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Lisis de células bacterianas: ¿que solución usar?

Lisis de células bacterianas: ¿que solución usar?


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Estoy tratando de determinar qué tan rápido actúan los detergentes sobre las células bacterianas (lisis celular). Me gustaría comparar algunos detergentes a diferentes concentraciones para determinar la actividad bacteriolítica. No me importan todos los metabolitos dentro de las células (proteínas, ADN, etc…). Muchas publicaciones sugieren que a menudo se utilizan soluciones más complicadas. Mi primer pensamiento fue usar un detergente preparado simple en PBS o solución salina para lisar las células. ¿Necesito una solución compleja para lisar las células? ¿Podría alguien darme una sugerencia? Gracias por adelantado.


¿Cuál es exactamente el propósito de lisar las células? Las soluciones "complicadas", como usted dice, incluyen un montón de ingredientes. El detergente está presente en gran medida para disolver las membranas celulares (que están basadas en lípidos) y permitir la extracción de proteínas u otros productos bioquímicos del interior de la célula (y orgánulos en eucariotas). También hay dos tipos de detergentes: iónicos y aniónicos. Ambos tipos de detergente disolverán las membranas, pero los detergentes iónicos tienden a ser más duros de los dos al alterar fuertemente las estructuras de las proteínas.

Si la bioquímica de las proteínas es importante, los siguientes ingredientes más importantes serán los inhibidores específicos de las proteasas: enzimas que degradan las proteínas. Hay muchos de estos, pero algunos ejemplos incluyen PMSF, EDTA, aprotinina, etc.

A veces es necesario amortiguar el pH de la solución de lisis para monitorear los complejos de proteínas, o mantener una proteína natural o mantener el ADN en un rango de pH óptimo. Las soluciones generales para tampones de lisis incluyen Tris-EDTA (TE), PBS, etc. Esta elección depende de si desea un tampón y en qué rango de pH desea mantener su solución de lisis. Los tampones comunes como TE y PBS están hechos para un rango de pH de entre 7-8. Hay otros tampones que se utilizan para rangos de pH bajos (pH 4-6), pero generalmente son menos comunes.

Por último, existen formas de lisar células sin utilizar ningún tipo de tampón de lisis. Un método consiste en utilizar la sonicación, que utiliza pulsos dirigidos de sonido de alta frecuencia para lisar las células cortándolas mecánicamente. Otro método es congelar-descongelar repetidamente las células de -80 ° C a 4 ° C (por lo general, 3 veces es suficiente). La lisis de esta manera se logra mediante la formación repetida de cristales de hielo que cortan las células abiertas, liberando su contenido.

Si tiene una pregunta más específica, uno de nosotros puede guiarlo más, pero esto proporciona una descripción general de lo que está involucrado con los tampones de lisis celular.


Me pregunto cómo planeas medir la lisis. Encontrará que muchos métodos de lisis para E. coli incorporar un tratamiento con lisozima y EDTA. Esto es para que las capas de lipopolisacárido (membrana externa) y peptidoglicano de la envoltura celular puedan romperse antes de agregar detergente (generalmente SDS o Triton X-100) para disolver la membrana interna o citoplasmática. Sospecho que si agrega detergente a las células intactas, no sería particularmente efectivo, y las células que se vean afectadas permanecerán como células desnaturalizadas que, por ejemplo, seguirían contribuyendo a la densidad óptica.

Dado que generalmente son capaces de resistir las sales biliares en el intestino delgado, las bacterias gramnegativas pueden ser bastante resistentes a los detergentes. Por ejemplo muchos Enterobacterias puede crecer en 5% SDS - ver:

Rajagopal, S et al. (2003) Ocho bacterias gramnegativas son 10 000 veces más sensibles a los detergentes catiónicos que a los aniónicos. Canad. J. Mic. 49: 775-779


Bacterias

Las bacterias se clasifican como grampositivas o gramnegativas según la estructura de la pared celular. El peptidoglicano, que consiste en repeticiones de glicano-tetrapéptido conectadas por puentes de penta-glicina, proporciona fuerza y ​​rigidez a la pared celular.

El peptidoglicano tiene una composición similar en ambos tipos de bacterias, sin embargo, en las bacterias Gram positivas es mucho más espeso. Hacia el exterior de la célula Gram-positiva, el peptidoglicano está conectado a los ácidos teicoicos y polisacáridos [1]. La pared de las bacterias Gram-negativas consiste en una membrana lipídica externa que cubre el peptidoglicano en una estructura de dos capas con el espacio periplásmico en Entre. La membrana externa de las bacterias gramnegativas normalmente evita el acceso de las enzimas digestivas al peptidoglicano. Por esa razón, las células Gram negativas normalmente requieren un tratamiento previo con un detergente o un agente quelante para desestabilizar o eliminar la membrana externa antes de la digestión [1, 2].

Las enzimas que escinden el peptidoglicano se denominan mureína hidrolasas y se clasifican en 3 grupos: glicosidasas (escinde cadenas de polisacáridos), endopeptidasas (escinde cadenas polipeptídicas) o amidasas (escisiones entre polisacáridos y péptidos) [1, 2].

Lisozima

Entre las muramidasas, la lisozima es la más utilizada, ya que tiene actividad contra la mayoría de las bacterias Gram negativas y muchas Gram positivas. La lisozima de clara de huevo de gallina es la lisozima más comúnmente utilizada debido a sus actividades, disponibilidad y costo. La hidrólisis extensa de peptidoglicano por lisozima puede ser suficiente para la lisis celular sin medidas adicionales en algunas bacterias. En otros, puede ser necesario un procedimiento adicional, como un choque hipotónico y sensibilización previa, para la lisis completa. El tratamiento con lisozima de células viables de algunas bacterias puede resultar más difícil.

La lisozima se usa comúnmente para la lisis de E. coli, Estreptomicetosy otras bacterias. Además, existen muchos otros usos más allá de la bacteriolisis y la formación de protoplastos, como el control antimicrobiano, la preparación de muestras, la farmacología, así como como potenciador del sabor en algunos alimentos y bebidas.

Otras enzimas bacteriolíticas:

Hay otras enzimas disponibles para las bacterias resistentes a la lisozima (como muchas bacterias Gram positivas) o en los casos en que se desee una alternativa a la lisozima. Ejemplos incluyen:

  • Lisostafina es una endopeptidasa con especificidad por los puentes de pentaglicina del peptidoglicano. Se ha utilizado con cepas de estafilococos y como potencial antimicrobiano [4].
  • Acromopeptidasa es una endopeptidasa de amplio espectro con especificidad por enlaces Lys / - que retiene actividad en SDS al 0,1% y urea 5M. Se ha utilizado para la preparación de protoplastos de Actinomycetes y para la lisis de Staphylococcus y Micrococcus [5].
  • Labios tiene actividades de β-N-acetil-D-glucosamidasa y muramidasa y se ha demostrado que tiene una actividad bacteriolítica de amplio espectro en bacterias gram positivas [6]. Se ha utilizado para la extracción de ADN y otros usos.
  • Mutanolisina se caracterizó por primera vez como un compuesto de 3 enzimas de S. globisporus con β-1,4-N, 6-O-diacetilmuramidasa (M1), β-1,4-N-acetilmuramidasa (M2) y N-acetilmuramil-alanina amidasa ocupaciones. La enzima M1 aislada también puede denominarse mutanolisina [7]. Se ha utilizado para la lisis de Listeria, Lactococcus, Lactobacillus, y Estreptococo, y se ha utilizado para la formación de protoplastos y el aislamiento de ADN.

¿Y los otros detergentes?

Cada proteína es diferente e interactúa con los detergentes de diferentes formas. Si no cree que esté solubilizando todas sus proteínas o si está buscando una interacción proteína-proteína específica, entonces es posible que desee jugar con diferentes detergentes.

CHAPS (3- [(3-colamidopropil) dimetilamonio] -1-propanosulfonato un detergente bipolar) es más áspero que los detergentes no iónicos, pero más suave que los detergentes iónicos. Por lo tanto, puede mantener algunas interacciones proteína-proteína, pero puede ser mejor en la solubilización.

La digitonina es un detergente suave no sinónico similar a NP-40 y Triton X-100. Es muy eficaz para solubilizar proteínas de membrana. Si está buscando una interacción proteína-proteína utilizando co-IP, es posible que desee probar la digitonina. Cuando era estudiante de posgrado, trabajé con dos proteínas que solo co-IP en presencia de digitonina.

Para utilizar estos detergentes, comience con una concentración del 1%.


Tampón de lisis para ácidos nucleicos

La lisis de células para la extracción de ácidos nucleicos es, en cierto modo, mucho más fácil que la extracción de proteínas. Los ácidos nucleicos son mucho más resistentes a la desnaturalización que la mayoría de las proteínas, por lo que se puede utilizar un tampón de lisis desnaturalizante. El tipo de tampón de lisis depende del tipo de ácido nucleico, como ADN genómico, mitocondrial o plásmido, y total o una sustracción de ARN, así como de la fuente celular.

Obtener ARN intacto es más exigente que aislar ADN, debido a la presencia de ARNasas. El tampón de lisis celular para la extracción de ARN es altamente desnaturalizante y generalmente está compuesto de fenol e isotiocianato de guanidina. Los inhibidores de ARNasa suelen estar presentes en el tampón de lisis, ya que las ARNasas pueden ser muy resistentes a la desnaturalización y permanecer activas.

Para la extracción de ADN, el tampón de lisis normalmente contendrá SDS. En la mayoría de los kits para la extracción de plásmidos, el tampón contendrá hidróxido de sodio y SDS, para lisis alcalina. La adición de acetato de potasio a este tampón de lisis permite la renaturalización del ADN plasmídico pero no del ADN bacteriano, que precipita.

Dado que la lisis celular y la extracción de ácidos nucleicos no están sujetas a tantas variables como para las proteínas, la mayor parte de la extracción de ácidos nucleicos se puede realizar con uno de los pocos kits. Los kits contienen típicamente un tampón de lisis celular y una matriz de unión de ácido nucleico y ndash apropiada.

Bio-Rad ofrece una gama de kits para la preparación y purificación de muestras de ácido nucleico, todos incluidos un tampón de lisis celular optimizado para cada kit: aislamiento total de ARN de varios tipos de células, extracción de plásmido y ADN genómico, extracción en gel de agarosa y limpieza de sondas radiomarcadas , traducciones de muescas, plásmidos y mezclas de reacción de PCR.


Lisis celular: ¿qué solución usar? (26 / Abr / 2002)

Soy un químico que hace un poco de preparación y análisis de células. Estoy tratando de determinar qué solución de lisis celular usar. Mi primer pensamiento fue usar un detergente simple o una solución hipotónica para lisar las células. sin embargo, una búsqueda rápida en la literatura sugiere que a menudo se utilizan soluciones más complicadas. ¿Podría alguien darme una breve explicación de los siguientes ingredientes de la solución de lisis celular? Necesito decidir cuáles de estos son necesarios para mis propósitos. Gracias por adelantado.

* Algunas soluciones contienen solución salina 150 mM. ¿Por qué preocuparse por la osmolaridad si planea matar las células?

* Algunas soluciones están tamponadas. ¿Por qué preocuparse por el pH (con fosfato o citrato o HEPES o lo que sea) si planea matar las células?

* Algunas soluciones de lisis contienen EDTA. ¿Por qué usarlo / qué estás quelando?

* ¿Cuándo es apropiado / necesario inhibir las proteasas? ¿Cómo se decide entre las distintas opciones (por ejemplo, DFP vs PMSF vs AEBSF, etc.)?

* ¿Cómo se selecciona el detergente o los detergentes adecuados? A veces se ven mezclas muy simples (por ejemplo, 0,5% de Triton X) pero a veces relativamente complicadas (SDS + NP-40 + desoxicolato de sodio). que debemos usar?

Perdón por la publicación tan larga. Para una respuesta, una oración por tema debería ser suficiente: recibirá la gratitud eterna de un químico confundido.

(PD. Si está interesado, actualmente estoy analizando las células neuronales CATH.a para el contenido de catecolaminas. Pero independientemente de la solución de lisis que use ahora, estoy interesado en los temas anteriores para obtener información general para el futuro).

Los tampones de lisis celular dependen de lo que desee hacer con su lisado:

El EDTA suele quelar los iones de Ca involucrados en la adhesión intercelular e intracelular para que se descomponga mejor las células. También puede quelar iones que son cofactores de ciertas enzimas.

Los inhibidores de proteasa se utilizan para evitar que la proteína se degrade si es una proteína que le interesa. Los diferentes inhibidores usados ​​tienen diferentes especificidades para inhibir ciertas familias de proteasas, p. Ej. PMSF para serina proteasas.

Se necesita un control adecuado del pH para mantener la actividad de las proteínas para los ensayos enzimáticos, etc., de modo que no se desplieguen y se vuelvan inativos o, en el caso de los occidentales, pierdan su antigenicidad. Lo mismo para mantener la osmolaridad.

Nuevamente, con la elección del detergente, puede romper selectivamente diferentes membranas para liberar el contenido.


Lisis del huésped por bacteriófago

Perspectiva

La lisis se consideró una vez una consecuencia bastante trivial e inevitable de la infección por bacteriófagos, una consecuencia indirecta de la extensa redirección de las funciones biosintéticas y de mantenimiento del hospedador hacia los propósitos del virus. Sin embargo, ahora está claro que la lisis es un proceso cuidadosamente orquestado y regulado programado por el fago. Además, la base molecular del evento lítico y su regulación son de un interés convincente, que implica aspectos fundamentales del comportamiento de las proteínas de membrana y también de la función de la vía de biosíntesis de la pared celular bacteriana. La disponibilidad de la tradicionalmente poderosa facilidad genética de los fagos, junto con los enfoques genómicos, proteómicos y estructurales modernos, promete un rápido progreso en nuestra comprensión de este proceso biológico fundamental.


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Lisis de E. coli por lisozima - (17 / Jul / 2010)

Estoy tratando de lisar E. coli con lisozima. He buscado bajo y alto, en la mayoría de los protocolos dice usar 1 mg / ml para lisar las bacterias. Pero cuando volví a la literatura muy antigua, la mayoría usaba 0.02 mg / ml de lisozima para lisar bacterias.
Lo intenté con una concentración diferente y encontré resultados interesantes:
1. E coli no tratada con EDTA nunca se lisó
2. E. coli tratada con EDTA se lisó bien desde 0,02 mg / ml hasta 1 mg / ml (la solución se vuelve translúcida)
3. E. coli tratada con alta concentración de lisozima & gt2 mg / ml no lisada. la solución en realidad se volvió muy muy turbia, muy extraña
4. No importa la cantidad de lisozima, la solución nunca se vuelve completamente transparente. Por ejemplo, cuando se transfiere una pequeña cantidad de la muestra 2 anterior después de la lisis a una solución fresca de células E coli, la lisis ocurre pero nunca se completa (juzgue por la transparencia). Significa:
a) ¿las lisozimas están activas pero de alguna manera no lisan todas las células?
¿La solución nunca sale clara porque la capa de peptidoglicano solo hidroliza parcialmente por lisozima, otras moléculas grandes unidas covalentemente pero rotas por lisozima?
c) el LPS es demasiado grande para que fluya en la solución y contribuya a que no sea 100% transparente

En comparación con la sonicación, siempre obtengo un lisado muy claro. El tratamiento con lisozme solo puede proporcionarme lisado

50% transparente en comparación con el tratamiento con sonicación.

¿Alguien tiene un muy buen tratamiento con lisozima para lisar e coli 100%?

Hola, mi nombre es Mary Ann Santos y soy científica de producto de InVitria. Me gustaría compartir con ustedes los beneficios de Lysobac, nuestra lisozima humana recombinante libre de animales que se utiliza en la lisis eficaz de células de E. coli. A continuación se muestra una breve descripción de este producto:

Lysobac® es un gran avance para la lisis de células bacterianas y se puede utilizar en aplicaciones de diagnóstico, bioprocesamiento e investigación en ciencias de la vida. Lysobac es lisozima humana recombinante producida en un sistema de producción libre de animales. La producción sin animales elimina el riesgo de seguridad y el desempeño inconsistente entre lotes de la lisozima de clara de huevo de gallina. Lysobac tiene una bioactividad significativamente mayor que la lisozima de clara de huevo de gallina. Un gramo de Lysobac reemplaza 4 gramos de lisozima de clara de huevo de gallina. Lysobac también proporciona una suave lisis celular, a diferencia de la lisis mecánica, que puede provocar el cizallamiento de proteínas y reducir la producción de proteínas hasta en un 20%. Cuando se agrega a la lisis mecánica, puede proporcionar una lisis más completa, aumentando la producción de proteínas.

Mejora la eficiencia de la fermentación bacteriana
Mayor actividad de lisis bacteriana por mg
1 gramo de Lysobac proporciona más actividad de lisis que 4 gramos de HEWL
Sin animales y consistente que conduce a una eficiencia regulatoria mejorada para la fabricación de medicamentos
Rendimiento de proteína recombinante mejorado en comparación con la lisis mecánica
Reduce el costo de los bienes

Trabajamos con grupos que usan Lysobac solo para lisar su E. coli. En estos casos, han reducido sus concentraciones habituales de lisozima de gallina como se describió anteriormente y han dado como resultado una lisis completa.

También trabajamos con grupos que combinan Lysobac con sonicación. Uno de los grupos dijo que usaban regularmente lisozima de gallina en combinación con congelación-descongelación o sonicación y pudieron reducir su concentración de lisozima 4 veces y dieron como resultado una lisis más completa. La combinación de 0,1 mg / ml de Lysobac con sonicación ha dado los mejores resultados.

Por último, la tabla adjunta muestra el efecto sinérgico de Lysobac cuando se utiliza en combinación con EDTA (las concentraciones están en microgramos / ml).

No dude en ponerse en contacto conmigo en [email protected] si desea obtener una muestra de Lysobac para su evaluación o si necesita más información.

Solo quería dirigirte a la página web a continuación. También encontrará un enlace a un artículo de revista que puede ser de su interés en esta página (lado derecho).


Ver el vídeo: Next Science Biofilm Disruption Technology (Junio 2022).