquatic (water column) Edit

Studying eDNA in the water column can indicate the community composition of a body of water. Before eDNA, the main ways to study open water diversity was to use fishing and trapping, which requires resources such as funding and skilled labour, whereas eDNA only needs samples of water. [11] This method is effective as pH of the water does not affect the DNA as much as previously thought, and sensitivity can be increased relatively easily. [11] [48] Sensitivity is how likely the DNA marker will be present in the sampled water, and can be increased simply by taking more samples, having bigger samples, and increasing PCR. [48] eDNA degrades relatively fast in the water column, which is very beneficial in short term conservation studies such as identifying what species are present. [10]

Researchers at the Experimental Lakes Area in Ontario, Canada and McGill University have found that eDNA distribution reflects lake stratification. [49] As seasons and water temperature change, water density also changes such that it forms distinct layers in small boreal lakes in the summer and winter. These layers mix during the spring and fall. [50] Fish habitat use correlates to stratification (e.g. a cold-water fish like lake trout will stay in cold water) and so does eDNA distribution, as these researchers found. [49]

In the diagram above on the left, the pink dashed line indicates the use of a chemical tracer for contamination tracking during coring. The white dashed line depicts the sediment core. Small yellow circles indicate theoretical sedaDNA sampling intervals, corresponding to pie charts on the right. Pie charts represent hypothetical paleo-communities detectable from sedaDNA shotgun analysis, where the majority (

75%) of the recovered sedaDNA sequences originate from bacteria, and where sedaDNA from fossilizing/cyst-forming taxa increases relative to non-fossilizing/non-cyst-forming taxa with subseafloor depth (assuming that sedaDNA of fossilizing/cyst-forming taxa preserves better than that of non-fossilizing/non-cyst-forming taxa). The decreasing size of the pie charts with subseafloor depth indicates an expected decrease in sedaDNA. [51]

eDNA can be used to monitor species throughout the year and can be very useful in conservation monitoring. [17] [52] [53] eDNA analysis has been successful at identifying many different taxa from aquatic plants, [54] aquatic mammals, [21] [17] fishes, [26] [53] mussels, [52] fungi [55] [56] and even parasites. [57] [43] eDNA has been used to study species while minimizing any stress inducing human interaction, allowing researchers to monitor species presence at larger spatial scales more efficiently. [58] [59] The most prevalent use in current research is using eDNA to study the locations of species at risk, invasive species, and keystone species across all environments. [58] eDNA is especially useful for studying species with small populations because eDNA is sensitive enough to confirm the presence of a species with relatively little effort to collect data which can often be done with a soil sample or water sample. [8] [58] eDNA relies on the efficiency of genomic sequencing and analysis as well as the survey methods used which continue to become more efficient and cheaper. [60] Some studies have shown that eDNA sampled from stream and inshore environment decayed to undetectable level at within about 48 hours. [61] [62]

Environmental DNA can be applied as a tool to detect low abundance organisms in both active and passive forms. Active eDNA surveys target individual species or groups of taxa for detection by using highly sensitive species-specific quantitative real-time PCR [63] or digital droplet PCR markers. [64] CRISPR-Cas methodology has also been applied to the detection of single species from eDNA [65] utilising the Cas12a enzyme and allowing greater specificity when detecting sympatric taxa. Passive eDNA surveys employ massively-parallel DNA sequencing to amplify all eDNA molecules in a sample with no a priori target in mind providing blanket DNA evidence of biotic community composition. [66]

Decline of terrestrial arthropods Edit

Terrestrial arthropods are experiencing massive decline in Europe as well as globally, [67] [68] [69] [70] although only a fraction of the species have been assessed and the majority of insects are still undescribed to science. [71] As one example, grassland ecosystems are home to diverse taxonomic and functional groups of terrestrial arthropods, such as pollinators, phytophagous insects, and predators, that use nectar and pollen for food sources, and stem and leaf tissue for food and development. These communities harbor endangered species, since many habitats have disappeared or are under significant threat. [72] [73] Therefore, extensive efforts are being conducted in order to restore European grassland ecosystems and conserve biodiversity. [74] For instance, pollinators like bees and butterflies represent an important ecological group that has undergone severe decline in Europe, indicating a dramatic loss of grassland biodiversity. [75] [76] [77] [78] The vast majority of flowering plants are pollinated by insects and other animals both in temperate regions and the tropics. [79] The majority of insect species are herbivores feeding on different parts of plants, and most of these are specialists, relying on one or a few plant species as their main food resource. [80] However, given the gap in knowledge on existing insect species, and the fact that most species are still undescribed, it is clear that for the majority of plant species in the world, there is limited knowledge about the arthropod communities they harbor and interact with. [1]

Terrestrial arthropod communities have traditionally been collected and studied using methods, such as Malaise traps and pitfall traps, which are very effective but somewhat cumbersome and potentially invasive methods. In some instances, these techniques fall short of performing efficient and standardized surveys, due to, for example, phenotypic plasticity, closely related species, and difficulties in identifying juvenile stages. Furthermore, morphological identification depends directly on taxonomic expertise, which is in decline. [81] [82] [83] All such limitations of traditional biodiversity monitoring have created a demand for alternative approaches. Meanwhile, the advance in DNA sequencing technologies continuously provides new means of obtaining biological data. [16] [84] [25] [85] Hence, several new molecular approaches have recently been suggested for obtaining fast and efficient data on arthropod communities and their interactions through non‐invasive genetic techniques. This includes extracting DNA from sources such as bulk samples or insect soups, [86] [87] [88] [89] empty leaf mines, [90] spider webs, [91] pitcher plant fluid, [92] environmental samples like soil and water (environmental DNA [eDNA]), [93] [94] [85] [95] host plant and predatory diet identification from insect DNA extracts, [96] [97] and predator scat from bats. [98] [99] Recently, also DNA from pollen attached to insects has been used for retrieving information on plant–pollinator interactions. [100] [101] Many of such recent studies rely on DNA metabarcoding—high‐throughput sequencing of PCR amplicons using generic primers. [102] [93] [1]

Mamíferos Editar

Snow tracks Edit

Wildlife researchers in snowy areas also use snow samples to gather and extract genetic information about species of interest. DNA from snow track samples has been used to confirm the presence of such elusive and rare species as polar bears, arctic fox, lynx, wolverines, and fishers. [103] [104] [105] [106]

DNA from the air Edit

In 2021, researchers demonstrated that eDNA can be collected from air and used to identify mammals. [107] [108]

Managing fisheries Edit

The successful management of commercial fisheries relies on standardised surveys to estimate the quantity and distribution of fish stocks. Atlantic cod (Gadus morhua) is an iconic example that demonstrates how poorly constrained data and uninformed decision making can result in catastrophic stock decline and ensuing economic and social problems. [110] Traditional stock assessments of demersal fish species have relied primarily on trawl surveys, which have provided a valuable stream of information to decision makers. [111] However, there are some notable drawbacks of demersal trawl surveys including cost, [112] gear selectivity/catchability, [113] habitat destruction [114] and restricted coverage (e.g. hard-substrate bottom environments, marine protected areas). [115]

Environmental DNA (eDNA) has emerged as a potentially powerful alternative for studying ecosystem dynamics. The constant loss and shedding of genetic material from macroorganisms imparts a molecular footprint in environmental samples that can be analysed to determine either the presence of specific target species [12] [116] or characterise biodiversity. [117] [118] The combination of next generation sequencing and eDNA sampling has been successfully applied in aquatic systems to document spatial and temporal patterns in the diversity of fish fauna. [119] [120] [121] [122] To further develop the utility of eDNA for fisheries management, understanding the ability of eDNA quantities to reflect fish biomass in the ocean is an important next step. [115]

Positive relationships between eDNA quantities and fish biomass and abundance have been demonstrated in experimental systems. [123] [124] [125] However, known variations between eDNA production [126] [127] and degradation [128] [129] [130] [131] rates is anticipated to complicate these relationships in natural systems. Furthermore, in oceanic systems, large habitat volumes and strong currents are likely to result in physical dispersal of DNA fragments away from target organisms. [132] These confounding factors have been previously considered to restrict the application of quantitative eDNA monitoring in oceanic settings. [132] [115]

Despite these potential constraints, numerous studies in marine environments have found positive relationships between eDNA quantities and complimentary survey efforts including radio-tagging, [133] visual surveys, [122] [134] echo-sounding [135] and trawl surveys. [121] [136] However, studies that quantify target eDNA concentrations of commercial fish species with standardised trawl surveys in marine environments are much scarcer. [136] In this context, direct comparisons of eDNA concentrations with biomass and stock assessment metrics, such as catch per unit effort (CPUE), are necessary to understand the applicability of eDNA monitoring to contribute to fisheries management efforts. [115]

Deep sea sediments Edit

Extracellular DNA in surface deep-sea sediments is by far the largest reservoir of DNA of the world oceans. [138] The main sources of extracellular DNA in such ecosystems are represented by in situ DNA release from dead benthic organisms, and/or other processes including cell lysis due to viral infection, cellular exudation and excretion from viable cells, virus decomposition, and allochtonous inputs from the water column. [138] [139] [140] [141] Previous studies provided evidence that an important fraction of extracellular DNA can escape degradation processes, remaining preserved in the sediments. [142] [143] This DNA represents, potentially, a genetic repository that records biological processes occurring over time. [144] [145] [137]

Recent investigations revealed that DNA preserved in marine sediments is characterized by a large number of highly diverse gene sequences. [144] [145] [144] [145] [146] In particular, extracellular DNA has been used to reconstruct past prokaryotic and eukaryotic diversity in benthic ecosystems characterized by low temperatures and/or permanently anoxic conditions. [146] [147] [148] [149] [150] [137]

The diagram on the right shows the OTU (operational taxonomic unit) network of the extracellular DNA pools from the sediments of the different continental margins. The dot size within the network is proportional to the abundance of sequences for each OTU. Dots circled in red represent extracellular core OTUs, dot circled in yellow are partially shared (among two or more pools) OTUs, dots circled in black are OTUs exclusive of each pool. The core OTUs contributing at least for 20 sequences are shown. The numbers in parentheses represent the number of connections among OTUs and samples: 1 for exclusive OTUs, 2–3 for partially shared OTUs and 4 for core OTUs. [137]

Previous studies suggested that the preservation of DNA might be also favoured in benthic systems characterised by high organic matter inputs and sedimentation rates, such as continental margins,. [151] [152] These systems, which represent ca. 15% of the global seafloor, are also hotspots of benthic prokaryotic diversity, [153] [154] [155] and therefore they could represent optimal sites to investigate the prokaryotic diversity preserved within extracellular DNA. [137]

Spatial distribution of prokaryotic diversity has been intensively studied in benthic deep-sea ecosystems [156] [157] [158] [159] through the analysis of "environmental DNA" (i.e., the genetic material obtained directly from environmental samples without any obvious signs of biological source material). [85] However, the extent to which gene sequences contained within extracellular DNA can alter the estimates of the diversity of the present-day prokaryotic assemblages is unknown. [160] [137]

Sedimentary ancient DNA Edit

Analyses of ancient DNA preserved in various archives have transformed understanding of the evolution of species and ecosystems. Whilst earlier studies have concentrated on DNA extracted from taxonomically constrained samples (such as bones or frozen tissue), advances in high-throughput sequencing and bioinformatics now allow the analysis of ancient DNA extracted from sedimentary archives, [161] so called sedaDNA. The accumulation and preservation of sedaDNA buried in land and lake sediments have been subject to active research and interpretation. [162] However, studying the deposition of DNA on the ocean floor and its preservation in marine sediments is more complex because the DNA has to travel through a water column for several kilometers. [163] Unlike in the terrestrial environment, with pervasive transport of subfossil biomass from land, the largest portion of the marine sedaDNA is derived from planktonic community, which is dominated by marine microbes and marine protists. [164] After the death of the surface plankton, its DNA is subject to a transport through the water column, during which much of the associated organic matter is known to be consumed and respired. [165] This transport could take between 3 to 12 days depending on the size and morphology of test. [166] However, it remains unclear how exactly the planktonic eDNA, defined as the total DNA present in the environment after, [167] survives this transport, whether the degradation or transport are associated with sorting or lateral advection, and finally, whether the eDNA arriving at the seafloor is preserved in marine sediments without further distortion of its composition. [168]

Despite the long exposure to degradation under oxic conditions during transport in the water column, and substantially lower concentration of organic matter on the seafloor, there is evidence that planktonic eDNA is preserved in marine sediments and contains exploitable ecological signal. [169] Earlier studies have shown sedaDNA preservation in marine sediments deposited under anoxia with unusually high amounts of organic matter preserved, [170] but later investigations indicate that sedaDNA can also be extracted from normal marine sediments, dominated by clastic or biogenic mineral fractions. [171] [172] [173] In addition, the low temperature of deep-sea water (0–4 °C) ensures a good preservation of sedaDNA. [167] [169] Using planktonic foraminifera as a "Rosetta Stone", allowing benchmarking of sedaDNA signatures by co-occurring fossil tests of these organisms, Morard et al. showed in 2017 that the fingerprint of plankton eDNA arriving on the seafloor preserves the ecological signature of these organisms at a large geographic scale. [170] This indicates that planktonic community eDNA is deposited onto the seafloor below, together with aggregates, skeletons and other sinking planktonic material. If this is true, sedaDNA should be able to record signatures of surface ocean hydrography, affecting the composition of plankton communities, with the same spatial resolution as the skeletal remains of the plankton. In addition, if the plankton eDNA is arriving on the seafloor in association with aggregates or shells, it is possible that it withstands the transport through the water column by fixation onto mineral surfaces. The same mechanism has been proposed to explain the preservation of sedaDNA in sediments, [171] [172] [173] implying that the flux of planktonic eDNA encapsulated in calcite test arriving on the seafloor is conditioned for preservation upon burial. [168]

Planktonic foraminifera sedaDNA is an ideal proxy both “horizontally” to assess the spatial resolution of reconstructing past surface ocean hydrographic features and “vertically”, to unambiguously track the burial of its signal throughout the sediment column. Indeed, the flux of planktonic foraminifera eDNA should be proportionate to the flux of dead foraminiferal shells sinking to the seafloor, allowing independent benchmarking of the eDNA signal. eDNA is powerful tool to study ecosystem because it does not require direct taxonomic knowledge thus allowing information to be gathered on every organism present in a sample, even at the cryptic level. However, assignment of the eDNA sequences to known organisms is done via comparison with reference sequences (or barcodes) made available in public repositories or curated databases. [174] The taxonomy of planktonic foraminifera is well understood [1]</ref> and barcodes exist allowing almost complete mapping of eDNA amplicons on the taxonomy based on foraminiferal test morphology. [175] [176] Importantly, the composition of planktonic foraminifera communities is closely linked to surface hydrography and this signal is preserved by fossil tests deposited on the seafloor. [177] [178] Since foraminiferal eDNA accumulated in the ocean sediment can be recovered, it could be used to analyze changes in planktonic and benthic communities over time. [179] [180] [181] [182] [168]

Participatory research and citizen science Edit

The relative simplicity of eDNA sampling lends itself to projects which seek to involve local communities in being part of research projects, including collecting and analysing DNA samples. This can empower local communities (including Indigenous peoples) to be actively involved in monitoring the species in an environment, and help make informed decisions as part of participatory action research model. An example of such a project has been demonstrated by the charity Science for All with the 'Wild DNA' project. [183]


Conclusión

We conclude that the implementation of biologically realistic model parameters, such as site interaction (mixed DNA/RNA models) and compositional heterogeneity of base frequency, is fundamental to robustly reconstruct phylogenies. The most conspicuous examples comparing our tress are a) the position of Hutchinsoniella (Crustacea), although a low pP value of 0.59 in the non-stationary tree prohibits conclusions about its internal crustacean relationship and b) the well supported position of Ctenolepisma y Lepisma (Zygentoma). As a consequence, the monophyly of Hexapoda, Entognatha and Ectognatha and Dicondylia received support only in the time-heterogeneous approach. Several artificial clades remain in our analyses which cannot be causally explained unambiguously. However, the examples given here clearly demonstrate that the probability to causally explain some incongruities between different data sets, as well as the correction of certain obvious misplacements, is enhanced by using more complex but realistic models. The present study aimed to incorporate background knowledge on the evolution of molecular sequences in general and ribosomal RNA-genes in special into various steps of data processing. For all steps fully automated methods were used, including an automated secondary structure guided alignment approach, a software that enables to distinguish random similarity from putative phylogenetic signal, mixed models that avoid artefacts due to co-variation among sites, and analyses that account for variation of evolutionary rates among lineages. The resolution of many relationships among arthropods, and the minimization of obvious misplacements demonstrate that the increased computational effort pays off.


Abstracto

A functional human homologue of Escherichia coli endonuclease III (Nth-Eco protein) has recently been cloned and characterized [Aspinwall, R., Rothwell, D. G., Roldan-Arjona, T., Anselmino, C., Ward, C. J., Cheadle, J. P., Sampson, J. R., Lindahl, T., Harris, P. C., and Hickson, I. D. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. ESTADOS UNIDOS., 94, 109−114]. This enzyme, designated hNTH1 protein, shares an extensive sequence similarity with Nth-Eco protein and a related enzyme from Schizosaccharomyces pombe (Nth-Spo protein). We investigated the substrate specificity of this human enzyme for oxidative DNA base damage, using the technique of gas chromatography/isotope-dilution mass spectrometry. Four different DNA substrates damaged by various free radical-generating systems were used. 5-Hydroxycytosine, thymine glycol, 5-hydroxy-6-hydrothymine, 5,6-dihydroxycytosine, and 5-hydroxyuracil were substrates of hNTH1 protein among 17 lesions found in DNA substrates. The substrate specificity and excision kinetics of the human enzyme were found to be significantly different from those of Nth-Spo and Nth-Eco proteins.

To whom correspondence should be addressed.

National Institute of Standards and Technology.

Department of Toxicology, Faculty of Pharmacy, Gazi University, Ankara, Turkey.

Departamento de Genética, Facultad de Ciencias, Universidad de Cordoba, Cordoba, Spain.


Información suplementaria

This file contains Supplementary Text and Data, Supplementary Figures, Supplementary Tables and additional references (see Contents for details). This file was updated on 3 July 2013 to correctly display figure S1.3 (PDF 20068 kb)

Figuras complementarias

This file contains Supplementary Figures S6.8-S6.38, which show DNA fragmentation and nucleotide misincorporation patterns for mitochondrial reads from other ancient samples analyzed in this study. (PDF 2191 kb)

Supplementary Tables

This zipped file contains Supplementary Tables 4.2, 4.3, 4.4, 5.9, 11.3, 11.4, 11.7 and 12.8. (ZIP 10146 kb)


Ver el vídeo: Capítulo 3 Célula Eucariota y Flujo de la Información Genética de Biología (Agosto 2022).