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Reparación de cortes de vector de clonación digeridos con fosfatasa antártica y ligados con enzima T4

Reparación de cortes de vector de clonación digeridos con fosfatasa antártica y ligados con enzima T4



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El producto de vector obtenido por ligación entre un vector previamente digerido con fosfatasa antártica carece de grupos fosfato 5 '. La ligasa T4 puede ligarla a un inserto con extremos pegajosos complementarios que proporciona 2 grupos fosfato. ¡Pero todavía hay 2 mellas en el producto vectorial! ¿Cómo se reparan normalmente?


Las mellas no se reparan durante la preparación. En cambio, el vector (que es circular, a pesar de las mellas) se transforma en el huésped donde se repara mediante mecanismos endógenos, probablemente a través de la escisión de la base.


Biotecnología molecular, Capítulo 3

Son endonucleasas de restricción que pueden cortar moléculas de ADN en sitios específicos llamados sitios de reconocimiento. Los sitios de reconocimiento contienen SECUENCIAS DE ADN PALINDRÓMICO y tienen una longitud de entre 4 y 8 bps.

La base más importante de la tecnología del ADN recombinante es la presencia de endonucleasas de restricción. Las enzimas de restricción dividen las grandes moléculas de ADN en fragmentos más pequeños y manejables. Esto es necesario para manipular el fragmento de ADN y en experimentos de clonación de genes. Además, la escisión del ADN mediante enzimas de restricción es MUY ESPECÍFICA. ASÍ, las endonucleasas de restricción ayudan a cortar la muestra de ADN de una manera reproducible.

El plásmido pCEL1 es un plásmido circular de doble hebra y se trata con enzimas de restricción de una en una y en combinaciones. Las bandas obtenidas en pares basados:

Por tanto, el tamaño del plásmido pCEL1 es de 6 kilopares de bases porque produce un único fragmento de 6,0 kb de longitud en la digestión con EcoRI, BamHI y HindIII. También tiene un sitio de reconocimiento único para estas 3 enzimas. Tiene tres sitios para HaeII

tamaño del plásmido - & gt 4.361 pb
tiene dos genes que le dan resistencia a ampicilina y tetraciclina. se denominan genes Amp ^ r y Tet ^ r.

El gen Tet ^ r tiene sitios de reconocimiento únicos BamHI, SaII y HindII. El gen amp ^ r tiene un sitio PstI único, hay un gen EcoRI único fuera del ADN codificante

tiene un origen de replicación para la replicación del ADN que trabaja en E. coli

se mantiene como un plásmido de alto número de copias que incluye la célula de E. coli.

El ADN diana se combina ahora con el ADN plasmídico y se liga usando la enzima T4 ADN ligasa y ATP. Esto produce una mezcla de plásmidos recombinantes que tienen el ADN diana y plásmidos no recombinantes que surgen debido a la autoligación del ADN plasmídico. A continuación, estos plásmidos se transforman en las células de E. coli huésped.

Las células que contienen el ADN clonado se identifican seleccionando las células TRANSFORMADAS para los dos marcadores de resistencia a antibióticos que están presentes en el plásmido.

Inmediatamente después de la transformación, las células se incuban en un medio libre de abx para permitir que las células crezcan y expresen los genes de resistencia a abx. A continuación, las células se cultivan en el abx cuyo gen de resistencia en el plásmido está intacto.
así que, por ejemplo, si el ADN diana se inserta en el sitio BamHI del gen Tet ^ r, entonces las células se cultivan primero en un medio que contiene ampilcina (el gen de resistencia en el plásmido está intacto) Las células que no se han transformado no sobreviven en este medio. Las células transformadas con y sin el ADN diana crecen en este medio.

La inserción del ADN diana en el sitio BamHI altera el gen Tet ^ r y la célula que contiene este plásmido ya no es resistente a la tetraciclina. Solo es resistente a la ampicilina. Si el plásmido no contiene el inserto de ADN, entonces tiene un gen Tet ^ r intacto y es resistente a ambos antibióticos.

por lo tanto, en el siguiente paso, las células que han crecido en medio de ampicilina se colocan en placas sobre un medio con tetraciclina marcando las posiciones relativas de las colonias.
Sólo las células que contienen el gen Tet ^ r intacto, que son los plásmidos autoligados, crecen en este medio.

tamaño - & gt 2,686 bp
tiene un gen que le da resistencia a la ampicilina abx. conocido como gen amp ^ r.

también contiene una región del gen de la B-galactosidasa (lacZ) que es parte del operón lactosa en E. coli. esto está bajo el control del promotor lac que puede regularse. el gen lacI también está presente y produce la proteína represora que ayuda a regular el gen lacZ

tiene un origen de replicación del plásmido pBR322 para la replicación del ADN que trabaja en E. coli.

contiene un segmento de ADN corto llamado sitio de clonación múltiple o polienlazador. esto tiene un número de sitios de clonación únicos que están agrupados. por ejemplo, EcoRI, BamHI, HincII, PstI, SacI, etc. son algunos de los sitios presentes en el sitio de clonación múltiple. Está presente en el gen lacZ y no afecta la producción de la enzima.

el ADN diana ahora se combina con el ADN plasmídico y se liga usando la enzima T4 ADN ligasa y ATP

esto produce una mezcla de plásmidos recombinantes que tienen el ADN diana y plásmidos no recombinantes que surgen debido a la autoligación del ADN plasmídico. estos plásmidos luego se transforman en las células hospedadoras de E. coli.

las células huésped deberían poder producir la otra parte de la B-galactosidasa llamada LacZa. esto se combina con la porción de la enzima producida por el gen lacZ y forma una enzima activa.

Se usa un medio que contiene ampicilina, IPTG y X-Gal para hacer crecer las células huésped tratadas. IPTG actúa como un inductor del operón lac y X-Gal actúa como sustrato para la B-galactosidasa. tras la hidrólisis, X-Gal produce un compuesto de color azul. la presencia de ampicilina asegura que las células no transformadas no crezcan en el medio

las células que se han transformado con plásmidos autoligados producen la enzima B-galactosidasa activa e hidrolizan X-Gal para producir colonias de color azul. Las células que se han transformado con el plásmido recombinante no producirán la enzima activa y producirán colonias de color blanco. esto se debe a que el ADN diana que se introduce en el sitio de clonación múltiple interrumpe el gen lacZ y, por lo tanto, NO SE PRODUCE LA ENZIMA ACTIVA


Búferes de reacción

  • El tampón de ADN ligasa T4 (NEB # B0202) debe descongelarse en el banco o en la palma de su mano, y no a 37 ° C (para evitar la descomposición del ATP).
  • Una vez descongelado, el tampón de ADN ligasa T4 debe colocarse en hielo.
  • Las ligaciones se pueden realizar en cualquiera de los cuatro tampones NEB de endonucleasa de restricción estándar o en tampón polinucleótido quinasa T4 (NEB # B0201) si se complementan con ATP 1 mM.
  • Al complementar con ATP, use ribo ATP (NEB # P0756). Deoxyribo ATP no funcionará.
  • Antes de la ligadura, inactive completamente la enzima de restricción mediante inactivación por calor, columna de centrifugación (NEB # T1030) o purificación con fenol / EtOH.
  • Inactivar por calor (fosfatasa antártica, Quick CiP, rSAP) antes de la ligadura.
  • Mantenga la concentración total de ADN entre 1-10 y microg / ml.
  • Vector: las relaciones molares de inserto entre 1: 1 y 1:10 son óptimas para inserciones individuales (hasta 1:20 para adaptadores cortos). Inserto: la relación molar del vector debe ser 6: 1 para promover múltiples insertos. Utilice NEBioCalculator para calcular las relaciones molares.
  • Para clonar más de un inserto, recomendamos NEBuilder & reg HiFi DNA Assembly Products.
  • Si no está seguro de la concentración de su ADN, realice varias ligaduras con proporciones variables.

Subclonación

La subclonación es el proceso de mover el ADN del inserto de un vector a otro mediante la preparación del inserto de ADN y el nuevo vector por separado, ligarlos y seleccionar los clones de la mezcla resultante para identificar el subclón deseado.

La subclonación se realiza porque el nuevo vector o la nueva disposición de insertos de ADN en el subclon planificado ofrece alguna ventaja sobre el antiguo vector o disposición.

Aunque hay tantas ventajas potenciales como vectores y hay cientos, si no miles, de vectores diferentes. Sin embargo, existen algunos temas comunes. Una es que el vector de clonación óptimo, el fago lambda, no es óptimo para producir fácilmente grandes cantidades de ADN para su uso en otros fines, como el aislamiento de fragmentos para subclonación. Para resolver esto, el ADN recién clonado de una biblioteca lambda generalmente se subclona inmediatamente en un vector plásmido, que ofrece rendimientos mucho mayores de ADN con mucha más facilidad que el fago lambda.

En un caso típico, se aísla un ADNc (ADN complementario) para un gen específico clonando un solo fago recombinante (virus bacteriano) de una biblioteca de ADNc de fagos recombinantes. El fago tiene un genoma de ADN muy grande y el ADNc clonado representa solo del 2 al 5% del mismo. Después de un día de trabajo, se pueden aislar quizás 25 microgramos de ADN de fago, que contiene solo de 0,5 a 1 microgramos de ADNc. Subclonarlo primero en otro vector de subclonación de propósito general, simplemente para permitir que se haga más fácilmente. A partir de una construcción de vector de subclonación de este tipo, es fácil hacer múltiples cantidades de miligramos de ADNc en poco tiempo.

Otra razón para subclonar es poner el ADN de interés en un nuevo contexto para la expresión como ARN y / o proteína. Normalmente, la expresión requiere un promotor y un terminador para iniciar y detener la síntesis de ARNm y un componente necesario para la traducción: un sitio de unión al ribosoma y un marco de lectura abierto que comienza con un codón de inicio (ATG) y termina con un codón de terminación. Los vectores que están diseñados para la expresión génica suelen proporcionar todo excepto el marco de lectura abierto. Los vectores de clonación típicos (generalmente fagos) y los vectores de subclonación típicos de uso general (plásmidos) no contienen todos estos elementos. Los elementos de expresión difieren mucho y no son compatibles entre los tipos de organismos en los que se desea la expresión: bacterias, levaduras, células de insectos, células de animales vertebrados, células vegetales, por lo que se debe utilizar un vector diferente para cada uno.

Finalmente, para obtener un cambio específico en el ADN, se manipula enzimáticamente (completamente in vitro, en el tubo de ensayo). Esto se puede hacer para producir fusiones de dos piezas de ADN, deleciones de parte del ADN o mutaciones (cambios en la secuencia de ADN). Normalmente, estas manipulaciones enzimáticas producen el ADN deseado en cantidades muy pequeñas y, a menudo, desconocidas e indetectables. Para ser útil, el ADN resultante (deseado) debe subclonarse y amplificarse en bacterias.

PCR y su uso para subclonación

La PCR se puede usar para preparar ADN de interés para ligarlo en un subclon o para otras manipulaciones in vitro, como secuenciación de ADN o mapeo de restricción. Sin embargo, cuando se usa de manera preparativa de esta manera, la PCR puede presentar problemas. Un problema es que la PCR produce una cantidad bastante pequeña de ADN, con un rendimiento decreciente a medida que el ADN se alarga. La PCR no funciona muy bien con ADN de más de 1000 pares de bases, y la mayoría de los ADNc son más grandes que eso. Además, la amplificación por PCR introduce mutaciones aleatoriamente a una velocidad de una por cada 2 o 3 kilopares de bases, por lo que cualquier subclón resultante (o secuencia de ADN o mapeo) puede realizarse comenzando con una mezcla compleja de ADN amplificados. Además, el ADN amplificado por PCR está muy contaminado por los cebadores cortos de ADN monocatenario que interfieren con el procesamiento necesario para subclonar el ADN elaborado por PCR. Dichos cebadores deben eliminarse antes de cualquier procesamiento, y este es un paso adicional que no es trivial de realizar sin perder una cantidad significativa del producto de PCR deseado. Además, el ADN elaborado mediante amplificación por PCR, que es lineal, se subclona mejor si sus extremos se cortan con una o dos enzimas de restricción; sin embargo, muchas enzimas de restricción no cortan bien el ADN amplificado por PCR cerca de sus extremos a menos que las condiciones estén especialmente optimizadas. Para empeorar las cosas, a diferencia de los insertos cortados de plásmidos, uno no puede saber mediante el análisis en gel de agarosa si los extremos del ADN amplificado por PCR han sido cortados por enzimas de restricción, por lo que una falla en el corte aparece como una falla de subclonación solo después de varios días de uso adicional. esfuerzo.

Los métodos de PCR avanzados permiten la ligación mediada por PCR del ADN amplificado en el vector mediante el uso de cebadores de PCR que se aparean tanto con la secuencia de interés como con el ADN del vector. Aunque esto requiere cebadores más largos, el costo de la síntesis de cebadores se ha reducido drásticamente en los últimos años, de modo que los cebadores más largos son bastante asequibles. El problema del bajo rendimiento no es importante con estos métodos, ya que la inserción mediada por PCR no requiere el uso de ADN ligasa y las bacterias pueden amplificar incluso las cantidades extremadamente pequeñas de producto de ADN circular de este método. El principal problema restante es el de la alta tasa de error de las ADN polimerasas de alta temperatura utilizadas en la PCR.

Metodología de subclonación tradicional (escisión-ligadura)

Preparación del inserto de ADN

El ADN "insertado", que es el ADN que se colocará en un nuevo vector mediante subclonación, se puede obtener de otro plásmido, del ADN del fago, del ADN genómico, del ADNc elaborado por la transcriptasa inversa o de cualquiera de estos ADN que tenga ha sido amplificado por PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Además, el ADN sintético se puede utilizar como inserto. Sin embargo, consulte la sección anterior que describe las desventajas de preparar ADN para su uso en subclonación mediante amplificación por PCR. En la forma más tradicional de subclonación, el ADN que se subclona se escinde de otro clon o subclon de ADN usando digestión con endonucleasas de restricción.

Tradicionalmente, el ADN de inserción cortado de su ADN de origen (generalmente fago o plásmido) por digestión de restricción, debe aislarse de las otras piezas de ADN resultantes de la reacción de digestión. Esta separación de los fragmentos de ADN se realiza mediante electroforesis en gel de agarosa. Luego, la banda de ADN de interés se corta literalmente del gel con una cuchilla de afeitar y el ADN del trozo de agarosa se extrae mediante uno de varios métodos. Estos métodos eliminan los fragmentos de agarosa que interfieren con el paso de ligación posterior.

Para la subclonación, la elección de cómo cortar el ADN del inserto de su contexto de ADN previo (inicial) depende de qué sitios de enzimas de restricción estén disponibles para ese propósito y en qué otro lugar esas enzimas cortan el ADN del inserto y su vector inicial. Es deseable que las enzimas que cortan el ADN del inserto no se corten dentro del ADN del inserto y que dejen un voladizo corto de una sola hebra que sea compatible con el voladizo formado al abrir el ADN del vector de subclonación (ver más abajo). Si es posible, se deben usar dos enzimas diferentes para cortar el inserto de ADN (una en cada extremo), ya que eso permite la "subclonación direccional" (ver más abajo). En algunos casos, puede que no sea posible evitar el corte con una enzima que también corta dentro del ADN del inserto. En tales casos, se realiza una digestión de restricción parcial para producir el fragmento de ADN deseado. Esto se hace cortando el vector inicial con un inserto en una reacción que no se completa, por lo que solo se cortan algunos de los sitios de ADN. Dado que la enzima corta los sitios en cada molécula al azar, se producen todos los posibles productos de digestión parcial, incluidos algunos fragmentos de ADN que continúan con los sitios de restricción internos no cortados. En algunos casos, se debe usar una enzima de restricción de "extremos romos" para cortar uno o ambos extremos del ADN del inserto. En esos casos, la subclonación es más difícil porque no hay "extremos pegajosos" (salientes) para ayudar a que el ADN se una a la ligasa de ADN. Tales ligaciones, aunque posibles, son algo menos eficientes (menos positivos de los subclones resultantes) que aquellas con fragmentos con proyecciones en ambos extremos. Dado que los extremos del ADN del inserto preparado deben poder ligarse con los extremos preparados del ADN del vector, es posible que, aunque se puedan producir proyecciones en cada uno, es posible que no se puedan generar con las mismas enzimas debido a la falta de secuencias de reconocimiento disponibles o útiles. En algunos casos, las enzimas con diferentes secuencias de reconocimiento pueden producir proyecciones compatibles (como BamHI y BglII o NcoI y SalI). De lo contrario, los voladizos se pueden convertir en extremos romos recortando o rellenando el extremo rebajado con ADN polimerasa.

El ADN vectorial

Dado que el objetivo de la subclonación es crear una nueva construcción de ADN (vector + inserto) que contenga el inserto de ADN, el fragmento de inserto de ADN se ligará en un sitio en el vector de ADN deseado (normalmente un plásmido). Para preparar el ADN del vector para esta ligación, debe cortarse (abrirse) en el sitio donde se desea ligar el inserto. A diferencia del ADN de inserción, las digestiones parciales normalmente no son factibles con vectores y el sitio de inserción debe consistir en uno o dos sitios de enzimas de restricción únicos en el lugar apropiado del vector en relación con las secuencias necesarias para la expresión u otra función biológica (si existe) y en relación con mutuamente. La presencia o ausencia de los sitios de restricción apropiados en el ADN del inserto y el vector restringen fuertemente el proceso de subclonación y cuando esas restricciones son demasiado restrictivas, a menudo se debe realizar un esfuerzo considerable para trabajar alrededor de ellas. A veces, cuando un sitio específico no está presente en el inserto de ADN, el inserto de ADN se puede subclonar primero en el sitio de clonación múltiple de otro plásmido, luego se puede cortar con las enzimas necesarias para la subclonación en el vector diana real. Alternativamente, los sitios de la enzima de restricción en un vector se pueden cambiar abriendo el vector y ligándose a esa apertura los "adaptadores" o "enlazadores" de ADN sintético que introducen un nuevo sitio de endonucleasa de restricción. Finalmente, se puede agregar un sitio de restricción a un inserto de ADN donde antes no había ninguno mediante el uso de mutagénesis específica del sitio, una metodología principalmente distinta.

En la práctica, para la preparación del ADN del vector, a menudo es suficiente simplemente cortarlo con una o dos enzimas necesarias para abrir el sitio de subclonación y luego desnaturalizar o eliminar las enzimas de restricción, ya que interferirán con la ligación posterior. Sin embargo, por varias razones, a menudo es deseable purificar en gel el ADN del vector linealizado (cortado) separándolo en un gel de agarosa y aislando el ADN del gel cortando un trozo de agarosa como se describió anteriormente para el inserto de ADN. Para los vectores de ADN lineales tales como lambda y derivados, cada "brazo" del ADN del vector se aísla como fragmentos de ADN distintos. Una razón para la purificación en gel de los fragmentos de ADN del vector que se usarán en la subclonación es que esto elimina la necesidad de usar ADN de vector altamente purificado (es decir, sobre gradiente de densidad de CsCl). En segundo lugar, cuando se elimina mediante purificación en gel, no hay posibilidad de que el "fragmento de relleno" (el fragmento de ADN entre los dos sitios de restricción en el vector) se vuelva a ligar en el vector durante la subclonación. En tercer lugar, es posible que el vector no se abra por completo y cualquier vector que quede sin cortar tiende a interferir fuertemente con la selección posterior de subclones. El vector original sin cortar generalmente se puede eliminar fácilmente mediante la purificación en gel de los vectores lineales (debido a las diferencias de tamaño) y la purificación de los vectores plasmídicos, ya que el ADN plasmídico circular y superenrollado migran de manera diferente en un gel que el fragmento de ADN lineal. Generalmente, siempre es mejor purificar en gel el ADN del vector, ya que proporciona más robustez (menos probabilidad de falla). Dado que el ADN del inserto generalmente se purifica en gel, el vector se puede realizar al mismo tiempo prácticamente sin costo de mano de obra adicional.

Subclonación direccional

En la mayoría de los casos, es importante que el ADN de inserción se subclone de manera que esté en una orientación correcta en el sitio del vector, típicamente para la expresión como ARN y / o proteína. Si el vector se abre con una sola enzima de restricción y el ADN del inserto tiene los mismos salientes en ambos extremos, es posible que el ADN del inserto se ligue en el sitio del vector en cualquiera de las dos orientaciones. Si se hace esto, los subclones deben seleccionarse no solo por la presencia en el ADN del inserto, sino también por la orientación del inserto en relación con el vector. Tales ligaciones de "extremos similares" también están sujetas a la re-ligadura del vector en ausencia de cualquier inserto de ADN, lo que da como resultado un alto "fondo" de subclones candidatos de inserto negativo. Ambos problemas pueden eliminarse si se utilizan dos enzimas de restricción diferentes para abrir el vector y preparar el ADN de inserción. Para que esto funcione correctamente, las dos enzimas deben dejar "salientes" de ADN incompatibles para que no se liguen con el otro extremo. Esto limita la ligadura del inserto en el vector a los casos en los que el inserto está orientado de la forma deseada. Esto se llama "subclonación direccional". Como todas las cosas buenas, presenta al menos un nuevo problema. Mientras se corta el inserto de su vector anterior utilizando dos enzimas de restricción diferentes, es fácil saber a partir del gel de preparación de fragmentos si la digestión alcanzó el nivel deseado de finalización por la presencia del fragmento de ADN del inserto deseado, normalmente no ocurre lo mismo. cierto para el doble corte del nuevo vector. Mientras se corta el ADN del nuevo vector con dos enzimas, los sitios suelen estar tan cerca uno del otro (en la "secuencia de clonación múltiple" o MCS) que una vez no se puede saber a partir de una separación en gel si ambas enzimas o solo una cortan el vector. Si una de las dos enzimas corta de manera ineficaz, la ligación tendrá un fondo alto y un rendimiento relativamente bajo del subclon deseado. Para empeorar las cosas, muchas enzimas de restricción no cortan bien cerca del final de un fragmento de ADN, por lo que a menudo cortar con una inhibirá la reacción de la otra. Además, si una de las dos enzimas utilizadas es un cortador de punta roma, la reducción en la eficiencia de la ligadura es tan grande que generalmente es mejor seguir con una ligadura de "extremos similares" (sitio de una sola enzima) con una enzima que deja un saliente, y simplemente filtra los subclones para orientación más tarde.

Reducir el fondo de las ligaciones de extremos similares eliminando el fosfato 5 'en los extremos del ADN del vector

El ADN del vector en un tipo de subclonación de ligación de "extremos similares" se abrió cortando con una única enzima de restricción. Esto significa que los extremos del ADN del vector pueden reasociarse y ligarse sin el inserto de ADN durante la reacción de ligación. Esto se debe a que los extremos de un ADN cortado con una enzima de restricción siempre se pueden reasociar y ligar, esencialmente invirtiendo la acción de la enzima de restricción. No solo es posible que el vector se vuelva a ligar consigo mismo, sino que esta reacción unimolecular se ve en realidad fuertemente favorecida sobre la reacción bimolecular que involucra una molécula de vector con una molécula de inserto de ADN. Esta nueva ligadura del vector sin inserto, sin embargo, no produce el subclon deseado y, por tanto, es un producto de reacción secundaria no deseado. Esta reacción secundaria afecta negativamente el proceso de subclonación de dos maneras. En primer lugar, consume el vector de modo que hay menos disponible para hibridar y ligar al ADN del inserto. En segundo lugar, provoca un fondo más grande de colonias de inserción negativa en la subclonación, disminuyendo la fracción de subclones positivos (eficiencia) y aumentando potencialmente el número de subclones que necesitarán cribarse para obtener la construcción deseada.

Existe un método que reduce la posibilidad de volver a ligar el vector sin ningún inserto de ADN. Este método implica tratar el ADN del vector cortado con una fosfatasa que elimina el fosfato que queda en cada extremo 5 'del ADN cortado. Sin un fosfato en el extremo 5 ', los extremos 5' y 3 'de las hebras del vector no pueden ser ligados por la ADN ligasa (que requiere que el extremo 5' tenga un fosfato). Dado que ninguna de las hebras del ADN del vector se puede volver a ligar con su otro extremo, el vector no se puede recircularizar sin un inserto. Si el inserto está presente y se hibrida con los extremos del vector, la ADN ligasa puede ligar una de las dos hebras (la que tiene el extremo 5 'del ADN del inserto y el extremo 3' del ADN del vector), pero no la otra. uno. Dado que el ADN del inserto suele ser muy largo, existe una gran cantidad de apareamiento de bases de ADN entre las dos roturas de hebra única ("mellas") que quedan después de que se completa la ligadura del inserto con el vector fosfatado. Entonces, aunque el ADN no está completamente ligado (ambas hebras tienen una rotura), el ADN parece a las bacterias como si estuviera completamente ligado con el propósito de que las bacterias lo absorban. Una vez dentro de las células, las roturas de una sola hebra se reparan mediante procesos normales de reparación del ADN.

Ligadura, transformación y siembra en placas para colonias.

Las ligaciones solo requieren una enzima (ADN ligasa T4), un tampón (que incluye el magnesio y el ATP necesarios) y el vector y los fragmentos de ADN insertados. Después de incubarlos juntos, toda la mezcla se pone en bacterias, ya sea "transformando" las bacterias que se vuelven competentes mediante tratamiento químico o por electroporación (haciendo agujeros en las bacterias con un pulso eléctrico corto). Luego, estas bacterias se cultivan en placas de agar que contienen un antibiótico (típicamente ampicilina) que previene el crecimiento de bacterias que no recibieron ningún vector de ADN. Después de la incubación durante la noche, algunas de las numerosas colonias bacterianas de las placas ("subclones") se transfieren a cultivos líquidos individuales y se cultivan pequeñas cantidades (normalmente 3 ml de cultivo) como suspensiones para el aislamiento del ADN plasmídico, que luego se criba. Por lo general, solo se deben analizar de 5 a 10 subclones para detectar cualquier ligadura. Los subclones también se pueden cribar inmediatamente sin hacerlos crecer como pequeños cultivos en suspensión mediante el uso de PCR analítica. Sin embargo, el cribado por PCR generalmente solo detecta la presencia de parte del ADN del inserto. (por lo general es demasiado largo para detectarlo todo) y no verifica si el inserto está intacto. Se puede utilizar para seleccionar la orientación del inserto (un cebador en el inserto y otro en el vector), pero esto no detecta reordenamientos inusuales (y ciertamente infrecuentes) que a veces ocurren durante las ligaduras, particularmente durante las subclonaciones que ocurren con baja eficiencia.

Debido a que el aislamiento y el cribado del plásmido suelen tardar uno o dos días más, es muy útil evitar hacer esto si la ligadura no funcionó bien. Esta alerta temprana requiere que se realicen algunas observaciones útiles en el momento de la aparición de colonias bacterianas en las placas. Lamentablemente, dos métodos sencillos no son fiables ni de aplicación generalizada. Un método simple es usar un vector con una cadena A de LacZ (beta-galactosidasa) que complementa una versión corta de LacZ en las células y cataliza una reacción que convierte la colonia en azul si se incluye un sustrato cromogénico (X-Gal) en el agar en placa. Si el inserto de ADN está presente, la secuencia de la cadena LacZ A se interrumpe y no se produce una versión funcional de la misma y la colonia no se vuelve azul. Este método de preselección de colonias no puede usarse en vectores de expresión porque las secuencias de LacZ interfieren con la expresión del ADNc del vector. Además, a menudo falla, ya que las bacterias a menudo vuelven a ligar (cierran) un vector abierto sin incluir un ADN insertado, pero a menudo con una pequeña mutación en el sitio de subclonación que evita que la cadena A de Lac Z funcione (por lo tanto, colonias blancas sin inserciones). Esto es particularmente común con inserciones de extremos romos y subclonación direccional, pero ocurre con frecuencia incluso con subclonación de extremos similares (particularmente si el ADN del vector se trató con fosfatasa).

El segundo método simple para obtener una advertencia temprana sobre una ligadura fallida es simplemente contar las colonias de subclones. Sin embargo, el número de colonias varía mucho, en parte debido a la variación del fondo y los recuentos positivos. Sin embargo, los recuentos simples de colonias son informativos cuando se comparan con los controles adecuados. Para hacer esto, al mismo tiempo que se realiza una reacción de ligación regular (que involucra vector e inserto de ADN), se realiza una segunda ligadura de control que contiene ADN de vector pero no inserta ADN. Los recuentos de colonias de la ligadura de control pueden servir como una indicación de los antecedentes. Si la reacción de ligación que contiene el inserto de ADN da como resultado un aumento significativo en los recuentos de colonias compartidas con respecto a la reacción de control sin inserto, entonces la ligación probablemente fue exitosa. Si no hay un aumento en el recuento de colonias como resultado de la inclusión del ADN del inserto en la reacción de ligadura, entonces es probable que la ligadura falle. Tenga en cuenta que esta interpretación hace la suposición lógica de que el vector no se puede ligar sin inserto. Ésta es una suposición válida para la subclonación direccional y para las ligaciones con extremos similares en las que el vector se ha tratado con fosfatasa, pero no es válida con ligaciones con extremos similares que no emplearon el tratamiento con fosfatasa del ADN del vector.

Cribado de subclones

El ADN plasmídico subclónico aislado se criba habitualmente mediante digestión con enzimas de restricción y electroforesis en gel de agarosa. Normalmente (aunque no siempre), esto se hace con la enzima o las enzimas utilizadas para abrir el vector y preparar el inserto. Para las ligaduras con extremos similares, el proceso de selección generalmente implica dos pasos. En primer lugar, se debe realizar el cribado para encontrar qué subclones son positivos para la presencia del ADN del inserto utilizando la enzima que se utilizó para preparar el ADN del inserto y el ADN del vector para la ligación. El segundo paso luego analiza los positivos para el inserto de ADN para determinar la orientación del inserto en el vector. Este "cribado de orientación" se realiza habitualmente con una o dos enzimas que cortan el vector y el ADN insertado de forma asimétrica para distinguir las dos orientaciones. Se puede predecir que las dos orientaciones producirán diferentes patrones de fragancia del resumen, y estos se utilizan para asignar la orientación del inserto en cada subclon candidato. En algunas subclonaciones, la primera selección y selección de orientación se puede realizar con una única digestión de selección, aunque dicha digestión no se puede realizar con la misma enzima que se utilizó para abrir el vector para la ligación.


DISCUSIÓN

En el presente estudio, hemos demostrado que la integración de un AT-DRS largo en una región no frágil puede impulsar la expresión de un sitio frágil. Esto proporciona una evidencia clara del papel directo de los AT-DRS en el impulso de la fragilidad cromosómica. Además, encontramos que los fragmentos de ADN derivados del AT-DRS integrado tienen una mayor tendencia a formar estructuras secundarias estables en un estado monocatenario, lo que explica su capacidad para perturbar la replicación del ADN que conduce a la inestabilidad genómica (20). La observación de que una proporción importante (~ 45%) de AT-DRS largos a lo largo del genoma humano reside dentro de regiones cromosómicas inestables definidas citogenéticamente, lo que destaca aún más que las repeticiones de AT-dinucleótidos son un factor clave que predispone las regiones cromosómicas a la fragilidad.

La frecuencia de rotura del FS recién generado fue significativamente menor que la frecuencia en el FRA16C endógeno, del cual se derivó el AT-DRS. Esto indicó que otros factores están contribuyendo a la fragilidad de FRA16C. Curiosamente, en FRA16C, además del AT-DRS largo estudiado aquí, hay tres AT-DRS largos adicionales (& gt400 pb), que demostraron detener la progresión de la horquilla de replicación en condiciones de estrés de replicación (20) y probablemente están contribuyendo a la mayor fragilidad en el sitio endógeno. Además, los datos de tiempo de replicación (http://www.replicationdomain.com) revelan que la región FRA16C endógena se replica más tarde en la fase S en relación con el locus HPRT, por lo que puede aumentar aún más la dificultad para completar la replicación a lo largo de esta región antes de la entrada. en mitosis. Será interesante caracterizar aún más el nuevo sitio frágil generado, mediante el estudio del efecto del AT-DRS sobre la capacidad de la región para completar la replicación durante la fase S. Recent finding showed that fragile regions fail to complete their replication during S-phase and the under-replicated sequences are subjected to repair synthesis during mitosis termed MiDAS ( 34).

The question of whether integration of CFS sequences are sufficient to recapitulate FS-like instability was previously addressed using whole BACs containing FRA3B sequences ( 39). Integration of two adjacent FRA3B BACs, 150 kb each, into a non-fragile ectopic site in human cells was able to confer FS-like instability, implying an inherent instability of these sequences. However, a specific sequence motif responsible for the observed fragility in that study could not be identified. In the present work, however, we showed that a long AT-DRS is able and sufficient to drive the formation of an FS in a non-fragile region in the studied cellular system.

A number of fragile sites are enriched with AT-DRSs that have the potential to form alternative non-B DNA secondary structures ( 10, 21, 29, 40). AT-DRSs >200 bp in length are predicted to readily form secondary structures following unwinding of the DNA double helix during replication ( 10). Under aphidicolin treatment, which leads to uncoupling between the DNA polymerase and the helicase ( 41) longer stretches of ssDNA are exposed, which may enhance the formation of stable secondary structures of the AT-DRSs. Three in vitro studies tested the replication dynamics within plasmids containing different AT-DRSs derived from FRA16D ( 21, 22) and an AT-DRS derived from FRA16B ( 40). In one study ( 21), an ∼500 bp sequence which spans a FRA16D region highly enriched with perfect AT repeats, was shown to stall replication fork progression in yeast in a manner depending on the repeat length. Mfold predictions and gel electrophoresis migration analysis of these fragments suggested that the observed replication perturbation involves secondary structure formation ( 21). This suggestion was recently reinforced by showing that this AT-DRS is targeted by the MUS81 structure-specific endonuclease which cleaves the replication forks stalled at DNA secondary structures along this region ( 42). In another study, cell-free assays showed alleviated polymerase stalling within FRA16D-derived AT-DRSs by the addition of the Werner helicase, implicated in processing of secondary structures arising during replication ( 22). In the third study, a FRA16B-derived AT-rich fragment, cloned into a SV40 replication plasmid, was able to fold into branched secondary structures, promoting polymerase stalling ( 40). The probability to fold into secondary structures was increased when the structure-prone strand served as the lagging strand template ( 40). Recently, using HR reporters it was shown that the Bloom helicase activity and the FANCM fork reversal activity are required for preventing double strand breaks (DSBs) formation along AT-DRSs derived from FRA3B, FRA16C and FRA16D ( 14, 15). In an additional recent study, genome-wide analysis in human cells identified structure forming repeats, including quasi palindromic AT-rich repeats, as principal sites of fork collapse upon ATR inhibition ( 43). All these studies demonstrate that AT-DRSs can perturb the replication progression and generate DSBs. In the current study however, we have directly demonstrated that an AT-DRS that was shown to stall the replication fork progression ( 20) and form highly stable secondary structures (Figure 3B) has the ability to create recurrent chromosomal fragility in a non-fragile region. This provides for the first time a direct evidence for the role of the difficult to replicate AT-DRSs in the mechanism underlying fragile site formation.

DNA DSBs induced by hydroxyurea treatment were recently detected within poly(dA:dT) tracts in the CFSs FRA3B and FRA16D, suggesting that in addition to AT-DRSs, other sequences with potential to form non-B DNA sequences may also contribute to the fragility of CFSs under various stress conditions ( 44).

The landscape of CFS expression differs across cell types. This has been attributed to differences in the availability of replication origins and differences in replication timing programs among cell types ( 6). However, for example, FRA16D and FRA3B that are highly expressed in lymphocytes in which they exhibit a paucity of replication initiation events ( 45), are also expressed in fibroblasts (although to a lesser extent) in which replication initiation events are distributed along the fragility core ( 32, 45, 46). This intrinsic instability suggests that features as AT-DRSs which reside along FRA16D and FRA3B ( 18, 47) predispose these regions to breakage, independently of the tissue specific replication program and together with other key features underlying the fragility along CFSs.

CFSs are preferentially unstable in precancerous lesions and during cancer development [reviewed in ( 9, 48)]. A comprehensive study of the gene pairs involved in all recurrent chromosomal translocations in tumor cells found that over half of breakpoints are mapped to human fragile sites ( 49). Sequences within and flanking three randomly selected pairs of translocations prone genes showed enrichment of AT-DRSs, that were shown to form highly stable secondary structures ( 49). Another study analyzed ∼20 000 translocation breakpoints in cancer genomes and found significant association with potential non-B DNA forming sequences, including AT-DRSs ( 50). AT-DRSs were also found as hot spots for translocations causing genetic syndromes, as in the case of the translocation between chromosomes 11 and 22, t(1122), which underlies the Emanuel syndrome or the supernumerary-der(22)t(1122) syndrome. In most patients the translocation breakpoint is found at the center of the AT-DRS ( 51, 52). All these studies highlight the role of AT-DRSs in genomic instability driving cancer and genetic diseases. In summary, the results presented in the current work highlight the deleterious effect of intrinsic DNA features such as the AT-DRSs in driving recurrent genome instability.


1.4: Enzimas modificadoras del ADN

  • Contribuido por Michael Blaber
  • Profesor (Ciencias Biomédicas) en Florida State University

Metilasas

Así como el estudio del sistema de modificación de restricción bacteriana ha proporcionado una variedad de endonucleasas específicas, también hay una variedad de metilasas de ADN específicas.

  • Las secuencias de reconocimiento de las metilasas son las mismas que las de las endonucleasas asociadas (por ejemplo, la metilasa EcoR1 reconoce y metila en la secuencia GAATTC).
  • Todas las metilasas transfieren el grupo metilo de la S-adenosilmetionina (SAM) a una base específica en la secuencia de reconocimiento, y SAM es un componente necesario en la reacción de metilación.
  • La metilación del ADN generalmente tiene el efecto de proteger el ADN de la endonucleasa de restricción relacionada. Sin embargo, existen metilasas con una especificidad mínima. Por ejemplo, Sss I metilasa metilará residuos de citosina en la secuencia 5 '& hellip CG & hellip 3'. In this case, el ADN metilado estará protegido de una amplia variedad de endonucleasas de restricción.
  • Algunas endonucleasas de restricción solo cortarán el ADN en sus sitios de reconocimiento si el ADN es metilado (por ejemplo, Dpn I).
  • Aún otras endonucleasas de restricción cortarán ambos ADN metilado y no metilado en sus secuencias de reconocimiento (por ejemplo, BamH I).

Represa y dcm Metilación

  • La metilasa codificada por el represa gen (dam metilasa) transfiere un grupo metilo de SAM al N6 posición de la base de adenina en la secuencia 5 '& hellip GATC & hellip 3'.
  • La metilasa codificada por el dcm gen (metilasa dcm) metila la base interna de citosina, en el C5 posición, en las secuencias 5 '& hellip CCAGG & hellip 3' y 5 '& hellip CCTGG & hellip 3'.
  • Casi todas las cepas de E. coli de uso común en la clonación tienen un represa+dcm+ genotipo. El punto aquí es no que particularmente queremos que nuestro ADN esté metilado, pero que para hacer una presa-dcm- alguien tiene que mutar la bacteria y aislar el mutante correcto. Eso aparentemente no se ha hecho con muchas cepas bacterianas. Probablemente porque el represa y dcm La metilación afecta solo a un pequeño subconjunto de endonucleasas de restricción potenciales.

ADN aislado de presa + dcm + son en realidad no se cortará por un modesto subconjunto de endonucleasas de restricción disponibles:

Secuencia de reconocimiento Enzima restrictiva GATC G me ATC
TGATCA Bcl I + -
GATC Mbo yo + -
ATCGAT Cla I + -
TCTAGA Xba yo + -
TCGA Taq I + -
GAAGA Mbo II + -
GGTGA Hph I + -

Puede ser necesario preparar ADN a partir de cepas de E. coli que son dam-dcm- para poder ser cortado por estas enzimas.

ADN polimerasas

Se ha caracterizado una amplia variedad de polimerasas y están disponibles comercialmente. Todas las ADN polimerasas comparten dos características generales:

  1. Añaden nucleótidos a la Extremo 3'-OH de una cartilla
  2. El orden de los nucleótidos en el polinucleótido naciente es plantilla dirigida

Figura 1.4.1:Replicación de ADN

Además de la actividad polimerasa 5 '- & gt3', las polimerasas pueden contener actividad exonucleasa. Esta actividad exonucleasa puede proceder en la dirección 5 '- & gt3' o en la dirección 3 '- & gt5'.

  • La actividad exonucleasa en la dirección 3 '- & gt5' permite que la polimerasa corrija un error si incorpora un nucleótido incorrecto (llamado & quotactividad de corrección de errores& quot). También puede degradar lentamente el extremo 3 'de la imprimación..
  • La actividad exonucleasa en la dirección 5 '- & gt3' le permitirá degradar cualquier otro cebador hibridado que pueda encontrar. Sin actividad de exonucleasa 5 '- & gt3', los cebadores de obstrucción pueden desplazarse físicamente o no, dependiendo de la polimerasa que se utilice.

Las diferentes polimerasas tienen diferentes tasas de error de incorporación incorrecta y diferentes tasas de polimerización.

ADN polimerasa I de E. coli ADN polimerasa I de E. coli - Fragmento de Klenow ADN polimerasa T4 ADN polimerasa T7 Taq DNA polymerase Transcriptasa inversa M-MuLV
Actividad exonucleasa 5 '- & gt3' * *
Actividad exonucleasa 3 '- & gt5' * * * *
Tasa de error (x10 -6) 9 40 & lt1 15 285
Desplazamiento de hebra *
Inactivación por calor * * * *

Usos de polimerasas

Las diversas actividades de las diferentes polimerasas las prestan a una variedad de aplicaciones. Por ejemplo, las endonucleasas de restricción pueden producir fragmentos de ADN con 3 'o 5' nucleótidos y voladizos de quoto.

  • En el caso de voladizos de 5 ', la actividad de polimerasa 5' - & gt3 'puede completarlos para hacer extremos romos.
  • En el caso de salientes 3 ', la actividad exonucleasa 3' - & gt5 'presente en algunas polimerasas (especialmente ADN polimerasa T4) puede "masticar" estos extremos para producir también fragmentos de ADN de extremos romos.

Figura 1.4.2:Actividad de la polimerasa

& quotNick-translation & quot

Este método se utiliza para obtener fragmentos de ADN monocatenarios altamente radiomarcados, que utilizan la actividad exonucleasa 5 '- & gt3' presente en algunas polimerasas (E. coli ADN polimerasa I, por ejemplo).

  • En este método, se hace un corte en un dúplex de ADN de interés (es decir, se corta una de las hebras, véase ADNasa I).
  • Luego se agrega ADN pol I junto con nucleótidos radiomarcados. La actividad de la exonucleasa 5 '- & gt3' mastica el extremo 5 'en el sitio "pinchazo" y la actividad polimerasa incorpora los nucleótidos radiomarcados. El polinucleótido resultante estará altamente radiomarcado y se hibridará con la secuencia de ADN de interés.

Figura 1.4.3:Nick-traducción

  • Las polimerasas termoestables tienen la capacidad de permanecer funcionales a intervalos de temperatura en los que el dúplex de ADN realmente se "fundirá" y se separará. Esto ha permitido el desarrollo de la & quot Reacción en cadena de la polimerasa & quot técnica (PCR), que ha tenido un profundo impacto en la biotecnología moderna. Discutiremos este método en una fecha posterior.
  • La incorporación de bases didesoxi (es decir, sin grupos hidroxilo en el carbono 2 'o 3' del azúcar ribosa) conduce a terminación de la reacción de la polimerasa. Esto se discutirá con mayor detalle más adelante. Sin embargo, esta terminación de la cadena mediante la incorporación de didesoxinucleótidos es la base del método de secuenciación del ADN de Sanger, así como de las terapias para intentar inhibir la replicación viral.

Nucleasas

Nucleasa BAL-31

  • This is an exonucleasa (comienza en los extremos y trabaja hacia adentro) que degradará los extremos 3 'y 5' del ADN bicatenario. No hará escisiones internas ("mellas"), sin embargo, degradará los extremos del ADN en las "mellas" internas existentes (que crean los extremos 3 'y 5').
  • La degradación de los terminales no está coordinada, lo que significa que el producto es no 100% de extremos romos (aunque el dúplex original puede haber tenido extremos romos).
  • Dichos extremos arrancados se pueden hacer romos rellenando y masticando con una polimerasa adecuada (por ejemplo, ADN polimerasa de T4). La definición de unidad de 1 unidad es la cantidad de enzima necesaria para eliminar 200 pares de bases de cada extremo del ADN dúplex en 10 minutos a 30 ° C.

Figura 1.4.4:Actividad de nucleasa BAL-31

Exonucleasa III

  • Cataliza la eliminación gradual de nucleótidos de los extremos hidroxilo 3 'del ADN dúplex.
  • La enzima atacará el hidroxilo 3 'en el ADN dúplex con extremos romos, con voladizos 5' o con muescas internas.
  • Dado que se requiere ADN dúplex, la enzima no digerir el extremo 3 'del ADN dúplex donde los extremos son salientes 3'.

Figura 1.4.5:Actividad de exonucleasa III

Nucleasa de frijol mungo (aislado de brotes de frijol mungo)

  • A específico de una sola hebra Endonucleasa de ADN y ARN que degradará las extensiones de hebra única de los extremos del ADN y ARN dejando extremos romos.
  • Las extensiones de una sola hebra pueden ser extensiones de 5 'o 3'; ambas se eliminan y se deja un dúplex romo.

Figura 1.4.6:Actividad de la nucleasa de frijol mungo

Desoxirribonucleasa I (ADNasa I) de páncreas bovino

  • Esta enzima hidroliza hebras de ADN dúplex o simples preferentemente en los enlaces fosfodiéster 5 'a pirimidina nucleótidos
  • En presencia del ion Mg 2+, la ADNasa I ataca cada hebra de forma independiente y produce mellas de forma aleatoria (útil para la traducción de mellas)
  • En presencia de ADNsa de iones Mn2 +, escinde ambas cadenas de ADN aproximadamente en la misma posición (pero dejando los extremos `` arrastrados '')

Ligasas

  • Las ligasas catalizan la formación de un enlace fosfodiéster entre los extremos 5 'fosfato y 3' hidroxilo yuxtapuestos de los nucleótidos (potencialmente ARN o ADN dependiendo de la ligasa).
  • En cierto sentido, son lo opuesto a las endonucleasas de restricción, pero no parecen estar influenciadas por la secuencia local, per se.
  • Ligasas requieren ya sea rATP o NAD + como cofactor, y esto contrasta con las endonucleasas de restricción.

Los siguientes son diferentes tipos de ligasas y sus características.

ADN ligasa T4

  • Aislado del bacteriófago T4.
  • Ligará los extremos del ADN o ARN dúplex.
  • Esta enzima unirá los extremos romos así como los extremos con extremos colgantes cohesivos (complementarios) (salientes complementarios 3 'o 5').
  • Esta enzima también reparará las mellas de una sola hebra en los dúplex de ADN, ARN o ADN / ARN dúplex. Requiere ATP como cofactor.

Ligasa de ADN Taq

  • Esta ligasa catalizará un enlace fosfodiéster entre dos oligonucleótidos adyacentes que se hibridan con una hebra de ADN complementaria:

Figura 1.4.7:Actividad de la ADN ligasa Taq

  • La ligación es eficaz solo si los oligonucleótidos se hibridan perfectamente con la hebra molde.
  • La enzima es activa a temperaturas relativamente altas (45 - 65 ° C). Requiere NAD + como cofactor.

T4 RNA ligasa

  • Catalizará la formación de un enlace fosfodiéster entre oligonucleótidos ARN / ARN, oligonucleótidos ARN / ADN u oligonucleótidos ADN / ADN.
  • Requiere ATP como cofactor.
  • Esta enzima no requiere una hebra molde.

La ligasa de ARN de T4 se puede usar para una variedad de propósitos que incluyen la construcción de moléculas híbridas de ARN / ADN.

Figura 1.4.8:Actividad de ligasa de ARN de T4

ADN ligasa (E. coli)

  • Catalizará un enlace fosfodiéster entre el ADN dúplex que contiene extremos cohesivos.
  • Va a no ligar eficientemente fragmentos de extremos romos.
  • Requiere NAD + como cofactor.

Figura 1.4.9:Actividad de la ADN ligasa (E. Coli)

Polinucleótido quinasa T4

  • Cataliza la transferencia e intercambio de un grupo fosfato del gramo posición de rATP (nucleótido de adenina ribosa trifosfato) al extremo 5 'hidroxilo terminal del ADN o ARN bicatenario y monocatenario, y monofosfatos de nucleósido 3 '.
  • La enzima también eliminará los grupos fosforilo 3 '.
  • Los oligonucleótidos que se obtienen de sintetizadores automáticos carecen de un grupo fosfato 5 'y, por lo tanto, no pueden ligarse a otros polinucleótidos..

La polinucleótido quinasa T4 se puede usar para fosforilar el extremo 5 'de tales polinucleótidos:

Figura 1.4.10:Actividad de la polinucleótido quinasa T4


DISCUSIÓN

The In-Fusion™ cloning method was originally developed to produce a common entry vector for a multi-vector cloning system based on the cre-lox recombination (Clontech). As shown here and by others ( 18) (and Andrew Farmer: Clontech, personal communication), the enzyme can be used in combination with any 15 bp homology region to enable ligation-independent cloning of PCR products. We have exploited this property, in combination with single and multiple promoter vectors, to produce a simple and versatile system for expression of recombinant proteins. We have incorporated the method into a semi-automated pipeline for both vector construction and expression screening using standard laboratory liquid handling instruments. The pilot experiments in 96-well format showed cloning efficiencies of 89% after two clones per target tested, with 94% achievable with four clones tested, which we would recommend to maximize cloning efficiency. The reason(s) for some PCR products not cloning is not clear although the quality and quantity of the input DNA appears to be important. Over the last 12 months in the OPPF, we have used In-Fusion™ to construct a total of 661 vectors from 703 PCR products, an overall cloning efficiency of 94%. These results compare favourably with data reported by other HTP structural genomics consortia using either the Gateway™ recombinatorial system (e.g. 79% PCR product to expression clone efficiency ( 19, 20)) or ‘classical’ restriction enzyme and ligation-dependent methods (e.g. 87% ( 1)).

Multi-promoter vectors have been used to express recombinant proteins in more than one host in parallel, typically baculovirus-infected insect cells and E. coli p.ej. ( 21, 22). Similarly, the pOPINE, pOPINF, pOPINJ or pOPINM vectors based on pTriEx2 (Novagen) described in this study can be used to survey expression in E. coli, insect cells, and mammalian cells from a single vector, which can be easily constructed in HTP mode with the associated savings in time and resources. Transient transfection of mammalian cells, notably COS7 and HEK293, is widely used to investigate the expression of eukaryotic proteins and can be readily scaled up for production purposes ( 7, 12, 23, 24). We describe the derivation and use of a secretion vector based on the pOPINF/pTriEx2 vector backbone for the HTP expression of extra-cellular proteins and domains. In addition, the expression from single vector constructs in all three hosts (E. coli, HEK293T and Sf9 cells) has been demonstrated for five target proteins. This ability to screen in multiple hosts would enable rapid scale-up in the most appropriate host (determined by small-scale screening) without the necessity for additional rounds of sub-cloning. The transient transfection protocol (HEK293 cells) and co-transfection protocols (Sf9 cells), which make use of a commercial transfection reagents, have both been automated to enable consistent HTP operation for functional/structural proteomic applications. As far as we are aware, this is the first report of such implementations.

In summary, we have addressed the primary characteristics we set for an improved strategy for HTP cloning as follows:

The ability to clone genes-encoding proteins, or domains thereof, in a rapid and reliable parallel or high-throughput (HTP) fashion. Cloning efficiencies of >90% have been achieved in a parallel 96-well plate format using a generic vector in combination with the In-Fusion™ enzyme.

The ability to accurately determine the final constructs without the addition of extraneous/vector or restriction-site-derived amino acids to the expressed protein. A suite of vectors has been described which make use of In-Fusion™ cloning to precisely engineer the expressed sequence, for example, introducing an N-terminal His6 tag and 3C protease cleavage site to enable removal of the tag during purification. The utility of this format has been exemplified (Case study I).

The process must be versatile in terms of insert sequence independence. Three case studies have been described in which eighty-two expression vectors have been produced from a variety of target genes using the vector system (Case studies I, II, III).

The process would preferably be single-step, to give rapid and cost-effective vector construction. Vector construction involves a single-step reaction that enables the simple and rapid construction of vectors in parallel using a 96-well plate format. Further, certain PCR products are compatible with multiple fusion vector formats (e.g. N-His, N-His-GST and N-His-MBP—see examples in Case study III) thereby enabling cost-effective use of PCR primers.

The constructs should be capable of expressing proteins from multiple hosts, i.e. a single vector capable of expression in E. coli, mammalian cell lines (e.g. HEK293T cells) and insect cell lines (e.g. Sf9 cells). By adapting a multi-promoter vector a single cloning step has been used to produce a single vector suitable for expression in E. coli, mammalian and insect cells. The utility of this has been exemplified (Case study III).

The expressed proteins must be capable of purification in HTP mode, i.e. they must all be fused to a common affinity purification ‘tag’ which may be removed, if desired, by enzymatic digest prior to crystallization. All vectors, regardless of additional fusion protein expressed, add either an N-terminal or C-terminal His6 tag onto the expressed target protein to facilitate detection and purification. The purification of proteins expressed both intracellularly in E. coli and secreted from mammalian cells using a common purification strategy has been exemplified (Case studies I and II).

The process should be amenable to automation. Laboratory automation to carry out liquid handling tasks involved in the various stages of the expression screening experiments in all three hosts has been described.


Resultados

Cernunnos Promotes Joining of Mismatched Ends and Noncohesive Ends.

We purified Ku, DNA-PKcs, XL, and Cernunnos to apparent homogeneity (Fig. 1 A) and tested their ability to join cohesive 5′ ends (EcoRI–EcoRI) or cohesive 3′ ends (KpnI–KpnI). To measure joining efficiency, we used quantitative PCR, which amplified junctions produced from one pair of ends. The PCR primers eliminated signals from competing junctions, such as those produced from intramolecular ligation into circular monomers or intermolecular ligation of other ends. Ku, DNA-PKcs, and XL joined EcoRI–EcoRI ends and KpnI–KpnI ends with efficiencies of 1.2–2.2% (Fig. 1 B, rows 1 and 2). However, the addition of Cernunnos had no effect on joining efficiency.

Cernunnos stimulates the joining of mismatched DNA ends. (A) Purification of NHEJ proteins. Coomassie staining after SDS/PAGE shows our purified preparations of Ku, DNA-PKcs (Pk), Cernunnos (C), and XL. (B) Cernunnos stimulates the joining of noncohesive ends by Ku, DNA-PKcs, and XL. Linear DNA substrates were incubated with no protein (dark gray bars), Ku, DNA-PKcs and XL (light gray bars), or Ku, DNA-PKcs, XL, and Cernunnos (black bars). The orientation of DNA is depicted in the upper left corner. We tested compatible ends (rows 1–3) with cohesive 5′ overhangs (EcoRI–EcoRI), cohesive 3′ overhangs (KpnI–KpnI), or blunt ends (EcoRV–EcoRV). We also tested eight combinations of mismatched ends (rows 4–11). Note that SacII creates a 2-nt 3′ overhang. All other 3′ and 5′ overhangs were 4 nt. We measured joining efficiency by quantitative PCR and expressed efficiency as the percentage of input DNA ends joined (18). Because of large differences among experiments, we plotted joining efficiency on a logarithmic scale. Concentrations of Ku, DNA-PKcs, XL, and Cernunnos were 5, 5, 0.5, and 2.5 nM, respectively, here and elsewhere unless otherwise noted. (Insets) The overhangs from the KpnI–SacI, Acc65I–EcoRI, and EcoRI–BamHI ends.

Next, we tested whether Cernunnos might affect the joining of noncohesive DNA ends. The addition of Cernunnos to Ku, DNA-PKcs, and XL stimulated the joining of two blunt ends (EcoRV–EcoRV) by 6-fold (Fig. 1 B, row 3). In the absence of Cernunnos, Ku, DNA-PKcs, and XL joined blunt ends paired with either 5′ or 3′ overhangs with low and approximately equal efficiencies (Fig. 1 B, rows 4–7). However, the addition of Cernunnos stimulated joining 30- and 55-fold for the blunt-3′ ends, EcoRV–KpnI and EcoRV–SacII, and 8- and 9-fold for the blunt-5′ ends, EcoRV–EcoRI and EcoRV–BamHI. Thus, Cernunnos had a greater effect on blunt-3′ ends than on blunt-5′ ends.

Cernunnos also stimulated joining of ends with mismatched overhangs by 40- to 150-fold (Fig. 1 B, rows 8–11). Ku, DNA-PKcs, XL, and Cernunnos joined mismatched 5′ overhangs (Acc65I–EcoRI, 0.0039%) with 23-fold lower efficiency than mismatched 3′ overhangs (KpnI–SacI, 0.091%). However, Cernunnos facilitated more efficient joining when the 5′ overhangs contained partially complementary sequences (BamHI–EcoRI, 0.25%).

In summary, Cernunnos exhibited a preference for 3′ overhangs over 5′ overhangs. This preference also occurred when we omitted DNA-PKcs from the joining reaction [supporting information (SI) Fig. 6]. The effect of Cernunnos appeared to be specific, because Cernunnos had no effect on ligation of blunt ends to 3′ overhangs by bacteriophage T4 DNA ligase (SI Fig. 7).

Cernunnos Requires Ku to Promote Mismatched End Joining by XL.

We were particularly interested in the joining of mismatched 3′ overhangs because they are produced during V(D)J recombination en vivo (15) and because Cernunnos stimulated their joining by 40-fold in vitro (Figura 1 B, row 9). Interestingly, purified XL joined KpnI–SacI ends with low but detectable efficiency, although the addition of Cernunnos failed to stimulate joining by XL alone (Fig. 2 A). However, even a substoichiometric concentration of Cernunnos (0.05 nM) stimulated joining by XL (0.5 nM) in the presence of Ku (5 nM) and DNA-PKcs (5 nM). A stoichiometric excess of Cernunnos (15 nM) stimulated joining 200-fold, up to a level of nearly 1%.

Ku, DNA-PKcs, XL, and Cernunnos act in concert to join mismatched 3′ overhangs. (A) Cernunnos stimulates the joining of mismatched ends with Ku, DNA-PKcs, and XL but not with XL alone. DNA substrates with mismatched 3′–3′ overhangs (KpnI–SacI) were incubated with XL alone or XL, Ku, and DNA-PKcs (Pk). Concentrations of Ku, DNA-PKcs, and XL were 5, 5, and 0.5 nM, respectively. Cernunnos (C) was added at concentrations of 0.05, 0.1, 0.5, 2.5, 5, and 15 nM. The point in the lower left shows the background PCR signal in the absence of protein. Error bars represent the variation in duplicate measurements. (B) Cernunnos requires Ku to promote mismatched end joining by XL. DNA substrates with mismatched 3′ overhangs (KpnI–SacI) were incubated with different combinations of the core NHEJ proteins Ku, DNA-PKcs, XL, and Cernunnos (2.5 nM).

To determine which proteins were required for joining mismatched ends, we incubated the DNA with Ku, DNA-PKcs, XL, and Cernunnos in different combinations (Fig. 2 B). As single proteins, only XL produced detectable joining of the KpnI–SacI ends. The addition of Ku and DNA-PKcs to XL increased joining efficiency 12-fold. Starting from the reaction with all four protein preparations, we omitted each protein one at a time. The omission of DNA-PKcs reduced joining only 4-fold, but the omission of Ku or Cernunnos reduced joining 150-fold or 40-fold, respectively. Note that the omission of Cernunnos reduced joining 200-fold when the concentration of Cernunnos was 15 nM rather than 2.5 nM (Fig. 2 A). Significantly, the omission of XL eliminated joining activity completely. Thus, Ku, XL, and Cernunnos were required for efficient joining of mismatched ends. These data suggest that Cernunnos and Ku stimulated a latent joining activity for mismatched ends contained in Ligase IV.

Cernunnos Promotes the Preservation of 3′ Overhangs.

To further characterize the joining of mismatched KpnI–SacI ends, we sequenced the junctions created by Ku, DNA-PKcs, and XL with or without the addition of Cernunnos. Surprisingly, the sequence from one 3′ overhang was retained in every junction, whereas the sequence of the other 3′ overhang was lost (Fig. 3). In the absence of Cernunnos, 21 of the 22 sequenced junctions retained the 3′ KpnI overhang, whereas only 1 junction retained the SacI overhang. This preference occurred only in the absence of Cernunnos and remains unexplained. However, in the presence of Cernunnos, the 3′ overhangs were retained with equal probability.

Cernunnos promotes the retention of overhanging ends. We incubated DNA substrates with Ku, DNA-PKcs, and XL with or without the addition of Cernunnos. The DNA substrates had mismatched 3′–3′ ends (KpnI–SacI), blunt-3′ ends with 4-nt overhangs (EcoRV–KpnI), or blunt-3′ ends with 2-nt overhangs (EcoRV–SacII). We used quantitative PCR to measure the percentage of DNA ends joined and sequenced products from each reaction to characterize the junctions. The key shown at the top indicates how the data are presented for each reaction. The junctions recovered from PCR amplification are depicted to show nucleotide addition (black background) and nucleotide deletion (white background).

We also characterized the joining of blunt ends to 3′ overhangs of 4 nt (EcoRV–KpnI) or 2 nt (EcoRV–SacII). In the absence of Cernunnos, most junctions (20 of 29) lost the 3′ overhang, and only a minority (9 of 29) retained the 3′ overhang (Fig. 3). In the presence of Cernunnos, 62 of 62 sequenced junctions retained the 3′ overhang (Fig. 3). Cernunnos exhibited the same effect when added to Ku and XL in the absence of DNA-PKcs (SI Fig. 8). Thus, the addition of Cernunnos promoted retention of sequences from the 3′ overhangs.

Finally, we characterized the joining of blunt ends to 5′ overhangs (SI Fig. 9). Cernunnos exhibited only a moderate effect in promoting retention of the 5′ overhang for EcoRV–BamHI ends, and no effect on retention of the 5′ overhang for EcoRV–EcoRI ends.

Ku, XL, and Cernunnos Ligate One of the Two Strands from Mismatched DNA Ends.

In an effort to account for the retention or deletion of 3′ overhangs, we examined our purified protein preparations for polymerase or nuclease activities. Polymerase activity was absent because the joining reactions did not include dNTPs and because joining efficiency was unaffected by addition of dNTPs (data not shown). Nuclease activity also was absent because Cernunnos strongly stimulated joining of blunt-3′ ends with retention of 3′ overhanging sequences (Fig. 3 and SI Fig. 8). Furthermore, Cernunnos, Ku, XL, and DNA-PKcs failed to degrade radiolabeled single-strand DNA substrates (SI Fig. 10) and did not delete any nucleotides in 112 junctions from pairs of blunt ends (EcoRV–EcoRV) and cohesive ends (EcoRI–EcoRI and KpnI–KpnI) (SI Fig. 11).

Taken together, our data suggest that Cernunnos and Ku stimulated XL to ligate one of the two strands from mismatched DNA ends. The deletion or retention of 3′ overhangs would depend on which strand was ligated. If Ligase IV catalyzes ligation of only one strand from mismatched ends, the 5′ phosphate group of one DNA substrate should be dispensable for ligation. To test this hypothesis, we removed 5′ phosphates from the DNA substrates with 3′ overhanging KpnI ends or blunt EcoRV ends and incubated the DNA with Ku, XL, and Cernunnos with or without DNA-PKcs (Fig. 4). When we removed the recessed 5′ phosphate on the KpnI end, joining actually increased because of decreased competition from intramolecular circularization of the KpnI substrate. This result demonstrated that the 5′ phosphate on the KpnI end was dispensable for joining. By contrast, when we removed the 5′ phosphate from the blunt EcoRV end, joining decreased to the levels observed when both DNA ends lacked 5′ phosphates. Taken together with the junction sequences (Fig. 3), these data indicated that Cernunnos stimulated the ligation of one strand from each end, joining the overhanging 3′ hydroxyl on the KpnI end to the 5′ phosphate on the blunt EcoRV end.

Ku, XL, and Cernunnos join mismatched ends with the 5′ phosphate from only one end. To determine how Ku, XL, and Cernunnos joined mismatched ends, we treated the EcoRV and KpnI substrates with DNA phosphatase (Antarctic phosphatase New England Biolabs). EcoRV* and KpnI* denote dephosphorylated DNA molecules. We confirmed the successful removal of the 5′ phosphates by incubating each DNA preparation with T4 ligase and were able to demonstrate a loss of >90% of the ligation products by using agarose gel electrophoresis (data not shown). We incubated mismatched DNA substrates (EcoRV–KpnI, EcoRV–KpnI*, EcoRV*–KpnI, or EcoRV*–KpnI*) with Ku, XL (1 nM), and Cernunnos (2 nM), with or without DNA-PKcs amplified the junctions by quantitative PCR and plotted joining efficiency on a linear scale.

We wanted to obtain direct evidence for what we shall refer to as mismatched end (MEnd) DNA ligase activity. To avoid PCR amplification, we designed a gel-based assay with radiolabeled DNA. To unambiguously identify the joined products and improve joining efficiency, we assayed intramolecular joining of linear DNA. Each DNA molecule contained cohesive EcoRI–EcoRI ends, blunt EcoRV–EcoRV ends, or mismatched blunt-3′ EcoRV–KpnI ends (Fig. 5).

Ku, XL, and Cernunnos join mismatched ends by ligation of one strand. (A) Schematic of the gel-based assay for joining. We incubated Ku, XL, and Cernunnos (Ku/XL/C) or T4 ligase (T4) with a linear DNA substrate containing EcoRI–EcoRI, EcoRV–EcoRV, or EcoRV–KpnI ends digested the DNA products with XmnI and used T4 polynucleotide kinase to radiolabel the DNA. Concentrations of XL and Cernunnos were 1 nM and 5 nM, respectively. For EcoRV–EcoRV and EcoRV–KpnI ends, we performed a second digest with ApoI or MspA1I to remove the radiolabel from one DNA strand. To confirm that ligation created a new phosphodiester bond, we digested the products of the EcoRV–EcoRV joining reaction with EcoRV. Radiolabeled DNA strands are red with red asterisks at the 5′ end, and unlabeled DNA strands are black. DNA products were resolved with denaturing gel electrophoresis. (B) Ku, XL, and Cernunnos joined cohesive EcoRI–EcoRI ends. Ku, XL, and Cernunnos (lane 3) and T4 ligase (lane 4) produced a higher molecular weight band of 498 nt. The molecular weight markers consisted of a radiolabeled 50-bp ladder (lane 1). Joining efficiencies for Ku/XL/C and T4 (calculated from the ratio of intensities in the 498-nt band to the 339-nt band) were 39% and 89%, respectively. Sizes of the ligated higher molecular weight bands in B – D appear in blue typeface. (C) Ku, XL, and Cernunnos joined blunt EcoRV–EcoRV ends. Ku, XL, and Cernunnos (lane 3) and T4 ligase (lane 4) produced a higher molecular weight band of 470 nt, with joining efficiencies of 20% and 14%, respectively. ApoI digestion converted the 470-nt band to 413-nt and 57-nt bands and converted the 281-nt band to 224-nt and 57-nt bands (lane 6). MspA1I digestion converted the 470-nt band to 434-nt and 36-nt bands and the 189-nt band to 153-nt and 36-nt bands (lane 8). Intensities of the 413-nt and 434-nt bands were reduced to 50% of the 470-nt band because the second digestion removed the radiolabel from one strand. EcoRV digestion eliminated the 470-nt band (lane 10), demonstrating that the DNA junction contained new phosphodiester bonds. The 153-, 57-, and 36-nt bands are not shown. (D) Ku, XL, and Cernunnos joined only one strand from mismatched EcoRV–KpnI ends. Ku, XL, and Cernunnos (lane 3) produced a higher molecular weight band of 472 nt, with a joining efficiency of 5%. ApoI digestion converted the 472-nt band to 415-nt and 57-nt bands and the 281-nt band to 224-nt and 57-nt bands (lane 5). The intensities of the 472-nt and 415-nt bands were equivalent (lanes 3 and 5). MspA1I digestion converted the 472-nt band to a 36-nt band and converted the 191-nt band to a 36-nt band (lane 7), demonstrating the ligation of only one strand.

We incubated the DNA with Ku, XL, and Cernunnos. To detect the joined products by denaturing gel electrophoresis, we cleaved the DNA products with XmnI and labeled the ends with [γ- 32 P]ATP and T4 polynucleotide kinase (Fig. 5 A). This procedure labeled the 5′ ends of DNA strands terminating at XmnI, EcoRI, and EcoRV sites. We measured joining by appearance of a higher molecular weight DNA fragment of the appropriate size. To determine whether joining occurred for a specific strand, we removed the radiolabel on one strand or the other by cleaving the DNA with ApoI or MspA1I.

For the cohesive 5′ overhanging EcoRI–EcoRI ends (Fig. 5 B), Ku, XL, and Cernunnos joined 39% of the input DNA. By contrast, T4 ligase joined 89% of the input DNA. For blunt EcoRV–EcoRV ends (Fig. 5 C), Ku, XL, and Cernunnos joined 20%, and T4 ligase joined 14% of the input DNA. When we removed the radiolabel from one strand by cleaving the DNA with ApoI or MspA1I, 50% of the signal from the higher molecular weight DNA disappeared (Fig. 5 C). Thus, the assay was able to discriminate the joining of one strand vs. the other. The junction formed by joining of the blunt EcoRV ends was susceptible to cleavage by the phosphodiesterase activity of EcoRV, indicating that Cernunnos stimulated a ligation event that created a bona fide phosphodiester bond.

For blunt-3′ EcoRV–KpnI ends, Ku, XL, and Cernunnos joined 5% of the input DNA (Fig. 5 D), which was higher than the result from quantitative PCR of the same DNA products, which detected ligation of 1.6% of the input DNA (data not shown). When we removed the radiolabel from the strand containing the 3′ overhang by MspA1I cleavage, 100% of the signal from the higher molecular weight DNA disappeared. By contrast, removal of the radiolabel from the other strand by ApoI reduced the size of the higher molecular weight fragment by 57 nt without diminishing the signal. This result provided direct evidence for single-strand ligation of the hydroxyl group of the 3′ overhang to the 5′ phosphate of the blunt end. Remarkably, Ku, XL, and Cernunnos ligated blunt-3′ ends with an efficiency of 5%, even in the absence of DNA-PKcs. For comparison, T4 ligase ligated blunt ends with an efficiency of 14%.


Associated Data

Targeted nucleases are powerful tools for mediating genome alteration with high precision. The RNA-guided Cas9 nuclease from the microbial clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) adaptive immune system can be used to facilitate efficient genome engineering in eukaryotic cells by simply specifying a 20-nt targeting sequence within its guide RNA. Here we describe a set of tools for Cas9-mediated genome editing via nonhomologous end joining (NHEJ) or homology-directed repair (HDR) in mammalian cells, as well as generation of modified cell lines for downstream functional studies. to minimize off-target cleavage, we further describe a double-nicking strategy using the Cas9 nickase mutant with paired guide RNAs. This protocol provides experimentally derived guidelines for the selection of target sites, evaluation of cleavage efficiency and analysis of off-target activity. Beginning with target design, gene modifications can be achieved within as little as 1𠄲 weeks, and modified clonal cell lines can be derived within 2𠄳 weeks.


Funding for this work was provided by the National Institutes of Health (R01GM121698 to D.A.B, R21AG056706 to D.A.B, R01GM106081 to X.W.) and the Arizona Biomedical Research Commission (ADHS16-162401 to D.A.B). nótese bien was supported by a fellowship from the International Foundation for Ethical Research.

Nicholas Brookhouser, Toan Nguyen, Stefan J. Tekel and Kylie Standage-Beier contributed equally to this work.

Afiliaciones

School of Biological and Health Systems Engineering, Arizona State University, 501 E. Tyler Mall, ECG 334A, Tempe, AZ, 85287, USA

Nicholas Brookhouser, Toan Nguyen, Stefan J. Tekel, Kylie Standage-Beier, Xiao Wang & David A. Brafman

Graduate Program in Clinical Translational Sciences, University of Arizona College of Medicine-Phoenix, Phoenix, AZ, 85004, USA

Molecular and Cellular Biology Graduate Program, Arizona State University, Tempe, AZ, 85287, USA


Ver el vídeo: Biotecnología Vectores de clonación (Agosto 2022).