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¿Cuál es la vida de los circuitos genéticos libres de células?

¿Cuál es la vida de los circuitos genéticos libres de células?


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¿Se pueden probar los circuitos genéticos en un entorno libre de células? ¿Cuál sería su vida si los mantenemos a temperatura ambiente?

Los circuitos que se componen de componentes basados ​​en ADN se denominan comúnmente circuitos genéticos. Al probar, quise decir probar su comportamiento, es decir, aplicar señales de entrada (quizás proteínas) para ver si genera una señal de salida (otra proteína, puede ser una proteína fluorescente).

Por vida, quise decir, durante cuánto tiempo un circuito de este tipo (que contiene cadenas de adn) puede sobrevivir a temperatura ambiente normal.


Biología sintética libre de células: ingeniería en un mundo abierto

La biología sintética libre de células surge como una tecnología habilitadora poderosa y flexible que puede diseñar piezas y sistemas biológicos para aplicaciones de las ciencias de la vida sin utilizar células vivas. Proporciona soluciones de ingeniería más simples y rápidas con una libertad de diseño sin precedentes en un entorno abierto que el sistema celular. Esta revisión se centra en los desarrollos recientes de la biología sintética libre de células en los campos de la ingeniería biológica a nivel molecular y celular, incluida la ingeniería de proteínas, la ingeniería metabólica y la ingeniería de células artificiales. En la ingeniería de proteínas sin células, el control directo de las condiciones de reacción en un sistema sin células permite una fácil síntesis de proteínas complejas, proteínas tóxicas, proteínas de membrana y proteínas nuevas con aminoácidos no naturales. Los sistemas libres de células ofrecen la capacidad de diseñar rutas metabólicas hacia la producción de los productos deseados. La acumulación de células artificiales basadas en sistemas libres de células mejorará nuestra comprensión de la vida y las utilizará para aplicaciones ambientales y biomédicas.


Desde que se descubrió que el nivel de iones de calcio dentro de una célula puede oscilar (Woods et al., 1986), los biólogos han estado intrigados por la naturaleza periódica de muchas señales celulares. Mientras poco a poco empezamos a comprender los muchos y variados roles que estas oscilaciones periódicas juegan en la comunicación celular, queda una pregunta abierta: ¿cómo son las redes de genes capaces de generar oscilaciones sostenidas? Ahora, en eLife, Sebastian Maerkl y sus colaboradores, incluidos Henrike Niederholtmeyer y Zachary Sun como primeros autores conjuntos, informan que han utilizado un enfoque de biología sintética para revelar cómo los circuitos genéticos simples pueden producir oscilaciones robustas en las células (Niederholtmeyer et al., 2015).

Inicialmente, se argumentó que las oscilaciones periódicas en el nivel de iones de calcio y otros componentes celulares no tenían ningún papel en la señalización, pero décadas de investigación han revelado que las señales periódicas son mejores para transmitir información que las señales no periódicas (Rapp, 1987 Behar y Hoffman , 2010 Purvis y Lahav, 2013 Levine et al., 2013). Ambos tipos de señales pueden codificar información en el tamaño (amplitud) de la señal, pero la frecuencia y fase de las señales periódicas también pueden codificar información. Como resultado, las señales periódicas pueden regular procesos celulares complejos con mayor precisión que las señales no periódicas. Es importante destacar que los avances recientes en el análisis unicelular y la optogenética han dado lugar a numerosos estudios en profundidad que revelan cómo los eventos críticos, como la determinación del destino celular y la comunicación multicelular, son controlados por señales periódicas (la revisión de Sonnen y Auleha, 2014 describe otros ejemplos).

El análisis matemático muestra que un elemento esencial de un circuito oscilante es un circuito de retroalimentación inhibitoria: si la actividad de un gen en dicho circuito de retroalimentación aumenta, activa otros genes en el circuito que finalmente lo inhiben (Rapp, 1987 Novak y Tyson, 2008 Purcell et al., 2010). Este circuito de retroalimentación debe tener un retardo de tiempo incorporado para permitir que las actividades de los genes en el circuito fluctúen en ciclos regulares.

El auge de la biología sintética ha hecho posible diseñar y construir redes sintéticas en células vivas que desempeñan un papel específico. En un ejemplo temprano de esto, los investigadores de Princeton informaron que habían construido una red de genes oscilatorios en E. coli basado en una red cíclica de tres genes denominada represor (Elowitz y Leibler, 2000 Figura 1). La teoría predice que el represor y otros osciladores de anillo que tienen un número impar de genes (nodos) deberían ser capaces de producir oscilaciones sostenidas. Sin embargo, dado que diseñar, construir y probar nuevas redes de genes en células vivas es un proceso largo, no se han reportado osciladores de anillo con más de tres nodos.

Redes de genes sintéticos que contienen tres, cuatro y cinco genes.

Los genes de cada circuito (arriba) se traducen en productos proteicos, y cada producto proteico reprime la actividad de otro gen en la red (como lo indican las flechas). La teoría predice que las redes cíclicas de genes muestran un comportamiento oscilatorio cuando el número de nodos de la red es impar. Niederholtmeyer y col. encontraron que un circuito que constaba de tres genes daba lugar a oscilaciones bien definidas con un período de hasta 8 horas, y que un circuito que contenía cinco genes oscilaba con un período de 19 horas. Por el contrario, y de acuerdo con las predicciones teóricas, una red formada por cuatro nodos no oscilaba, sino que alcanzaba un estado estable donde la actividad de todos los genes era constante en el tiempo.

Ahora, Maerkl y sus colaboradores, que tienen su sede en la École Polytechnique Fédérale de Lausanne y el Instituto de Tecnología de California, han creado arquitecturas de anillo que contienen tres, cuatro y cinco genes (Figura 1). Construyeron sus circuitos genéticos prototipo en un sistema libre de células combinando reactores de flujo de microfluidos con extractos de Bacterias E. coli (Niederholtmeyer et al, 2013 Noireaux et al., 2003). La principal ventaja de este enfoque es que reduce significativamente el tiempo necesario para cada ciclo de diseño, construcción y prueba porque elimina la necesidad de varias tareas laboriosas, como la clonación molecular y la recopilación de mediciones de células individuales.

Usando esta estrategia Niederholtmeyer, Sun et al. pudieron confirmar la predicción de que los osciladores con tres o cinco nodos son capaces de generar oscilaciones, mientras que los osciladores con cuatro nodos no lo son. El período del oscilador de cinco nodos es aproximadamente el doble de largo que el del oscilador de tres nodos, lo que indica que las células pueden ajustar la periodicidad de las señales aumentando la complejidad de sus circuitos genéticos. A continuación, los investigadores transfirieron sus diseños de prototipos a living E. coli células y mostró que el período de oscilación en las células coincidía con el período de oscilación en los sistemas libres de células. Este es un resultado importante, ya que muestra que los sistemas libres de células pueden usarse para capturar con precisión el comportamiento de las células, lo que allana el camino para que los investigadores utilicen enfoques de biología sintética en sistemas libres de células para explorar los complejos mecanismos reguladores que operan dentro de las células. (van Roekel et al., 2015). El último trabajo también debería acelerar en gran medida la construcción de nuevas redes de genes complejas en bacterias, que podrían tener aplicaciones en la producción de biocombustibles, diagnóstico médico y experimentos para explorar las formas en que las células procesan la información.


Visualización de circuitos genéticos en el espacio y el tiempo, con traducción libre de células en papel

Somos un par de científicos del Laboratorio de Biología Molecular del Consejo de Investigación Médica (MRC LMB), a quienes les apasiona ayudar a los estudiantes a aprender sobre la ciencia moderna.

La biología sintética es particularmente interesante para nosotros ya que ambos trabajamos a la vanguardia de este campo y apreciamos cómo la biología se ha transformado en una disciplina más de ingeniería, donde aprendemos sobre la vida mediante la construcción de sistemas biológicos. El mismo principio, es decir, aprender biología haciéndolo, es muy eficaz para estudiar conceptos complejos en las escuelas. Sin embargo, realizar experimentos modernos de biología sintética en el aula es una actividad costosa, debido a los reactivos, medios, bacterias e instrumentos de laboratorio necesarios, sin mencionar la carga de papeleo de tratar con organismos genéticamente modificados.

Creemos que la enseñanza de la ciencia moderna puede ser accesible, barata y sencilla. No estamos solos en esto y hay avances significativos que han realizado Amino Labs, Cell-free tech y Biobits, que persiguen el mismo objetivo que nosotros: hacer que la ciencia de vanguardia sea accesible y asequible. Elegimos trabajar con el sistema de transcripción-traducción sin células (TXTL) porque es barato de hacer, no hay necesidad de regulaciones de seguridad y son altamente personalizables: lo único que necesita es una construcción genética.

Nuestro objetivo es enseñar a los estudiantes los principios del control genético, la base de la biología sintética. Lo primero que nos llamó la atención fue la facilidad con la que los niños estudian los circuitos eléctricos conectando directamente partes eléctricas en cadenas y experimentando con ellas. Queríamos reiterar esta lógica para la biología. Afortunadamente, los principios fundamentales de la regulación genética ya se han establecido teniendo en cuenta la ingeniería eléctrica, la única pieza del rompecabezas que falta: conectarlos físicamente en una placa de pruebas.

Figura A: Sistema de transcripción-traducción sin células (TXTL) con papel de filtro

El TXTL está destinado a ser una mezcla mágica que produce prácticamente cualquier parte genética (como la proteína fluorescente verde o la polimerasa de ARN T7). Como material de soporte donde se contiene la reacción, optamos por un papel de filtro. La idea era convertir estos trozos de papel en módulos funcionales expresando proteínas en ellos. Por lo tanto, conectar los trozos de papel más tarde permitirá que las proteínas expresadas se muevan de un trozo de papel a otro con el flujo de agua (Figura A).

Al final, una proteína expresada en un módulo puede afectar la reacción en el otro. Esta configuración experimental simplifica el estudio de los circuitos de genes, ya que los disparadores y los productos del circuito están separados físicamente y, por lo tanto, teóricamente debería ser más fácil tratar con este tipo de sistema en lugar de una mezcla de caja negra en el tubo. Además, las posibilidades son prácticamente infinitas, ya que este sistema es altamente personalizable y las piezas se pueden conectar de cualquier manera que ayude a los niños a experimentar con el material sin restricciones.

Figura B: comparación de la actividad entre la mezcla comercial (Promega T7 de alto rendimiento S30) y la propia E. coli mezcla.

El proyecto comenzó con la producción de TXTL de gran actividad. E. coli mezclas. Para ayudar a otros laboratorios que tienen acceso solo a equipos básicos, utilizamos un protocolo barato y sencillo para preparar extractos de células, de modo que nuestro trabajo sea fácilmente reproducible. Hemos preparado extractos de células ya sea tradicionalmente con una prensa francesa (Emulsiflex) y una centrífuga de alta velocidad, o utilizando un enfoque más económico y simplificado mediante el uso de lisis celular por ultrasonido y una centrífuga de mesa refrigerada. Independientemente del protocolo que utilizamos para la preparación de E. coli lisado, la actividad estaba a la par con la mezcla comercial (Promega T7 de alto rendimiento S30) (Fig. B).

Figura c: Mezclas de TXTL que muestran más actividad en solución que en papel.

Los desafíos comenzaron cuando intentamos ejecutar la reacción TXTL en papel: las mezclas sin células siempre están activas en la solución, su contraparte en papel solo da una señal baja que solo se puede visualizar con instrumentación costosa y, por lo tanto, no se puede usar en cualquier entorno de bajos recursos (Fig. C).

Por ahora, hemos encontrado una alternativa viable que es adecuada para la divulgación: en lugar de liofilizar TXTL en el papel, liofilizamos TXTL en el tubo. Sorprendentemente, la mezcla de reacción era tan activa como la original y, según informes anteriores, los componentes de la reacción conservan su actividad durante semanas e incluso meses. Por lo tanto, nuestro objetivo es utilizar este producto TXTL "a mitad de camino" en la próxima campaña de verano. Sin embargo, la batalla aún no ha terminado, ahora hemos centrado nuestra atención en otros materiales de soporte como la agarosa, que no interfiere con TXTL, es barato, puede liofilizarse y fundirse de cualquier forma.


Fabricación de terapéuticos

Otra área activa en la investigación del SFC es la biofabricación de productos terapéuticos y otros reactivos a base de proteínas. Los sistemas biológicos naturales han desarrollado una notable capacidad para sintetizar una variedad de moléculas que van desde metabolitos hasta biopolímeros. Los sistemas de expresión de proteínas libres de células permiten la incorporación de tales reacciones en un proceso altamente controlado que permite la producción de moléculas según sea necesario y en el campo. Nuestro enfoque principal aquí estará en un subconjunto de biopolímeros, a saber, proteínas terapéuticas. El trabajo en curso en este campo se basa en décadas de investigación que han conducido a los sistemas productivos y prácticos actualmente disponibles [28, 29, 36,37,38, 40]. Los avances recientes en las técnicas de preparación de alto rendimiento [40, 45] y en el desarrollo de sistemas que pueden utilizar fuentes de energía más económicas [64, 65] han hecho que el SFC sea muy accesible. Mientras tanto, se están logrando avances significativos hacia la resolución de diversos problemas de plegamiento de proteínas y deficiencias en las modificaciones postraduccionales [66] asociadas con el SFC tradicional. Los avances recientes han demostrado el potencial para aumentar la escala de las reacciones sin células, y algunos han demostrado que los volúmenes de reacción alcanzan los 100 litros [67, 68] a 1000 litros [69]. La expresión libre de células se ha utilizado como plataforma para la producción de una amplia gama de posibles agentes terapéuticos, algunos de los cuales se han resumido en la Tabla 1. Varios de estos productos se han validado en modelos animales [49, 76].

Se han perseguido dos modos principales de CFS. El primero, utilizado por esfuerzos comerciales como Sutro [94], se centra en una producción grande y centralizada. Este enfoque aprovecha las ventajas de la síntesis fuera de la celda para la biofabricación. Para estas aplicaciones, el SFC no solo permite una producción rápida, sino que también acelera significativamente el proceso de desarrollo de fármacos [95]. Sorprendentemente, Sutro ha aumentado su producción sin células a la increíble cantidad de 1000 litros [69], lo que demuestra la escalabilidad de la producción sin células centralizada. El segundo modo utiliza sistemas FD-CF para descentralizar la capacidad de biofabricación para la producción de productos terapéuticos en lotes pequeños, con aplicaciones en la salud global y la respuesta a emergencias [49, 73, 96, 97]. Utilizando este modo de producción, hemos demostrado recientemente la capacidad de prueba de concepto para fabricar más de 50 reactivos terapéuticos y de laboratorio, incluidas proteínas (p. Ej., Vacunas, anticuerpos y péptidos antimicrobianos) y moléculas pequeñas [49], con aplicaciones fuera de el entorno del laboratorio.

La biofabricación libre de células es particularmente adecuada para la producción de vacunas debido a su potencial para una rápida ampliación en respuesta a emergencias de salud pública. Se ha demostrado la expresión exitosa sin células de varias vacunas recombinantes (p. Ej., Botulínica, difteria, ántrax) [49, 86,87,88,89,90, 98], y algunas han sido validadas en modelos animales, como ratones [49, 90]. Teniendo en cuenta los requisitos de dosis bajas (rango de microgramos) para muchas de estas terapias, es probable que la comercialización de vacunas derivadas del SFC experimente un rápido crecimiento en los próximos años. La producción de anticuerpos también ha sido un área de interés para la comunidad libre de células [20, 49, 51, 74,75,76,77,78,79,80, 99, 100]. Debido a su tamaño compacto y niveles de expresión relativamente altos en el SFC, los anticuerpos de dominio único han atraído una atención particular y parecen estratégicamente bien ubicados para satisfacer las necesidades emergentes en la medicina personalizada, es decir, para la terapéutica y el diagnóstico.

La resistencia a los antibióticos ha sido reconocida como una de las principales amenazas para la salud mundial, lo que resulta en aproximadamente dos millones de enfermedades y 23.000 muertes solo en los EE. UU. Cada año [101]. En consecuencia, la producción libre de células de compuestos antimicrobianos, incluidos péptidos antimicrobianos y fármacos de moléculas pequeñas, se ha convertido en el centro de atención de algunos grupos [49, 93]. Varios laboratorios también han demostrado el poder del SFC para expresar fagos [56, 102,103,104]. La tendencia al alza en los casos notificados de resistencia a los antibióticos ha llevado a un resurgimiento en la visualización de la terapia con fagos como una alternativa potencialmente viable a los regímenes antibióticos actuales [101, 105]. El uso de fagos también se ha evaluado como una estrategia de tratamiento eficaz para varias enfermedades de las plantas, y algunos fagos están ahora disponibles comercialmente para el consumo masivo [106]. La producción basada en el SFC de estos antimicrobianos no tradicionales podría desempeñar un papel importante en la lucha contra la crisis de resistencia a los antibióticos y también podría ayudar a mejorar la seguridad alimentaria en todo el mundo.

A continuación, destacaremos algunas de las áreas en las que CFS ha mostrado un gran potencial para mejorar los métodos actuales de desarrollo y fabricación de terapias. Estos avances están transformando rápidamente a CFS en una parte integral del ecosistema de fabricación.

Proteínas de membrana

Si bien aproximadamente el 70% de todos los fármacos actúan sobre las proteínas de membrana [107], trabajar con estas proteínas es notoriamente difícil debido a su enriquecimiento en superficies hidrófobas. La expresión celular de las proteínas de la membrana a menudo está plagada de desafíos, como la toxicidad causada por la incorporación de la membrana o su incompatibilidad con la fisiología del huésped [108]. Recientemente, se han utilizado enfoques sin células para abordar esta desafiante categoría de proteínas, cuyas secuencias codificantes comprenden del 20 al 30% de todos los genes conocidos [107]. En comparación con los métodos celulares actuales, el SFC puede ser una herramienta poderosa en la producción de proteínas de membrana activas solubles [109]. La capacidad de integrar pasos que pueden abordar los aspectos desafiantes de la síntesis de proteínas de membrana es particularmente valiosa. Por ejemplo, esfuerzos previos en sistemas basados ​​en células han demostrado que los imitadores de membrana pueden usarse con éxito para sintetizar y estabilizar una amplia gama de proteínas de membrana, como los receptores acoplados a proteína G [110, 111], el receptor del factor de crecimiento epidérmico [71]. ], proteínas de membrana del virus de la hepatitis C [112] y una ATP sintasa [109, 113]. Estos imitadores incluyen tensioactivos, liposomas y nanodiscos [114,115,116] y se pueden añadir directamente a CFS co-traduccional o post-traduccionalmente. También hay pruebas que sugieren que las proteínas funcionales de membrana de un solo tramo pueden sintetizarse simplemente en presencia de una interfaz aceite-agua (por ejemplo, mediante el uso de emulsiones) [117].

Producción macromolecular

La investigación molecular ha destacado la importancia de las interacciones proteína-proteína y los complejos resultantes que estas interacciones pueden generar. Ya sea para el estudio biofísico de estos complejos o como vehículos para una nueva administración terapéutica (por ejemplo, andamios similares a virus para vacunas), existe una creciente necesidad de desarrollar herramientas sólidas destinadas a la síntesis de dichos complejos. Como en el caso de las proteínas de membrana, el SFC también ha demostrado mayores rendimientos, en comparación con las estrategias in vivo, en la producción de ensamblajes macromoleculares como partículas similares a virus (VLP) [109]. Trabajo pionero del grupo Swartz, que demuestra la expresión libre de células del antígeno central de la hepatitis B VLP (2 subunidades) [91] en un E. colibasado en células libres, abrió la puerta a otros investigadores que expresan una variedad de ensamblajes macromoleculares, incluido el E. coli ARN polimerasa (5 subunidades) [118] y una ATP sintasa (25 subunidades) [113]. Trabajos anteriores con lisado de reticulocitos también habían demostrado la expresión libre de células del receptor de células T humanas (7 subunidades) [119]. Sorprendentemente, varios bacteriófagos ahora también se han expresado con éxito en el SFC, incluido el fago T4, que contiene estructuralmente 1500 proteínas de 50 genes [56, 102,103,104] (Fig. 3).

Síntesis de complejos de proteínas de múltiples subunidades en el SFC. Varios grupos han demostrado la producción de complejos de proteínas cada vez más intrincados. Estos han incluido el antígeno central de la hepatitis B (HBc) VLP (2 subunidades) [91], el E. coli ARN polimerasa (5 subunidades) [118], el receptor de células T humano (7 subunidades) [119], una ATP sintasa (25 subunidades) [113] y el fago T4 (1500 subunidades) [102,103,104]

Las subunidades no idénticas de un complejo proteico se denominan a menudo subunidades hetero. En algunos casos, tales subunidades hetero requieren co-traducción para producir complejos activos [120]. Por lo tanto, la capacidad del SFC para traducir simultáneamente múltiples ARNm facilita la producción de complejos activos compuestos por varias subunidades diferentes [121]. Algunos SFC como E. coliLas preparaciones a base de proteínas generalmente no son capaces de producir proteínas que contengan enlaces disulfuro, que son fundamentales para numerosas proteínas farmacéuticamente relevantes (por ejemplo, anticuerpos y muchas citocinas) [121]. Sin embargo, los esfuerzos recientes han aumentado estos sistemas para permitir la producción de proteínas complejas que requieren múltiples enlaces disulfuro [85, 99, 122], ampliando la gama de terapias que se pueden realizar en el SFC.

Modificación de proteínas y tablas de codones.

La eficacia de muchas terapias basadas en proteínas depende del control preciso sobre la modificación natural o no natural de sus secuencias de péptidos. Uno de los usos más convincentes de tales modificaciones es en el desarrollo de conjugados anticuerpo-fármaco (ADC), que están ganando popularidad rápidamente como una nueva clase de terapéutica contra el cáncer. Las técnicas clásicas de conjugación dan como resultado una mezcla heterogénea de anticuerpos marcados debido a su dependencia de la conjugación arbitraria con múltiples cadenas laterales de aminoácidos. Sin embargo, estudios recientes sugieren que las propiedades farmacológicas de los ADC podrían mejorarse mediante la conjugación de sitios específicos. Los aminoácidos no naturales proporcionan una vía eficaz para dicha conjugación específica de sitio [123]. Hasta la fecha, se ha demostrado in vivo la incorporación co-traduccional de más de 100 aminoácidos no naturales diferentes [124], lo que permite una amplia gama de modificaciones [125,126,127,128,129]. Muchas de estas modificaciones se han demostrado en el contexto libre de células para una variedad de aplicaciones, incluida la inmovilización controlada por orientación [92, 98] y la funcionalización específica del sitio (p. Ej., Fosforilación [130], PEGilación [131] o conjugación de fármacos [81]) [132,133,134].

Las plataformas CFS evitan algunas de las limitaciones de permeabilidad y toxicidad basadas en células y ofrecen un mayor control y versatilidad en la realización de modificaciones de proteínas [109, 135]. La incorporación de aminoácidos no naturales en enfoques basados ​​en células se ha basado típicamente en la reutilización de codones de terminación para minimizar los impactos negativos de la recodificación en la viabilidad celular [109]. En un sistema sin células, sin embargo, la tabla de codones completa se puede reprogramar en teoría, permitiendo no solo la incorporación de aminoácidos no naturales, sino también la creación de tablas de codones completamente nuevas.

Llevado al extremo, este último podría ayudar con la protección de la propiedad intelectual. Las secuencias de ADN podrían ofuscarse de modo que se vuelvan no funcionales fuera de su contexto libre de células especializado. Este código ofuscado haría que los diseños propietarios fueran difíciles de copiar. La ofuscación de codones también podría plantear serios desafíos para la detección de secuencias de ADN que pueden ser empleadas por entidades malévolas. Por ejemplo, las empresas de síntesis de ADN tendrían más dificultades para detectar secuencias de ADN que podrían usarse para actividades nefastas (por ejemplo, bioterrorismo). Un trabajo reciente ha demostrado que el tamaño de la tabla de codones también se puede ampliar aumentando el alfabeto genético de cuatro letras con pares de bases no naturales [136, 137]. Por lo tanto, las proteínas producidas en el SFC podrían, al menos en teoría, contener un número ilimitado de aminoácidos no naturales.

El CFS también se puede emplear para realizar modificaciones de origen natural en proteínas. Un ejemplo de estos es el injerto de azúcares (es decir, glicanos) denominado glicosilación. La producción exitosa de muchos terapéuticos depende a menudo de una glicosilación altamente eficiente, ya que la falta de una glicosilación adecuada puede reducir la eficacia y la vida media en circulación de muchas proteínas terapéuticas [138]. Algunos SFC (por ejemplo, insectos, ovario de hámster chino y sistemas basados ​​en extracto de K562 humano) son inherentemente capaces de glicosilación. Sin embargo, su repertorio de estructuras de glicanos tiende a limitarse a las sintetizadas naturalmente por el tipo de célula fuente de sus lisados. Además, la glicosilación en estos sistemas a menudo requiere la recapitulación de los mecanismos de tráfico de proteínas de la célula fuente [109]. Por lo tanto, la creación de vías de glicosilación sintéticas en el SFC se ha convertido en un área de interés en los últimos años [135, 139]. El éxito en este dominio probablemente servirá como un catalizador clave para llevar vacunas producidas sin células y otras terapias a las masas. La Figura 4 describe algunas de las posibles modificaciones de proteínas en el SFC.

Modificaciones de proteínas en el SFC. Las posibles modificaciones de proteínas incluyen, pero no se limitan a, glicosilación, formación de enlaces disulfuro, acetilación [140], fosforilación [141] y PEGilación [131] (que se pueden lograr mediante el uso de aminoácidos no naturales). Los aminoácidos no naturales también se pueden utilizar para la conjugación de una amplia gama de compuestos tales como fármacos (por ejemplo, mediante la química del clic) [81] o moléculas fluorescentes [142]. Figura adaptada de Pagel et al.. [143]

Evolución dirigida

La evolución dirigida es una herramienta poderosa para la ingeniería de aptámeros y proteínas que utiliza rondas iterativas de mutagénesis y selección para modificar o ajustar propiedades bimoleculares específicas (por ejemplo, la actividad del sustrato de una enzima). La utilidad de aptámeros o proteínas, en un contexto dado, con respecto a sus correspondientes secuencias de nucleótidos se describe a menudo como un panorama de aptitud. La evolución dirigida proporciona un método masivamente paralelo para buscar a través de un panorama de aptitud para encontrar variantes óptimas y sus correspondientes genotipos [144]. Esto generalmente requiere un mapeo uno a uno de fenotipo a genotipo. Aunque las células tienen una capacidad incorporada para tal mapeo debido a su naturaleza compartimentada, el uso de células para realizar una evolución dirigida puede imponer límites al tamaño de las bibliotecas candidatas examinadas y restringe el tipo de disolventes, tampones y temperaturas que se pueden muestrear [ 145]. Como resultado, las plataformas de evolución dirigida sin células han ganado popularidad [145], comenzando con los primeros sistemas verdaderamente libres de células publicados a finales de los 90 [146, 147]. Más recientemente, la conexión del fenotipo al genotipo se ha logrado mediante la compartimentación artificial (por ejemplo, utilizando emulsión, microperlas y liposomas) [145, 148,149,150,151]. Las aplicaciones han incluido el diseño y optimización de fragmentos de anticuerpos Fab [77, 152], proteínas de membrana [151] y, como veremos más adelante, descubrimiento de enzimas [52].


Abstracto

Las redes reguladoras sintéticas con funciones prescritas se diseñan mediante el ensamblaje de un conjunto reducido de elementos funcionales. También podríamos ensamblarlos computacionalmente si los modelos matemáticos de esos elementos funcionales fueran lo suficientemente predictivos en diferentes contextos genéticos. Solo después de lograr esto tendremos bibliotecas de modelos de partes biológicas capaces de proporcionar comportamientos dinámicos predictivos para la mayoría de los circuitos construidos con ellos. Por lo tanto, necesitamos herramientas que puedan explorar automáticamente diferentes contextos genéticos, además de poder utilizar dichas bibliotecas para diseñar circuitos novedosos con dinámicas específicas. Hemos implementado una nueva herramienta, AutoBioCAD, orientada al diseño automatizado de circuitos reguladores de genes. AutoBioCAD carga una biblioteca de modelos de elementos genéticos e implementa estrategias de diseño evolutivo para producir (i) secuencias de nucleótidos que codifican circuitos con dinámicas específicas que luego pueden probarse experimentalmente y (ii) modelos de circuitos para probar principios de regulación en sistemas naturales, proporcionando una nueva herramienta para biología sintética. AutoBioCAD se puede utilizar para modelar y diseñar circuitos genéticos con comportamiento dinámico, gracias a la incorporación de efectos estocásticos, robustez, dinámica cualitativa, optimización multiobjetivo o secuencias de nucleótidos degenerados, todo ello facilitando el vínculo con la ingeniería de parte / circuito biológico.


Los componentes básicos de la vida, todo está en los genes

Por Deborah Smith

¿Qué es esencial para la vida? Parece que no mucho. Esta semana se reveló que algunas bacterias, por muy pequeñas que sean, llevan consigo una gran cantidad de equipaje genético adicional.

Solo el 12 por ciento del ADN de un microbio común de agua dulce era necesario para su supervivencia, descubrieron los investigadores, después de eliminar el otro 88 por ciento. Como era de esperar, estos fragmentos vitales del código genético incluían genes y otros segmentos de ADN que activan y desactivan los genes.

& # x27 & # x27Pero hubo muchas sorpresas, & # x27 & # x27, dice una bióloga de la Universidad de Stanford, la Dra. Lucy Shapiro. & # x27 & # x27 Por ejemplo, encontramos 91 segmentos de ADN esenciales de los que no tenemos idea de lo que hacen. & # x27 & # x27

Reducir el modelo genético de un organismo a sus elementos esenciales más básicos es parte de una nueva búsqueda para comprender mejor la vida y luego rediseñarla.

La gran promesa es la capacidad de construir nuevas formas de vida artificiales que puedan resolver muchos de los problemas del mundo: limpiar los derrames de petróleo y otros contaminantes, y producir alimentos, combustible, plásticos y medicamentos.

Los principios formales de la ingeniería son la clave de esta controvertida búsqueda, conocida como biología sintética, que todavía está en su infancia, dice el Dr. Jim Haseloff, un experto australiano en plantas de la Universidad de Cambridge.

& # x27 & # x27El campo se encuentra en una situación similar a la de la ingeniería mecánica a principios del siglo XIX y la microelectrónica a principios de los 50 & # x27 & # x27, dice.

Hace dos siglos, los ingenieros mecánicos construyeron cada máquina de vapor individualmente. Pero el desarrollo de piezas estandarizadas, como las roscas de tornillo en la década de 1830, y la construcción modular, llevaron a la producción en masa de motores a partir de planos.

La ingeniería eléctrica siguió un camino similar, con el desarrollo de componentes clave, como transistores y circuitos integrados, lo que llevó a la industria electrónica internacional actual. & # x27 & # x27Y ahora tienes el mismo tipo de trayectoria que ocurre en biología, & # x27 & # x27, dice el Dr. Haseloff.

Al igual que los primeros constructores de motores, los biólogos se han vuelto muy buenos en la creación de sus propios organismos modificados genéticamente mediante la adición de uno o dos genes a una planta o microbio.

Pero se necesita una revolución en el diseño de nuevos organismos si el mundo quiere escapar de su dependencia de fuentes de energía y materiales no renovables, dice el Dr. Haseloff, quien recientemente dio una charla en la Universidad de Sydney.

Los bloques de Lego en una caja de juegos para niños proporcionaron la primera inspiración. En los últimos años, los científicos han creado una biblioteca de miles de bloques de construcción biológicos estandarizados. Estos pequeños repuestos de ADN pueden ser utilizados por cualquier investigador para ensamblar nuevos microbios que puedan, por ejemplo, operar a temperaturas más altas, absorber dióxido de carbono o adherirse a metales pesados.

& # x27 & # x27Es una idea sencilla. Pero también es un cambio profundo en la forma de hacer las cosas, similar a pasar de la biología a la ingeniería, & # x27 & # x27, dice el Dr. Haseloff.

La última y más sofisticada fase implica la construcción de circuitos genéticos complejos, hechos de genes y proteínas que interactúan, para controlar el comportamiento celular.

Los circuitos naturales, por ejemplo, hacen que las células crezcan, se dividan, produzcan una señal o se conviertan en un tipo diferente de célula. Synthetic circuits might be able to be integrated with natural circuits to ''rewire'' cells and get a plant or microbe to produce the fuel, medicine or material that is desired.

Dr Haseloff is particularly interested in how to modify the shape of plants, by altering the number of cells that proliferate or change type during development, to increase the amount of certain tissues, such as fruit.

He points to the remarkable differences between the ancient, small tomatoes of Peru and the large, red juicy ones we enjoy today, achieved by traditional breeding. ''The question is whether you can rationally engineer and produce those changes [with synthetic circuits].''

Medical researchers have already begun to use synthetic biology techniques in the laboratory, to try to tackle infectious disease and cancer, researchers report this week in the journal, Ciencias.

For example, bacteria have been engineered to produce a protein that allows them to invade cancer cells, and to then produce a small piece of RNA that turns down the effect of a gene in the cell that stimulates colon cancer.

Concerns about synthetic biology focus on bioterror - the potential for development of new deadly microbes as weapons - and bioerror - their escape into the environment or unforseen harm to human health.

Some environmental groups have called for a moratorium on the science, but many researchers say the technology is an extension of genetic modification techniques widely used now. 'ɺnd we already have a very efficient framework of regulation and governance for these kinds of manipulations,'' Dr Haseloff says.


What is the life of cell-free genetic circuits? - biología

Store, Exchange, and Interact with Synthetic Biological Data

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As synthetic biology techniques become more powerful, researchers are anticipating a future in which the design of biological circuits will be similar to the design of integrated circuits in electronics. Cello is a framework that describes what is essentially a programming language to design computational circuits in living cells. The circuits generated on plasmids expressed in Escherichia coli required careful insulation from their genetic context, but primarily functioned as specified. The circuits could, for example, regulate cellular functions in response to multiple environmental signals. Such a strategy can facilitate the development of more complex circuits by genetic engineering.

Cello converts electronic design specifications of combinational logic to complete DNA sequences encoding transcriptional logic circuits that can be executed in bacterial cells. A database of transcriptional repressors characterized in the Voigt lab provide genetic NOT gates and NOR gates that can be composed into any logic function.

The automated workflow and in-house genetic gates will make circuit design more reproducible and broadly accessible to biological engineering labs.

Generates a Boolean circuit as a Directed Acyclic graph from an HDL specification (Verilog).

Uses a database of second-generation genetic logic gates whose transfer functions are insulated from promoter context.

Allows users to upload custom UCF (User Constraint file) files.

Searches for the optimal assignment of transcriptional repressors to NOT/NOR gates by signal matching with the experimentally measured transfer functions.

Offers a wide range of assignment algorithms including Simulated annealing (default), Hill climbing, Breadth first search, Random permutations,etc.

Generates histograms for predicted gate REU for each row of the truth table for the best genetic circuit assignment.

Generates multiple plasmid versions using the Eugene language for constrained combinatorial enumeration of transcriptional unit orders and orientations.

Allows external applications to connect to Cello using a REST API.

Life Technologies (a Thermo Fisher brand): A114510

Office of Naval Research: Multidisciplinary University Research Initiative grant N00014-13-1-0074

Siebel Scholarship: Class of 2015

Air Force Office of Scientific Research: National Defense Science and Engineering Graduate fellowship FA9550-11-C-0028


Synthetic biologists extend functional life of cancer fighting circuitry in microbes

Bioengineers at the University of California San Diego have developed a method to significantly extend the life of gene circuits used to instruct microbes to do things such as produce and deliver drugs, break down chemicals and serve as environmental sensors.

Most of the circuits that synthetic biologists insert into microbes break or vanish entirely from the microbes after a certain period of time -- typically days to weeks -- because of various mutations. But in the September 6, 2019 issue of the journal Ciencias, the UC San Diego researchers demonstrated that they can keep genetic circuits going for much longer.

The key to this approach is the researchers' ability to completely replace one genetic-circuit-carrying sub-population with another, in order to reset the mutation clock, while keeping the circuit running.

"We've shown that we can stabilize genetic circuits without getting into the business of fighting evolution," said UC San Diego bioengineering and biology professor Jeff Hasty, the corresponding author on the study. "Once we stopped fighting evolution at the level of individual cells, we showed we could keep a metabolically-expensive genetic circuit going as long as we want."

The circuit the UC San Diego researchers used in the Ciencias study is one that this team, and others, are actively using to develop new kinds of cancer therapies.

"As synthetic biologists our goal is to develop gene circuits that will enable us to harness microorganisms for a wide range of applications. However, the reality today is that the gene circuits we insert into microbes are prone to fail due to evolution. Whether it be days, weeks, or months, even with the best circuit-stabilization approaches, it's just a matter of time. And once you lose functionality in your genetic circuit, there is nothing to do but start over," said Michael Liao, a UC San Diego bioengineering PhD student and the first author on the Ciencias papel. "Our work shows there is another path forward, not just in theory, but in practice. We've shown that it's possible to keep circuit-busting mutations at bay. We found a way to keep hitting reset on the mutation clock."

If the team's method can be optimized for living systems, the implications could be significant for many fields, including cancer therapy, bioremediation, and bioproduction of useful proteins and chemical components.

Rock Paper Scissors

To actually build a "reset button" for the mutation clock, the researchers focused on dynamics between strains of microbes, rather than trying to hold selective pressures at bay at the level of individual cells. The researchers demonstrated their community-level engineering system using three sub-populations of E. coli with a "rock-paper-scissors" power dynamic. This means that the "rock" strain can kill the "scissors" strain but will be killed by the "paper" strain.

Most published work tends to focus on stabilization strategies that act at the level of single cells. While some of these approaches may be sufficient in a given therapeutic context, evolution dictates that single cell approaches will naturally tend to stop working at some point. However, since the rock-paper-scissors (RPS) stabilization acts at a community level, it can also be coupled with any of the systems that act on a single cell level to drastically extend their lifespan.

Making Cancer Drugs and Delivering them to Tumors

In 2016 in Naturaleza, UC San Diego researchers led by Hasty, along with colleagues at MIT, described a "synchronized lysis circuit" that could be used to deliver cancer-killing drugs that are produced by bacteria that accumulate in and around tumors. This led the UC San Diego group to focus on the synchronized lysis platform for the experiments published in Ciencias.

These coordinated explosions only occur once a predetermined density of cells has been reached, thanks to "quorum sensing" functionality also baked into the genetic circuitry. After the explosion, the approximately 10% of the bacterial population that did not explode starts growing again. When the population density once again reaches the predetermined density (more "quorum sensing"), another drug-delivering explosion is triggered and the process encoded by the researchers' synchronized lysis circuit restarts.

The challenge, however, is that this cancer killing genetic circuit -- and other genetic circuits created by synthetic biologists -- eventually stop working in the bacteria. The culprit. Mutations driven by the process of evolution.

"The fact that some bugs naturally grow in tumors and we can engineer them to produce and deliver therapies in the body is a game-changer for synthetic biology," said Hasty. "But we have to find ways to keep the genetic circuits running. There is still work to do, but we're showing that we can swap populations and keep the circuit running. This is a big step forward for synthetic biology."

Biomedical Research Advances

One of the research teams working to further advance and implement the synchronized lysis circuit is run by Tal Danino, now a professor at Columbia University, who also published seminal work on the development of quorum sensing for synthetic biology as part of his Ph.D. at UC San Diego.

"Tal recently showed that synchronized lysis technology can be used to deliver an immunotherapy to tumors in mice. To my knowledge, they are the first to show that bacterial drug production and delivery within a treated tumor can modify the immune system to attack untreated tumors. The results are fascinating. They also highlight how important it is for us to figure out how to keep the lysis circuit running as long as possible," said Hasty.

The current approach is not limited to a three-strain system. Individual sup-populations of microbes, for example, could each be programmed to produce different drugs, offering the potential of precise combination drug therapies to treat cancer, for example.

The researchers studied the dynamics of the populations using microfluidic devices that allow for controlled interactions between the different sub-populations. They also demonstrated the system is robust when tested in larger wells.

One next step will be to combine the approach with standard stabilizing approaches and demonstrate the system works in live animal models.

"We are converging on an extremely stable drug delivery platform with wide applicability for bacterial therapies," said Hasty.

Hasty, Din, and Danino are co-founders of GenCirq, a company which seeks to transfer this and related work to the clinic.


The Cell: A Molecular Approach. 2ª edición.

Cells are divided into two main classes, initially defined by whether they contain a nucleus. Prokaryotic cells (bacteria) lack a nuclear envelope eukaryotic cells have a nucleus in which the genetic material is separated from the cytoplasm. Prokaryotic cells are generally smaller and simpler than eukaryotic cells in addition to the absence of a nucleus, their genomes are less complex and they do not contain cytoplasmic organelles or a cytoskeleton (Table 1.1). In spite of these differences, the same basic molecular mechanisms govern the lives of both prokaryotes and eukaryotes, indicating that all present-day cells are descended from a single primordial ancestor. How did this first cell develop? And how did the complexity and diversity exhibited by present-day cells evolve?

Table 1.1

Prokaryotic and Eukaryotic Cells.


Researchers create synthetic cells to isolate genetic circuits

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Synthetic biology allows scientists to design genetic circuits that can be placed in cells, giving them new functions such as producing drugs or other useful molecules. However, as these circuits become more complex, the genetic components can interfere with each other, making it difficult to achieve more complicated functions.

MIT researchers have now demonstrated that these circuits can be isolated within individual synthetic “cells,” preventing them from disrupting each other. The researchers can also control communication between these cells, allowing for circuits or their products to be combined at specific times.

“It’s a way of having the power of multicomponent genetic cascades, along with the ability to build walls between them so they won’t have cross-talk. They won’t interfere with each other in the way they would if they were all put into a single cell or into a beaker,” says Edward Boyden, an associate professor of biological engineering and brain and cognitive sciences at MIT. Boyden is also a member of MIT’s Media Lab and McGovern Institute for Brain Research, and an HHMI-Simons Faculty Scholar.

This approach could allow researchers to design circuits that manufacture complex products or act as sensors that respond to changes in their environment, among other applications.

Boyden is the senior author of a paper describing this technique in the Nov. 14 issue of Nature Chemistry. The paper’s lead authors are former MIT postdoc Kate Adamala, who is now an assistant professor at the University of Minnesota, and former MIT grad student Daniel Martin-Alarcon. Katriona Guthrie-Honea, a former MIT research assistant, is also an author of the paper.

Circuit control

The MIT team encapsulated their genetic circuits in droplets known as liposomes, which have a fatty membrane similar to cell membranes. These synthetic cells are not alive but are equipped with much of the cellular machinery necessary to read DNA and manufacture proteins.

By segregating circuits within their own liposomes, the researchers are able to create separate circuit subroutines that could not run in the same container at the same time, but can run in parallel to each other, communicating in controlled ways. This approach also allows scientists to repurpose the same genetic tools, including genes and transcription factors (proteins that turn genes on or off), to do different tasks within a network.

“If you separate circuits into two different liposomes, you could have one tool doing one job in one liposome, and the same tool doing a different job in the other liposome,” Martin-Alarcon says. “It expands the number of things that you can do with the same building blocks.”

This approach also enables communication between circuits from different types of organisms, such as bacteria and mammals.

As a demonstration, the researchers created a circuit that uses bacterial genetic parts to respond to a molecule known as theophylline, a drug similar to caffeine. When this molecule is present, it triggers another molecule known as doxycycline to leave the liposome and enter another set of liposomes containing a mammalian genetic circuit. In those liposomes, doxycycline activates a genetic cascade that produces luciferase, a protein that generates light.

Using a modified version of this approach, scientists could create circuits that work together to produce biological therapeutics such as antibodies, after sensing a particular molecule emitted by a brain cell or other cell.

“If you think of the bacterial circuit as encoding a computer program, and the mammalian circuit is encoding the factory, you could combine the computer code of the bacterial circuit and the factory of the mammalian circuit into a unique hybrid system,” Boyden says.

The researchers also designed liposomes that can fuse with each other in a controlled way. To do that, they programmed the cells with proteins called SNAREs, which insert themselves into the cell membrane. There, they bind to corresponding SNAREs found on surfaces of other liposomes, causing the synthetic cells to fuse. The timing of this fusion can be controlled to bring together liposomes that produce different molecules. When the cells fuse, these molecules are combined to generate a final product.

More modularity

The researchers believe this approach could be used for nearly any application that synthetic biologists are already working on. It could also allow scientists to pursue potentially useful applications that have been tried before but abandoned because the genetic circuits interfered with each other too much.

“The way that we wrote this paper was not oriented toward just one application,” Boyden says. “The basic question is: Can you make these circuits more modular? If you have everything mishmashed together in the cell, but you find out that the circuits are incompatible or toxic, then putting walls between those reactions and giving them the ability to communicate with each other could be very useful.”

Vincent Noireaux, an associate professor of physics at the University of Minnesota, described the MIT approach as “a rather novel method to learn how biological systems work.”

“Using cell-free expression has several advantages: Technically the work is reduced to cloning (nowadays fast and easy), we can link information processing to biological function like living cells do, and we work in isolation with no other gene expression occurring in the background,” says Noireaux, who was not involved in the research.

Another possible application for this approach is to help scientists explore how the earliest cells may have evolved billions of years ago. By engineering simple circuits into liposomes, researchers could study how cells might have evolved the ability to sense their environment, respond to stimuli, and reproduce.

“This system can be used to model the behavior and properties of the earliest organisms on Earth, as well as help establish the physical boundaries of Earth-type life for the search of life elsewhere in the solar system and beyond,” Adamala says.


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